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Cancer Research

3 डी ऑर्गेनोइड्स में ओरल-एसोफैगल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा मॉडलिंग

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64676
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1,3, 4, 1,2, 1,5, 1,6, 1,7, 1,5, 1,2,5
1Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 2Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, 3Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, 4Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, 5Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, 6Department of Genetics and Development, Columbia University, 7Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल म्यूरिन मौखिक-एसोफैगल 3 डी ऑर्गेनोइड्स को उत्पन्न करने और चिह्नित करने के लिए प्रमुख चरणों का वर्णन करता है जो रासायनिक कार्सिनोजेनेसिस के माध्यम से प्रेरित सामान्य, प्रीनोप्लास्टिक और स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा घावों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Abstract

एसोफेजेल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ईएससीसी) दुनिया भर में प्रचलित है, जो हर साल सभी एसोफैगल कैंसर के मामलों का 90% हिस्सा है, और सभी मानव स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में सबसे घातक है। ईएससीसी दीक्षा और विकास के साथ आणविक परिवर्तनों को परिभाषित करने में हालिया प्रगति के बावजूद, रोगी का पूर्वानुमान खराब रहता है। इन आणविक परिवर्तनों का कार्यात्मक एनोटेशन आवश्यक अगला कदम है और ऐसे मॉडल की आवश्यकता होती है जो दोनों ईएससीसी की आणविक विशेषताओं को पकड़ते हैं और कार्यात्मक एनोटेशन के लिए आसानी से और सस्ते में हेरफेर किया जा सकता है। तंबाकू के धुएं के साथ इलाज किए गए चूहे मिमेटिक 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड (4एनक्यूओ) अनुमानित रूप से ईएससीसी और एसोफैगल प्रीनोप्लासिया बनाते हैं। ध्यान दें, 4NQO घाव मौखिक गुहा में भी उत्पन्न होते हैं, आमतौर पर जीभ में, साथ ही साथ फोरडोमैक, जो सभी स्तरीकृत स्क्वैमस एपिथेलियम को साझा करते हैं। हालांकि, इन चूहों को कार्यात्मक परिकल्पना परीक्षण के लिए केवल हेरफेर नहीं किया जा सकता है, क्योंकि इसोजेनिक माउस मॉडल उत्पन्न करना समय और संसाधन-गहन है। यहां, हमने मुराइन ईएससीसी या प्रीनियोप्लास्टिक कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए 4एनक्यूओ के साथ इलाज किए गए चूहों से एकल सेल-व्युत्पन्न त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड उत्पन्न करके इस सीमा को दूर किया। ये ऑर्गेनोइड ईएससीसी और एसोफेजेल प्रीनोप्लासिया की मुख्य विशेषताओं को पकड़ते हैं, सस्ते में और जल्दी से इसोजेनिक मॉडल बनाने के लिए लाभ उठाया जा सकता है, और सिंजेनिक प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि सामान्य, प्रीनियोप्लास्टिक और एससीसी मुराइन एसोफैगल ऊतक से 3 डी ऑर्गेनोइड्स कैसे उत्पन्न करें और इन ऑर्गेनोइड्स को बनाए रखें और क्रायोप्रिजर्व करें। इन बहुमुखी ऑर्गेनोइड्स के अनुप्रयोग व्यापक हैं और इसमें आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का उपयोग और फ्लो साइटोमेट्री या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा आगे के लक्षण वर्णन, सीआरआईएसपीआर प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके आइसोजेनिक ऑर्गेनॉइड लाइनों की पीढ़ी और दवा स्क्रीनिंग या सिंजेनिक प्रत्यारोपण शामिल हैं। हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शित तकनीकों को व्यापक रूप से अपनाने से ईएससीसी के गंभीर बोझ का मुकाबला करने के लिए इस क्षेत्र में प्रगति में तेजी आएगी।

Introduction

एसोफेजेल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ईएससीसी) मानव स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा का सबसे घातक है, इसके देर से निदान, चिकित्सा प्रतिरोध और मेटास्टेसिस 1,2 के कारण। ईएससीसी स्तरीकृत स्क्वैमस एपिथेलियम से उत्पन्न होता है, जो अन्नप्रणाली की ल्यूमिनल सतह को रेखाबद्ध करता है। स्क्वैमस एपिथेलियम में प्रोलिफेरेटिव बेसल कोशिकाएं और सुप्राबेसल सेल परत के भीतर विभेदित कोशिकाएं शामिल हैं। शारीरिक स्थितियों के तहत, बेसल कोशिकाएं पी 63, सॉक्स 2, और साइटोकेराटिन के 5 और के 14 जैसे मार्करों को व्यक्त करती हैं, जबकि विभेदित कोशिकाएं के 4, के 13 और आईवीएल को व्यक्त करती हैं। बेसल कोशिकाएं स्वयं विषम होती हैं और इसमें के 15 3 और सीडी73 4 जैसे मार्करों द्वारा परिभाषित कथित स्टेम सेल शामिल होते हैं। होमियोस्टैसिस में, बेसल कोशिकाएं सुप्राबेसल सेल परत के भीतर पोस्ट-माइटोटिक टर्मिनल भेदभाव से गुजरती हैं, जबकि विभेदित कोशिकाएं उपकला नवीकरण को पूरा करने के लिए लुमेन में प्रवास और निर्जलीकरण करती हैं। मूल की उनकी कोशिकाओं की याद दिलाते हुए, ईएससीसी स्क्वैमस सेल भेदभाव को अलग-अलग डिग्री तक प्रदर्शित करता है। ईएससीसी अक्सर मल्टीफोकल हिस्टोलॉजिकल अग्रदूत घावों के साथ होता है, जिसे इंट्राएपिथेलियल नियोप्लासिया (आईईएन) या डिस्प्लेसिया के रूप में जाना जाता है, जिसमें एटिपिकल बेसलॉइड कोशिकाएं शामिल होती हैं। उपकला परिवर्तनों के अलावा, ईएससीसी उपउपकला डिब्बे के भीतर ऊतक रीमॉडेलिंग प्रदर्शित करता है, जहां कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) की सक्रियता और प्रतिरक्षा / भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती ट्यूमर को बढ़ावा देने वाले माइक्रोएन्वायरमेंट को बढ़ावा देने के लिए होती है।

ईएससीसी के रोगजनन में आनुवंशिक परिवर्तन और पर्यावरणीय जोखिम कारकों के संपर्क में आना शामिल है। प्रमुख आनुवंशिक घावों में ट्यूमर सप्रेसर जीन टीपी 53 और सीडीकेएन 2 ए (पी 16 आईएनके 4 ए) की निष्क्रियता और सीसीएनडी 1 (साइक्लिन डी 1) और ईजीएफआर ऑन्कोजीन की सक्रियता शामिल है, जो बिगड़ा हुआ सेल चक्र चेकपॉइंट फ़ंक्शन, असामान्य प्रसार और पर्यावरणीय कार्सिनोजेन्स के संपर्क से संबंधित जीनोटॉक्सिक तनाव के तहत जीवित रहने में समाप्त होता है। दरअसल, आनुवंशिक परिवर्तन व्यवहार और पर्यावरणीय जोखिम कारकों के साथ निकटता से बातचीत करते हैं, आमतौर पर तंबाकू और शराब का उपयोग। तंबाकू के धुएं में एसिटालडिहाइड जैसे मानव कार्सिनोजेन होते हैं, जो शराब का प्रमुख मेटाबोलाइट भी है। एसीटैल्डिहाइड डीएनए जोड़ों और इंटरस्ट्रैंड डीएनए क्रॉसलिंक को प्रेरित करता है, जिससे डीएनए क्षति और डीएनए उत्परिवर्तन और क्रोमोसोमल अस्थिरता का संचय होता है। अत्यधिक माइटोजेनिक उत्तेजनाओं और ऑन्कोजीन सक्रियण से असामान्य प्रसार को देखते हुए, एसोफेजेल उपकला कोशिकाओं के घातक परिवर्तन को जीनोटॉक्सिक तनाव से निपटने के लिए तंत्र द्वारा सुविधाजनक बनाया जाता है, जिसमें एंटीऑक्सिडेंट, ऑटोफैगी और उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) की सक्रियता शामिल है। दिलचस्प बात यह है कि ये साइटोप्रोटेक्टिव फ़ंक्शन अक्सर ईएससीसी कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) में सक्रिय होते हैं जो उच्च सीडी 44 (सीडी 44 एच) अभिव्यक्ति की विशेषता रखते हैं और ट्यूमर दीक्षा, आक्रमण, मेटास्टेसिस और चिकित्सा प्रतिरोध 5,6,7 की क्षमताएं होती हैं।

ईएससीसी को सेल कल्चर और कृंतक मॉडल 8,9 में मॉडलिंग किया गया है। पिछले तीन दशकों में, ईएससीसी के मजबूत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। इनमें सीसीएनडी 1 और ईजीएफआर ट्रांसजेनिक चूहे10,11 और पी 53 और पी 120सीटीएन नॉकआउट चूहे12,13 शामिल हैं। हालांकि, एकल आनुवंशिक परिवर्तन आमतौर पर तेजी से शुरू होने वाले ईएससीसी का परिणाम नहीं होता है। इस चुनौती को एसोफेजेल कार्सिनोजेन्स के उपयोग से दूर किया गया है जो ईएससीसी14 में मानव आनुवंशिक घावों को अच्छी तरह से पुन: उत्पन्न करते हैं। उदाहरण के लिए, 4-नाइट्रोक्विनोलिन-1-ऑक्साइड (4एनक्यूओ) सीसीएनडी 1 ट्रांसजेनिक चूहों15 में ईएससीसी विकास को तेज करता है। हाल के वर्षों में, सेल वंश-ट्रेसेबल माउस मॉडल 3,4 में कथित एसोफेजेल एपिथेलियल स्टेम सेल, पूर्वज कोशिकाओं और उनके संबंधित भाग्य की जांच की गई है। इसके अलावा, इन सेल वंश-ट्रेस करने योग्य चूहों का उपयोग ईएससीसी की उत्पत्ति की कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया है और ऐसी कोशिकाएं पारंपरिक हिस्टोलॉजी और ओमिक्स-आधारित आणविक लक्षण वर्णन7 के माध्यम से सीडी 44 एच सीएससी को कैसे जन्म देती हैं।

इन माउस मॉडल से संबंधित एक उभरता हुआ क्षेत्र तीन आयामी (3 डी) ऑर्गेनॉइड सिस्टम में लाइव ईएससीसी और अग्रदूत कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए सेल कल्चर तकनीकों का नया अनुप्रयोग है जिसमें मूल ऊतकों की वास्तुकला को विवो 7,8,9 से पुन: परिभाषित किया जाता है। ये 3 डी ऑर्गेनोइड तेजी से म्यूरिन ऊतकों से पृथक एकल-कोशिका निलंबन से उगाए जाते हैं, जिसमें प्राथमिक और मेटास्टैटिक ट्यूमर (जैसे, लिम्फ नोड, फेफड़े और यकृत घाव) शामिल हैं। कोशिकाओं को तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) में एम्बेडेड किया जाता है और एक अच्छी तरह से परिभाषित सीरम-मुक्त सेल कल्चर माध्यम के साथ खिलाया जाता है। 3 डी ऑर्गेनोइड 7-10 दिनों के भीतर बढ़ते हैं, और परिणामस्वरूप गोलाकार संरचनाएं उपसंस्कृति, क्रायोप्रिजर्वेशन और सीएससी मार्करों, ईएमटी, ऑटोफैगी, प्रसार, भेदभाव और एपोप्टोटिक सेल डेथ सहित विभिन्न सेलुलर गुणों और कार्यों का विश्लेषण करने के लिए सहायक होती हैं।

इन विधियों को मोटे तौर पर किसी भी स्तरीकृत स्क्वैमस उपकला ऊतक से स्थापित 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि सिर और गर्दन म्यूकोसा (मौखिक गुहा, जीभ, ग्रसनी, और स्वरयंत्र) और यहां तक कि फोरेडोमैक। सिर और गर्दन का म्यूकोसा अन्नप्रणाली के साथ सन्निहित हैं, और दो ऊतक समान ऊतक संगठन, कार्य और बीमारी के लिए संवेदनशीलता साझा करते हैं। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एचएनएससीसी) और ईएससीसी दोनों आनुवंशिक घावों और जीवनशैली से संबंधित पर्यावरणीय जोखिम कारकों जैसे तंबाकू और शराब के जोखिम को साझा करते हैं। इस समानता को रेखांकित करते हुए, तंबाकू के धुएं के मिमेटिक 4एनक्यूओ के साथ इलाज किए गए चूहे आसानी से एचएनएससीसी और ईएससीसी दोनों विकसित करते हैं। जिस आसानी से नीचे वर्णित प्रोटोकॉल को एचएनएससीसी मॉडलिंग पर लागू किया जा सकता है, हम इन घावों से 3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए विशिष्ट निर्देश शामिल करते हैं।

यहां, हम सामान्य, प्रीनोप्लास्टिक और ईएससीसी घावों का प्रतिनिधित्व करने वाले मुराइन एसोफैगल 3 डी ऑर्गेनोइड्स (एमईओ) उत्पन्न करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो 4 एनक्यूओ के साथ इलाज किए गए चूहों में विकसित होते हैं। विभिन्न माउस उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें सामान्य प्रयोगशाला उपभेद जैसे सी 57बीएल / 6 और सेल वंश-ट्रेसेबल और अन्य आनुवंशिक रूप से इंजीनियर डेरिवेटिव शामिल हैं। हम सामान्य या रोगग्रस्त मुराइन एसोफैगल एपिथेलियम के अलगाव, एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी, बढ़ते 3 डी ऑर्गेनोइड्स की खेती और निगरानी, उपसंस्कृति, क्रायोप्रिजर्वेशन और आकृति विज्ञान और अन्य अनुप्रयोगों सहित बाद के विश्लेषणों के लिए प्रसंस्करण सहित प्रमुख चरणों पर जोर देते हैं।

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Protocol

म्यूरिन प्रयोगों को नियमों के अनुसार और पशु प्रोटोकॉल #AABB1502 के तहत योजनाबद्ध और प्रदर्शन किया गया था, कोलंबिया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा समीक्षा और अनुमोदित किया गया था। चूहों को एक उचित पशु देखभाल सुविधा में रखा गया था जो चूहों के मानवीय उपचार को सुनिश्चित करता है और चूहों के लिए उचित पशु चिकित्सा देखभाल और प्रयोगशाला कर्मियों के लिए प्रयोगशाला सुरक्षा प्रशिक्षण प्रदान करता है।

1. एसोफेजेल आईईएन और ईएससीसी घावों को प्रेरित करने के लिए 4एनक्यूओ के साथ चूहों का उपचार (समय विचार: 28 सप्ताह तक)

नोट: नियोप्लास्टिक एसोफैगल घावों का प्रतिनिधित्व करने वाले एमईओ उत्पन्न करने के लिए, चूहों को 4एनक्यूओ-मध्यस्थता रासायनिक कार्सिनोजेनेसिस के अधीन किया जाता है जैसा कि पहले तांग एट अल.14 द्वारा वर्णित किया गया था। सामान्य / गैर-नियोप्लास्टिक एमईओ अनुपचारित चूहों से उत्पन्न होते हैं।

  1. चूहों
    1. प्रति पिंजरे चार से पांच चूहों को रखें, और एक प्रयोग शुरू करने से पहले उन्हें कम से कम 1 सप्ताह के लिए पशु सुविधा में रखें। इस संभावना को कम करने के लिए कि उम्र से संबंधित विकारों के परिणामस्वरूप पूरे 28 सप्ताह के प्रयोग की समय से पहले समाप्ति होती है, 8 सप्ताह से 16 सप्ताह के चूहों से शुरू करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में लगभग 20-30 ग्राम वजन वाले सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग किया गया था। छोटे प्रयोगों के लिए, पुराने चूहों का उपयोग किया जा सकता है। नर या मादा चूहे स्वीकार्य हैं। नियंत्रण (कोई उपचार नहीं, अनुभाग 1.3.1 देखें) चूहों को उम्र और लिंग में मिलान किया जाना चाहिए।
  2. 4NQO युक्त पीने के पानी की तैयारी
    1. एथिलीन प्रोपलीन ग्लाइकोल (सामग्री की तालिका) में 1 मिलीग्राम / एमएल 4 एनक्यूओ स्टॉक समाधान तैयार करें। सीलिंग फिल्म से ढके 500 एमएल ग्लास बीकर में 100 मिलीग्राम 4एनक्यूओ को 99.9% एथिलीन प्रोपलीन ग्लाइकोल के 100 एमएल में घोलें। 30 मिनट के लिए 800 आरपीएम पर चुंबकीय स्टिरर का उपयोग करके कमरे के तापमान (आरटी) पर अच्छी तरह से मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 1 mg/mL 4NQO स्टॉक समाधान के 100 mL में 900 mL ऑटोक्लेव्ड डीआयनाइज्ड पानी जोड़ें, और सीलिंग फिल्म से ढके 2 L प्लास्टिक स्नातक सिलेंडर में व्युत्क्रमण द्वारा मिलाएं। 10% एथिलीन प्रोपलीन ग्लाइकोल में 100 μg / mL 4NQO के 1 L की मात्रा 500 mL पीने की बोतल से लैस दो माउस पिंजरों की सेवा करेगी।
      सावधानी: ध्यान दें, 4NQO एक सिंथेटिक रासायनिक कार्सिनोजेन है जो कैंसर का कारण बन सकता है। नाइट्राइल दस्ताने और लंबी आस्तीन वाले लैब कोट के साथ संभालें, और बंद पैर की अंगुली के जूते पहनें। उचित आंखों की सुरक्षा, चेहरे की सुरक्षा और सिर को ढंकने पर विचार करें। अपशिष्ट निपटान के लिए, 4NQO को पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा द्वारा खतरनाक अपशिष्ट प्रबंधन के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार एक लेबल कंटेनर में रखा जाना चाहिए।
  3. 4NQO के साथ उपचार और निगरानी
    1. पीने की बोतल संलग्न करें, और 16 सप्ताह के लिए चूहों को पीने के पानी के माध्यम से 4एनक्यूओ का प्रबंधन करें। वाहन (कोई उपचार नहीं) नियंत्रण के रूप में 10% (डब्ल्यू / वी) प्रोपलीन ग्लाइकोल का उपयोग करें।
      नोट: आईईएन को प्रेरित करने के लिए 4एनक्यूओ उपचार की छोटी अवधि का उपयोग किया जा सकता है।
    2. सप्ताह में एक बार पानी को फिर से भरें।
    3. प्रयोगशाला संतुलन पर प्लास्टिक कंटेनर में रखकर साप्ताहिक रूप से प्रत्येक माउस का वजन करें।
    4. 16 सप्ताह 4NQO उपचार अवधि के अंत में, चूहों को 12 सप्ताह तक पोस्ट-4NQO अवलोकन अवधि के दौरान नियमित रूप से पीने का पानी देना शुरू करें (चित्रा 1)।
    5. संकट के संकेतों के लिए रोजाना चूहों की निगरानी करें (उदाहरण के लिए, बिगड़ा हुआ गतिशीलता, हंच्ड हैबिटस, और वापस लिया गया व्यवहार), डिस्पैगिया और निर्जलीकरण। इसके अतिरिक्त, शरीर के वजन या भोजन और तरल सेवन में परिवर्तन के लिए साप्ताहिक चूहों का मूल्यांकन करें। क्या शरीर का वजन प्रारंभिक शरीर के वजन से 10% से अधिक कम हो जाता है, चूहों को तरल आहार पूरक के साथ खिलाएं।
      नोट: तरल आहार की खुराक के लिए शरीर के वजन में कमी ईएससीसी का संकेत हो सकती है, और चूहे जो अपने शरीर के वजन का 20% से अधिक खो देते हैं, उन्हें इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, एमईओ को समय से पहले इच्छामृत्यु वाले चूहों से उत्पन्न किया जा सकता है। ध्यान दें कि आनुवंशिक संशोधनों के बिना सी 57बीएल / 6 चूहे आमतौर पर रुग्णता के लक्षण प्रदर्शित नहीं करते हैं या पोस्ट-4एनक्यूओ अवलोकन अवधि के अंत तक ईएससीसी घावों को दिखाई देते हैं।
  4. जानवरों की तैयारी
    1. प्रवाहदर पर सीओ 2 से भरे सीओ2 कक्ष में चूहों को इच्छामृत्यु करें जो प्रति मिनट कक्ष मात्रा का 30% -70% विस्थापित करता है। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से मृत्यु की पुष्टि करें।
    2. 21 जी सुइयों का उपयोग करके विच्छेदन मंच पर लापरवाह स्थिति में माउस के अंगों और नाक को पिन करें।
    3. 70% इथेनॉल के साथ माउस की उदर सतह को कीटाणुरहित करें।
  5. विच्छेदन (समय विचार: 0.5 घंटे)
    1. मिडएब्डोमिनल फर और त्वचा को चुटकी मारकर त्वचा को खोलें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह नीचे विसरा से निकल गया है। निचले पेट से ठोड़ी तक क्रैनियोकॉडल, वेंट्रल मिडलाइन चीरा बनाने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें।
    2. मध्य रेखा चीरा से शुरू करके, माउस के दोनों किनारों पर अंगों तक फैले रेडियल कट बनाने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। त्वचा खुली फड़फड़ाती है।
    3. ग्रीवा श्वासनली को उजागर करने के लिए, मध्य रेखा पर लार ग्रंथियों को विभाजित करने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। श्वासनली ग्रंथियों में गहरी होती है।
    4. वक्ष श्वासनली को उजागर करने के लिए, उरोस्थि को हटा दें।
      1. धीरे से पेरिटोनियम को बल के साथ चुटकी लें और उठाएं, और पेरिटोनियम क्रानियोकॉडल और पार्श्व रूप से पसली पिंजरे के साथ विभाजित करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
      2. धीरे से डायाफ्राम की पुच्छल सतह से यकृत को वापस लें, और विशेष रूप से ज़िफॉइड प्रक्रिया की पृष्ठीय सतह पर, स्टर्नल नॉच पर डायाफ्राम में एक छोटा सा चीरा लगाने के लिए कैंची का उपयोग करें। यह आंत के फुफ्फुस से फेफड़े और हृदय को मुक्त करता है।
      3. रिबकेज को वक्ष सामग्री से अलग करें। डायाफ्राम में चीरा में कैंची डालें, और ग्रीवा गर्डल में कपाल को विच्छेदित करें। इस विच्छेदन के दौरान, नीचे के अंगों को नुकसान से बचने के लिए उरोस्थि की पृष्ठीय सतह से निकटता से पालन करें। सुनिश्चित करें कि विच्छेदन का विमान श्वासनली के पूर्ववर्ती है।
      4. कैंची का उपयोग करके उरोस्थि के दोनों ओर पसलियों को काटें, और उरोस्थि को हटा दें। सुनिश्चित करें कि वक्ष सामग्री उजागर हो।
    5. पेट की अन्नप्रणाली को उजागर करें। धीरे-धीरे एंट्रम को बल के साथ पकड़कर पेट को ऊपर उठाएं। कैंची के साथ पेट और अन्नप्रणाली से तिल्ली, अग्न्याशय और मेसेन्ट्री को विच्छेदित करें।
    6. वक्ष अन्नप्रणाली को उजागर करें (चित्रा 2)।
      1. धीरे से श्वासनली को तुरंत थायरॉयड उपास्थि तक उठाएं, और आईरिस कैंची का उपयोग करके श्वासनली के पृष्ठीय पक्ष के अन्नप्रणाली को विच्छेदित करें।
      2. थायरॉयड कार्टिलेज पर श्वासनली को आईरिस कैंची के साथ विभाजित करें।
      3. पुच्छल दिशा में सावधानीपूर्वक विच्छेदन के माध्यम से श्वासनली को अन्नप्रणाली के शेष भाग से छील लें।
      4. श्वासनली के साथ फेफड़े , हृदय और थाइमस को द्रव्यमान में हटा दें। महाधमनी और वेना कावा को विच्छेदित और विभाजित करते समय अन्नप्रणाली को नुकसान से बचने के लिए ध्यान रखें।
    7. कैंची से पेट को पाइलोरस में विभाजित करें।
    8. एन्ट्रोपेम को बल के साथ पकड़कर और कपाल को विच्छेदित करके कशेरुक से अन्नप्रणाली को अलग करें।
    9. थायरॉयड उपास्थि के स्तर पर अन्नप्रणाली को विभाजित करें, और अन्नप्रणाली और पेट को द्रव्यमान में काटें (चित्रा 3)।
    10. कार्डिया में अन्नप्रणाली को विभाजित करके पेट और अन्नप्रणाली को अलग करें (चित्रा 4, शीर्ष पैनल, लाल रेखा)।
    11. अन्नप्रणाली की बाहरी सतह पर किसी भी प्रावरणी को विच्छेदित करें। हिस्टोलॉजी (वैकल्पिक) के लिए एक नमूना आरक्षित करने के लिए, अन्नप्रणाली के आधे हिस्से को हटा दें और कैंची के साथ अनुदैर्ध्य रूप से विभाजित करें। बर्फ पर ठंडे पीबीएस में शेष बरकरार अन्नप्रणाली रखें।
    12. अधिक वक्रता के साथ पेट खोलें, और पीबीएस के साथ पर्याप्त रूप से धो लें। फोरडोमैक को अलग करें, और ठंडे पीबीएस से धो लें। बर्फ पर ठंडे पीबीएस में वनमाच रखें।
    13. जीभ काटने के लिए, नाक पर 21 ग्राम सुई निकालें, और चिमटी के साथ जीभ को बाहर निकालें। जीभ को जितनी देर हो सके काट लें। जीभ को बर्फ पर ठंडे पीबीएस में रखें।

2. मुराइन एसोफैगल ऑर्गेनॉइड (एमईओ) संस्कृति की स्थापना

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक ऐसे चरण के साथ एक मुराइन जीभ ऑर्गेनॉइड संस्कृति स्थापित करने के लिए भी किया जा सकता है जिसमें ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले जीभ के ऊतकों की कीमा की जाती है। चरण 2.2.3 में नोट देखें।

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    नोट: अभिकर्मकों की एक सूची सामग्री की तालिका में पाई जा सकती है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्टॉक समाधान तैयार करें और स्टोर करें जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।
    1. सुनिश्चित करें कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (बीएमई) के एकल-उपयोग वाले एलिकोट उपयोग के दिन तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं, बाद में बर्फ पर या 2-8 डिग्री सेल्सियस पर पिघल जाते हैं, और उपयोग में नहीं होने पर हर समय बर्फ पर रखे जाते हैं।
    2. 1,000 एमएल पीबीएस (250 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक एकाग्रता) में 250 मिलीग्राम सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक (एसटीआई) को घोलें, और इसे फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें (0.22 μm)। शंक्वाकार ट्यूबों में 50 एमएल एलिकोट वितरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक स्टोर करें।
    3. माउस ऑर्गेनॉइड माध्यम (एमओएम) तैयार करें: उन्नत डीएमईएम / एफ 12 को 1 एमएम एन-एसिटाइल-एल-सिस्टीन (एनएसी), 2% आर-स्पोंडिन और नोगिन वातानुकूलित माध्यम (आरएन सीएम), 1 एक्स एन -2 पूरक, 1 एक्स बी -27 पूरक, 10 एमएम एचईपीईएस, 1 एक्स एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक, 1 एक्स ग्लूटामैक्स पूरक, और 100 एनजी / एमएल माउस एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (एमईजीएफ) के साथ पूरक करें। एक समय में MOM 500 mL तैयार करें, इसे 50 mL एलिकोट में विभाजित करें, और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले 0.5 μg / mL एम्फोटेरिसिन बी और 10 μM Y-27632 जोड़ें।
    4. उपयोग से पहले पानी या मोती स्नान में एमओएम, 0.25% ट्रिप्सिन और सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक (एसटीआई) को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें।
  2. विच्छेदित माउस ऊतक से केराटिनोसाइट्स का अलगाव (समय विचार: 2 घंटे)
    1. एसोफेजेल ऊतक को पीबीएस (कुल 2.5-5 इकाइयों) में 500 μL डिस्पेज़ में स्थानांतरित करें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 800 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर में इनक्यूबेट करें।
    2. ऊतक को एक संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें, और बल का उपयोग करके उपकला से मांसपेशियों की परत को सावधानीपूर्वक हटा दें (चित्रा 4)।
      नोट: यह चरण एक अनुभवी शोधकर्ता द्वारा डिस्पेस के साथ इनक्यूबेशन करने से पहले भी किया जा सकता है।
    3. एपिथेलियम को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 0.25% ट्रिप्सिन का 500 μL होता है, और 37 डिग्री सेल्सियस और 800 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर में इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि प्रारंभिक सामग्री जीभ ऊतक है, तो ट्रिप्सिन जोड़ने से पहले, बाँझ स्केलपेल के साथ ऊतक को छोटे टुकड़ों में काट लें, आकार में लगभग1-2 मिमी 2 ।
    4. ऊतक को छर्रों से छर्रों में 2,000 x g पर 5-10 सेकंड के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। 100 μm सेल छन्नी के साथ एक 50 mL शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें। ऊतक/कोशिका निलंबन को छन्नी के माध्यम से गोलाकार गतियों का उपयोग करके एक विस्तृत बोर टिप के साथ स्थानांतरित करें।
    5. धोने के लिए गोलाकार गति का उपयोग करके, छन्नी के माध्यम से 3 एमएल एसटीआई जोड़ें।
    6. कोशिकाओं को धक्का देने के लिए 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज प्लंजर के आधार के साथ छन्नी को स्क्रब करें।
    7. छन्नी को 3 एमएल पीबीएस के साथ 3-5 बार धोएं, धोने के बीच सिरिंज के आधार से छन्नी को रगड़ें।
    8. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    9. ट्यूब में 1 एमएल घोल छोड़ते हुए, सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    10. शेष 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, और 70 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से सेल निलंबन को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    11. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    12. एमओएम के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें; आवश्यकतानुसार मात्रा समायोजित करें। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा एक स्वचालित सेल गणना करें।
  3. प्रारंभिक सेल निलंबन की सीडिंग (समय विचार: <1 घंटे)
    1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक 24-वेल सेल कल्चर प्लेट तैयार करें।
    2. प्लेट 5,000 व्यवहार्य कोशिकाएं 75% (v/v) BME/MOM में 50 μL प्रति कुएं की कुल मात्रा के साथ। नीचे दी गई उदाहरण गणना के अनुसार एक अतिरिक्त कुएं के लिए बीएमई में प्लेट किए गए कुओं की संख्या को अधिकतम करें और पर्याप्त कोशिकाएं तैयार करें।
      नोट: क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम (एफबीएस में 10% डीएमएसओ) में किसी भी अतिरिक्त कोशिकाओं को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की अधिकतम एकाग्रता पर क्रायोप्रिजर्वेशन करें। क्रायोवियल्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीजिंग कंटेनर में स्टोर करें। उन्हें दीर्घकालिक भंडारण के लिए वाष्प चरण तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    3. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, पहले एमओएम में एक उपयुक्त सेल कमजोर पड़ने तैयार करें, और फिर चढ़ाना से ठीक पहले एक विस्तृत बोर टिप का उपयोग करके बीएमई जोड़ें।
    4. 200 μL चौड़े बोर टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे कुएं के केंद्र में 50 μL की बूंद जोड़ें, नोक और कुएं के निचले हिस्से या किनारों के बीच संपर्क से बचें (चित्र 5)। सावधान रहें कि टिप से तरल को बाहर निकालने के लिए बहुत अधिक बल का उपयोग न करें, अन्यथा गुंबद चपटा हो जाएगा।
    5. बीएमई को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए जमने दें।
    6. सावधानीपूर्वक 0.5 μg / mL एम्फोटेरिसिन बी और 10 μM Y-27632 के साथ पूरक प्रति अच्छी तरह से MOM के 500 μL जोड़ें।
      नोट: प्रारंभिक प्राथमिक संस्कृति में सभी एमओएम में एम्फोटेरिसिन जोड़ें। सभी परिच्छेदों के लिए केवल पासिंग (दिन 0) के दिन ही Y-27632 जोड़ें।
    7. एमओएम को 3-4 दिनों में बदलें और फिर उसके बाद हर 2-3 दिनों में जब तक पारित होने के लिए तैयार न हो जाएं।
    8. 7-10 दिनों में, ऑर्गेनोइड्स की छवि बनाएं, और शुरू में बीज ति कोशिकाओं की संख्या से बनने वाले ऑर्गेनोइड्स की संख्या को विभाजित करके ऑर्गेनोइड गठन दर (ओएफआर) को मापें।
      उदाहरण गणना:
      Equation 1
  4. म्यूरिन एसोफेजेल ऑर्गेनोइड्स (एमईओ) के पासिंग और क्रायोप्रिजर्वेशन (समय विचार: <1.5 घंटे)
    1. पिघलाएं और बीएमई को बर्फ पर रखें। उपयोग से पहले पानी या मोती स्नान में प्रीवार्म एमओएम, 0.05% ट्रिप्सिन, और एसटीआई 37 डिग्री सेल्सियस तक। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक 24-वेल सेल कल्चर प्लेट तैयार करें।
    2. एक विस्तृत बोर माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके, सतह पर तैरने वाले के साथ बीएमई गुंबद में ऑर्गेनोइड्स एकत्र करें। ऊपर और नीचे पाइप करके बीएमई को बाधित करें।
      नोट: समान नमूने वाले कुओं को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं।
    3. ऑर्गेनोइड्स को पेलेट करने के लिए 2,000 x g पर 10-15 सेकंड के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को निकालें और त्याग दें।
    4. धीरे से गोली को हटा दें, और गोली को 0.05% ट्रिप्सिन के 500 μL में फिर से निलंबित करें।
    5. ट्यूब को थर्मोमिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस और 800 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. एसटीआई के 600 μL के साथ ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें।
    7. कोशिकाओं को छर्रों से छर्रों के लिए 5 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. सतह पर तैरने वाले को निकालें और त्याग दें। सेल पेलेट को एमओएम के 100 μL में पुन: निलंबित करें। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा एक स्वचालित सेल गणना करें।
      नोट: वॉल्यूम आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है।
    9. प्लेट 2,000-5,000 व्यवहार्य कोशिकाएं 75% (v/v) BME/MOM में 50 μL प्रति कुएं की कुल मात्रा के साथ। चढ़ाए गए कुओं की संख्या को अधिकतम करें और पहले उल्लिखित उदाहरण गणना के अनुसार एक अतिरिक्त कुएं के लिए बीएमई में पर्याप्त कोशिकाएं तैयार करें।
      नोट: क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम (एफबीएस में 10% डीएमएसओ) में किसी भी अतिरिक्त कोशिकाओं को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की अधिकतम एकाग्रता पर क्रायोप्रिजर्वेशन करें। क्रायोवियल्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीजिंग कंटेनर में स्टोर करें। उन्हें दीर्घकालिक भंडारण के लिए वाष्प चरण तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    10. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, पहले एमओएम में एक उपयुक्त सेल कमजोर पड़ने तैयार करें, और फिर चढ़ाना से ठीक पहले एक विस्तृत बोर टिप का उपयोग करके बीएमई जोड़ें।
    11. 200 μL चौड़े बोर टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे कुएं के केंद्र में 50 μL की बूंद जोड़ें, कुएं के सिरे और निचले या किनारों के बीच संपर्क से बचें। सावधान रहें कि टिप से तरल को बाहर निकालने के लिए बहुत अधिक बल का उपयोग न करें, अन्यथा गुंबद चपटा हो जाएगा।
    12. प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2,95% आरएच इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    13. सावधानीपूर्वक 10 μM Y-27632 के साथ पूरक प्रति अच्छी तरह से MOM के 500 μL जोड़ें।
      नोट: वाई -27632 केवल पासिंग के दिन (दिन 0) जोड़ें। मीडिया परिवर्तनों के दौरान इसे जोड़ना अनावश्यक है। एम्फोटेरिसिन बी जोड़ना अब आवश्यक नहीं है।
    14. एमओएम को 3-4 दिनों में बदलें और फिर उसके बाद हर 2-3 दिनों में जब तक पारित होने के लिए तैयार न हो जाएं।
    15. 7-10 दिनों में, ऑर्गेनोइड्स को चित्रित करें, और ओएफआर को मापें।
  5. मुराइन एसोफैगल ऑर्गेनोइड्स (एमईओ) का पिघलना और वसूली (समय विचार: <1 घंटे)
    1. पिघलाएं और बीएमई को बर्फ पर रखें। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक 24-वेल सेल कल्चर प्लेट तैयार करें।
    2. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 10 एमएल ठंडा या आरटी एमओएम या पीबीएस तैयार करें।
    3. लगभग 30 सेकंड से 1 मिनट के लिए या एक छोटी बर्फ की गोली के रहने तक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या मोती स्नान में क्रायोवियल पिघलाएं।
    4. एक पूर्व-गीले पिपेट टिप के साथ, धीरे-धीरे सेल निलंबन को एमओएम या पीबीएस युक्त ट्यूब में ड्रॉपवाइज तरीके से स्थानांतरित करें।
    5. कोशिकाओं को छर्रों को छर्रों से भरने के लिए ट्यूब को 300 x g और 4 °C के लिए 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरने वाले को निकालें और त्याग दें। एमओएम के 100 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें; आवश्यकतानुसार मात्रा समायोजित करें। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा एक स्वचालित सेल गणना करें।
    7. प्लेट 5,000-10,000 व्यवहार्य कोशिकाएं 75% (v/v) BME/MOM में 50 μL प्रति कुएं की कुल मात्रा के साथ। चढ़ाए गए कुओं की संख्या को अधिकतम करें और पहले उल्लिखित उदाहरण गणना के अनुसार एक अतिरिक्त कुएं के लिए बीएमई में पर्याप्त कोशिकाएं तैयार करें।
    8. म्यूरिन एसोफैगल ऑर्गेनोइड्स (एमईओ) के पासिंग और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए प्रोटोकॉल के शेष चरणों के साथ जारी रखें (चरण 2.4.11 देखें)।

3. पैराफिन एम्बेडिंग के लिए ऑर्गेनोइड्स की तैयारी (समय विचार: <1 घंटे [अभिकर्मक तैयारी के लिए प्लस 1.5 घंटे])

  1. एक विस्तृत-बोर माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके, प्रति माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तीन कुएं एकत्र करें। सतह पर तैरने वाले के साथ बीएमई गुंबद में ऑर्गेनोइड्स एकत्र करें। ऊपर और नीचे पाइप करके बीएमई को बाधित करें।
  2. ऑर्गेनोइड्स को पेलेट करने के लिए 2,000 x g पर 10-15 सेकंड के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को निकालें और त्याग दें।
  3. धीरे से गोली को हटा दें, और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 300 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. ऑर्गेनोइड्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
  5. ऑर्गेनोइड्स को पेलेट करने के लिए 2,000 x g पर 10-15 सेकंड के लिए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज। जितना संभव हो उतना पीएफए निकालें और त्याग दें।
  6. धीरे से गोली को हटा दें, और पीबीएस के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले फिक्स्ड ऑर्गेनोइड्स को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. एगर जेल का 50 एमएल स्टॉक तैयार करें (2% अगर प्लस 2.5% जिलेटिन)।
    नोट: इनक्यूबेशन समय के कारण, आगर जेल स्टॉक को पहले से तैयार करें, इसके बाद ऑटोक्लेव चक्र करें।
    1. 150 एमएल ऑटोक्लेवेबल ग्लास बीकर में 50 एमएल पानी में 1 ग्राम बैक्टो-आगर और 1.25 ग्राम जिलेटिन को पुन: निलंबित करें।
    2. निलंबन को घुमाएं, और इसे आरटी पर 30-60 मिनट तक बैठने दें।
    3. 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव।
    4. थोड़ा ठंडा करें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 5 एमएल एलिकोट वितरित करें।
    5. आरटी पर 6 महीने तक स्टोर करें।
  8. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रैक को उलटकर और सीलिंग फिल्म की शीट के साथ सतह को कवर करके एक एम्बेडिंग सतह तैयार करें। संबंधित ऑर्गनॉइड आईडी (ओं) के साथ लेबल करें।
  9. ऑर्गेनोइड्स को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को निकालें और त्याग दें।
  10. इस बीच, अगर जेल युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को 150 एमएल ग्लास बीकर में रखकर एगर जेल को तरलीकृत करें, जिसमें 100 एमएल पानी होता है और 1-2 मिनट के लिए उच्चतम बिजली सेटिंग पर माइक्रोवेविंग होती है या जब तक कि पानी उबलना शुरू न हो जाए और आगर जेल तरल अवस्था में न हो।
    सावधानी: माइक्रोवेविंग से पहले एगर जेल युक्त शंक्वाकार ट्यूब की टोपी को ढीला करें।
  11. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में किसी भी पानी को पेश किए बिना ऑर्गेनॉइड पेलेट युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को आंशिक रूप से गर्म पानी में डुबोएं।
  12. ट्यूब के किनारे 50 μL आगर जोड़कर ऑर्गेनॉइड पेलेट को सावधानीपूर्वक ओवरल करें।
  13. गोली को परेशान किए बिना (फिर से निलंबित न करें, गोली को बरकरार रखें), एगर जेल की बूंद में गोली को एम्बेडिंग सतह पर सीलिंग फिल्म में स्थानांतरित करें।
  14. चरण 3.12 और चरण 3.13 को अतिरिक्त 50 μL तरल आगर जेल के साथ दोहराएं ताकि किसी भी शेष ऑर्गेनॉइड गोली को इकट्ठा किया जा सके, और सावधानीपूर्वक उसी जेल की बूंद में जोड़ें।
  15. ऑर्गेनॉइड पेलेट युक्त बूंद को 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  16. फोर्सप्स का उपयोग करके, ऑर्गेनॉइड पेलेट युक्त बूंद को सावधानीपूर्वक एक लेबल पैथोलॉजी कैसेट में स्थानांतरित करें।
  17. कैसेट को 70% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक स्टोर करें।
  18. पैराफिन ब्लॉक तैयार करने के लिए नियमित हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग के माध्यम से पैराफिन एम्बेडिंग के साथ आगे बढ़ें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल पीने के पानी में प्रशासित 4एनक्यूओ के 16 सप्ताह के 4एनक्यूओ से युक्त एक विशिष्ट उपचार आहार के अनुसार सामान्य एसोफैगल ऊतक या ईएससीसी ट्यूमर ऊतक से मुराइन एसोफैगल ऑर्गेनोइड्स (एमईओ) उत्पन्न करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है, इसके बाद 10 सप्ताह से 12 सप्ताह की अवलोकन अवधि (चित्रा 1)। चूहों को जीभ या एसोफेजेल ऊतक (चित्रा 2 और चित्रा 3) के विच्छेदन के लिए इच्छामृत्यु दी जाती है। हम बरकरार अन्नप्रणाली (चित्रा 4) से उपकला परत के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग बाद में एकल-कोशिका अलगाव के लिए किया जाता है। अन्नप्रणाली-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं को शुरू में 50 μL बूंदों में प्रति कुएं 5,000 कोशिकाओं पर चढ़ाया जाता है, जिसमें एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और अच्छी तरह से विशेषता सीरम-मुक्त सेल कल्चर माध्यम (चित्रा 5) में कोशिकाएं होती हैं और औसतन 7-10 दिनों के दौरान ऑर्गेनोइड बनाने की अनुमति होती है। म्यूरिन एसोफैगल, जीभ और फोरडोमैक ऑर्गेनोइड्स को आगे चरण-कंट्रास्ट / ब्राइटफील्ड इमेजिंग और हिस्टोपैथोलॉजी (चित्रा 6) द्वारा रूपात्मक विश्लेषण द्वारा विशेषता दी जा सकती है। उपसंस्कृति पर ओएफआर का निर्धारण करके ऑर्गेनोइड्स की आत्म-नवीकरण क्षमता का आकलन किया जा सकता है (चित्रा 7)। ओएफआर काफी हद तक प्रोलिफेरेटिव बेसलॉइड कोशिकाओं की सामग्री से प्रभावित होता है, जैसा कि उनके आकृति विज्ञान (चित्रा 8) के साथ युग्मित विकास कैनेटीक्स विश्लेषण से पता चलता है। अंत में, 4एनक्यूओ-अनुपचारित चूहों से सामान्य संरचनाओं सहित ये ऑर्गेनोइड्स लगातार बढ़ते हैं और लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है (चित्रा 9)।

Figure 1
चित्रा 1: 4एनक्यूओ उपचार आहार। चूहों को 16 सप्ताह के लिए पीने के पानी में 4एनक्यूओ के साथ इलाज किया जाता है, इसके बाद 10 सप्ताह से 12 सप्ताह की अवलोकन अवधि होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: वक्ष अन्नप्रणाली को उजागर करना। श्वासनली (नीली रेखाएं) अन्नप्रणाली (सफेद रेखाओं) से दूर छील दी जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: स्क्वैमस कॉलमर जंक्शन (नीली रेखा) पर पेट (पीली रेखाओं) से जुड़ी अन्नप्रणाली (सफेद रेखाएं)। संक्षिप्तरूप: एफएस = फोरडोमैक, डीएस = डिस्टल पेट, एल = यकृत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पेट और अन्नप्रणाली को अलग करना और उपकला को अलग करना। ऊपरी: पेट अन्नप्रणाली से अलग हो जाता है। लाल रेखा इंगित करती है कि विच्छेदन के दौरान अन्नप्रणाली को कहां अलग किया जाना चाहिए। मध्य: उपकला (सफेद रेखा) मांसपेशियों की परत से दूर छील दी जाती है। निचला: चित्रा 1 में वर्णित उपचार अनुसूची के बाद एसोफैगस वाले ट्यूमर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एक विस्तृत बोर टिप का उपयोग करके एकल कोशिकाओं वाले बीएमई बूंद को चढ़ाना। ऑर्गेनोइड्स 4-7 दिनों के आसपास बनना शुरू होते हैं और औसतन 7-10 दिनों के बाद पारित होने के लिए तैयार होते हैं। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: रूपात्मक विश्लेषण द्वारा ऑर्गेनोइड्स की विशेषता।  (ए) सामान्य और ईएससीसी एमईओ की प्रतिनिधि छवियां। ऊपरी बाएं: एक सामान्य एमईओ की ब्राइटफील्ड छवि। निचले बाएं: एक सामान्य एमईओ का एच एंड ई धुंधलापन। ऊपरी दाएं: 4एनक्यूओ-उपचारित माउस से ईएससीसी एमईओ की ब्राइटफील्ड छवि। निचला दायां: 4एनक्यूओ-उपचारित माउस से ईएससीसी एमईओ का एच एंड ई धुंधला होना जो परमाणु एटिपिया और अचानक केराटिनाइजेशन प्रदर्शित करता है, बाद में एक केराटिन मोती की याद दिलाता है, जो एससीसी ट्यूमर के भीतर एक अच्छी तरह से विभेदित डिब्बे का प्रतिनिधित्व करता है।  (बी) सामान्य माउस जीभ और फोरडोमैक ऑर्गेनोइड्स (एमटीओ और एमएफओ, क्रमशः) की प्रतिनिधि छवियां। ऊपरी बाएं: एक सामान्य एमटीओ की ब्राइटफील्ड छवि। निचले बाएं: एक सामान्य एमटीओ का एच एंड ई धुंधलापन। ऊपरी दाएं: एक सामान्य एमएफओ की ब्राइटफील्ड छवि। निचला दायां: एक सामान्य एमएफओ का एच एंड ई धुंधलापन। सभी स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ऑर्गेनोइड नवीकरण क्षमता का निर्धारण। (ए) उपसंस्कृति द्वारा ऑर्गेनोइड नवीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए प्रायोगिक डिजाइन। बढ़ते प्राथमिक ऑर्गेनोइड्स (पी 0) को विभिन्न समय बिंदुओं पर अलग किया जाता है और एकल-सेल निलंबन में बनाया जाता है। इन कोशिकाओं को उपसंस्कृति (पी 1) में दिन 7 पर ओएफआर निर्धारित करने के लिए पारित किया जाता है। (बी) 4एनक्यूओ-अनुपचारित चूहों से उत्पन्न पारित एमईओ से प्रतिनिधि ओएफआर डेटा। ध्यान दें कि ओएफआर समय के कार्य के रूप में घटता है, परिपक्व ऑर्गेनोइड्स में प्रोलिफेरेटिव बेसलॉइड कोशिकाओं में कमी को दर्शाता है, जिसमें अधिक कोशिकाएं होती हैं जो पोस्ट-माइटोटिक टर्मिनल भेदभाव से गुजरी हैं ( चित्रा 8 देखें)। पी < 0.001 (एन = 6) दिन 7, दिन 11 और दिन 21 पर ओएफआर बनाम दिन 4 पर ओएफआर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: ऑर्गेनोइड्स के विकास कैनेटीक्स जैसा कि विभिन्न समय बिंदुओं पर उनकी आकृति विज्ञान से पता चलता है। 4एनक्यूओ-अनुपचारित चूहों से एक सामान्य एमईओ की प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र और एच एंड ई धुंधला छवियां दिखाई गई हैं। ध्यान दें कि ऑर्गेनोइड्स के आंतरिक कोर का केराटिनाइजेशन 10 वें दिन तक प्रमुख हो जाता है। प्रोलिफेरेटिव बेसलॉइड कोशिकाएं दिन 14 और दिन 21 समय बिंदुओं पर भी सबसे बाहरी कोशिका परत में रहती हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री / इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, संचित केराटिन गैर-विशिष्ट धुंधलापन पैदा कर सकता है, जैसा कि मूल स्क्वैमस उपकला ऊतकों के मामले में होता है, जो धुंधला होने की स्थिति, नियंत्रण (जैसे, केवल द्वितीयक एंटीबॉडी), और डेटा व्याख्या के सावधानीपूर्वक अनुकूलन की आवश्यकता है। सभी स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: 4एनक्यूओ-अनुपचारित चूहों से उत्पन्न एक प्रतिनिधि सामान्य एमटीओ की आबादी दोगुनी वक्र। इन ऑर्गेनोइड्स को पहले उत्पन्न किया गया था, क्रायोप्रिजर्व किया गया था, और कई मार्गों और दीर्घकालिक संस्कृति पर उनकी स्थिर वृद्धि का प्रदर्शन करने के लिए पिघलाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में एमईओ के उत्पादन और विश्लेषण के लिए कई महत्वपूर्ण कदम और विचार हैं। एमईओ प्रयोगों में प्रजनन क्षमता और कठोरता सुनिश्चित करने के लिए, जैविक और तकनीकी प्रतिकृतियां दोनों महत्वपूर्ण हैं। जैविक प्रतिकृति के लिए, ईएससीसी वाले दो से तीन स्वतंत्र चूहे आम तौर पर प्रयोगात्मक स्थिति के लिए पर्याप्त होते हैं। हालांकि, जैविक प्रतिकृतियों की उचित संख्या व्यक्तिगत अध्ययनों में परीक्षण किए जाने वाले मापदंडों के आधार पर भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, वर्तमान में यह अज्ञात है कि मैक्रोस्कोपिक रूप से दिखाई देने वाले घावों या हिस्टोलॉजिकल आईईएन और ईएससीसी घावों के बिना 4एनक्यूओ-उपचारित चूहों से कितनी जल्दी और कितनी बार नियोप्लास्टिक ऑर्गेनोइड्स का पता लगाया जा सकता है। यद्यपि 4एनक्यूओ विभिन्न माउस उपभेदों14 में एसोफैगल घावों को प्रेरित करता है, एमईओ केवल सी 57बीएल / 6 चूहों से उत्पन्न हुए हैं। ईएससीसी के विकास और प्रगति को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर आनुवंशिक घावों जैसे कि टीआरपी 53 हानि और साइक्लिन डी 1 ओवरएक्प्रेशन 7,14,15 के साथ चूहों में तेज किया जाता है। ऐसे चूहों में, नियोप्लास्टिक एमईओ 4एनक्यूओ उपचार के दौरान या बाद में जंगली प्रकार के सी 57बीएल / 6 चूहों की तुलना में अधिक बार और पहले उभर सकते हैं। यदि आवश्यक हो, तो नियोजित प्रयोगों में चूहों के उपयुक्त नमूना आकार का अनुमान लगाने के लिए पायलट अध्ययन किया जाना चाहिए। मल्टी-वेल सेल कल्चर प्लेटों के साथ, तकनीकी प्रतिकृति (एन = 3-6) आसानी से बनाई जाती है। हालांकि, अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए सावधानीपूर्वक पिपेटिंग और अभ्यास की आवश्यकता होती है क्योंकि कोशिकाओं को बीएमई युक्त चिपचिपे माध्यम में वितरित किया जाता है।

वर्णित प्रोटोकॉल में एमईओ स्थापना के लिए लगभग 100% सफलता दर की उम्मीद की जा सकती है। हालांकि, सफल एमईओ संस्कृति प्रारंभिक पृथक एसोफैगल उपकला कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर निर्भर करती है, जो काफी हद तक प्रारंभिक सामग्री की गुणवत्ता से संबंधित है। जब इच्छामृत्यु पर चूहों को तुरंत विच्छेदित नहीं किया जा सकता है, तो अगले दिन एसोफैगी को अलग करने के लिए शवों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। हालांकि, शवों को जमे हुए नहीं होना चाहिए, क्योंकि जमे हुए ऊतक व्यवहार्य कोशिकाओं का उत्पादन नहीं करेंगे। विघटित एसोफेजेल उपकला कोशिकाओं को ठंड माध्यम (90% एफबीएस और 10% डीएमएसओ) में एकल-कोशिका निलंबन के रूप में क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है और बाद की तारीख में ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है। एसोफैगी (उपकला शीट) को एक समान तरीके से क्रायोप्रिजर्व किया जा सकता है, हालांकि कम बेहतर तरीके से। जबकि एमईओ को प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और एसोफेजेल उपकला कोशिकाओं के अद्वितीय उपसमुच्चय को शुद्ध करने के लिए अन्य तरीकों से शुद्ध कोशिकाओं के साथ शुरू किया जा सकता है, शुद्धिकरण के बाद सेल व्यवहार्यता कम हो सकती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण जैसे सेल व्यवहार्यता परख मृत कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं लेकिन मरने वाली कोशिकाओं को नहीं, इस प्रकार ऑर्गेनॉइड संस्कृति दीक्षा से पहले सेल व्यवहार्यता को कम आंकते हैं। स्थापना के बाद, 4एनक्यूओ-उपचारित और अनुपचारित चूहों दोनों से एमईओ को अनिश्चित काल तक पारित किया जा सकता है (>20 मार्ग), निर्दिष्ट माध्यम में प्रत्येक मार्ग पर >80% व्यवहार्यता की उम्मीद है। यह उल्लेखनीय है कि ऑर्गेनोइड मध्यम घटक हैं जिनकी आवश्यकताएं अस्पष्ट बनी हुई हैं। झेंग एट अल ने हाल ही में प्रदर्शित किया कि डब्ल्यूएनटी 3 ए, आरस्पोंडिन -1 और नोगिन युक्त एक पूरक को मुराइन एसोफैगल ऑर्गेनोइड्स16 विकसित करने की आवश्यकता होती है। हालांकि, हम इस प्रोटोकॉल में डब्ल्यूएनटी 3 ए का उपयोग नहीं करते हैं क्योंकि जीभ, अन्नप्रणाली और वनमाच से ऑर्गेनोइड बढ़ते हैंऔर इसके बिना कई बार (>10 अंश) पारित किए जा सकते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन कारकों की आवश्यकताओं को व्यक्तिगत रूप से परीक्षण नहीं किया गया है।

एपिथेलियल शीट का उपयोग ट्यूमर जैसे मैक्रोस्कोपिक रूप से दिखाई देने वाले घावों के बिना सामान्य अन्नप्रणाली या एसोफैगल म्यूकोसा से एमईओ उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। उपकला शीट का उपयोग प्रारंभिक सामग्री के रूप में उपकला कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति देता है। हालांकि, ट्यूमर-असर वाले एसोफेजेल म्यूकोसा से उपकला चादरों का अलगाव उपउपकला डिब्बों में ईएससीसी आक्रमण के कारण मुश्किल है। पूरे अन्नप्रणाली का उपयोग एमईओ संस्कृति शुरू करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि गैर-उपकला कोशिका आबादी की उपस्थिति प्रारंभिक संस्कृति में ऑर्गेनोइड गठन दर (ओएफआर) को कम कर सकती है। ओएफआर को बाद के मार्गों में बढ़ने की उम्मीद है, क्योंकि वर्तमान एमईओ संस्कृति की स्थिति उपकला कोशिकाओं को बीएमई के भीतर बढ़ने की अनुमति देती है। ध्यान दें, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को अन्य अंगों, विशेष रूप से मौखिक जीभ और फोरडोमैक पर भी लागू किया जा सकता है, जिनमें से दोनों 4एनक्यूओ-प्रेरित स्क्वैमस सेल कार्सिनोजेनेसिस के लिए अतिसंवेदनशील हैं। ध्यान दें, हमने उपकला कोशिकाओं को अलग किए बिना पूरे ऊतकों से माउस जीभ ऑर्गेनोइड्स (एमटीओ) और माउस फोरडोमैक ऑर्गेनोइड्स (एमएफओ) उत्पन्न किए हैं। यदि आवश्यक हो, तो इन ऑर्गेनोइड्स को फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा शुद्ध उपकला कोशिकाओं की उप-जनसंख्या से बनाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, उच्च सीडी 44 अभिव्यक्ति, सीडी 73 + कथित एसोफेजेल स्टेम कोशिकाओं की विशेषता वाले कैंसर स्टेम सेल)।

इसके अतिरिक्त, गैर-उपकला कोशिकाएं, विशेष रूप से फाइब्रोब्लास्ट, प्लास्टिक की सतह पर एक मोनोलेयर में बढ़ने के लिए बीएमई से बाहर पलायन कर सकती हैं, जिससे कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट सहित मुराइन एसोफैगल फाइब्रोब्लास्ट की समवर्ती स्थापना की अनुमति मिलती है। 3 डी बीएमई में उपकला कोशिका वृद्धि के लिए चयनात्मकता यहां वर्णित वर्तमान स्थितियों के तहत प्रतिरक्षा कोशिकाओं और अन्य सेल प्रकारों के साथ एमईओ के सह-संवर्धन को सीमित कर सकती है। सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए अनुकूलन चल रहा है। इसके अतिरिक्त, ट्यूमर इनवेसिव फ्रंट को वैकल्पिक 3 डी कल्चर विधियों जैसे ऑर्गेनोटाइपिक 3 डी कल्चर8,18 द्वारा मॉडलकिए गए उपकला-स्ट्रोमल इंटरफ़ेस में बेहतर तरीके से पुन: परिभाषित किया जा सकता है। इसके अलावा, एमईओ उपकला बाधा समारोह को मापने के लिए एक उपयुक्त मंच नहीं हो सकता है, जिसका ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध 19,20,21 का आकलन करने के लिए वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृति का उपयोग करके बेहतर मूल्यांकन किया जा सकता है।

एमईओ, और वास्तव में एमटीओ और एमएफओ का सबसे बड़ा लाभ, एकल कोशिका-व्युत्पन्न संरचनाओं का तेजी से विकास है जो मूल उपकला संरचनाओं, सौम्य और घातक दोनों को पुन: उत्पन्न करते हैं। इन ऑर्गेनोइड्स का दोहरीकरण समय (डीटी) आमतौर पर <20 घंटे होने का अनुमान है। 4एनक्यूओ-अनुपचारित चूहों से सामान्य एमटीओ के विकास कैनेटीक्स सामान्य ऑर्गेनोइड्स की दीर्घकालिक संस्कृति के साथ-साथ अपेक्षित जनसंख्या दोहरीकरण (पीडी) स्तर और डीटी (चित्रा 9) दोनों की क्षमता को दर्शाते हैं। इस उदाहरण में, प्रत्येक मार्ग के दौरान लगभग 10 जनसंख्या दोगुनी हुई, औसतन 18.5 घंटे और 18.3 घंटे की गणना डीटी के साथ। प्रारंभिक प्राथमिक संस्कृति के बाद, सीडिंग घनत्व की परवाह किए बिना, आमतौर पर 15% -25% का ओएफआर अपेक्षित होता है, और एमईओ दिन 4 (चित्रा 8) के रूप में उभर सकते हैं, हालांकि वे आकार में छोटे हो सकते हैं। चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के तहत, सामान्य एसोफेजेल म्यूकोसा से ऑर्गेनोइड चिकनी सतहों के साथ गोलाकार संरचनाओं को प्रदर्शित करते हैं। समय के एक कार्य के रूप में, सामान्य ऑर्गेनोइडएक संकेंद्रित संरचना प्रदर्शित करते हैं क्योंकि आंतरिक कोशिका द्रव्यमान पोस्ट-माइटोटिक टर्मिनल भेदभाव से गुजरता है, जिससे एक भेदभाव ढाल उत्पन्न होता है जो स्तरीकृत स्क्वैमस एपिथेलियम की नकल करता है। नियोप्लास्टिक ऑर्गेनोइड अनियमित सतहों को दिखाते हैं, जो बेसलॉइड कोशिकाओं की उच्च प्रोलिफेरेटिव गतिविधि को दर्शाते हैं, जो बाहरी फैशन में विस्तार कर सकते हैं। प्रसार-विभेदन ढाल प्रदर्शित करने के लिए एमईओ की क्षमता का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है कि प्रोलिफेरेटिव एसोफैगल बेसल केराटिनोसाइट्स पोस्ट-माइटोटिक टर्मिनल भेदभाव का प्रसार और गुजर सकते हैं। अलग किए गए एमईओ कोशिकाओं को उप-संवर्धन करके, कोई उपकला कोशिका आत्म-नवीकरण (चित्रा 7) का मूल्यांकन कर सकता है, साथ ही 4एनक्यूओ द्वारा प्रेरित जीनोटॉक्सिक तनाव के तहत पुनर्जनन या परिवर्तन कर सकता है। मौखिक कैंसर के संदर्भ में एमटीओ मॉडल का उपयोग करके इसी तरह के अध्ययन भी किए जा सकते हैं, जिससे सिर और गर्दन एससीसी के लिए वर्णित 4एनक्यूओ माउस ऑर्गेनॉइड मॉडल के आवेदन का विस्तार होता है। जबकि उपकला नवीकरण स्टेम कोशिकाओं को इंगित कर सकता है, एमईओ प्रणाली की एक संभावित कमजोरी यह है कि यह स्टेम कोशिकाओं को अलग करने या शायद ही कभी विभाजित करने का पता लगा सकता है, क्योंकि एमईओ गठन सेल प्रसार पर निर्भर करता है। एमईओ पर हाल ही में एक एकल-कोशिका विश्लेषण अध्ययन ने एसोफेजेल एपिथेलियल सेल विषमता22 में पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्रदान की।

घातक परिवर्तन का मूल्यांकन व्यक्तिगत एमईओ संरचनाओं के सावधानीपूर्वक रूपात्मक मूल्यांकन और एमईओ से युक्त कोशिकाओं के परमाणु एटिपिया द्वारा किया जा सकता है। पूरे एक्सोम अनुक्रमण और आरएनए अनुक्रमण द्वारा एमईओ की आणविक प्रोफाइलिंग प्रीनोप्लास्टिक और ईएससीसी घावों की विशिष्ट प्रकृति को प्रकट कर सकती है। हालांकि, घातक परिवर्तन के लिए अंतिम परीक्षण के लिए एमईओ को ईएससीसी कोशिकाओं की ट्यूमरजेनेसिटी का दस्तावेजीकरण करने के लिए इम्यूनोडेफिशिएंसी या इम्यूनोसक्षम चूहों में प्रत्यारोपण की आवश्यकता हो सकती है। सिंजेनिक इम्यूनोसक्षम चूहों में प्रत्यारोपित ईएससीसी एमईओ ट्यूमर प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मंच भी प्रदान कर सकते हैं।

एमईओ के अनुप्रयोग व्यापक हैं। आकृति विज्ञान, जैव रसायन और बहु-ओमिक्स दृष्टिकोण के अलावा, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग न केवल सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे डीएनए संश्लेषण, एपोप्टोसिस, ऑटोफैगी और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि सेल सतह मार्कर भी हैं जो आनुवंशिक और औषधीय संशोधनों के अनुरूप एमईओ के भीतर कोशिकाओं के अद्वितीय उपसमुच्चय को परिभाषित करते हैं। . इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं और स्ट्रोमा, प्रतिरक्षा कोशिकाओं या यहां तक कि माइक्रोबायोम24 के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग किया जा सकता है। अंत में, एमईओ को सेल वंश-ट्रेस करने योग्य आनुवंशिक संशोधनों को ले जाने वाले चूहों से उत्पन्न किया जा सकता है, जैसे कि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन सेल प्रकार-विशिष्ट जीन नियामक प्रमोटर (जैसे, सोक्स 2, साइटोकेराटिन्स केआरटी 5, और केआरटी 15) 3,4,7,25 के तहत व्यक्त किया जाता है।

संक्षेप में, एमईओ ईएससीसी के अध्ययन के लिए एक अमूल्य उपकरण हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह दिखाना है कि एमईओ एक बहुमुखी मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं जो उत्पन्न करने, बनाए रखने और चिह्नित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और ईएससीसी और एसोफैगल नियोप्लासिया की विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करने की क्षमता रखता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए कोलंबिया विश्वविद्यालय में हर्बर्ट इरविंग कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर में साझा संसाधनों (फ्लो साइटोमेट्री, आणविक पैथोलॉजी, और कॉन्फोकल और विशेष माइक्रोस्कोपी) को धन्यवाद देते हैं। हम सहायक चर्चाओं के लिए डॉ एलन डिहल, एडम जे बास, और क्वोक-किन वोंग (एनसीआई पी 01 तंत्र ऑफ एसोफैगल कार्सिनोजेनेसिस) और रुस्तगी और नाकागावा प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को निम्नलिखित एनआईएच अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: P01CA098101 (H.N. और A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.), 2401874 (F.M.H.)

(जे.जी.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. और H.N.), और P30CA013696 (A.K.R.) एच.एन. और सी.एल. कोलंबिया विश्वविद्यालय हर्बर्ट इरविंग कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर मल्टी-पीआई पायलट अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं। एच.एन. फैनकोनी एनीमिया रिसर्च फंड अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं। एफएमएच द मार्क फाउंडेशन फॉर कैंसर रिसर्च अवार्ड (20-60-51-एमओएमई) और अमेरिकन एसोसिएशन फॉर कैंसर रिसर्च अवार्ड के प्राप्तकर्ता हैं। जेजी अमेरिकन गैस्ट्रोएंटेरोलॉजी एसोसिएशन (एजीए) पुरस्कार के प्राप्तकर्ता हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25-300-120
0.25% trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25-200-114
0.4% Trypan Blue Thermo Fisher Scientific T10282
1 mL tuberculin syringe without needle BD 309659
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 05-408-129
100 µm cell strainer Thermo Fisher Scientific 22363549
15 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 14-959-53A
200 µL wide bore micropipette tips Thermo Fisher Scientific 212361A
21 G needles BD 305167
24 well plate Thermo Fisher Scientific 12-556-006
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) Tokyo Chemical Industry NO250
50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 12-565-270
6 well plate Thermo Fisher Scientific 12556004
70 µm cell strainer Thermo Fisher Scientific 22363548
99.9% ethylene propylene glycol SK picglobal
Advanced DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 12634028
Amphotericin B Gibco, Thermo Fisher Scientific 15290018 Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 Stock concentration 100x, final concentration 1x
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Stock concentration 50x, final concentration 1x
Bacto agar BD 214010
CO2 incubator, e.g.Heracell 150i Thermo Fisher Scientific 51026406 or equivalent
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000 or equivalent
Cryovials Thermo Fisher Scientific 03-337-7D
DietGel 76A Clear H2O 72-07-5022
Dimethyl sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma D4540
Dispase Corning 354235 Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL
Dissecting scissors VWR 25870-002
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190250 Stock concentration 1x
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SH30071.03
Forceps VWR 82027-386
Freezing container Corning 432002 or equivalent
Gelatin Thermo Fisher Scientific G7-500
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Stock concentration 100x, final concentration 1x
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080 Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM
Hot plate/stirrer Corning PC-420D or equivalent
Lab Armor bead bath (or water bath) VWR 89409-222 or equivalent
Laboratory balance Ohaus 71142841 or equivalent
Matrigel basement membrane extract (BME) Corning 354234
Microcentrifuge Minispin Eppendorf 22620100 or equivalent
Microcentrifuge tube rack Southern Labware 0061
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Stock concentration 100x, final concentration 1x
N-acetylcysteine (NAC) Sigma-Aldrich A9165 Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Parafilm M wrap Thermo Fisher Scientific S37440
Paraformaldehyde (PFA) MilliporeSigma 158127-500G
Pathology cassette Thermo Fisher Scientific 22-272416
Phase-contrast microscope Nikon or equivalent
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) Peprotech 315-09-1mg Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) N/A N/A Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%
Sorval ST 16R centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004380 or equivalent
Soybean trypsin inhibitor (STI) MilliporeSigma T9128 Stock concentration 250 µg/mL
ThermoMixer C Thermo Fisher Scientific 14-285-562 PM or equivalent
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 190
3 डी ऑर्गेनोइड्स में ओरल-एसोफैगल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा मॉडलिंग
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Flashner, S., Martin, C., Matsuura,… More

Flashner, S., Martin, C., Matsuura, N., Shimonosono, M., Tomita, Y., Morimoto, M., Okolo, O., Yu, V. X., Parikh, A. S., Klein-Szanto, A. J. P., Yan, K., Gabre, J. T., Lu, C., Momen-Heravi, F., Rustgi, A. K., Nakagawa, H. Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids. J. Vis. Exp. (190), e64676, doi:10.3791/64676 (2022).

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