Summary
يصف هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية لتوليد وتوصيف عضويات 3D عن طريق الفم والمريء التي تمثل آفات سرطان الخلايا الطبيعية والأورام والحرشفية الناجمة عن التسرطن الكيميائي.
Abstract
ينتشر سرطان الخلايا الحرشفية المريئي (ESCC) في جميع أنحاء العالم ، حيث يمثل 90٪ من جميع حالات سرطان المريء كل عام ، وهو الأكثر فتكا من بين جميع سرطانات الخلايا الحرشفية البشرية. على الرغم من التقدم الأخير في تحديد التغيرات الجزيئية المصاحبة لبدء ESCC وتطوره ، لا يزال تشخيص المريض ضعيفا. إن التعليق التوضيحي الوظيفي لهذه التغييرات الجزيئية هو الخطوة التالية الضرورية ويتطلب نماذج تلتقط السمات الجزيئية ل ESCC ويمكن معالجتها بسهولة وبتكلفة زهيدة للتعليق التوضيحي الوظيفي. الفئران المعالجة بمحاكاة دخان التبغ 4-نيتروكينولين 1-أكسيد (4NQO) تشكل بشكل متوقع ESCC والأورام المريئية. وتجدر الإشارة إلى أن آفات 4NQO تنشأ أيضا في تجويف الفم ، والأكثر شيوعا في اللسان ، وكذلك المعدة الأمامية ، والتي تشترك جميعها في ظهارة الحرشفية الطبقية. ومع ذلك ، لا يمكن التلاعب بهذه الفئران ببساطة لاختبار الفرضيات الوظيفية ، حيث أن توليد نماذج الفئران متساوية المنشأ يتطلب وقتا طويلا وموارد. هنا ، نتغلب على هذا القيد عن طريق توليد عضويات ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من خلية واحدة من الفئران المعالجة ب 4NQO لتوصيف الفئران ESCC أو الخلايا قبل الورمية خارج الجسم الحي. تلتقط هذه الكائنات العضوية السمات البارزة ل ESCC وأورام المريء ، ويمكن الاستفادة منها بثمن بخس وبسرعة لتشكيل نماذج متساوية المنشأ ، ويمكن استخدامها في تجارب زرع الجينات المتزامنة. نوضح كيفية توليد عضويات 3D من أنسجة المريء العادية ، preneoplastic ، و SCC الفئران والحفاظ على هذه المواد العضوية وحفظها بالتبريد. تطبيقات هذه الكائنات العضوية متعددة الاستخدامات واسعة وتشمل استخدام الفئران المعدلة وراثيا والمزيد من التوصيف عن طريق قياس التدفق الخلوي أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وتوليد خطوط عضوية متساوية الجينات باستخدام تقنيات كريسبر ، وفحص الأدوية أو زرع الجينات. نعتقد أن الاعتماد الواسع النطاق للتقنيات الموضحة في هذا البروتوكول سيسرع التقدم في هذا المجال لمكافحة العبء الشديد ل ESCC.
Introduction
سرطان الخلايا الحرشفية المريئي (ESCC) هو أكثر سرطانات الخلايا الحرشفية البشرية فتكا ، بسبب التشخيص المتأخر ومقاومة العلاج وورم خبيث 1,2. ينشأ ESCC من الظهارة الحرشفية الطبقية ، التي تبطن السطح اللمعي للمريء. تتكون الظهارة الحرشفية من خلايا قاعدية تكاثرية وخلايا متمايزة داخل طبقة الخلايا فوق القاعدية. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تعبر الخلايا القاعدية عن علامات مثل p63 و Sox2 و cytokeratin K5 و K14 ، بينما تعبر الخلايا المتمايزة عن K4 و K13 و IVL. الخلايا القاعدية نفسها غير متجانسة وتشمل الخلايا الجذعية المفترضة المحددة بعلامات مثل K153 و CD734. في الاتزان الداخلي، تخضع الخلايا القاعدية للتمايز الطرفي بعد الانقسام داخل طبقة الخلايا فوق القاعدية، في حين تهاجر الخلايا المتمايزة وتتقشر في التجويف لإكمال التجديد الطلائي. يذكرنا ESCC بخلاياهم الأصلية ، ويعرض تمايز الخلايا الحرشفية بدرجات متفاوتة. غالبا ما يصاحب ESCC آفات سلائف نسيجية متعددة البؤر ، تعرف باسم الأورام داخل الظهارة (IEN) أو خلل التنسج ، والتي تضم خلايا قاعدية غير نمطية. بالإضافة إلى التغيرات الظهارية ، يعرض ESCC إعادة تشكيل الأنسجة داخل المقصورة تحت الظهارية ، حيث يتم تنشيط الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) وتجنيد الخلايا المناعية / الالتهابية لتعزيز البيئة المكروية المعززة للورم.
ينطوي التسبب في ESCC على التغيرات الجينية والتعرض لعوامل الخطر البيئية. تشمل الآفات الجينية الرئيسية تعطيل الجينات المثبطة للورم TP53 و CDKN2A (p16INK4A) وتنشيط الجينات المسرطنة CCND1 (cyclin D1) و EGFR ، والتي تبلغ ذروتها في ضعف وظيفة نقطة تفتيش دورة الخلية ، والانتشار الشاذ ، والبقاء على قيد الحياة تحت الإجهاد السمي الجيني المرتبط بالتعرض للمواد المسرطنة البيئية. في الواقع ، تتفاعل التغيرات الجينية بشكل وثيق مع عوامل الخطر السلوكية والبيئية ، وأكثرها شيوعا تعاطي التبغ والكحول. يحتوي دخان التبغ على مواد مسرطنة بشرية مثل الأسيتالديهيد ، وهو أيضا المستقلب الرئيسي للكحول. يحفز الأسيتالديهيد تقريب الحمض النووي والروابط المتقاطعة للحمض النووي ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي وتراكم طفرات الحمض النووي وعدم استقرار الكروموسومات. بالنظر إلى المحفزات الانقسامية المفرطة والانتشار الشاذ من تنشيط الجينات المسرطنة ، يتم تسهيل التحول الخبيث للخلايا الظهارية المريئية من خلال آليات للتعامل مع الإجهاد السمي الجيني ، بما في ذلك تنشيط مضادات الأكسدة ، والالتهام الذاتي ، والانتقال الظهاري الوسيطة (EMT). ومن المثير للاهتمام ، أن وظائف الحماية الخلوية هذه غالبا ما يتم تنشيطها في الخلايا الجذعية السرطانية ESCC (CSCs) التي تتميز بتعبير CD44 (CD44H) العالي ولديها قدرات بدء الورم ، والغزو ، ورم خبيث ، ومقاومة العلاج5،6،7.
تم تصميم ESCC في زراعة الخلايا وفي نماذجالقوارض 8,9. في العقود الثلاثة الماضية ، تم تطوير نماذج فئران قوية معدلة وراثيا من ESCC. وتشمل هذه الفئران المعدلة وراثيا CCND1 و EGFR 10،11 و p53 و p120Ctn بالضربة القاضية12,13. ومع ذلك ، فإن التغيرات الجينية الفردية لا تؤدي عادة إلى ظهور ESCC سريع. تم التغلب على هذا التحدي باستخدام المواد المسرطنة المريئية التي تلخص بشكل جيد الآفات الوراثية البشرية في ESCC14. على سبيل المثال ، يسرع 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) تطوير ESCC في الفئران المعدلة وراثيا CCND1 15. في السنوات الأخيرة ، تم التحقيق في الخلايا الجذعية الظهارية المريئية المفترضة ، والخلايا السلفية ، ومصائر كل منها في نماذج الفئران التي يمكن تتبعها من سلالة الخلايا 3,4. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذه الفئران التي يمكن تتبعها لاستكشاف خلايا منشأ ESCC وكيف تؤدي هذه الخلايا إلى ظهور CSCs CD44H عبر علم الأنسجة التقليدي والتوصيف الجزيئي القائم على omics7.
أحد المجالات الناشئة المتعلقة بنماذج الفئران هذه هو التطبيق الجديد لتقنيات زراعة الخلايا لتحليل ESCC الحية والخلايا السليفة في نظام عضوي ثلاثي الأبعاد (3D) يتم فيه تلخيص بنية الأنسجة الأصلية خارج الجسم الحي7،8،9. ونمت هذه المواد العضوية 3D بسرعة من تعليق خلية واحدة معزولة من أنسجة الفئران ، بما في ذلك الأورام الأولية والنقيلي (على سبيل المثال ، العقدة الليمفاوية والرئة وآفات الكبد). يتم تضمين الخلايا في مستخلص الغشاء القاعدي (BME) وتغذيتها بوسط زراعة خلايا خال من المصل محدد جيدا. تنمو الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد في غضون 7-10 أيام ، وتكون الهياكل الكروية الناتجة قابلة للزراعة الفرعية ، والحفظ بالتبريد ، والمقايسات لتحليل مجموعة متنوعة من الخصائص والوظائف الخلوية ، بما في ذلك علامات CSC ، EMT ، الالتهام الذاتي ، الانتشار ، التمايز ، وموت الخلايا المبرمج.
يمكن تطبيق هذه الطرق على نطاق واسع على الثقافات العضوية 3D التي أنشئت من أي الأنسجة الظهارية الحرشفية الطبقية ، مثل الغشاء المخاطي للرأس والرقبة (تجويف الفم واللسان والبلعوم والحنجرة) وحتى المعدة الأمامية. الغشاء المخاطي للرأس والرقبة متجاوران مع المريء ، ويشترك النسيجان في تنظيم الأنسجة ووظيفتها وقابليتها للإصابة بالأمراض. يشترك كل من سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) و ESCC في الآفات الوراثية وعوامل الخطر البيئية المرتبطة بنمط الحياة مثل التعرض للتبغ والكحول. وتأكيدا على هذا التشابه ، فإن الفئران المعالجة بمحاكاة دخان التبغ 4NQO تطور بسهولة كلا من HNSCC و ESCC. نظرا للسهولة التي يمكن بها تطبيق البروتوكولات الموضحة أدناه على نمذجة HNSCC ، فإننا ندرج تعليمات محددة لإنشاء ثقافات عضوية 3D من هذه الآفات.
هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد عضويات 3D مريئية للفئران (MEOs) تمثل الآفات الطبيعية والأورام و ESCC التي تتطور في الفئران المعالجة ب 4NQO. يمكن استخدام سلالات الفئران المختلفة ، بما في ذلك السلالات المختبرية الشائعة مثل C57BL / 6 ومشتقات سلالة الخلايا التي يمكن تتبعها وغيرها من المشتقات المعدلة وراثيا. نؤكد على الخطوات الرئيسية ، بما في ذلك عزل ظهارة المريء الفئرانية الطبيعية أو المريضة ، وإعداد معلقات أحادية الخلية ، وزراعة ومراقبة المواد العضوية 3D المتنامية ، والثقافة الفرعية ، والحفظ بالتبريد ، ومعالجة التحليلات اللاحقة ، بما في ذلك التشكل والتطبيقات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تخطيط تجارب الفئران وتنفيذها وفقا للوائح وبموجب البروتوكول الحيواني #AABB1502 ، وتمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كولومبيا. تم إيواء الفئران في مرفق مناسب لرعاية الحيوانات يضمن المعاملة الإنسانية للفئران ويوفر الرعاية البيطرية المناسبة للفئران والتدريب على سلامة المختبرات لموظفي المختبر.
1. علاج الفئران ب 4NQO للحث على آفات المريء IEN و ESCC (النظر في الوقت: حتى 28 أسبوعا)
ملاحظة: لتوليد MEOs تمثل آفات المريء الورمية ، تتعرض الفئران للتسرطن الكيميائي بوساطة 4NQO كما وصفه سابقا Tang et al.14. يتم إنشاء MEOs العادية / غير الورمية من الفئران غير المعالجة.
- فئران
- منزل أربعة إلى خمسة فئران لكل قفص ، وتأقلمهم مع منشأة الحيوانات لمدة 1 أسبوع على الأقل قبل بدء التجربة. لتقليل احتمالية أن تؤدي الاضطرابات المرتبطة بالعمر إلى الإنهاء المبكر للتجربة الكاملة التي تستغرق 28 أسبوعا ، ابدأ بالفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 أسابيع و 16 أسبوعا.
ملاحظة: تم استخدام الفئران C57BL / 6 التي تزن حوالي 20-30 جم في هذا البروتوكول. للتجارب الأقصر ، يمكن استخدام الفئران الأكبر سنا. الفئران الذكور أو الإناث مقبولة. السيطرة (لا يوجد علاج ، انظر القسم 1.3.1) يجب مطابقة الفئران في العمر والجنس.
- منزل أربعة إلى خمسة فئران لكل قفص ، وتأقلمهم مع منشأة الحيوانات لمدة 1 أسبوع على الأقل قبل بدء التجربة. لتقليل احتمالية أن تؤدي الاضطرابات المرتبطة بالعمر إلى الإنهاء المبكر للتجربة الكاملة التي تستغرق 28 أسبوعا ، ابدأ بالفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 أسابيع و 16 أسبوعا.
- تحضير مياه الشرب التي تحتوي على 4NQO
- تحضير محلول مخزون 1 مجم / مل 4NQO في جلايكول الإيثيلين بروبيلين (جدول المواد). قم بإذابة 100 مجم من 4NQO في 100 مل من 99.9٪ إيثيلين بروبيلين جليكول في دورق زجاجي سعة 500 مل مغطى بغشاء مانع للتسرب. تخلط جيدا في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام محرك مغناطيسي عند 800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- أضف 900 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم إلى 100 مل من محلول مخزون 4NQO 1 مجم / مل ، واخلطه عن طريق الانقلاب في أسطوانة بلاستيكية مدرجة سعة 2 لتر مغطاة بغشاء مانع للتسرب. حجم 1 لتر من 100 ميكروغرام / مل 4NQO في 10٪ إيثيلين بروبيلين غليكول سيخدم قفصين للفأر مجهزين بزجاجة شرب سعة 500 مل.
تنبيه: تجدر الإشارة إلى أن 4NQO مادة كيميائية اصطناعية قد تسبب السرطان. تعامل مع قفازات النتريل ومعطف مختبر بأكمام طويلة ، وارتداء أحذية مغلقة من الأمام. ضع في اعتبارك الحماية المناسبة للعين وحماية الوجه وغطاء الرأس. للتخلص من النفايات ، يجب وضع 4NQO في حاوية مصنفة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لإدارة النفايات الخطرة من خلال الصحة والسلامة البيئية.
- العلاج باستخدام 4NQO والمراقبة
- قم بتوصيل زجاجة الشرب ، وقم بإدارة 4NQO عبر مياه الشرب المخصصة للفئران لمدة 16 أسبوعا. استخدم 10٪ (وزن / حجم) بروبيلين غليكول كعنصر تحكم في السيارة (بدون علاج).
ملاحظة: يمكن استخدام فترات أقصر من العلاج 4NQO للحث على IEN. - أعد ملء الماء مرة واحدة في الأسبوع.
- قم بوزن كل فأرة أسبوعيا عن طريق وضعها في وعاء بلاستيكي على ميزان المختبر.
- في نهاية فترة العلاج 4NQO لمدة 16 أسبوعا ، ابدأ في إعطاء الفئران مياه شرب منتظمة خلال فترة مراقبة ما بعد 4NQO لمدة تصل إلى 12 أسبوعا (الشكل 1).
- راقب الفئران يوميا بحثا عن علامات الضيق (على سبيل المثال ، ضعف الحركة ، والهابيتوس المنحني ، والسلوك المنسحب) ، وعسر البلع ، والجفاف. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتقييم الفئران أسبوعيا بحثا عن التغيرات في وزن الجسم أو تناول الطعام والسوائل. إذا انخفض وزن الجسم بأكثر من 10٪ من وزن الجسم الأولي ، فقم بإطعام الفئران بمكمل غذائي سائل.
ملاحظة: قد يكون فقدان وزن الجسم المقاوم للمكملات الغذائية السائلة مؤشرا على ESCC ، ويجب القتل الرحيم للفئران التي تفقد أكثر من 20٪ من وزن الجسم. الأهم من ذلك ، يمكن إنشاء MEOs من الفئران التي تم قتلها رحيما قبل الأوان. لاحظ أن الفئران C57BL / 6 بدون تعديلات وراثية لا تظهر عادة علامات المراضة أو لديها آفات ESCC مرئية حتى نهاية فترة المراقبة بعد 4NQO.
- قم بتوصيل زجاجة الشرب ، وقم بإدارة 4NQO عبر مياه الشرب المخصصة للفئران لمدة 16 أسبوعا. استخدم 10٪ (وزن / حجم) بروبيلين غليكول كعنصر تحكم في السيارة (بدون علاج).
- إعداد الحيوان
- القتل الرحيم للفئران في غرفة CO 2 مليئة CO2 بمعدل تدفق يزيح 30٪ -70٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. تأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم.
- ثبت أطراف وأنف الماوس في وضع ضعيف على منصة التشريح باستخدام إبر 21 جرام.
- تطهير السطح البطني للماوس مع 70 ٪ من الإيثانول.
- تشريح (النظر في الوقت: 0.5 ساعة)
- افتح الجلد عن طريق الضغط على فرو منتصف البطن والجلد للتأكد من تحريره من الأحشاء أدناه. استخدم المقص الجراحي لعمل شق قحفي ذيلي بطني في خط الوسط من أسفل البطن إلى الذقن.
- بدءا من شق خط الوسط ، استخدم المقص الجراحي لعمل جروح شعاعية تمتد إلى الأطراف على جانبي الماوس. سحق اللوحات الجلدية مفتوحة.
- لفضح القصبة الهوائية العنقية ، استخدم مقص التشريح لتقسيم الغدد اللعابية عند خط الوسط. القصبة الهوائية تقع في عمق الغدد.
- لفضح القصبة الهوائية الصدرية ، قم بإزالة القص.
- قرصة بلطف ورفع الصفاق بالملقط ، واستخدام مقص لتقسيم الصفاق القحفي الذيلي والجانبي على طول القفص الصدري.
- اسحب الكبد برفق من السطح الذيلي للحجاب الحاجز ، واستخدم المقص لعمل شق صغير في الحجاب الحاجز عند الشق القصي ، وتحديدا على السطح الظهري لعملية الخنجري. هذا يحرر الرئة والقلب من غشاء الجنب الحشوي.
- افصل القفص الصدري عن محتويات الصدر. أدخل المقص في شق الحجاب الحاجز ، وتشريح الجمجمة إلى حزام عنق الرحم. خلال هذا التشريح ، التزم عن كثب بالسطح الظهري للقص لتجنب تلف الأعضاء أدناه. تأكد من أن مستوى التشريح هو الأمامي للقصبة الهوائية.
- قطع الأضلاع على جانبي القص باستخدام مقص ، وإزالة القص. تأكد من تعرض محتويات الصدر.
- كشف المريء البطني. ارفع المعدة برفق من الأمام عن طريق إمساك الغار بالملقط. تشريح الطحال والبنكرياس والمساريق من المعدة والمريء بالمقص.
- كشف المريء الصدري (الشكل 2).
- ارفع القصبة الهوائية برفق على الفور إلى غضروف الغدة الدرقية ، وقم بتشريح المريء من الجانب الظهري من القصبة الهوائية باستخدام مقص القزحية.
- قسم القصبة الهوائية في غضروف الغدة الدرقية بمقص القزحية.
- قشر القصبة الهوائية من بقية المريء عن طريق تشريح دقيق في الاتجاه الذيلي.
- إزالة الرئة والقلب والغدة الصعترية بشكل جماعي مع القصبة الهوائية. احرص على تجنب تلف المريء عند تشريح وتقسيم الشريان الأورطي والوريد الأجوف.
- قسم المعدة عند البواب بالمقص.
- افصل المريء عن الفقرة عن طريق إمساك الغار بالملقط وتشريح الجمجمة.
- قسم المريء على مستوى غضروف الغدة الدرقية ، واحصد المريء والمعدة بشكل جماعي (الشكل 3).
- افصل المعدة والمريء عن طريق تقسيم المريء عند القلب (الشكل 4 ، اللوحة العلوية ، الخط الأحمر).
- تشريح أي لفافة على السطح الخارجي للمريء. لحجز عينة للأنسجة (اختياري) ، قم بإزالة نصف المريء وتقسيمه طوليا بالمقص. ضع المريء السليم المتبقي في برنامج تلفزيوني بارد على الجليد.
- افتح المعدة على طول الانحناء الأكبر ، واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني بما فيه الكفاية. افصل المعدة الأمامية واغسلها ببرنامج تلفزيوني بارد. ضع المعدة الأمامية في برنامج تلفزيوني بارد على الثلج.
- لحصاد اللسان ، قم بإزالة إبرة 21 G على الأنف ، واسحب اللسان بالملاقط. قطع اللسان لأطول فترة ممكنة. ضع اللسان في برنامج تلفزيوني بارد على الجليد.
2. إنشاء ثقافة عضوية مريئية للفأر (MEO)
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لإنشاء مزرعة عضوية لسان الفئران مع إضافة خطوة يتم فيها فرم أنسجة اللسان قبل التربسين. انظر الملاحظة في الخطوة 2.2.3.
- تحضير الكواشف
ملاحظة: يمكن العثور على قائمة بالكواشف في جدول المواد. إعداد وتخزين حلول المخزون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ما لم يذكر خلاف ذلك.- تأكد من تخزين الحصصات ذات الاستخدام الواحد لمصفوفة الغشاء القاعدي (BME) المستخدمة في هذا البروتوكول عند -20 درجة مئوية حتى يوم الاستخدام ، ثم إذابتها على الثلج أو عند 2-8 درجة مئوية ، والاحتفاظ بها على الجليد في جميع الأوقات عندما لا تكون قيد الاستخدام.
- قم بإذابة 250 مجم من مثبطات التربسين لفول الصويا (STI) في 1000 مل من PBS (تركيز مخزون 250 مجم / مل) ، وقم بتعقيمه بالترشيح (0.22 ميكرومتر). قم بتوزيع 50 مل من القسامات في أنابيب مخروطية ، وتخزينها لمدة تصل إلى 6 أشهر عند 4 درجات مئوية.
- تحضير الوسط العضوي للفأر (MOM): مكمل DMEM / F12 المتقدم مع 1 mM N-acetyl-L-cysteine (NAC) ، 2٪ R-Spondin ووسط مكيف Noggin (RN CM) ، 1x N-2 ملحق ، 1x B-27 ملحق ، 10 mM HEPES ، 1x مضاد حيوي مضاد حيوي ، 1x مكمل GlutaMAX ، وعامل نمو بشرة الفأر 100 نانوغرام / مل (mEGF). تحضير MOM 500 مل في وقت واحد ، وتقسيمها إلى 50 مل من القسامات ، وتخزينها في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. أضف 0.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B و 10 ميكرومتر Y-27632 قبل الاستخدام مباشرة.
- قم بتسخين MOM و 0.25٪ من التربسين ومثبطات التربسين من فول الصويا (STI) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو حبة قبل الاستخدام.
- عزل الخلايا الكيراتينية من أنسجة الفأر المشرحة (اعتبار الوقت: 2 ساعة)
- نقل أنسجة المريء إلى 500 ميكرولتر من dispase في PBS (2.5-5 وحدات إجمالا) ، واحتضانها في خلاط حراري لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة.
- انقل الأنسجة إلى طبق مزرعة ، وقم بإزالة طبقة العضلات بعناية من الظهارة باستخدام ملقط (الشكل 4).
ملاحظة: يمكن أيضا تنفيذ هذه الخطوة من قبل باحث متمرس قبل الحضانة مع dispase. - انقل الظهارة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين ، واحتضانها في خلاط حراري لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: إذا كانت المادة الأولية عبارة عن نسيج لسان ، فقم بفرم الأنسجة بمشرط معقم إلى قطع أصغر ، بحجم 1-2 مم2 تقريبا ، قبل إضافة التربسين. - جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لمدة 5-10 ثوان عند 2000 × جم لحبيبات الأنسجة. تحضير أنبوب مخروطي 50 مل مع مصفاة خلية 100 ميكرومتر. انقل تعليق الأنسجة / الخلايا من خلال المصفاة بطرف تجويف عريض باستخدام حركات دائرية.
- أضف 3 مل من الأمراض المنقولة جنسيا من خلال المصفاة ، باستخدام حركات دائرية للغسل.
- افرك المصفاة بقاعدة مكبس حقنة السلين سعة 1 مل لدفع الخلايا من خلالها.
- اغسل المصفاة ب 3 مل من PBS 3-5 مرات ، وفرك المصفاة بقاعدة المحقنة بين الغسلات.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وترك 1 مل من المحلول في الأنبوب.
- أعد تعليق الحبيبات في 1 مل المتبقية ، وانقل تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا.
- إعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من MOM ؛ اضبط مستوى الصوت حسب الحاجة. قم بإجراء عدد تلقائي للخلايا عن طريق استبعاد trypan blue.
- بذر تعليق الخلية الأولي (اعتبار الوقت: <1 ساعة)
- قم بتسخين صفيحة استزراع خلايا مكونة من 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
- لوحة 5000 خلية قابلة للحياة في 75٪ (v / v) BME / MOM مع حجم إجمالي 50 ميكرولتر لكل بئر. قم بزيادة عدد الآبار المطلية إلى أقصى حد وقم بإعداد خلايا كافية في BME لبئر إضافي واحد وفقا لحسابات المثال أدناه.
ملاحظة: حفظ أي خلايا زائدة في وسط الحفظ بالتبريد (10٪ DMSO في FBS) بتركيز أقصى يبلغ 1 × 106 خلايا / مل. قم بتخزين الكريوفيال في وعاء تجميد طوال الليل عند -80 درجة مئوية. نقلها إلى النيتروجين السائل في مرحلة البخار للتخزين على المدى الطويل. - في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، قم بإعداد تخفيف مناسب للخلية في MOM أولا ، ثم أضف BME باستخدام طرف تجويف عريض قبل الطلاء مباشرة.
- باستخدام طرف تجويف عريض 200 ميكرولتر ، أضف ببطء قطرة 50 ميكرولتر إلى وسط البئر ، وتجنب الاتصال بين الطرف وأسفل أو جوانب البئر (الشكل 5). احرص على عدم استخدام الكثير من القوة لطرد السائل من الحافة ، وإلا ستسطح القبة.
- اسمح ل BME بالتصلب لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة نسبية (RH).
- أضف بعناية 500 ميكرولتر من MOM لكل بئر مكمل ب 0.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B و 10 ميكرومتر Y-27632.
ملاحظة: أضف الأمفوتريسين إلى جميع MOM في جميع أنحاء الثقافة الأولية الأولية. أضف Y-27632 فقط في يوم المرور (اليوم 0) لجميع الممرات. - قم بتغيير MOM في الأيام 3-4 ثم كل 2-3 أيام بعد ذلك حتى تصبح جاهزة للمرور.
- في الأيام 7-10 ، قم بتصوير الكائنات العضوية ، وقم بقياس معدل تكوين الأعضاء (OFR) بقسمة عدد الكائنات العضوية التي تشكلت على عدد الخلايا المصنفة في البداية.
أمثلة على العمليات الحسابية:
- تمرير وحفظ عضويات المريء للفأر (MEOs) بالتبريد (اعتبار الوقت: <1.5 ساعة)
- قم بإذابة الجليد والحفاظ على BME على الجليد. يسخن MOM و 0.05٪ من التربسين والأمراض المنقولة جنسيا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو خرز قبل الاستخدام. قم بتسخين صفيحة استزراع خلايا مكونة من 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
- باستخدام طرف ماصة عريض التجويف ، اجمع المواد العضوية في قبة BME جنبا إلى جنب مع المادة الطافية. قم بتعطيل BME عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
ملاحظة: ادمج الآبار التي تحتوي على عينات متطابقة في أنبوب طرد مركزي واحد دقيق. - جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لمدة 10-15 ثانية عند 2000 × جم لحبيبات المواد العضوية. قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية.
- قم بإزاحة الحبيبات برفق ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين.
- احتضان الأنبوب (الأنابيب) في خلاط حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
- قم بتعطيل التربسين ب 600 ميكرولتر من الأمراض المنقولة جنسيا.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا.
- قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من MOM. قم بإجراء عدد تلقائي للخلايا عن طريق استبعاد trypan blue.
ملاحظة: يمكن ضبط مستوى الصوت حسب الحاجة. - لوحة 2000-5000 خلية قابلة للحياة في 75٪ (v / v) BME / MOM مع حجم إجمالي 50 ميكرولتر لكل بئر. تعظيم عدد الآبار المطلية وإعداد خلايا كافية في BME لبئر إضافي واحد وفقا لحسابات المثال المذكورة سابقا.
ملاحظة: حفظ أي خلايا زائدة في وسط الحفظ بالتبريد (10٪ DMSO في FBS) بتركيز أقصى يبلغ 1 × 106 خلايا / مل. قم بتخزين الكريوفيال في وعاء تجميد طوال الليل عند -80 درجة مئوية. نقلها إلى النيتروجين السائل في مرحلة البخار للتخزين على المدى الطويل. - في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، قم بإعداد تخفيف مناسب للخلية في MOM أولا ، ثم أضف BME باستخدام طرف تجويف عريض قبل الطلاء مباشرة.
- باستخدام طرف تجويف عريض 200 ميكرولتر ، أضف ببطء قطرة 50 ميكرولتر إلى وسط البئر ، وتجنب الاتصال بين الطرف وأسفل أو جوانب البئر. احرص على عدم استخدام الكثير من القوة لطرد السائل من الحافة ، وإلا ستسطح القبة.
- احتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2,95٪ RH.
- أضف بعناية 500 ميكرولتر من MOM لكل بئر تستكمل ب 10 ميكرومتر Y-27632.
ملاحظة: أضف Y-27632 فقط في يوم المرور (اليوم 0). ليس من الضروري إضافته أثناء تغييرات الوسائط. إضافة الأمفوتريسين B لم يعد ضروريا. - قم بتغيير MOM في الأيام 3-4 ثم كل 2-3 أيام بعد ذلك حتى تصبح جاهزة للمرور.
- في الأيام 7-10 ، قم بتصوير المواد العضوية وقياس OFR.
- ذوبان واستعادة عضويات المريء الفأر (MEOs) (اعتبار الوقت: <1 ساعة)
- قم بإذابة الجليد والحفاظ على BME على الجليد. قم بتسخين صفيحة استزراع خلايا مكونة من 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
- تحضير 10 مل من البرد أو RT MOM أو PBS في أنبوب مخروطي 15 مل.
- قم بإذابة الجليد في حمام مائي أو حمام خرز بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة تقريبا أو حتى تبقى حبيبات ثلج صغيرة.
- باستخدام طرف ماصة مبلل مسبقا ، انقل تعليق الخلية ببطء إلى الأنبوب الذي يحتوي على MOM أو PBS بطريقة قطرة.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا.
- قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية. إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من MOM ؛ اضبط مستوى الصوت حسب الحاجة. قم بإجراء عدد تلقائي للخلايا عن طريق استبعاد trypan blue.
- لوحة 5000-10000 خلية قابلة للحياة في 75٪ (v / v) BME / MOM مع حجم إجمالي 50 ميكرولتر لكل بئر. تعظيم عدد الآبار المطلية وإعداد خلايا كافية في BME لبئر إضافي واحد وفقا لأمثلة الحسابات المذكورة سابقا.
- استمر في الخطوات المتبقية من بروتوكول المرور والحفظ بالتبريد لعضويات المريء الفأرية (MEO) (انظر الخطوة 2.4.11).
3. تحضير المواد العضوية لتضمين البارافين (اعتبار الوقت: <1 ساعة [بالإضافة إلى 1.5 ساعة لإعداد الكاشف])
- باستخدام طرف micropipette واسع التجويف ، اجمع ثلاثة آبار لكل أنبوب طرد مركزي دقيق. اجمع المواد العضوية في قبة BME مع المادة الطافية. قم بتعطيل BME عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
- جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لمدة 10-15 ثانية عند 2000 × جم لحبيبات المواد العضوية. قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية.
- قم بإزاحة الحبيبات برفق ، وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA).
- ثبت المواد العضوية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لمدة 10-15 ثانية عند 2000 × جم لحبيبات المواد العضوية. قم بإزالة وتجاهل أكبر قدر ممكن من PFA.
- قم بإزاحة الحبيبات برفق ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS.
ملاحظة: يمكن تخزين المواد العضوية الثابتة عند 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. - تحضير مخزون 50 مل من هلام أجار (2٪ أجار بالإضافة إلى 2.5٪ جيلاتين).
ملاحظة: قم بإعداد مخزون هلام أجار مقدما ، بسبب وقت الحضانة ، متبوعا بتنفيذ دورة الأوتوكلاف.- أعد تعليق 1 جم من باكتو أجار و 1.25 جم من الجيلاتين في 50 مل من الماء في دورق زجاجي سعة 150 مل قابل للتعتيم.
- قم بتدوير التعليق ، واتركه لمدة 30-60 دقيقة في RT.
- الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
- تبرد قليلا وتوزع 5 مل من القسامات في أنابيب مخروطية سعة 15 مل.
- يخزن لمدة تصل إلى 6 أشهر في RT.
- قم بإعداد سطح التضمين عن طريق قلب رف أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتغطية السطح بورقة من فيلم الختم. التسمية مع معرف (معرفات) العضوية المقابلة.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق لحبيبات المواد العضوية. قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية.
- في هذه الأثناء ، قم بتسييل هلام الآجار عن طريق وضع أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على هلام أجار في دورق زجاجي سعة 150 مل يحتوي على 100 مل من الماء ووضعه في الميكروويف على أعلى إعداد للطاقة لمدة 1-2 دقيقة أو حتى يبدأ الماء في الغليان ويكون جل الآجار في حالة سائلة.
تنبيه: قم بفك غطاء الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على هلام أجار قبل وضعه في الميكروويف. - قم بغمر أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على الحبيبات العضوية جزئيا في الماء الدافئ دون إدخال أي ماء في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- تراكب بعناية بيليه عضوي عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من أجار أسفل جانب الأنبوب.
- دون إزعاج الحبيبات (لا تستعيد ، حافظ على الحبيبات سليمة) ، انقل الحبيبات الموجودة في قطرة هلام أجار إلى فيلم الختم على سطح التضمين.
- كرر الخطوتين 3.12 والخطوة 3.13 مع 50 ميكرولتر إضافية من هلام أجار السائل لجمع أي حبيبات عضوية متبقية ، وأضفها بعناية إلى نفس قطرة الجل.
- احتضان القطيرة التي تحتوي على الحبيبات العضوية لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- باستخدام ملقط ، انقل بعناية القطرة التي تحتوي على الحبيبات العضوية إلى شريط علم الأمراض المسمى.
- تخزين الكاسيت في 70٪ من الإيثانول عند 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر.
- المضي قدما في تضمين البارافين عن طريق المعالجة النسيجية الروتينية لإعداد كتل البارافين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول عملية توليد عضويات المريء الفأر (MEOs) من أنسجة المريء الطبيعية أو أنسجة ورم ESCC من الفئران المعالجة ب 4NQO وفقا لنظام علاج محدد يتكون من 16 أسبوعا من 4NQO تدار في مياه الشرب ، تليها فترة مراقبة من 10 أسابيع إلى 12 أسبوعا (الشكل 1). ثم يتم القتل الرحيم للفئران لتشريح اللسان أو أنسجة المريء (الشكل 2 والشكل 3). نصف طريقة لعزل الطبقة الظهارية عن المريء السليم (الشكل 4) لاستخدامها في عزل الخلية الواحدة اللاحق. يتم طلاء الخلايا الظهارية المشتقة من المريء في البداية ب 5000 خلية لكل بئر في قطرات 50 ميكرولتر تحتوي على خلايا في مصفوفة غشاء قاعدي ووسط زراعة خلية خال من المصل جيد المواصفات (الشكل 5) ويسمح لها بتكوين عضويات على مدار 7-10 أيام في المتوسط. يمكن تمييز عضويات المريء واللسان والمعدة الأمامية عن طريق التحليل المورفولوجي عن طريق تصوير تباين الطور / برايتفيلد وعلم أمراض الأنسجة (الشكل 6). يمكن تقييم قدرة التجديد الذاتي للعضويات عن طريق تحديد OFR على الثقافة الفرعية (الشكل 7). يتأثر OFR إلى حد كبير بمحتوى الخلايا القاعدية التكاثرية ، كما يتضح من تحليل حركية النمو إلى جانب مورفولوجيتها (الشكل 8). أخيرا ، تنمو هذه الكائنات العضوية ، بما في ذلك الهياكل الطبيعية من الفئران غير المعالجة 4NQO ، بشكل مستمر ويمكن الحفاظ عليها لفترة طويلة (الشكل 9).
الشكل 1: نظام علاج 4NQO. يتم التعامل مع الفئران مع 4NQO في مياه الشرب لمدة 16 أسبوعا ، تليها فترة مراقبة من 10 أسابيع إلى 12 أسبوعا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تعريض المريء الصدري. يتم تقشير القصبة الهوائية (الخطوط الزرقاء) بعيدا عن المريء (خطوط بيضاء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المريء (خطوط بيضاء) متصلة بالمعدة (خطوط صفراء) عند الوصلة العمودية الحرشفية (الخط الأزرق). الاختصارات: FS = المعدة الأمامية ، DS = المعدة البعيدة ، L = الكبد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فصل المعدة والمريء وعزل الظهارة. الجزء العلوي: يتم فصل المعدة عن المريء. يشير الخط الأحمر إلى المكان الذي يجب فصل المريء فيه أثناء التشريح. الوسط: يتم تقشير الظهارة (الخط الأبيض) بعيدا عن طبقة العضلات. السفلي: المريء الذي يحمل الأورام وفقا لجدول العلاج الموصوف في الشكل 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: طلاء قطرة BME التي تحتوي على خلايا مفردة باستخدام طرف تجويف عريض. تبدأ الكائنات العضوية في التكون في حوالي الأيام 4-7 وتكون جاهزة للمرور بعد 7-10 أيام في المتوسط. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: توصيف الكائنات العضوية عن طريق التحليل المورفولوجي. (أ) صور تمثيلية للوحدات البحرية العادية والبيئية والاجتماعية والبيئية. أعلى اليسار: صورة برايتفيلد ل MEO عادي. أسفل اليسار: تلطيخ H& E ل MEO عادي. أعلى اليمين: صورة Brightfield ل ESCC MEO من ماوس معالج ب 4NQO. أسفل اليمين: تلطيخ H&E ل ESCC MEO من فأر معالج ب 4NQO يظهر اللانمطية النووية والتقرن المفاجئ ، وهذا الأخير يذكرنا بلؤلؤة الكيراتين ، ويمثل حجرة متمايزة جيدا داخل ورم SCC. (ب) صور تمثيلية لسان الفأر الطبيعي وعضويات المعدة الأمامية (MTO و MFO ، على التوالي). أعلى اليسار: صورة برايتفيلد ل MTO عادي. أسفل اليسار: تلطيخ H& E ل MTO عادي. أعلى اليمين: صورة برايتفيلد ل MFO عادي. أسفل اليمين: تلطيخ H& E ل MFO عادي. جميع أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: تحديد قدرة التجديد العضوي. (أ) تصميم تجريبي لتحديد قدرة التجديد العضوي حسب الثقافة الفرعية. يتم فصل الكائنات العضوية الأولية المتنامية (P0) في نقاط زمنية مختلفة وتحويلها إلى معلقات أحادية الخلية. يتم تمرير هذه الخلايا لتحديد OFR في اليوم 7 في الثقافة الفرعية (P1). (ب) بيانات OFR التمثيلية من MEOs المارة الناتجة عن الفئران غير المعالجة 4NQO. لاحظ أن OFR يتناقص كدالة للوقت ، مما يعكس انخفاض الخلايا القاعدية التكاثرية في الكائنات العضوية الناضجة ، والتي تحتوي على المزيد من الخلايا التي خضعت للتمايز الطرفي بعد الانقسام (انظر الشكل 8). p < 0.001 (n = 6) OFR في اليوم 7 واليوم 11 واليوم 21 مقابل OFR في اليوم 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: حركية نمو الكائنات العضوية كما يتضح من مورفولوجيتها في نقاط زمنية مختلفة. يتم عرض صور تمثيلية للمجال الساطع وتلطيخ H& E ل MEO طبيعي من الفئران غير المعالجة 4NQO. لاحظ أن التقرن في النواة الداخلية للعضويات يصبح بارزا بحلول اليوم 10. تبقى الخلايا القاعدية التكاثرية في طبقة الخلايا الخارجية حتى في اليوم 14 واليوم 21. بالنسبة للكيمياء المناعية / التألق المناعي ، قد يتسبب الكيراتين المتراكم في تلطيخ غير محدد ، كما هو الحال بالنسبة للأنسجة الظهارية الحرشفية الأصلية ، مما يستدعي تحسينا دقيقا لظروف التلوين والضوابط (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة الثانوية فقط) ، وتفسير البيانات. جميع أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 9: منحنى مضاعفة عدد السكان ل MTO طبيعي تمثيلي تم إنشاؤه من الفئران غير المعالجة 4NQO. تم إنشاء هذه المواد العضوية مسبقا وحفظها بالتبريد وإذابتها لإظهار نموها المطرد عبر مقاطع متعددة وثقافة طويلة الأجل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من الخطوات والاعتبارات الحاسمة لتوليد وتحليل MEOs في البروتوكولات الموضحة هنا. لضمان قابلية التكرار والدقة في تجارب MEO ، تعد النسخ المتماثلة البيولوجية والتقنية مهمة. بالنسبة للتكرارات البيولوجية ، فإن اثنين إلى ثلاثة فئران مستقلة تحمل ESCC كافية بشكل عام لكل حالة تجريبية. ومع ذلك ، قد يختلف العدد المناسب من النسخ المتماثلة البيولوجية اعتمادا على المعلمات التي سيتم اختبارها في الدراسات الفردية. على سبيل المثال ، من غير المعروف حاليا مدى اكتشاف المواد العضوية الورمية في وقت مبكر وعدد المرات التي يمكن اكتشافها من الفئران المعالجة ب 4NQO دون آفات مرئية مجهريا أو آفات IEN و ESCC النسيجية. على الرغم من أن 4NQO يحفز آفات المريء في سلالات الفئرانالمختلفة 14 ، فقد تم إنشاء MEOs من الفئران C57BL / 6 فقط. يتم تسريع تطور وتطور ESCC في الفئران المصابة بآفات وراثية معدلة وراثيا مثل فقدان Trp53 والتعبير المفرط للسيكلين D17،14،15. في مثل هذه الفئران ، قد تظهر MEOs الورمية بشكل متكرر وأبكر من الفئران من النوع البري C57BL / 6 أثناء أو بعد علاج 4NQO. إذا لزم الأمر ، يجب إجراء دراسات تجريبية لتقدير حجم العينة المناسب من الفئران في التجارب المخطط لها. مع لوحات زراعة الخلايا متعددة الآبار ، يتم إنشاء النسخ المتماثلة التقنية (n = 3-6) بسهولة. ومع ذلك ، هناك ما يبرر السحب الدقيق والممارسة لتقليل التباين من بئر إلى بئر حيث يتم الاستغناء عن الخلايا في وسط لزج يحتوي على BME.
يمكن توقع معدل نجاح يقترب من 100٪ لإنشاء MEO في البروتوكولات الموصوفة. ومع ذلك ، تعتمد ثقافة MEO الناجحة على صلاحية الخلايا الظهارية المريئية المعزولة الأولية ، والتي ترتبط إلى حد كبير بجودة المواد الأولية. عندما لا يمكن تشريح الفئران على الفور عند القتل الرحيم ، يمكن الاحتفاظ بالجثث عند 4 درجات مئوية طوال الليل لعزل المريء في اليوم التالي. ومع ذلك ، لا ينبغي تجميد الذبائح ، لأن الأنسجة المجمدة لن تنتج خلايا قابلة للحياة. يمكن حفظ الخلايا الظهارية المريئية المنفصلة بالتبريد كتعليق أحادي الخلية في وسط تجميد (90٪ FBS و 10٪ DMSO) وتخزينها في النيتروجين السائل لتوليد المواد العضوية في وقت لاحق. قد يتم حفظ المريء (الصفائح الظهارية) بالتبريد بطريقة مماثلة ، وإن كان ذلك على النحو الأمثل. بينما يمكن بدء MEOs بالخلايا المنقاة عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) وطرق أخرى لتنقية مجموعات فرعية فريدة من الخلايا الظهارية المريئية ، قد تتضاءل صلاحية الخلية بعد التنقية. وتجدر الإشارة إلى أن مقايسات صلاحية الخلية مثل اختبار استبعاد التريبان الأزرق يمكن أن تميز الخلايا الحية عن الخلايا الميتة ولكن ليس الخلايا الميتة ، وبالتالي التقليل من صلاحية الخلية قبل بدء زراعة الأعضاء العضوية. بعد التأسيس ، يمكن تمرير MEOs من كل من الفئران المعالجة وغير المعالجة ب 4NQO إلى أجل غير مسمى (>20 مقطعا) ، مع توقع قابلية >80٪ في كل مقطع في الوسط المحدد. من الجدير بالذكر أن هناك مكونات متوسطة عضوية لا تزال متطلباتها غير واضحة. Zheng et al. أظهر مؤخرا أن المكمل الذي يشتمل على Wnt3A و RSpondin-1 و Noggin مطلوب لزراعة عضويات المريءالفئرانية 16. ومع ذلك ، فإننا لا نستخدم Wnt3A في هذا البروتوكول حيث تنمو الكائنات العضوية من اللسان والمريء والمعدة الأمامية ويمكن تمريرها عدة مرات (> 10 ممرات) بدونها7،3،17. تجدر الإشارة إلى أن متطلبات هذه العوامل لم يتم اختبارها بشكل فردي.
تستخدم الصفائح الظهارية لتوليد MEOs من المريء الطبيعي أو الغشاء المخاطي للمريء بدون آفات مرئية مجهريا مثل الأورام. يسمح استخدام الألواح الظهارية بإثراء الخلايا الظهارية كمواد أولية. ومع ذلك ، فإن عزل الصفائح الظهارية من الغشاء المخاطي المريئي الحامل للورم أمر صعب بسبب غزو ESCC في المقصورات تحت الظهارية. يمكن استخدام المريء بأكمله لبدء زراعة MEO ، على الرغم من أن وجود مجموعات الخلايا غير الظهارية قد يقلل من معدل تكوين الأعضاء (OFR) في الثقافة الأولية. من المتوقع أن يرتفع OFR في المقاطع اللاحقة ، حيث تسمح ظروف زراعة MEO الحالية للخلايا الظهارية بالنمو داخل BME. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن أيضا تطبيق البروتوكولات الموضحة هنا على الأعضاء الأخرى ، وخاصة اللسان الفموي والمعدة الأمامية ، وكلاهما عرضة لسرطان الخلايا الحرشفية الناجم عن 4NQO. من الجدير بالذكر أننا أنشأنا عضويات لسان الفأر (MTOs) وعضويات المعدة الأمامية للفأر (MFOs) من الأنسجة بأكملها دون عزل الخلايا الظهارية. إذا لزم الأمر ، يمكن صنع هذه الكائنات العضوية من مجموعة فرعية من الخلايا الظهارية المنقاة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (على سبيل المثال ، الخلايا الجذعية السرطانية التي تتميز بتعبير CD44 مرتفع ، خلايا جذعية مريئية مفترضة CD73 +).
بالإضافة إلى ذلك ، قد تهاجر الخلايا غير الظهارية ، والخلايا الليفية على وجه الخصوص ، من BME لتنمو في طبقة أحادية على السطح البلاستيكي ، مما يسمح بإنشاء متزامن للخلايا الليفية المريئية للفأرة ، بما في ذلك الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. قد تحد انتقائية نمو الخلايا الظهارية في 3D BME من الزراعة المشتركة ل MEOs مع الخلايا المناعية وأنواع الخلايا الأخرى في ظل الظروف الحالية الموصوفة هنا. يجري تحسين تجارب الثقافة المشتركة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تلخيص الجبهة الغازية للورم بشكل أفضل في الواجهة الظهارية اللحمية التي تم تصميمها بواسطة طرق ثقافة ثلاثية الأبعاد بديلة مثل ثقافة 3D العضوية 8,18. علاوة على ذلك ، قد لا تكون MEOs منصة مناسبة لقياس وظيفة الحاجز الظهاري ، والتي يمكن تقييمها بشكل أفضل من خلال استخدام ثقافة واجهة الهواء والسائل لتقييم المقاومة الكهربائية عبر الظهارة19،20،21.
الميزة الأولى ل MEOs ، وفي الواقع MTOs و MFOs ، هي النمو السريع للهياكل المشتقة من خلية واحدة والتي تلخص الهياكل الظهارية الأصلية ، الحميدة والخبيثة. يقدر وقت المضاعفة (DT) لهذه الكائنات العضوية عادة ب <20 ساعة. توضح حركية النمو ل MTOs العادية من الفئران غير المعالجة 4NQO كلا من القدرة على الاستزراع طويل الأجل للعضويات العادية ، بالإضافة إلى مستوى مضاعفة السكان المتوقع (PD) و DT (الشكل 9). في هذا المثال ، حدث ما يقرب من 10 تضاعف سكاني خلال كل مقطع ، مع DT محسوب يبلغ 18.5 ساعة و 18.3 ساعة ، في المتوسط. بعد الاستزراع الأولي الأولي، من المتوقع عادة حدوث OFR بنسبة 15٪ -25٪، بغض النظر عن كثافة البذر، وقد تظهر MEOs في وقت مبكر من اليوم 4 (الشكل 8)، على الرغم من أنها قد تكون أصغر في الحجم. تحت المجهر على النقيض من الطور ، تعرض الكائنات العضوية من الغشاء المخاطي المريئي الطبيعي هياكل كروية ذات أسطح ناعمة. كدالة للوقت ، تعرض الكائنات العضوية العادية بنية متحدة المركز حيث تخضع كتلة الخلية الداخلية للتمايز الطرفي بعد الانقسام ، مما يولد تدرجا تمايزيا يحاكي الظهارة الحرشفية الطبقية. تظهر الكائنات العضوية الورمية أسطحا غير منتظمة ، مما يعكس النشاط التكاثري العالي للخلايا البازالويد ، والتي قد تتوسع بطريقة خارجية. يمكن استخدام قدرة MEOs على عرض تدرج تمايز الانتشار لدراسة كيفية انتشار الخلايا الكيراتينية القاعدية المريئية التكاثرية والخضوع للتمايز الطرفي بعد الانقسام. من خلال الاستزراع الفرعي لخلايا MEO المنفصلة ، يمكن للمرء تقييم التجديد الذاتي للخلايا الظهارية (الشكل 7) ، وكذلك التجديد أو التحول تحت الإجهاد السمي الجيني الناجم عن 4NQO. يمكن أيضا إجراء دراسات مماثلة باستخدام نموذج MTO في سياق سرطان الفم ، مما يوسع نطاق تطبيق نموذج الفأر العضوي 4NQO الموصوف على الرأس والرقبة SCC. في حين أن التجديد الظهاري قد يعني الخلايا الجذعية ، فإن أحد نقاط الضعف المحتملة لنظام MEO هو أنه قد لا يكتشف الخلايا الجذعية الهادئة أو التي نادرا ما تنقسم ، حيث يعتمد تكوين MEO على تكاثر الخلايا. قدمت دراسة تحليل حديثة للخلية الواحدة على MEOs نظرة ثاقبة حول عدم تجانس الخلايا الظهارية المريئية22.
يمكن تقييم التحول الخبيث من خلال التقييم المورفولوجي الدقيق لهياكل MEO الفردية واللانمطية النووية للخلايا التي تتكون منها MEOs. قد يكشف التنميط الجزيئي ل MEOs عن طريق تسلسل الإكسوم الكامل وتسلسل الحمض النووي الريبي عن الطبيعة المميزة للآفات قبل الورمية و ESCC. ومع ذلك ، قد يتطلب الاختبار النهائي للتحول الخبيث زرع MEOs في الفئران التي تعاني من نقص المناعة أو الكفاءة المناعية لتوثيق ورم خلايا ESCC. قد توفر ESCC MEOs المزروعة في الفئران ذات الكفاءة المناعية الاصطناعية أيضا منصة ممتازة للتحقيق في البيئة المكروية المناعية للورم.
تطبيقات MEOs واسعة. إلى جانب التشكل والكيمياء الحيوية والنهج متعددة الأوميكس ، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي ليس فقط لتحليل العمليات الخلوية مثل تخليق الحمض النووي ، وموت الخلايا المبرمج ، والالتهام الذاتي ، وتنفس الميتوكوندريا ولكن أيضا علامات سطح الخلية التي تحدد مجموعات فرعية فريدة من الخلايا داخل MEOs المقابلة للتعديلات الجينية والدوائية خارج الجسم الحي 7,23 . علاوة على ذلك ، يمكن استخدام المواد العضوية في تجارب الاستزراع المشترك لتقييم التفاعلات بين الخلايا الظهارية والسدى أو الخلايا المناعية أو حتى الميكروبيوم24. أخيرا ، يمكن إنشاء MEOs من الفئران التي تحمل تعديلات جينية يمكن تتبعها من سلالة الخلايا ، مثل بروتين مراسل الفلورسنت المعبر عنه تحت محفز تنظيمي جيني خاص بنوع الخلية (على سبيل المثال ، Sox2 ، cytokeratins Krt5 ، و Krt15) 3،4،7،25.
باختصار ، تعد MEOs أداة لا تقدر بثمن لدراسة ESCC. تهدف البروتوكولات الموصوفة هنا إلى إظهار أن MEOs تمثل نموذجا متعدد الاستخدامات يسهل نسبيا توليده وصيانته وتوصيفه ولديه القدرة على تلخيص ميزات ESCC وأورام المريء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الموارد المشتركة (قياس التدفق الخلوي ، وعلم الأمراض الجزيئي ، والفحص المجهري البؤري والمتخصص) في مركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان في جامعة كولومبيا على الدعم الفني. نشكر الدكاترة آلان ديهل وآدم جيه باس وكوك كين وونغ (آليات NCI P01 لسرطان المريء) وأعضاء مختبرات روستي وناكاجاوا على المناقشات المفيدة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة التالية: P01CA098101 (H.N. و A.K.R.) ، R01DK114436 (H.N.) ، R01AA026297 (H.N.) ، L30CA264714 (SF) ، DE031112-01 (F.M.H.) ، KL2TR001874 (F.M.H.) ، 3R01CA255298-01S1 (JG) ، 2L30DK126621-02
(ج.ج.) R01CA266978 (C.L.) و R01DK132251 (C.L.) و R01DE031873 (C.L.) و P30DK132710 (CM و H.N.) و P30CA013696 (A.K.R.). حصل H.N. و C.L. على جائزة مركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان Multi-PI Pilot من جامعة كولومبيا. حصل H.N. على جائزة صندوق فانكوني لأبحاث فقر الدم. حصل F.M.H. على جائزة مؤسسة مارك لأبحاث السرطان (20-60-51-MOME) وجائزة الجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان. حصل JG على جائزة الجمعية الأمريكية لأمراض الجهاز الهضمي (AGA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B.
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
