Summary
Detta protokoll beskriver de viktigaste stegen för att generera och karakterisera murina oral-esofageala 3D-organoider som representerar normala, preneoplastiska och skivepitelcancerskador inducerade via kemisk karcinogenes.
Abstract
Esofagus skivepitelcancer (ESCC) är utbredd över hela världen och står för 90% av alla fall av matstrupscancer varje år och är den dödligaste av alla mänskliga skivepitelcancer. Trots de senaste framstegen med att definiera de molekylära förändringar som åtföljer ESCC-initiering och utveckling är patientprognosen fortfarande dålig. Den funktionella annoteringen av dessa molekylära förändringar är det nödvändiga nästa steget och kräver modeller som både fångar de molekylära egenskaperna hos ESCC och lätt och billigt kan manipuleras för funktionell annotering. Möss behandlade med tobaksrökmimetisk 4-nitrokinolin 1-oxid (4NQO) bildar förutsägbart ESCC och esofageal preneoplasi. Observera att 4NQO-lesioner också uppstår i munhålan, oftast i tungan, liksom i förmagen, som alla delar det stratifierade skivepitelet. Dessa möss kan dock inte enkelt manipuleras för funktionell hypotestestning, eftersom generering av isogena musmodeller är tids- och resurskrävande. Häri övervinner vi denna begränsning genom att generera encelliga tredimensionella (3D) organoider från möss behandlade med 4NQO för att karakterisera murina ESCC eller preneoplastiska celler ex vivo. Dessa organoider fångar de framträdande egenskaperna hos ESCC och esofageal preneoplasi, kan utnyttjas billigt och snabbt för att bilda isogena modeller och kan användas för syngena transplantationsexperiment. Vi demonstrerar hur man genererar 3D-organoider från normal, preneoplastisk och SCC murin matstrupsvävnad och underhåller och kryokonserverar dessa organoider. Tillämpningarna av dessa mångsidiga organoider är breda och inkluderar användning av genetiskt modifierade möss och ytterligare karakterisering genom flödescytometri eller immunhistokemi, generering av isogena organoidlinjer med CRISPR-teknik och läkemedelsscreening eller syngen transplantation. Vi tror att ett brett antagande av de tekniker som demonstreras i detta protokoll kommer att påskynda framstegen på detta område för att bekämpa den allvarliga bördan av ESCC.
Introduction
Esofagus skivepitelcancer (ESCC) är den dödligaste av humana skivepitelcancer på grund av dess sena diagnos, terapiresistens och metastaser 1,2. ESCC härrör från det stratifierade skivepitelet, som leder matstrupens luminala yta. Skivepitelet består av proliferativa basalceller och differentierade celler inom det suprabasala cellskiktet. Under fysiologiska förhållanden uttrycker basalceller markörer som p63, Sox2 och cytokeratin K5 och K14, medan differentierade celler uttrycker K4, K13 och IVL. Basalceller själva är heterogena och inkluderar förmodade stamceller definierade av markörer som K153 och CD734. Vid homeostas genomgår basalceller postmitotisk terminal differentiering inom det suprabasala cellskiktet, medan differentierade celler migrerar och desquamate in i lumen för att slutföra epitelförnyelse. ESCC påminner om sina ursprungsceller och visar skivepitelcelldifferentiering i varierande grad. ESCC åtföljs ofta av multifokala histologiska prekursorlesioner, kända som intraepitelial neoplasi (IEN) eller dysplasi, bestående av atypiska basaloidceller. Förutom epitelförändringar visar ESCC vävnadsremodellering inom subepitelfacket, där aktivering av cancerassocierade fibroblaster (CAF) och rekrytering av immun / inflammatoriska celler sker för att främja den tumörfrämjande mikromiljön.
Patogenesen av ESCC innebär genetiska förändringar och exponering för miljöriskfaktorer. Viktiga genetiska lesioner inkluderar inaktivering av tumörsuppressorgenerna TP53 och CDKN2A (p16INK4A) och aktivering av CCND1 (cyklin D1) och EGFR-onkogener, som kulminerar i nedsatt cellcykelkontrollpunktsfunktion, avvikande proliferation och överlevnad under genotoxisk stress relaterad till exponering för cancerframkallande ämnen i miljön. Faktum är att genetiska förändringar interagerar nära med beteendemässiga och miljömässiga riskfaktorer, oftast tobaks- och alkoholanvändning. Tobaksrök innehåller cancerframkallande ämnen som acetaldehyd, som också är den viktigaste metaboliten av alkohol. Acetaldehyd inducerar DNA-addukter och interstrand-DNA-tvärbindningar, vilket leder till DNA-skador och ackumulering av DNA-mutationer och kromosomal instabilitet. Med tanke på överdriven mitogen stimuli och avvikande proliferation från onkogenaktivering underlättas den maligna omvandlingen av esofageala epitelceller av mekanismer för att hantera genotoxisk stress, inklusive aktivering av antioxidanter, autofagi och epitelial-mesenkymal övergång (EMT). Intressant nog aktiveras dessa cytoprotektiva funktioner ofta i ESCC-cancerstamceller (CSC) som kännetecknas av högt CD44 (CD44H) uttryck och har förmågan till tumörinitiering, invasion, metastasering och terapiresistens 5,6,7.
ESCC har modellerats i cellodling och i gnagarmodeller 8,9. Under de senaste tre decennierna har robusta genetiskt modifierade musmodeller av ESCC utvecklats. Dessa inkluderar CCND1 och EGFR transgena möss 10,11 och p53 och p120Ctn knockout möss 12,13. Enstaka genetiska förändringar resulterar emellertid vanligtvis inte i snabbt insättande ESCC. Denna utmaning har övervunnits med användning av esofageala cancerframkallande ämnen som rekapitulerar väl de mänskliga genetiska lesionerna i ESCC14. Till exempel påskyndar 4-nitrokinolin-1-oxid (4NQO) ESCC-utvecklingen i CCND1-transgena möss15. Under senare år har förmodade esofageala epiteliala stamceller, stamceller och deras respektive öden undersökts i cellinjespårbara musmodeller 3,4. Vidare har dessa cellinjespårbara möss använts för att utforska ursprungscellerna för ESCC och hur sådana celler ger upphov till CD44H CSC via konventionell histologi och omics-baserad molekylär karakterisering7.
Ett framväxande område relaterat till dessa musmodeller är den nya tillämpningen av cellodlingstekniker för att analysera levande ESCC och prekursorceller i ett tredimensionellt (3D) organoidsystem där arkitekturen hos de ursprungliga vävnaderna rekapituleras ex vivo 7,8,9. Dessa 3D-organoider odlas snabbt från en encellssuspension isolerad från murina vävnader, inklusive primära och metastatiska tumörer (t.ex. lymfkörtel, lung- och leverskador). Cellerna är inbäddade i basalmembranextrakt (BME) och matas med ett väldefinierat serumfritt cellodlingsmedium. 3D-organoiderna växer inom 7-10 dagar, och de resulterande sfäriska strukturerna är mottagliga för subkultur, kryokonservering och analyser för att analysera en mängd olika cellulära egenskaper och funktioner, inklusive CSC-markörer, EMT, autofagi, proliferation, differentiering och apoptotisk celldöd.
Dessa metoder kan i stor utsträckning tillämpas på 3D-organoidkulturer etablerade från någon stratifierad skivepitelvävnad, såsom huvud- och halsslimhinnan (munhålan, tungan, svalget och struphuvudet) och till och med förmagen. Huvud- och halsslemhinnan är angränsande med matstrupen, och de två vävnaderna delar liknande vävnadsorganisation, funktion och mottaglighet för sjukdom. Både skivepitelcancer i huvud och hals (HNSCC) och ESCC delar genetiska skador och livsstilsrelaterade miljöriskfaktorer som tobaks- och alkoholexponering. För att understryka denna likhet utvecklar möss behandlade med tobaksrökmimetisk 4NQO lätt både HNSCC och ESCC. Med tanke på hur lätt protokollen som beskrivs nedan kan tillämpas på modellering av HNSCC, inkluderar vi specifika instruktioner för att upprätta 3D-organoidkulturer från dessa skador.
Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för att generera murina esofageala 3D-organoider (MEO) som representerar normala, preneoplastiska och ESCC-lesioner som utvecklas hos möss behandlade med 4NQO. Olika musstammar kan användas, inklusive vanliga laboratoriestammar såsom C57BL / 6 och cellinjespårbara och andra genetiskt modifierade derivat. Vi betonar de viktigaste stegen, inklusive isolering av normalt eller sjukt murint esofagealt epitel, beredning av encellssuspensioner, odling och övervakning av de växande 3D-organoiderna, subkultur, kryokonservering och bearbetning för efterföljande analyser, inklusive morfologi och andra applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Murina experiment planerades och utfördes i enlighet med föreskrifter och enligt djurprotokoll #AABB1502, granskades och godkändes av Columbia Universitys institutionella djurvårds- och användningskommitté. Mössen var inrymda på en lämplig djurvårdsanläggning som säkerställer human behandling av möss och ger lämplig veterinärvård för mössen och laboratoriesäkerhetsutbildning för laboratoriepersonalen.
1. Behandling av möss med 4NQO för att inducera esofageala IE- och ESCC-lesioner (tidsövervägande: upp till 28 veckor)
OBS: För att generera MEO som representerar neoplastiska esofageala lesioner utsätts mössen för 4NQO-medierad kemisk karcinogenes som tidigare beskrivits av Tang et al.14. Normala/icke-neoplastiska MEO genereras från obehandlade möss.
- Möss
- Hus fyra till fem möss per bur och acklimatisera dem till djuranläggningen i minst 1 vecka innan ett experiment påbörjas. För att minska risken för att åldersrelaterade störningar leder till för tidig avslutning av hela 28-veckorsexperimentet, börja med 8 veckor gamla till 16 veckor gamla möss.
OBS: C57BL / 6 möss som väger cirka 20-30 g användes i detta protokoll. För kortare experiment kan äldre möss användas. Manliga eller kvinnliga möss är acceptabla. Kontroll (ingen behandling, se avsnitt 1.3.1) måste möss matchas i ålder och kön.
- Hus fyra till fem möss per bur och acklimatisera dem till djuranläggningen i minst 1 vecka innan ett experiment påbörjas. För att minska risken för att åldersrelaterade störningar leder till för tidig avslutning av hela 28-veckorsexperimentet, börja med 8 veckor gamla till 16 veckor gamla möss.
- Beredning av dricksvatten innehållande 4NQO
- Bered 1 mg/ml 4NQO stamlösning i etylenpropylenglykol (materialtabell). Lös 100 mg 4NQO i 100 ml 99,9% etylenpropylenglykol i en 500 ml glasbägare täckt med tätningsfilm. Blanda noggrant vid rumstemperatur (RT) med en magnetomrörare vid 800 rpm i 30 min. Förvaras vid 4 °C.
- Tillsätt 900 ml autoklaverat avjoniserat vatten till 100 ml 1 mg/ml 4NQO stamlösning och blanda genom inversion i en 2 L plastcylinder täckt med tätningsfilm. En volym på 1 liter 100 μg / ml 4NQO i 10% etylenpropylenglykol kommer att betjäna två musburar utrustade med en 500 ml drickflaska.
VARNING: Observera att 4NQO är ett syntetiskt kemiskt cancerframkallande ämne som kan orsaka cancer. Hantera med nitrilhandskar och en långärmad labbrock och bära slutna tåskor. Överväg korrekt ögonskydd, ansiktsskydd och huvudskydd. För avfallshantering bör 4NQO placeras i en märkt behållare i enlighet med institutionella riktlinjer för hantering av farligt avfall genom miljöhälsa och säkerhet.
- Behandling med 4NQO och övervakning
- Fäst dricksflaskan och administrera 4NQO via dricksvattnet ad libitum till mössen i 16 veckor. Använd 10% (w/v) propylenglykol som vehikelkontroll (ingen behandling).
OBS: Kortare varaktigheter av 4NQO-behandling kan användas för att inducera IEN. - Fyll på vattnet en gång i veckan.
- Väg varje mus varje vecka genom att placera den i en plastbehållare på en laboratorievåg.
- I slutet av 16 veckors 4NQO-behandlingsperiod, börja ge mössen regelbundet dricksvatten under observationsperioden efter 4NQO i upp till 12 veckor (figur 1).
- Övervaka mössen dagligen för tecken på nöd (t.ex. nedsatt rörlighet, böjd habitus och tillbakadraget beteende), dysfagi och uttorkning. Dessutom utvärdera mössen varje vecka för förändringar i kroppsvikt eller mat och vätskeintag. Om kroppsvikten sjunker med mer än 10% från den ursprungliga kroppsvikten, mata mössen med ett flytande kosttillskott.
OBS: En förlust av kroppsvikt som är eldfast mot flytande kosttillskott kan vara en indikation på ESCC, och möss som förlorar mer än 20% av sin kroppsvikt bör avlivas. Det är viktigt att MEO kan genereras från för tidigt avlivade möss. Observera att C57BL / 6-möss utan genetiska modifieringar vanligtvis inte visar tecken på sjuklighet eller har synliga ESCC-lesioner fram till slutet av observationsperioden efter 4NQO.
- Fäst dricksflaskan och administrera 4NQO via dricksvattnet ad libitum till mössen i 16 veckor. Använd 10% (w/v) propylenglykol som vehikelkontroll (ingen behandling).
- Djurberedning
- Avliva mössen i en CO 2-kammare fylld med CO2 med en flödeshastighet som förskjuter 30% -70% av kammarvolymen per minut. Bekräfta döden genom cervikal dislokation.
- Fäst musens lemmar och näsa i ryggläge till dissektionsplattformen med 21 G nålar.
- Desinficera musens ventrala yta med 70% etanol.
- Dissektion (tidsövervägande: 0,5 h)
- Öppna huden genom att nypa i mitten av buken päls och hud för att säkerställa att den släpps från inälvorna nedan. Använd den kirurgiska saxen för att göra ett kranioaudalt, ventralt snitt från underlivet till hakan.
- Börja vid mittlinjens snitt, använd kirurgisk sax för att göra radiella snitt som sträcker sig till lemmarna på båda sidor av musen. Flä hudflikarna öppna.
- För att exponera livmoderhalsen, använd dissekeringssaxen för att dela spytkörtlarna vid mittlinjen. Trachea ligger djupt i körtlarna.
- För att exponera bröstkorgen, ta bort bröstbenet.
- Nyp försiktigt och lyft bukhinnan med pincett och använd sax för att dela bukhinnan kranioaudalt och lateralt längs ribbburet.
- Dra försiktigt tillbaka levern från membranets kaudala yta och använd sax för att göra ett litet snitt i membranet vid sternalhacket, speciellt vid dorsalytan av xiphoidprocessen. Detta frigör lungan och hjärtat från den viscerala pleuraen.
- Separera bröstkorgen från bröstkorgsinnehållet. Sätt in sax i snittet i membranet och dissekera kranialt till livmoderhalsen. Under denna dissektion, fäst nära bröstbenets dorsala yta för att undvika skador på organen nedan. Se till att dissektionsplanet är främre mot luftstrupen.
- Klipp revbenen på vardera sidan av bröstbenet med sax och ta bort bröstbenet. Se till att bröstkorgsinnehållet exponeras.
- Exponera bukstrupen. Lyft försiktigt magen framåt genom att hålla antrum med pincett. Dissekera mjälten, bukspottkörteln och mesenteriet från magen och matstrupen med sax.
- Exponera bröstkorgsmatstrupen (figur 2).
- Lyft försiktigt luftstrupen omedelbart caudal till sköldkörtelbrosket och dissekera matstrupen på luftrörets dorsala sida med irissax.
- Dela luftstrupen vid sköldkörtelbrosket med irissax.
- Skala luftstrupen från resten av matstrupen via försiktig dissektion i kaudal riktning.
- Ta bort lungan, hjärtat och tymus i massor med luftstrupen. Var försiktig så att du undviker skador på matstrupen när du dissekerar och delar aorta och vena cava.
- Dela magen vid pylorus med sax.
- Separera matstrupen från ryggkotan genom att hålla antrummet med pincett och dissekera kranialt.
- Dela matstrupen vid nivån av sköldkörtelbrosket och skörda matstrupen och magen en massa (Figur 3).
- Separera magen och matstrupen genom att dela matstrupen vid cardia (figur 4, övre panelen, röd linje).
- Dissekera av någon fascia på matstrupens yttre yta. För att reservera ett prov för histologi (valfritt), ta bort hälften av matstrupen och dela i längdriktningen med sax. Placera den återstående intakta matstrupen i kall PBS på is.
- Öppna magen längs den större krökningen och tvätta med PBS tillräckligt. Separera förmagen och tvätta med kall PBS. Placera förmagen i kall PBS på is.
- För att skörda tungan, ta bort 21 G nålen på näsan och dra ut tungan med pincett. Skär tungan så länge som möjligt. Lägg tungan i kall PBS på is.
2. Etablering av murin esofageal organoid (MEO) kultur
OBS: Detta protokoll kan också användas för att etablera en murin tungorganoidkultur med tillsats av ett steg där tungvävnaden hakas före trypsinisering. Se anmärkningen i steg 2.2.3.
- Beredning av reagenser
OBS: En lista över reagenser finns i materialförteckningen. Bered och förvara stamlösningarna enligt tillverkarens anvisningar om inte annat anges.- Se till att engångsalikvoterna av basalmembranmatrisen (BME) som används i detta protokoll förvaras vid −20 °C fram till användningsdagen, därefter tinas på is eller vid 2-8 °C och hålls på is hela tiden när de inte används.
- Lös 250 mg sojaböntrypsinhämmare (STI) i 1 000 ml PBS (250 mg/ml lagerkoncentration) och filtersterilisera (0,22 μm) den. Fördela 50 ml alikvoter i koniska rör och förvara i upp till 6 månader vid 4 °C.
- Förbered musorganoidmediet (MOM): Komplettera avancerad DMEM / F12 med 1 mM N-acetyl-L-cystein (NAC), 2% R-Spondin och Noggin konditionerat medium (RN CM), 1x N-2 tillägg, 1x B-27 tillägg, 10 mM HEPES, 1x antibiotika-antimykotisk, 1x GlutaMAX tillägg, och 100 ng / ml mus epidermal tillväxtfaktor (mEGF). Förbered MOM 500 ml åt gången, dela den i 50 ml alikvoter och förvara vid 2-8 °C tills den är klar att användas. Tillsätt 0,5 μg/ml amfotericin B och 10 μM Y-27632 strax före användning.
- Förvärm MOM, 0,25% trypsin och sojaböntrypsinhämmare (STI) till 37 ° C i ett vatten- eller pärlbad före användning.
- Isolering av keratinocyter från den dissekerade musvävnaden (tidsövervägande: 2 timmar)
- Överför matstrupsvävnaden till 500 μl dispas i PBS (totalt 2,5-5 enheter) och inkubera i en termomixer i 10 minuter vid 37 °C och 800 rpm.
- Överför vävnaden till en odlingsskål och ta försiktigt bort muskelskiktet från epitelet med pincett (figur 4).
OBS: Detta steg kan också utföras av en erfaren forskare före inkubation med dispase. - Överför epitelet till ett mikrocentrifugrör innehållande 500 μL 0,25% trypsin och inkubera i en termomixer i 10 minuter vid 37 °C och 800 rpm.
OBS: Om utgångsmaterialet är tungvävnad, hacka vävnaden med en steril skalpell i mindre bitar, ca 1-2 mm2 i storlek, innan du tillsätter trypsinet. - Centrifugera kort i 5-10 s vid 2 000 x g för att pellet vävnaden. Förbered ett 50 ml koniskt rör med en 100 μm cellsil. Överför vävnads-/cellsuspensionen genom silen med en bred hålspets med cirkulära rörelser.
- Tillsätt 3 ml STI genom silen med cirkulära rörelser för att tvätta.
- Skrubba silen med basen av en 1 ml tuberkulinsprutkolv för att trycka igenom cellerna.
- Tvätta silen med 3 ml PBS 3-5 gånger, skrubba silen med sprutans botten mellan tvättarna.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C för att pellet cellerna.
- Ta bort supernatanten och lämna 1 ml lösning i röret.
- Återsuspendera pelleten i de återstående 1 ml och överför cellsuspensionen genom en 70 μm cellsil till ett nytt 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C för att pellet cellerna.
- Återsuspendera pelleten i 100 μL MOM; Justera volymen efter behov. Utför ett automatiserat cellantal genom trypan blå uteslutning.
- Sådd av den initiala cellsuspensionen (tidsövervägande: <1 timme)
- Förvärm en cellodlingsplatta med 24 brunnar i en inkubator på 37 °C.
- Platta 5 000 viabla celler i 75% (v/v) BME/MOM med 50 μL total volym per brunn. Maximera antalet pläterade brunnar och förbered tillräckligt med celler i BME för en extra brunn enligt exempelberäkningarna nedan.
OBS: Kryokonservera eventuella överflödiga celler i kryokonserveringsmediet (10% DMSO i FBS) vid en maximal koncentration av 1 x 106 celler / ml. Förvara kryovialerna i en frysbehållare över natten vid -80 ° C. Överför dem till flytande kväve i ångfas för långvarig lagring. - I ett mikrocentrifugrör, förbered först en lämplig cellutspädning i MOM och tillsätt sedan BME med en bred borrspets strax före plätering.
- Tillsätt långsamt en 50 μL droppe med en 200 μL bred borrspets till mitten av brunnen och undvik kontakt mellan spetsen och brunnens botten eller sidor (figur 5). Var försiktig så att du inte använder för mycket kraft för att driva ut vätskan från spetsen, annars kommer kupolen att platta.
- Låt BME stelna i 30 minuter i en 37 °C, 5% CO2, 95% relativ fuktighet (RH) inkubator.
- Tillsätt försiktigt 500 μL MOM per brunn kompletterad med 0,5 μg/ml amfotericin B och 10 μM Y-27632.
OBS: Lägg till amfotericin till all MOM under hela den ursprungliga primärkulturen. Lägg till Y-27632 endast på passeringsdagen (dag 0) för alla passager. - Byt MOM på dag 3-4 och sedan var 2-3: e dag efter det tills den är redo att passera.
- På dagarna 7-10, avbilda organoiderna och mät organoidbildningshastigheten (OFR) genom att dividera antalet organoider som bildas av antalet celler som ursprungligen såddes.
Exempel på beräkningar:
- Passaging och kryokonservering av murina esofageala organoider (MEO) (tidsövervägande: <1,5 h)
- Tina och håll BME på is. Förvärm MOM, 0,05% trypsin och STI till 37 ° C i ett vatten- eller pärlbad före användning. Förvärm en cellodlingsplatta med 24 brunnar i en inkubator på 37 °C.
- Använd en mikropipettspets med bred borrning och samla organoiderna i BME-kupolen tillsammans med supernatanten. Stör BME genom att pipettera upp och ner.
OBS: Kombinera brunnarna som innehåller identiska prover till ett enda mikrocentrifugrör. - Centrifugera kort i 10-15 s vid 2 000 x g för att pellet organoiderna. Ta bort och kassera supernatanten.
- Lossa försiktigt pelleten och suspendera pelleten igen i 500 μL 0,05% trypsin.
- Inkubera röret/rören i en termomixer vid 37 °C och 800 rpm i 10 minuter.
- Inaktivera trypsinet med 600 μL STI.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min vid 4 °C för att pellet cellerna.
- Ta bort och kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 100 μL MOM. Utför ett automatiserat cellantal genom trypan blå uteslutning.
OBS: Volymen kan justeras efter behov. - Platta 2 000-5 000 viabla celler i 75% (v/v) BME/MOM med 50 μL total volym per brunn. Maximera antalet brunnar pläterade och förbered tillräckligt med celler i BME för en extra brunn enligt exempelberäkningarna som nämnts tidigare.
OBS: Kryokonservera eventuella överflödiga celler i kryokonserveringsmediet (10% DMSO i FBS) vid en maximal koncentration av 1 x 106 celler / ml. Förvara kryovialerna i en frysbehållare över natten vid -80 ° C. Överför dem till flytande kväve i ångfas för långvarig lagring. - I ett mikrocentrifugrör, förbered först en lämplig cellutspädning i MOM och tillsätt sedan BME med en bred borrspets strax före plätering.
- Använd en 200 μL bred borrspets och tillsätt långsamt en 50 μL droppe till mitten av brunnen och undvik kontakt mellan spetsen och botten eller sidorna av brunnen. Var försiktig så att du inte använder för mycket kraft för att driva ut vätskan från spetsen, annars kommer kupolen att platta.
- Inkubera plattan i 30 minuter i en 37 °C, 5% CO 2,95% RH-inkubator.
- Tillsätt försiktigt 500 μL MOM per brunn kompletterad med 10 μM Y-27632.
OBS: Lägg till Y-27632 endast på passeringsdagen (dag 0). Det är onödigt att lägga till det under medieändringarna. Tillsats av amfotericin B är inte längre nödvändigt. - Byt MOM på dag 3-4 och sedan var 2-3: e dag efter det tills den är redo att passera.
- På dagarna 7-10, avbilda organoiderna och mät OFR.
- Upptining och återvinning av murina esofageala organoider (MEO) (tidsövervägande: <1 h)
- Tina och håll BME på is. Förvärm en cellodlingsplatta med 24 brunnar i en inkubator på 37 °C.
- Förbered 10 ml kallt eller RT MOM eller PBS i ett 15 ml koniskt rör.
- Tina en kryovial i ett 37 ° C vattenbad eller pärlbad i cirka 30 s till 1 min eller tills en liten ispellet återstår.
- Med en förfuktad pipetspets, överför långsamt cellsuspensionen till röret innehållande MOM eller PBS på ett droppvis sätt.
- Centrifugera röret i 300 x g och 4 °C i 5 minuter för att pellet cellerna.
- Ta bort och kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 100 μL MOM; Justera volymen efter behov. Utför ett automatiserat cellantal genom trypan blå uteslutning.
- Platta 5 000-10 000 viabla celler i 75% (v/v) BME/MOM med 50 μL total volym per brunn. Maximera antalet brunnar pläterade och förbered tillräckligt med celler i BME för en extra brunn enligt exempel på beräkningar som nämnts tidigare.
- Fortsätt med de återstående stegen i protokollet för passage och kryokonservering av murina esofageala organoider (MEO) (se steg 2.4.11).
3. Beredning av organoider för paraffinininbäddning (tidsövervägande: <1 h [plus 1,5 h för reagensberedning])
- Använd en mikropipettspets med bred borrning och samla tre brunnar per mikrocentrifugrör. Samla organoiderna i BME-kupolen tillsammans med supernatanten. Stör BME genom att pipettera upp och ner.
- Centrifugera kort i 10-15 s vid 2 000 x g för att pellet organoiderna. Ta bort och kassera supernatanten.
- Lossa försiktigt pelleten och suspendera pelleten igen i 300 μl 4 % paraformaldehyd (PFA).
- Fixera organoiderna över natten vid 4 °C.
- Centrifugera kort i 10-15 s vid 2 000 x g för att pellet organoiderna. Ta bort och kassera så mycket PFA som möjligt.
- Lossa försiktigt pelleten och suspendera pelleten igen i 500 μL PBS.
OBS: Fasta organoider kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor innan de går vidare till nästa steg. - Förbered ett 50 ml lager agargel (2% agar plus 2,5% gelatin).
OBS: Förbered agargelstammen i förväg på grund av inkubationstiden, följt av autoklavcykeln.- Återsuspendera 1 g Bacto-agar och 1,25 g gelatin i 50 ml vatten i en 150 ml autoklaverbar glasbägare.
- Snurra fjädringen och låt den sitta i 30-60 minuter vid RT.
- Autoklav i 20 min vid 121 °C.
- Kyl något och fördela 5 ml alikvoter i 15 ml koniska rör.
- Förvara i upp till 6 månader på RT.
- Förbered en inbäddningsyta genom att invertera ett mikrocentrifugrörställ och täcka ytan med ett ark tätningsfilm. Etikett med motsvarande organoid-ID.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min för att pellet organoiderna. Ta bort och kassera supernatanten.
- Gör agargelen flytande genom att placera ett 15 ml koniskt rör innehållande agargelen i en 150 ml glasbägare innehållande 100 ml vatten och mikrovågsugn på högsta effektinställning i 1-2 minuter eller tills vattnet börjar koka och agargelen är i flytande tillstånd.
VARNING: Lossa locket på det koniska röret som innehåller agargelen före mikrovågsugn. - Sänk delvis ner mikrocentrifugröret som innehåller organoidpelleten i varmt vatten utan att införa något vatten i mikrocentrifugröret.
- Överlägg försiktigt organoidpelleten genom att tillsätta 50 μL agar längs rörets sida.
- Utan att störa pelleten (återsuspendera inte, håll pelleten intakt), överför pelleten i agargeldroppen till tätningsfilmen på inbäddningsytan.
- Upprepa steg 3.12 och steg 3.13 med ytterligare 50 μl flytande agargel för att samla upp eventuell kvarvarande organoidpellet, och tillsätt försiktigt till samma geldroppe.
- Inkubera droppen med organoidpelleten i 45 minuter vid 4 °C.
- Överför försiktigt droppen som innehåller organoidpelleten till en märkt patologikassett med pincett.
- Förvara kassetten i 70% etanol vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Fortsätt med paraffininbäddning via rutinmässig histologisk bearbetning för att förbereda paraffinblock.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver processen att generera murina esofageala organoider (MEO) från normal matstrupenvävnad eller ESCC-tumörvävnad från 4NQO-behandlade möss enligt en specifik behandlingsregim bestående av 16 veckor av 4NQO administrerad i dricksvatten, följt av en observationsperiod på 10 veckor till 12 veckor (figur 1). Mössen avlivas sedan för dissektion av tungan eller matstrupen vävnad (figur 2 och figur 3). Vi beskriver en metod för isolering av epitelskiktet från den intakta matstrupen (Figur 4) som ska användas för efterföljande encellsisolering. Esofagus-härledda epitelceller pläteras initialt vid 5 000 celler per brunn i 50 μL droppar innehållande celler i en basalmembranmatris och välkarakteriserat serumfritt cellodlingsmedium (figur 5) och tillåts bilda organoider under 7-10 dagar i genomsnitt. Murina esofageal-, tung- och förmagsorganoider kan karakteriseras ytterligare genom morfologisk analys genom faskontrast / ljusfältavbildning och histopatologi (figur 6). Organoidernas självförnyelseförmåga kan bedömas genom att bestämma OFR vid subkultur (figur 7). OFR påverkas till stor del av innehållet i de proliferativa basaloidcellerna, vilket avslöjas av tillväxtkinetikanalysen i kombination med deras morfologi (figur 8). Slutligen växer dessa organoider, inklusive normala strukturer från 4NQO-obehandlade möss, kontinuerligt och kan bibehållas under lång tid (figur 9).
Figur 1: 4NQO-behandlingsregimen. Mössen behandlas med 4NQO i dricksvatten i 16 veckor, följt av en observationsperiod på 10 veckor till 12 veckor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exponera bröstmatstrupen. Trachea (blå linjer) skalas bort från matstrupen (vita linjer). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Matstrupe (vita linjer) anslutna till magen (gula linjer) vid skivepitelkorsningen (blå linje). Förkortningar: FS = förmage, DS = distal mage, L = lever. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Separera magen och matstrupen och isolera epitelet. Övre: Magen är separerad från matstrupen. Den röda linjen indikerar var matstrupen ska lossas under dissektion. Mitten: Epitelet (vit linje) skalas bort från muskelskiktet. Nedre: Matstrupen som bär tumörer enligt behandlingsschemat som beskrivs i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Plätering av BME-droppen som innehåller enstaka celler med hjälp av en bred borrspets. Organoiderna börjar bildas runt dag 4-7 och är redo att passeras efter 7-10 dagar i genomsnitt. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Karakterisering av organoiderna genom morfologisk analys. (A) Representativa bilder av normala och ESCC MEO. Uppe till vänster: Brightfield-bild av en normal MEO. Nere till vänster: H&E-färgning av en normal MEO. Uppe till höger: Brightfield-bild av en ESCC MEO från en 4NQO-behandlad mus. Nedre höger: H&E-färgning av en ESCC MEO från en 4NQO-behandlad mus som visar nukleär atypi och abrupt keratinisering, den senare påminner om en keratinpärla, som representerar ett väl differentierat fack i en SCC-tumör. (B) Representativa bilder av normala organoider från mus och mage (MTO respektive MFO). Uppe till vänster: Brightfield-bild av ett normalt MTO. Nere till vänster: H&E-färgning av ett normalt MTO. Uppe till höger: Brightfield-bild av en normal MFO. Nere till höger: H&E-färgning av en normal MFO. Alla skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bestämning av organoidförnyelsekapacitet. (A) Experimentell design för att bestämma organoidförnyelsekapaciteten genom subkultur. De växande primära organoiderna (P0) dissocieras vid olika tidpunkter och görs till encellssuspensioner. Dessa celler passeras för att bestämma OFR vid dag 7 i subkulturen (P1). (B) Representativa OFR-data från överförda MEO genererade från 4NQO-obehandlade möss. Observera att OFR minskar som en funktion av tiden, vilket återspeglar minskade proliferativa basaloidceller i de mogna organoiderna, som innehåller fler celler som har genomgått postmitotisk terminal differentiering (se figur 8). p < 0,001 (n = 6) OFR dag 7, dag 11 och dag 21 jämfört med OFR dag 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Tillväxtkinetiken hos organoider som avslöjas av deras morfologi vid olika tidpunkter. Representativa ljusfälts- och H&E-färgningsbilder av en normal MEO från 4NQO-obehandlade möss visas. Observera att keratiniseringen av den inre kärnan av organoider blir framträdande vid dag 10. De proliferativa basaloidcellerna förblir i det yttersta cellskiktet även vid dag 14 och dag 21 tidpunkter. För immunhistokemi/immunofluorescens kan ackumulerat keratin orsaka ospecifik färgning, vilket är fallet för ursprungliga skivepitelvävnader, vilket motiverar en noggrann optimering av färgningsförhållandena, kontroller (t.ex. endast sekundär antikropp) och datatolkning. Alla skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: En populationsfördubblingskurva för ett representativt normalt medelfristigt budgetmål genererat från 4NQO-obehandlade möss. Dessa organoider genererades tidigare, kryopkonserverades och tinades för att visa sin stadiga tillväxt över flera passager och långsiktig kultur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera kritiska steg och överväganden för generering och analys av MEO i de protokoll som beskrivs här. För att säkerställa reproducerbarhet och noggrannhet i MEO-experiment är både biologiska och tekniska replikat viktiga. För biologiska replikat är två till tre oberoende möss som bär ESCC i allmänhet tillräckliga per experimentellt tillstånd. Det lämpliga antalet biologiska replikat kan dock variera beroende på vilka parametrar som ska testas i enskilda studier. Till exempel är det för närvarande okänt hur tidigt och hur ofta neoplastiska organoider kan detekteras från 4NQO-behandlade möss utan makroskopiskt synliga lesioner eller histologiska IEN- och ESCC-lesioner. Även om 4NQO inducerar esofageala lesioner i olika musstammar14, har MEO endast genererats från C57BL / 6-möss. Utvecklingen och progressionen av ESCC accelereras hos möss med genetiskt modifierade genetiska lesioner såsom Trp53-förlust och cyklin D1-överuttryck 7,14,15. Hos sådana möss kan neoplastiska MEO uppstå oftare och tidigare än hos vildtyp C57BL / 6-möss under eller efter 4NQO-behandling. Vid behov bör pilotstudier utföras för att uppskatta lämplig provstorlek på möss i planerade experiment. Med cellodlingsplattor med flera brunnar skapas enkelt tekniska replikat (n = 3-6). Noggrann pipettering och övning är dock motiverad för att minimera väl-till-brunn-variabilitet eftersom cellerna dispenseras i ett visköst medium innehållande BME.
En nästan 100% framgångsgrad kan förväntas för MEO-etablering i de beskrivna protokollen. Framgångsrik MEO-kultur beror emellertid på livskraften hos de initiala isolerade esofaguseala epitelcellerna, vilket till stor del är relaterat till utgångsmaterialets kvalitet. Om mössen inte omedelbart kan dissekeras vid avlivning kan slaktkropparna förvaras vid 4 °C över natten för att isolera matstrupen följande dag. Slaktkropparna bör dock inte frysas, eftersom frusen vävnad inte ger livskraftiga celler. De dissocierade esofaguseepitelcellerna kan frysas som en encellssuspension i ett frysmedium (90% FBS och 10% DMSO) och lagras i flytande kväve för att generera organoider vid ett senare tillfälle. Matstrupen (epitelplattor) kan kryokonserveras på liknande sätt, om än mindre optimalt. Medan MEO kan initieras med celler renade genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och andra metoder för att rena unika undergrupper av esofaguseala epitelceller, kan cellviabiliteten minskas efter rening. Det bör noteras att cellviabilitetsanalyser såsom trypanblått uteslutningstest kan skilja levande celler från döda celler men inte döende celler, vilket underskattar cellviabiliteten före organoidodlingsinitiering. Efter etablering kan MEO från både 4NQO-behandlade och obehandlade möss passeras på obestämd tid (>20 passager), med >80% livskraft förväntad vid varje passage i det angivna mediet. Det är anmärkningsvärt att det finns organoidmediekomponenter vars krav fortfarande är oklara. Zheng et al. visade nyligen att ett tillägg bestående av Wnt3A, RSpondin-1 och Noggin krävs för att odla murina esofageala organoider16. Vi använder dock inte Wnt3A i detta protokoll eftersom organoider från tungan, matstrupen och förmagen växer och kan passeras flera gånger (>10 passager) utan det 7,3,17. Det bör noteras att kraven för dessa faktorer inte har testats individuellt.
Epitelplattor används för att generera MEO från den normala matstrupen eller matstrupen slemhinnan utan makroskopiskt synliga lesioner såsom tumörer. Användningen av epitelplåtar möjliggör anrikning av epitelceller som utgångsmaterial. Isoleringen av epitelplåtarna från den tumörbärande matstrupen slemhinnan är emellertid svår på grund av ESCC-invasion i subepitelfacken. Hela matstrupen kan användas för att initiera MEO-odling, även om närvaron av icke-epitelcellpopulationer kan minska organoidbildningshastigheten (OFR) i den ursprungliga kulturen. OFR förväntas stiga i de efterföljande passagerna, eftersom de nuvarande MEO-odlingsförhållandena tillåter epitelceller att växa inom BME. Observera att protokollen som beskrivs här också kan tillämpas på andra organ, särskilt muntungan och förmagen, som båda är mottagliga för 4NQO-inducerad skivepitelcancerframkallande. Observera att vi har genererat mustungorganoider (MTO) och musförmagsorganoider (MFO) från hela vävnaderna utan att isolera epitelcellerna. Vid behov kan dessa organoider tillverkas från en subpopulation av epitelceller renade genom fluorescensaktiverad cellsortering (t.ex. cancerstamceller som kännetecknas av högt CD44-uttryck, CD73 + förmodade esofageala stamceller).
Dessutom kan icke-epitelceller, i synnerhet fibroblaster, migrera ut ur BME för att växa i ett monolager på plastytan, vilket möjliggör samtidig etablering av murina esofagusfibroblaster, inklusive cancerassocierade fibroblaster. Selektiviteten för epitelcelltillväxt i 3D BME kan begränsa samodling av MEO med immunceller och andra celltyper under de nuvarande förhållanden som beskrivs här. Optimering för samodlingsexperiment pågår. Dessutom kan tumörinvasivfronten sammanfattas bättre i epitelial-stromalgränssnittet modellerat med alternativa 3D-odlingsmetoder såsom organotypisk 3D-kultur 8,18. Dessutom kan MEO inte vara en lämplig plattform för att mäta epitelbarriärfunktionen, som bättre kan utvärderas genom att använda luft-vätskegränssnittskultur för att bedöma det transepiteliala elektriska motståndet 19,20,21.
Den främsta fördelen med MEO, och faktiskt MTO och MFO, är den snabba tillväxten av encellshärledda strukturer som rekapitulerar de ursprungliga epitelstrukturerna, både godartade och maligna. Fördubblingstiden (DT) för dessa organoider uppskattas typiskt till <20 timmar. Tillväxtkinetiken för normala MTO från 4NQO-obehandlade möss illustrerar både förmågan för långsiktig odling av normala organoider, liksom den förväntade populationsfördubblingsnivån (PD) och DT (figur 9). I detta exempel inträffade ungefär 10 befolkningsfördubblingar under varje passage, med en beräknad DT på 18,5 timmar och 18,3 timmar i genomsnitt. Efter den initiala primärkulturen förväntas vanligtvis en OFR på 15% -25%, oavsett sådddensitet, och MEO kan dyka upp så tidigt som dag 4 (figur 8), även om de kan vara mindre i storlek. Under faskontrastmikroskopi visar organoider från den normala matstrupen slemhinnan sfäriska strukturer med släta ytor. Som en funktion av tiden visar normala organoider en koncentrisk struktur när den inre cellmassan genomgår postmitotisk terminal differentiering, vilket genererar en differentieringsgradient som efterliknar det stratifierade skivepitelet. Neoplastiska organoider visar oregelbundna ytor, vilket återspeglar basaloidcellernas höga proliferativa aktivitet, som kan expandera utåt. MEO: s förmåga att visa en proliferationsdifferentieringsgradient kan utnyttjas för att studera hur proliferativa esofageala basala keratinocyter kan sprida sig och genomgå postmitotisk terminal differentiering. Genom att subkultuera dissocierade MEO-celler kan man utvärdera epitelcellens självförnyelse (figur 7), såväl som regenerering eller transformation under genotoxisk stress inducerad av 4NQO. Liknande studier kan också utföras med användning av MTO-modellen i samband med oral cancer, vilket breddar tillämpningen av den beskrivna 4NQO-musorganoidmodellen till huvud och hals SCC. Medan epitelförnyelse kan innebära stamceller, är en potentiell svaghet i MEO-systemet att det kanske inte upptäcker vilande eller sällan delande stamceller, eftersom MEO-bildning beror på cellproliferation. En nyligen genomförd encellsanalysstudie på MEO gav betydande inblick i esofageal epitelcellsheterogenitet22.
Malign transformation kan bedömas genom noggrann morfologisk bedömning av enskilda MEO-strukturer och nukleär atypi hos celler som innefattar MEO. Den molekylära profileringen av MEO genom helexomsekvensering och RNA-sekvensering kan avslöja den distinkta karaktären hos preneoplastiska och ESCC-lesioner. Det ultimata testet för malign transformation kan dock kräva transplantation av MEO till antingen immunbristfälliga eller immunkompetenta möss för att dokumentera ESCC-cellernas tumörigenicitet. ESCC MEO transplanterade i syngena immunkompetenta möss kan också ge en utmärkt plattform för att undersöka tumörens immunmikromiljö.
Tillämpningarna av MEO är breda. Förutom morfologi, biokemi och multi-omics-metoder kan flödescytometri användas inte bara för att analysera cellulära processer såsom DNA-syntes, apoptos, autofagi och mitokondriell andning utan också cellytmarkörer som definierar unika undergrupper av celler inom MEO som motsvarar genetiska och farmakologiska modifieringar ex vivo 7,23 . Dessutom kan organoider användas för samodlingsexperiment för att utvärdera interaktionerna mellan epitelcellerna och stroma, immuncellerna eller till och med mikrobiomet24. Slutligen kan MEO genereras från möss som bär cellinjespårbara genetiska modifieringar, såsom fluorescerande reporterprotein uttryckt under en celltypspecifik genreglerande promotor (t.ex. Sox2, cytokeratiner Krt5 och Krt15)3,4,7,25.
Sammanfattningsvis är MEO ett ovärderligt verktyg för studier av ESCC. Protokollen som beskrivs här syftar till att visa att MEO representerar en mångsidig modell som är relativt lätt att generera, underhålla och karakterisera och har förmågan att rekapitulera funktionerna i ESCC och esofageal neoplasi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar de delade resurserna (flödescytometri, molekylär patologi och konfokal och specialiserad mikroskopi) vid Herbert Irving Comprehensive Cancer Center vid Columbia University för teknisk support. Vi tackar Drs. Alan Diehl, Adam J. Bass och Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) och medlemmar av Rustgi- och Nakakawa-laboratorierna för hjälpsamma diskussioner. Denna studie stöddes av följande NIH-bidrag: P01CA098101 (H.N. och A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. och H.N.) och P30CA013696 (A.K.R.). H.N. och C.L. är mottagare av Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. är mottagare av Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. är mottagare av The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) och en American Association for Cancer Research Award. J.G. är mottagare av American Gastroenterological Association (AGA) utmärkelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B.
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
