Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Evaluering av antimikrobielle aktiviteter av nanopartikler og nanostrukturerte overflater in vitro

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64712
Automatic Translation
1, 3, 1,2,3
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

Summary

Vi introduserer fire metoder for å evaluere de antimikrobielle aktivitetene til nanopartikler og nanostrukturerte overflater ved hjelp av in vitro-teknikker . Disse metodene kan tilpasses for å studere samspillet mellom forskjellige nanopartikler og nanostrukturerte overflater med et bredt spekter av mikrobielle arter.

Abstract

De antimikrobielle aktivitetene til nanopartikler og nanostrukturerte overflater, som sølv, sinkoksid, titandioksid og magnesiumoksid, har blitt utforsket tidligere i kliniske og miljømessige innstillinger og i forbruksvarer. Imidlertid har mangel på konsistens i eksperimentelle metoder og materialer som brukes kulminert i motstridende resultater, selv blant studier av de samme nanostrukturtyper og bakteriearter. For forskere som ønsker å bruke nanostrukturer som tilsetningsstoff eller belegg i et produktdesign, begrenser disse motstridende dataene bruken i kliniske omgivelser.

For å konfrontere dette dilemmaet, presenterer vi i denne artikkelen fire forskjellige metoder for å bestemme antimikrobielle aktiviteter av nanopartikler og nanostrukturerte overflater, og diskutere deres anvendelighet i forskjellige scenarier. Tilpasning av konsistente metoder forventes å føre til reproduserbare data som kan sammenlignes på tvers av studier og implementeres for forskjellige nanostrukturtyper og mikrobielle arter. Vi introduserer to metoder for å bestemme de antimikrobielle aktivitetene til nanopartikler og to metoder for antimikrobielle aktiviteter av nanostrukturerte overflater.

For nanopartikler kan den direkte samkulturmetoden brukes til å bestemme minimumshemmende og minimum bakteriedrepende konsentrasjoner av nanopartikler, og metoden for direkte eksponeringskultur kan brukes til å vurdere bakteriostatisk versus bakteriedrepende aktivitet i sanntid som følge av nanopartikkeleksponering. For nanostrukturerte overflater brukes den direkte kulturmetoden til å bestemme levedyktigheten til bakterier indirekte og direkte i kontakt med nanostrukturerte overflater, og eksponeringsmetoden for fokusert kontakt brukes til å undersøke antimikrobiell aktivitet på et bestemt område av en nanostrukturert overflate. Vi diskuterer viktige eksperimentelle variabler å vurdere for in vitro studiedesign ved bestemmelse av antimikrobielle egenskaper av nanopartikler og nanostrukturerte overflater. Alle disse metodene er relativt lave kostnader, benytter teknikker som er relativt enkle å mestre og repeterbare for konsistens, og gjelder for et bredt spekter av nanostrukturtyper og mikrobielle arter.

Introduction

Bare i USA utvikler 1,7 millioner individer en sykehuservervet infeksjon (HAI) årlig, med en av hver 17 av disse infeksjonene som resulterer i død1. I tillegg er det anslått at behandlingskostnadene for HAIs varierer fra $ 28 milliarder til $ 45 milliarder årlig 1,2. Disse HAIene domineres av meticillinresistente gule stafylokokker (MRSA)3,4 og Pseudomonas aeruginosa4, som vanligvis isoleres fra kroniske sårinfeksjoner og vanligvis krever omfattende behandling og tid for å gi et gunstig pasientutfall.

I løpet av de siste tiårene har flere antibiotikaklasser blitt utviklet for å behandle infeksjoner relatert til disse og andre patogene bakterier. For eksempel har rifamycinanaloger blitt brukt til å behandle MRSA, andre gram-positive og gram-negative infeksjoner, og Mycobacterium spp. infeksjoner5. På 1990-tallet, for effektivt å behandle et økende antall M. tuberculosis-infeksjoner, ble flere stoffer kombinert med rifamycinanaloger for å øke effektiviteten. Imidlertid forblir omtrent 5% av M. tuberculosis-tilfellene resistente motrifampicin5,6, og det er økende bekymring for multiresistente bakterier7. For tiden kan bruk av antibiotika alene ikke være tilstrekkelig i behandlingen av HAIs, og dette har provosert et pågående søk etter alternative antimikrobielle terapier1.

Tungmetaller, som sølv (Ag) 8,9,10 og gull (Au) 11, og keramikk, som titandioksid (TiO 2) 12 og sinkoksid (ZnO) 13, i nanopartikkel (NP) form (AgNP, AuNP, TiO2 NP og ZnONP, henholdsvis) har blitt undersøkt for deres antimikrobielle aktiviteter og har blitt identifisert som potensielle antibiotikaalternativer. I tillegg bioresorberbare materialer, som magnesiumlegeringer (Mg legeringer)14,15,16, magnesiumoksid nanopartikler 17,18,19,20,21 og magnesiumhydroksid nanopartikler [nMgO og nMg(OH)2, henholdsvis] 22,23,24, har også blitt undersøkt. Imidlertid brukte de tidligere antimikrobielle studiene av nanopartikler inkonsistente materialer og forskningsmetoder, noe som resulterte i data som er vanskelige eller umulige å sammenligne og noen ganger motstridende i naturen18,19. For eksempel varierte den minste hemmende konsentrasjonen (MIC) og minimum bakteriedrepende konsentrasjon (MBC) av sølvnanopartikler betydelig i forskjellige studier. Ipe et al.25 evaluerte de antibakterielle aktivitetene til AgNPs med en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på ~ 26 nm for å bestemme MICs mot gram-positive og gram-negative bakterier. De identifiserte mikrofonene for P. aeruginosa, E. coli, S. aureus og MRSA var henholdsvis 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml og 10 μg/ml. I motsetning til dette evaluerte Parvekar et al.26 AgNPs med en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på 5 nm. I dette tilfellet ble AgNP MIC og en MBC på 0,625 mg / ml funnet å være effektive mot S. aureus. I tillegg evaluerte Loo et al.27 AgNPs med en størrelse på 4, 06 nm. Når E. coli ble utsatt for disse nanopartiklene, ble MIC og MBC rapportert ved 7, 8 μg / ml. Endelig undersøkte Ali et al.28 de antibakterielle egenskapene til sfæriske AgNPs med en gjennomsnittlig størrelse på 18 nm. Når P. aeruginosa, E. coli og MRSA ble utsatt for disse nanopartiklene, ble MIC identifisert ved henholdsvis 27 μg / ml, 36 μg / ml, 27 μg / ml og 36 μg / ml, og MBC ble identifisert ved henholdsvis 36 μg / ml, 42 μg / ml og 30 μg / ml.

Selv om den antibakterielle aktiviteten til nanopartikler har blitt grundig studert og rapportert de siste tiårene, er det ingen standard for materialene og forskningsmetodene som brukes til å tillate direkte sammenligninger på tvers av studier. Av denne grunn presenterer vi to metoder, den direkte samkulturmetoden (metode A) og den direkte eksponeringsmetoden (metode B), for å karakterisere og sammenligne de antimikrobielle aktivitetene til nanopartikler samtidig som materialene og metodene holdes konsistente.

I tillegg til nanopartikler har nanostrukturerte overflater også blitt undersøkt for antibakterielle aktiviteter. Disse inkluderer karbonbaserte materialer, som grafen nanoark, karbonnanorør og grafitt29, samt rene Mg og Mg legeringer. Hvert av disse materialene har vist minst en antibakteriell mekanisme, inkludert fysisk skade påført cellemembraner av karbonbaserte materialer og skade på metabolske prosesser eller DNA gjennom frigjøring av reaktive oksygenarter (ROS) når Mg nedbrytes. I tillegg, når sink (Zn) og kalsium (Ca) kombineres i dannelsen av Mg-legeringer, forbedres forfiningen av Mg-matrikskornstørrelsen, noe som fører til en reduksjon i bakteriell adhesjon til substratoverflater i forhold til Mg-only-prøver14. For å demonstrere antibakteriell aktivitet presenterer vi den direkte dyrkningsmetoden (metode C), som bestemmer bakteriell adhesjon på og rundt nanostrukturerte materialer over tid gjennom kvantifisering av bakteriekolonidannende enheter (CFU) med direkte og indirekte overflatekontakt.

Geometrien til nanostrukturer på overflater, inkludert størrelse, form og orientering, kan påvirke materialets bakteriedrepende aktiviteter. For eksempel fremstilte Lin et al.16 forskjellige nanostrukturerte MgO-lag på overflatene av Mg-substrater gjennom anodisering og elektroforetisk avsetning (EPD). Etter en periode med eksponering for nanostrukturert overflate in vitro ble veksten av S. aureus betydelig redusert sammenlignet med ikke-behandlet Mg. Dette indikerte en større styrke av den nanostrukturerte overflaten mot bakteriell adhesjon versus den ubehandlede metalliske Mg-overflaten. For å avsløre de forskjellige mekanismene til de antibakterielle egenskapene til forskjellige nanostrukturerte overflater, diskuteres en fokusert-kontakteksponeringsmetode (metode D) som bestemmer celleoverflateinteraksjonene innenfor interesseområdet i denne artikkelen.

Målet med denne artikkelen er å presentere fire in vitro-metoder som kan brukes på forskjellige nanopartikler, nanostrukturerte overflater og mikrobielle arter. Vi diskuterer viktige hensyn for hver metode for å produsere konsistente, reproduserbare data for sammenlignbarhet. Spesielt brukes den direkte samkulturmetoden17 og direkte eksponeringsmetoden for å undersøke de antimikrobielle egenskapene til nanopartikler. Gjennom den direkte samkulturmetoden kan minste hemmende og minste bakteriedrepende konsentrasjoner (henholdsvis MIC og MBC90-99.99) bestemmes for individuelle arter, og den mest potente konsentrasjonen (MPC) kan bestemmes for flere arter. Gjennom den direkte eksponeringsmetoden kan de bakteriostatiske eller bakteriedrepende effektene av nanopartikler ved minimumshemmende konsentrasjoner karakteriseres ved sanntids optiske tetthetsavlesninger over tid. Direct culture14-metoden er egnet for å undersøke bakterier direkte og indirekte i kontakt med nanostrukturerte overflater. Til slutt presenteres metoden med fokusert kontakteksponering 16 for å undersøke den antibakterielle aktiviteten til et bestemt område på en nanostrukturert overflate gjennom direkte påføring av bakterier og karakterisering av bakterievekst ved celle-nanostrukturgrensesnittet. Denne metoden er modifisert fra den japanske industristandarden JIS Z 2801: 200016, og er ment å fokusere på mikrobe-overflate-interaksjoner og utelukke effekten av nedbrytning av bulkprøver i mikrobiell kultur på antimikrobielle aktiviteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For å presentere direkte samkultur og direkte eksponeringsmetoder bruker vi magnesiumoksid nanopartikler (nMgO) som et modellmateriale for å demonstrere bakterielle interaksjoner. For å presentere eksponeringsmetodene for direkte kultur og fokusert kontakt, bruker vi en Mg-legering med nanostrukturerte overflater som eksempler.

1. Sterilisering av nanomaterialer

MERK: Alle nanomaterialer må steriliseres eller desinfiseres før mikrobiell dyrkning. Metodene som kan brukes inkluderer varme, trykk, stråling og desinfeksjonsmidler, men toleransen til materialene for hver metode må identifiseres før in vitro-forsøkene .

  1. Nanopartikler
    MERK: Prøver kan lagres i et organisk løsningsmiddel som etanol eller pakkes i en tallerken eller boks etterfulgt av sterilisering eller desinfeksjon på en passende måte. Nanopartiklene ble sterilisert ved hjelp av følgende metode for demonstrasjon av direkte kokulturmetode17 og direkte eksponeringsmetode.
    1. Steriliser MgO nanopartikler i en 200 ° C konveksjonsovn30 i 60 minutter før hvert in vitro-eksperiment .
      MERK: Denne metoden ble valgt fordi vanndamp og UV-lys kan påvirke strukturene til MgO nanopartikler (nMgO) 17.
  2. Bulk materialer
    MERK: De nanostrukturerte materialene ble sterilisert ved følgende metode for demonstrasjon av den direkte kulturmetoden.
    1. For direkte dyrkningsmetode14, desinfiser som preparerte ZC21-, Mg- og T64-prøver ved bruk av ultrafiolett (UV) stråling i 4 timer før in vitro-studier initieres.
    2. For eksponeringsmetoden med fokusert kontakt16, desinfiser alle prøvene ved hjelp av UV-stråling i 2 timer før oppstart av in vitro-studiene .
  3. Alternativt kan du bruke etylenoksid (EtO) til sterilisering av varmefølsomme materialer.

2. Direkte samkulturmetode (metode A)

MERK: I metode A blandes bakterier i en lag-fase såingskultur direkte med nanopartikler av visse konsentrasjoner. For undersøkelse av antimikrobielle aktiviteter i nanopartikler følger vi en protokoll beskrevet av Nguyen et al.17.

  1. Karakterisering av nanopartikler og nanostrukturer
    MERK: Nanostruktur sammensetning og form er bekreftet ved hjelp av røntgenpulverdiffraksjon.
    1. Måling av nanopartikler
      1. Vei nanopartiklene ved 9x ønsket masse per ml for å imøtekomme 3 ml prøver i tre eksemplarer. Vei for eksempel 0,2 mg/ml nMgO ved 1,8 mg/ml.
        MERK: Dette sikrer jevn fordeling av nanopartikler i bakteriekulturer og buljonger.
      2. Mål alle nanopartikler i et 5,0 ml mikrosentrifugerør som har blitt forhåndsveid og tared ved hjelp av en analytisk balanse.
  2. Forbereder og dyrker bakteriekulturer
    1. For hvert in vitro-eksperiment hentes bakteriecellelagre fra lagring ved -80 °C. Tilsett 10 μL av hver bakteriecellebestand i 5 ml av et passende vekstmedium.
    2. Plasser det inokulerte mediet i en inkubator-shaker ved 37 ° C og 250 o / min i ca. 16 timer over natten.
      1. Hvis Staphylococcus-arter dyrkes, subkultur ved å plassere 400 μL av hver overnattingskultur i 20 ml friskt vekstmedium (100 μL / 5 ml medium) og inkubere med risting ved 37 ° C og 250 rpm i ytterligere 4-6 timer.
  3. Vasking og telling av bakteriecellene for å bestemme såtettheten
    MERK: Den ønskede såtettheten på 7,8 × 106 CFU / ml ble identifisert som celletallet større enn det som kreves for å bekrefte en urinveisinfeksjon.
    1. Samle dyrkede bakterier ved å fortynne 1 ml av den nattlige bakteriekulturen i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Lag tilstrekkelig antall alikoter fra bakteriekulturer over natten og sentrifuge dem i 10 minutter ved 1,956 × g for å nå de ønskede såtetthetene.
    2. Etter sentrifugering, pipet for å fjerne supernatanten fra de pelleterte cellene og plassere supernatanten i en oppsamlingsbeholder. Resuspender cellepellets i 0,5 ml friskt vekstmedium. Kombiner to 0,5 ml suspensjoner for å lage 1 ml suspensjon for å redusere antall 1 ml alikoter av resuspenderte celler til seks. Gjenta sentrifugeringen i 10 minutter ved 1,956 × g.
    3. Fullfør en andre vaskesyklus med ferskt vekstmedium, som i trinn 2.3.2, for å redusere antall 1 ml alikoter av resuspenderte vaskede celler til tre.
    4. Fullfør den tredje syklusen, som i trinn 2.3.2, bortsett fra å resuspendere cellepellets i 0,33 ml Tris-buffer (hydroksymetyl) aminometanbuffer (Tris-buffer, pH 8,5). Kombiner de tre suspensjonene, hver på 0,33 ml volum, til én mikrosentrifuge på 1,5 ml. Gjenta sentrifugeringen i 10 minutter ved 1,956 × g.
      MERK: Tris buffer inneholder ikke Mg 2+ eller Ca2+ ioner31. Dette er viktig for bruk av induktivt koblet plasmaoptisk emisjonsspektrometri (ICP-OES) for å måle Mg 2+ og Ca2+ ioner i postkulturbuljonger. I motsetning til dette sekvestrerer fosfatene som er tilstede i fosfatbufret saltvann (PBS)32, for eksempel, både Mg 2+ eller Ca2+ ioner33,34,35 og forårsaker forvirring i tolkningen av ICP-OES-dataene.
    5. Fjern supernatanten fra de pelleterte cellene. Resuspender cellepelleten i 1 ml fersk Tris-buffer, kjent som cellesuspensjonen - en lagfase bakteriell såkultur.
    6. Bestem cellesuspensjonskonsentrasjonen (celler / ml) ved hjelp av et hemocytometer.
  4. Opprettelse av såbakteriekulturen
    MERK: Prøven har et totalvolum på 3 ml og er ferdig i triplikat (9 ml totalt).
    1. Bestem det totale volumet av bakteriesåingskultur som trengs. For å lage såkulturen, bruk C 1V1 = C 2 V2 for åberegne volumet av cellesuspensjonen som trengs for å skape en såkultur på 7,8 × 106 celler / ml. Legg til det beregnede volumet av cellesuspensjonen (V1) til ønsket volum av vekstmedier (V2).
    2. Bestem den faktiske bakteriesåtettheten i CFU / ml. Lag en ti ganger seriell fortynning til 10-4. Spred platen 10-4 fortynning på riktig vekstagar og inkuber over natten. Etter inkubasjon, telle antall kolonier, og beregne CFU / ml.
  5. Dannelse av bakterier og nanopartikkelkulturer
    1. I 12-brønns, ikke-vevsbehandlede polystyrenplater, aliquot 2 ml av bakteriell såkultur i hver brønn for antall brønner som trengs.
    2. For hvert 5 ml mikrosentrifugerør som inneholder forhåndsveid nMgO, tilsett 3 ml av bakteriell såkultur. Vortex kort for å blande nMgO med bakteriene. Aliquot 1 ml av blandingen i tre separate brønner for å lage triplikate prøver av hver forhåndsmålte vekt av nMgO. Pipett bakterien/nMgO blandingen 2-3x før hver 1 ml alikot lages for å opprettholde nMgO i suspensjon.
      MERK: Kontrollprøver vil bestå av 3 ml celler bare, 3 ml bare medier og 3 ml som inneholder de laveste og høyeste konsentrasjonene av nanopartikler som brukes. Disse er utarbeidet som i trinn 2.5.2. Alle kontrollprøvene er fullført i tre eksemplarer.
    3. Inkuber alle 12-brønnsplatene ved 37 °C og 120 o / min i 24 timer.
  6. Bestemmelse av bakteriell cellevekst etter eksponering for nMgO
    1. Etter inkubering over natten av bakteriekulturene, samles hver 3 ml prøve ved å pipettere inn i et individuelt 15 ml konisk rør.
    2. Bruk en plate med 96 brønner til å lage 1:10 serielle fortynninger. Bestem antall kolonner som er nødvendige for å serielt fortynne alle prøvene som inneholder bakterier. Legg til 180 μL Tris-buffer til hver brønn i rad B til rad G for riktig antall kolonner.
    3. Virvel kort hver 15 ml koniske rør som inneholder bakterieprøver, og tilsett 50 μL til en individuell brønn i rad A.
    4. For hver brønn i rad A, overfør 20 μL til rad B (f.eks. A1 til B1), og bland kort med pipettering for å oppnå et volum på 200 μL. Bruk en steril pipetspiss til å overføre 20 μL fra brønnen i rad B til brønnen i rad C. Fortsett dette mønsteret til brønnen i rad G inneholder 200 μL, fullføre en seriefortynning fra 10−1 i rad B til 10−6 i rad G.
    5. Pipet 100 μL av hver brønn på en passende vekstagarplate og spred over platen for å spre cellekulturen. Legg platene i en inkubator-shaker over natten ved 37 °C. Inkuber platene ved 37 °C i 24 timer.
    6. Undersøk platene og tell de som har omtrent 25-300 kolonier. Velg om mulig plater med samme fortynningsverdi. Bruk antall kolonier per plate til å beregne CFU / ml.
  7. Evaluering av pH etter inkubasjon
    MERK: Følg produsentens instruksjoner for hver pH-målermodell.
    1. Forhåndskalibrer en pH-måler ved hjelp av standardiseringsløsninger av pH 4, pH 7 og pH 10. Les av hver bakterieprøve ved å plassere pH-sonden i det koniske røret på 15 ml.
  8. Fremstilling av prøver for ICP-OES
    MERK: ICP-OES brukes til å bestemme konsentrasjonen av Mg 2+ og Ca2+ ioner. Disse kationene anses som viktige, da hver deltar i cellulær metabolisme.
    1. Sentrifuge hver 15 ml konisk rør fremstilt i trinn 2.6.1 i 5 minutter ved 5,724 × g for å pelletere cellulært og nanopartikkelavfall.
    2. Bruk et 15 ml konisk rør, fortynn 30 μL av supernatanten til 2,97 ml 18,2 Ω filtrert vann for å skape en 1:100 fortynning.
      MERK: Fortynningsfaktoren kan justeres basert på de projiserte ionekonsentrasjonene og deteksjonsgrensen for spektrometerinstrumentet.
    3. Les prøvene ved hjelp av ICP-OES.

3. Direkte eksponeringsmetode (metode B)

MERK: Hvis vekstraten til de valgte bakteriene er ukjent, må en standardisering av vekstkurven fullføres før implementering av denne metoden.

  1. Bestem sanntids bakteriostatiske og bakteriedrepende aktiviteter ved eksponering for nanopartikler av interesse.
    1. Forbered ønskede konsentrasjoner av nanopartikler ved hjelp av metodene beskrevet i trinn 2.1-2.1.2.2. Forbered to sett med hver vekt av nanopartikler som skal brukes: en som skal legges til 3 ml alikoter av bakteriekultur i den logaritmiske vekstfasen, og den andre skal tilsettes til 3 ml alikoter av vekstmedium uten bakterier som kontrollgrupper.
    2. Bestem passende bakteriostatiske og bakteriedrepende antibiotika for bakterieartene som skal testes.
      MERK: Kunnskap om minste hemmende konsentrasjon for hvert antibiotika er nødvendig.
  2. Beregn det totale volumet av bakteriekultur som trengs for triplikate 3 ml prøver for alle nanopartikkel-, antibiotika- og kontrollprøver.
    MERK: Et likt volum sterilt vekstmedium er nødvendig. Hvis bruk av spektrofotometri planlegges, krever dette justeringer av det totale volumet som trengs for innkvartering av 0,5 ml til 1,0 ml volum som trengs for kyvetter.
  3. Dag 1: For hvert in vitro-eksperiment lager du over natten etter trinn 2.2.1-2.2.2.
  4. Dag 2: Bekreft at plateleserinnstillingene har plass til en 96-brønnsplate med en optisk tetthet på 600 nm. Mål prøvene i 200 μL alikoter ved hjelp av en 96-brønnsplate.
    1. Bestem en innledende bakteriekultur OD600 ved 0,01 - tettheten som brukes til å starte den første inkubasjonsperioden før tilsetning av nanopartikler og antibiotika.
    2. Samle over natten bakteriekultur fra inkubator-shakeren.
      1. For hvert materiale (f.eks. Forhåndsmålte nanopartikler eller antibiotika) som skal testes, opprett en separat bakteriekultur ved en OD600 på 0,01. Bruk en beholder som er stor nok til å imøtekomme volumet av cellekultur som trengs (f.eks. en sterilisert Erlenmeyer-kolbe eller 50 ml koniske rør).
      2. Fortynn bakterieprøvene over natten med vekstmedium ved å plassere tre 200 μL alikoter av vekstmediet i tre brønner og tre 200 μL alikoter av bakteriekulturen i ytterligere brønner (f.eks. A1 til A6).
      3. Plasser platen med 96 brønner i plateleseren og skann den.
        MERK: Avlesningene er gjennomsnittet for hver skannet brønn for å produsere en middelverdi.
      4. For å beregne tettheten av bakterier i suspensjon, gjennomsnitt middelverdien for hver brønn som inneholder en triplikat prøve.
      5. For å bestemme bakteriens optiske tetthet, trekk buljongprøvens gjennomsnitt fra bakteriegjennomsnittet.
      6. Hvis det er nødvendig å fortsette å justere bakteriesuspensjonen, fortsett å tilsette buljong eller bakteriekultur over natten etter behov, og gjenta skanningen i plateleseren etter behov til en OD600 på ca. 0,01 er nådd.
      7. Inkuber ved 37 °C med risting ved 150 o / min til logaritmisk vekst er nådd.
  5. Fjern bakteriekulturer fra inkubator shakeren.
    1. Aliquot 3 ml av OD600 0,01 bakteriekultur i merkede 15 ml koniske rør for test og kontrollprøver i tre eksemplarer.
    2. Aliquot 200 μL av bakteriekulturen i tre brønner på en 96-brønnsplate og måler prøvene ved hjelp av plateleseren.
    3. Beregn avlesningene som beskrevet tidligere i trinn 3.4.2.2 og trinn 3.4.2.6 - "-0.5 h lesing".
  6. Opprettelse og måling av bakterier/nanopartikkelblandinger
    1. Aliquot 3 ml sterilt vekstmedium i like stort antall som bakteriekulturene i merkede 15 ml koniske rør for kontrollprøver (i triplikat).
    2. For å forberede bakterier / nanopartikkelsuspensjoner og sterile medier / nanopartikkelsuspensjoner, fjern 1 ml bakteriekultur eller medium fra hvert triplikat sett med 15 ml koniske rør.
      1. Plasser 1 ml alikotene i et 5 ml sentrifugerør som inneholder forhåndsmålte nanopartikler, og virvel kort for å blande.
      2. Fra 5 ml sentrifugerøret, returner 1 ml alikoter av bakteriene / nanopartikkelen eller medium / nanopartikkelsuspensjonene til 15 ml konisk rør for å distribuere nanopartiklene homogent.
        MERK: Pipett bakteriene / nanopartikkelblandingen 2x-3x før hver 1 ml aliquot pipetteres for å opprettholde nanopartiklene i suspensjon.
  7. Opprettelse og måling av bakterier/antibiotikablandinger
    1. For å skape bakterielle / antibiotiske kulturer, aliquot 3 ml av den inkuberte bakteriekulturen inn i tilsvarende merkede 15 ml koniske rør.
    2. Etter at alle prøvene er fremstilt, aliquot 200 μL av hver prøve inn i de enkelte brønnene i en 96-brønns plate.
    3. Plasser platen(e) i plateleseren, og start skanningen - "0 h" -avlesningen.
    4. Plasser de 15 ml koniske rørene som inneholder prøvene i en inkubator-shaker ved 37 ° C og 150 o / min. Registrer alle dataene som beskrevet tidligere i trinn 3.4.2.2 og trinn 3.4.2.6.
  8. Omtrent 15 minutter etter å ha fullført 0 timers avlesning, gjenta trinnene beskrevet i trinn 3.7.2-3.7.3 - "0.5 h"-avlesningen.
    1. Etter den etablerte 0 timen, gjenta trinnene beskrevet i trinn 3.7.2-trinn 3.7.3 hvert 90. minutt i seks sykluser; Komplett på 9 timer.
    2. Etter at den sjette syklusen er fullført, plasser prøvene i inkubator-shakeren i ytterligere 15 timer ved 37 ° C og 150 o / min. Gjenta trinnene beskrevet i trinn 3.7.2-3.7.3 for å få 24-timers lesing. Registrer alle dataene som beskrevet tidligere i trinn 3.4.2.2 og trinn 3.4.2.6.

4. Direkte kulturmetode (metode C)

MERK: I metode C plasseres bakterier i en lag-fase såingskultur direkte på nanostrukturerte overflater av interesse. For undersøkelse av nanostruktur antimikrobielle aktiviteter, følger vi en protokoll beskrevet av Zhang et al.14. For å demonstrere denne direkte dyrkningsmetoden ble ZC21 (Mg-Zn-Ca Alloy) og Mg-pinner brukt som prøver.

  1. Forbereder og dyrker bakteriekulturer
    1. For hvert in vitro-eksperiment oppretter du aksjer over natten ved å følge trinn 2.2.1-2.2.2.
  2. Vask og telle bakteriene for å bestemme såtettheten
    MERK: Den ønskede såtettheten på 7,5 × 105 CFU / ml ble identifisert som den rapporterte cellekonsentrasjonen som forårsaker ortopediske infeksjoner14.
    1. Hent bakteriekulturen over natten fra inkubator-shakeren.
    2. Vask og samle bakteriene etter trinn 2.3.2-2.3.2.3, men erstatt det ferske mediet med revidert simulert kroppsvæske (rSBF) for hvert vasketrinn.
      MERK: rSBF er en bufferløsning som etterligner den ioniske konsentrasjonen av humant blodplasma. Imidlertid inneholder rSBF bare uorganiske forbindelser, og er uten bioorganiske forbindelser som proteiner. For å løse dette kombineres føtalt bovint serum (FBS) med rSBF for å simulere sammensetningen av humant blod for bedre å etterligne den naturlige dannelsen av apatitt i forkalket vev under eksperimentelle forhold36.
    3. Fjern supernatanten fra de pelleterte cellene. Resuspender cellepelleten i 1 ml rSBF supplert med 10% FBS-cellesuspensjonen.
    4. Bestem cellesuspensjonskonsentrasjonen (celler / ml) ved hjelp av et hemocytometer. Fortynn cellesuspensjonen til en konsentrasjon på 7,5 × 105 celler/ml i rSBF supplert med 10 % FBS. Lag en såkultur etter trinn 2.4.1.
    5. Bestem den faktiske såtettheten etter trinn 2.4.2.
  3. Fordel bakteriell cellesuspensjon på prøvene i kulturbrønnene.
    1. Plasser både prøvene og kontrollprøvene i de enkelte brønnene i en 48-brønns, ikke-vevsbehandlet polystyrenplate.
    2. Aliquot 0,75 ml av cellesuspensjonen i hver brønn som inneholder prøvene og kontrollene. Plasser 48-brønnplaten (e) i en inkubator-shaker i 24 timer ved 37 ° C med risting ved 120 o / min.
  4. Karakterisering av bakteriekonsentrasjonen
    1. Etter 24 timers inkubasjon, samle prøvene og legg dem i separate, merkede oppsamlingsrør.
    2. Samle to prøver fra hver gruppe og plasser dem individuelt i merkede 5,0 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 2 ml rSBF til hvert rør.
    3. Plasser prøvene samlet i trinn 4.4.2 i et sonikeringsbad, og sonicate i 10 minutter. Etter hver 5 min periode, vortex hver prøve i 5 s.
    4. Samle rSBF som inneholder de nylig frittliggende bakteriecellene og plasser suspensjonen i et merket, friskt mikrosentrifugerør.
  5. Serielle fortynninger og plating av bakteriene
    1. Seriell fortynn og plate bakteriesuspensjonen etter trinn 2.6.2-2.6.6.
  6. Evaluer pH etter inkubasjon av kulturmedier ved å følge trinn 2.7.
  7. Forbered postkulturmediet for ICP-OES ved å følge metodene beskrevet i trinn 2.8.

5. Eksponeringsmetode med fokusert kontakt (metode D)

MERK: I metode D blir bakterier på et nitrocellulosefilterpapir satt i direkte kontakt med et område av interesse på nanostrukturerte overflater. Denne metoden minimerer forstyrrelsen av nedbrytning av bulkprøver i bakteriekulturer med bakterieaktivitetene. For å undersøke antimikrobielle aktiviteter på nanooverflaten følger vi en protokoll beskrevet av Lin et al.16.

  1. Følg prosedyrene i trinn 2.2.1-2.2.2.1 for å lage en bakteriell såkultur. Bekreft den faktiske såtettheten ved å følge trinn 2.4.2.
  2. Forbered prøvene til en størrelse på 1 × 1 cm2 i en firkantet form. Forbered alle prøvetypene i tre eksemplarer. Plasser om nødvendig prøvene på en tredimensjonal (3D) holder som er 15 mm i diameter og 10 mm i høyden. Plasser prøven og holderen i en brønn av en ikke-vevskulturbehandlet polystyrenbrønnplate.
  3. Forbered sterilisert nitrocellulosepapir ved å trimme hver til en diameter på 1 cm. Legg de klargjorte nitrocellulosepapirene på en agarplate som inneholder egnet medium.
  4. Pipet 50 μL av den fortynnede bakteriekulturen på filterpapiret.
  5. Pipet 50 mikrol av et egnet medium på midten av hver prøveoverflate.
  6. Bruk sterilisert pinsett, plukk opp nitrocellulosepapiret fra overflaten av agar. Vend forsiktig nitrocellulosepapiret og legg det på prøveoverflaten slik at bakteriene er i kontakt med 50 μL medium og den nanostrukturerte overflaten av interesse.
  7. Tilsett 1 ml Tris-buffer til hver brønn som inneholder en prøve for å opprettholde fuktigheten. Inkuber polystyrenbrønnplaten som inneholder alle prøvene ved 37 °C i 24 timer.
  8. Samle nitrocellulosepapiret fra hver prøveoverflate. Plasser hver i 5 ml Tris buffer. Vortex de innsamlede filterpapirene og nanosurfaced materialprøver i 5 s.
  9. Sonikere hver prøve i 10 minutter. Vortex i 5 s etter 5 min og igjen etter 10 min.
  10. Samle Tris-buffersuspensjonene fra alle prøvene og plasser hvert volum i individuelle ferske oppsamlingsrør.
  11. Seriell fortynne og plate prøvene etter trinn 2.6.2-2.6.6.

6. Postkulturkarakterisering av bakterier og nanomaterialer

  1. Undersøkelse av bakteriell adhesjon og morfologi ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM)
    1. Etter inkubasjon over natten, tilsett 10% glutaraldehyd i hver brønn i den 48-brønns, ikke-vevsbehandlede polystyrenplaten til prøvene er fullstendig dekket. Inkuber prøvene i 1 time for å fikse bakteriecellene.
    2. Aspirer glutaraldehydet i en avfallsflaske og skyll alle prøvene 3x med Tris bufferløsning for å fjerne ikke-adherente bakterier.
    3. Dehydrer prøvene med 30%, 75% og 100% etanol i 30 minutter hver16.
      MERK: Det anbefales å bruke en tørketrommel for kritisk punkt for å tørke prøvene. Det er ikke ideelt å lufttørke prøvene ved romtemperatur i 24 timer.
    4. Bruk ledende limbånd, for eksempel kobber- eller karbonbånd, for å feste prøvene på en SEM-stubb. Belegg prøveflatene med sputterbelegg for å gi ledningsevne før avbildningen (f.eks. belegg Mg-plater med klebende bakterier under platina / palladium (Pt / Pd) i 45 s ved 20 mA16).
      MERK: Belegningsmaterialene, behandlingstiden og driftsstrømmen kan variere avhengig av prøvetypene.
    5. Ta bilder av bakteriene på prøvene ved hjelp av SEM med passende arbeidsavstand og akselerasjonsspenning og ved ønskede forstørrelser. Bruk for eksempel en SEM med en sekundær elektrondetektor for å ta bilder med en arbeidsavstand på 5 mm og en akselerasjonsspenning på 10 kV16.
  2. Undersøk overflatemorfologi av postkulturnanomaterialprøver ved hjelp av SEM.
    1. For nanomaterialer vasker du prøvene med Tris-buffer 3x for å fjerne de frie bakteriene som ikke er festet til prøven. For nanopartikler, spre partiklene i et løsningsmiddel som ikke påvirker prøveegenskapene gjennom ultralydbehandling for å oppnå bedre spredning når det trengs.
    2. Tørk prøvene etter vaskeprosedyren.
    3. Bruk dobbeltsidig tape av karbon eller kobber for å feste prøvene på SEM-stubben.
    4. Lag et ledende overflatelag av Pt/Pd ved hjelp av en sputtercoater, som beskrevet i trinn 6.1.4, før avbildningen. Ta eksempelbildene som beskrevet i trinn 6.1.5.
    5. Analysere overflateelementsammensetningen ved hjelp av EDS med en passende akselerasjonsspenning og ved ønskede forstørrelser (f.eks. ved 10 kV etter å ha utført SEM-analysen16).
  3. Fluorescensavbildning av bakteriell adhesjon
    1. Forbered prøvene som skal visualiseres ved hjelp av fluorescensmikroskopi ved først å vaske dem med Tris buffer 3x. Lufttørk prøvene ved romtemperatur.
    2. Beis hver prøve med 10 μM tioflavin T fluorescensfargestoff etter den etablerte protokollen37.
    3. Utfør fluorescensavbildning av bakteriell adhesjon ved hjelp av et invertert mikroskop kombinert med et elektronmultipliserende ladningskoblet digitalkamera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifiseringen av den antibakterielle aktiviteten til magnesiumoksid nanopartikler og nanostrukturerte overflater har blitt presentert ved hjelp av fire in vitro-metoder som er anvendelige på tvers av forskjellige materialtyper og mikrobielle arter.

Metode A og metode B undersøker bakterieaktivitet når de utsettes for nanopartikler i en lagfase (metode A) og loggfase (metode B) i en varighet på 24 timer eller lenger. Metode A gir resultater for MIC og MBC, mens metode B bestemmer de hemmende versus bakteriedrepende effektene av nanopartikler. Metode C undersøker bakterieaktiviteten med direkte og indirekte kontakt med nanostrukturerte overflater, og metode D undersøker bakterieaktiviteten på et utvalgt område av et celle-nanostrukturgrensesnitt i en varighet på 24 timer eller lenger.

Metodene som er brukt er beskrevet i figur 1 og figur 2, og resultatene er presentert i figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8. Representative eksperimentelle resultater som kvantifiserer antimikrobiell aktivitet av nMgO mot gram-negative og gram-positive bakterier og gjær kan ses i figur 3. Den antibakterielle aktiviteten til nMgO og nMg(OH)2 mot MRSA kan ses i figur 4. De antibakterielle aktivitetene til nanostrukturerte overflater mot MRSA kan ses i figur 5 og figur 6. Endelig kan den antibakterielle aktiviteten til magnesiumlegeringer mot E. coli ses i figur 8B.

Ved hjelp av metode A er det mulig å bestemme mikrofonene og MBCene for bakterier utsatt for nanopartikler ved hjelp av konsistente metoder og materialer. Denne konsistensen gjør det mulig å sammenligne arter ved hjelp av de identifiserte MBCene for å bestemme den mest potente konsentrasjonen av nanopartikler som testes. I tillegg kan denne metoden brukes på andre klassifikasjoner av mikroorganismer for sammenligninger av MIC og minimale dødelige konsentrasjoner (MLC17) også. Her ble steriliserte nanopartikler forhåndsmålt i en mengde som tillater triplikater av hver konsentrasjon som kreves. Disse nanopartiklene ble suspendert i en lag-fase monobakterie-såkultur med en tetthet på 6 × 10 6-8 × 106 celler / ml. Metoden beskrevet for å suspendere de forhåndsmålte nanopartiklene med såkultur eller buljong, opprettet vellykket triplikate prøver som var relativt homologe i nanopartikkelfordeling, noe som kan redusere avviket i CFU / ml i triplikate prøver. Den eksperimentelle arbeidsflyten for denne metoden er illustrert i figur 1A. En demonstrasjon av de antimikrobielle effektene av nMgO på gram-negative og gram-positive bakterier og Candida spp. ved hjelp av metode A kan sees i figur 3. Her ble det identifisert en MIC på 1,0 mg/ml nMgO for gramnegative Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa, samt en MBC 99,99 på henholdsvis 1,0 mg/ml og1,6 mg/ml nMgO for disse artene (figur 3A). Gram-positive S. epidermidis, S. aureus og MRSA viste MIC på henholdsvis 0,5 mg/ml, 0,7 mg/ml og 1,0 mg/ml nMgO. MBC 99,99-verdier på 1,6 mg/ml og 1,2 mg/ml nMgO ble identifisert for henholdsvis S. epidermidis og S. aureus, mens MRSA ikke var redusert utover MBC90 (figur 3B). I legemiddelsensitive og medikamentresistente Candida spp., C. albicans og C. albicans FR, ble MIC på henholdsvis 1,2 mg/ml og 1,0 mg/ml nMgO identifisert. I kontrast viste nMgO MIC-verdier på 1,0 og 0,7 mg/ml for henholdsvis C. glabrata og C. glabrata ER. I tillegg nådde hver Candida-art en MBC 90 på 0,7-1,2 mg/ml nMgO, men bare C.glabrata ER ble redusert til MBC99,99 ved1,2 mg/ml nMgO (figur 3C). I tillegg, i de fleste testede arter, ble identifiseringen av den mest potente konsentrasjonen (MPC) av nMgO bestemt. MPC indikerer nanopartikkelkonsentrasjonen som er mest effektiv på tvers av polymikrobielle samfunn17.

Metode B eksponerer bakterier i den logaritmiske vekstfasen til nanopartikler med visse konsentrasjoner for å bestemme om nanopartiklene er bakteriostatiske (hemmende) eller bakteriedrepende ved bruk av MBCene identifisert i metode A. Denne metoden bruker spektrofotometri (OD600) målinger over diskrete tidsperioder for å identifisere endringer i bakterievekst som respons på nanopartikkeleksponering. I tillegg dyrkes bakterier utsatt for bakteriostatiske eller bakteriedrepende antibiotika samtidig med nanopartikkeleksponerte bakterier i separate brønner for å gi en referanse ved identifisering av disse nanopartikkelaktivitetene. Konsentrasjonene av nMgO og nMg(OH)2 som ble brukt, ble avledet fra en tidligere studie med bakterier fra den logaritmiske vekstfasen eksponert for nMgO og nMg(OH)2. Konsentrasjoner av nMgO og nMg(OH)2 ble identifisert ved bruk av mM-ekvivalenter fra 5 mM til 50 mM. Resultatene viste at nMgO var bakteriedrepende for MRSA ved 30 mM (1,2 mg/ml nMgO), mens nMg(OH)2 var bakteriostatisk ved 50 mM (2,9 mg/ml nMg(OH)2). Konsentrasjonene av antibiotika som ble brukt ble identifisert fra litteraturen og bekreftet i våre egne eksperimenter. Den eksperimentelle arbeidsflyten for denne metoden er illustrert i figur 1B. Representative resultater for metode B fremgår av figur 4. Her vokste MRSA ueksponert for nanopartikler eksponentielt til en OD600 på 0,85. Ved eksponering for 1,2 mg/ml nMgO og 6,25 μg/ml trimetoprim ble bakterieveksten redusert til en OD 600 på 0,18 (henholdsvis 80,2 % og 81,6 %), og 2,9 mg/ml nMg(OH)2 reduserte bakterieveksten til en OD600 på 0,25 (70,3 %). Eksponering for 1,0 μl/ml vankomycin resulterte i en 99,99 % reduksjon i veksten av MRSA, noe som tyder på at konsentrasjonene av nMgO og nMg(OH)2 som ble brukt her var bakteriostatiske i aktivitet.

Metode C undersøker den antibakterielle aktiviteten til nanostrukturerte overflater. En bakteriekultur i lagfasevekst ble sådd direkte på en nanostrukturert overflate for å måle CFU med eller uten direkte kontakt med overflaten. Ved hjelp av denne metoden var det mulig å bestemme overflateeffektene på bakteriell adhesjon og levedyktighet under direkte kontaktforhold. Bakterier i direkte kontakt med nanostrukturerte overflater og i indirekte kontakt (i kultursuspensjon) ble samlet og kvantifisert i CFU / ml for å bestemme bakterieveksten under hver tilstand. Disse dataene som er oppnådd, kan være nyttige i nedstrøms applikasjoner av nanostrukturerte materialer på overflater for klinisk bruk, hvor en reduksjon i bakteriekolonisering på overflatestrukturer er ønsket. Den eksperimentelle arbeidsflyten for denne metoden er illustrert i figur 2A. Representative resultater for metode C fremgår av figur 5. Her var det ingen hemming av bakterievekst ved indirekte kontakt. Imidlertid ble bakteriell adhesjon redusert for alle substrater, mest signifikant med ZC21-legeringen, etterfulgt av henholdsvis T64 (titan), magnesium, bare glass og ZSr41-legeringen. Disse resultatene indikerer at ZC21 hadde den sterkeste antibakterielle aktiviteten mot vedheft og vekst av MRSA for alle prøvene som ble testet14.

Metode D undersøker antibakteriell aktivitet på et utvalgt område av interesse ved celle-nanostrukturgrensesnittet gjennom direkte plassering av bakterier i filterpapir på en nanostrukturert overflate. Ved hjelp av denne metoden kan en sammenheng mellom antibakteriell aktivitet og overflateegenskaper, som overflatekjemi, ruhet og areal av nanostrukturert overflate, identifiseres16. Den eksperimentelle arbeidsflyten for denne metoden er illustrert i figur 2B. Representative resultater for metode D finnes i figur 6. Her ble ingen levedyktig S. aureus identifisert på 1.9A-, 1.9 AA- og EPD-prøvene eller deres parrede filterpapir. Imidlertid reduserte eksponering for EPD-prøvene etter glødning (A-EPD) bakterieveksten til noen få celler på den nanostrukturerte overflaten og det parrede filterpapiret. Prøven som inneholdt magnesium (Mg) hadde heller ingen bakterievekst, men levedyktige bakterier ble isolert fra det parrede filterpapiret. En reduksjon i veksten av S. aureus ble ikke sett med titan- og glassprøvene eller deres parrede filterpapir16.

I tillegg til bruken av metodene beskrevet ovenfor for å bestemme antimikrobielle aktiviteter, kan SEM og fluorescensmikroskopi brukes til å karakterisere de morfologiske endringene som forekommer i mikroorganismer etter eksponering for nanopartikler og nanostrukturerte materialer. De representative SEM-bildene som viser gramnegativ Escherichia coli etter eksponering er presentert i figur 7A, og de som viser posteksponeringen Gram-positive S. aureus er presentert i figur 7B. Ved bruk av SEM-avbildningsteknikken med 5000x forstørrelse kunne fenotypiske endringer i E. coli eksponert for konsentrasjoner på 0,5 mg/ml nMgO eller høyere identifiseres17. Fluorescensmikroskopi kan også brukes til å karakterisere morfologiske endringer i mikroorganismer, men med potensielt lavere kostnader og større tilgjengelighet enn SEM. Figur 8 viser representative fluorescensbilder av E. coli eksponert for nanostrukturert materiale MgY_O i 1 dag, 2 dager og 3 dager, samt referanse E. coli. Bare en bakterieart, E. coli, ble brukt til å begynne med. I fremtiden vil vi vurdere å utsette flere bakteriearter for de samme materialene av interesse for å produsere en mer omfattende forståelse av bakterielle responser på MgY_O eksponering. I disse resultatene kunne individuelle E. coli-celler og kolonier ses og avbildes ved hjelp av tioflavin T-farging og et fluorescensmikroskop for den kvalitative analysen av den antibakterielle aktiviteten tilMgY_O 15.

Figure 1
Figur 1: Skjematiske diagrammer for å bestemme nanopartikkel MIC eller MBC90-99.99 og bakteriostatiske eller bakteriedrepende aktiviteter i cellekulturer etter eksponering . (A) Direkte samkulturmetode17. (B) Direkte eksponeringsmetode. Forkortelser: CFU = kolonidannende enheter; NP = nanopartikler; OD 600 = optisk tetthet ved600 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematiske diagrammer for å bestemme bakterievekst med direkte og indirekte kontakt og ved celle-nanostrukturgrensesnittet til nanostrukturerte overflater. (A) Direkte dyrkingsmetode14. (B) Eksponeringsmetode for fokusert kontakt16. Forkortelser: CFU = kolonidannende enheter; SEM = skanning elektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representasjon av levedyktige bakterier og gjærsopper kvantifisert ved CFU / ml 24 timer etter eksponering for 0-2,0 mg / ml nMgO. (A) CFU / ml gramnegative bakterier, inkludert E. coli og P. aeruginosa. (B) CFU / ml av gram-positive bakterier, inkludert S. epidermidis, S. aureus og meticillinresistente S. aureus. (C) CFU / ml av legemiddelfølsomme C. albicans, stoffresistente C. albicans FR, legemiddelfølsomme C. glabrata og stoffresistente C. glabrata ER. Data er representert som gjennomsnitt ± standardavvik (N = 9). *p ≤ 0,05, signifikant lavere enn gruppene ved 0-0,7 mg/ml nMgO for den respektive bakterien eller gjærsopp. ^p ≤ 0,05, signifikant lavere enn gruppene ved 0-1 mg/ml nMgO for den respektive mikroorganismen. #p ≤ 0,05, signifikant lavere enn gruppene ved 0-0,5 mg/ml nMgO for den respektive mikroorganismen. &p ≤ 0,05, signifikant lavere enn gruppene ved 0-0,3 mg/ml nMgO for den respektive mikroorganismen17. Denne figuren er modifisert fra Nguyen et al.17. Forkortelser: FR = flukonazolresistent; ER = echinocandin-resistent; nMgO = magnesiumoksid nanopartikler; CFU = kolonidannende enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representasjon av optiske tetthetsavlesninger (OD600) tatt i sanntid for meticillinresistente S. aureus. MRSA-eksponering for 1,2 mg/ml nMgO, 2,9 mg/ml nMg(OH)2, 6,25 μg/ml trimetoprim og 1,0 mikrog/ml vankomycin i 24 timer. p ≤ 0,025: veksten av MRSA eksponert for 1,0 μg/ml vankomycin ved 0,5 timer er signifikant lavere enn veksten av MRSA eksponert for 2,9 mg/ml mg(OH)2 ved 7,5 timer. ^p ≤ 0,025: veksten av MRSA eksponert for 1,0 μg/ml vankomycin 24 timer etter inokulering er signifikant lavere enn veksten av MRSA eksponert for 2,9 mg/ml mg(OH)2 ved 24 timer. Data er presentert som gjennomsnittet ± standardfeilen til gjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representasjon av levedyktig meticillinresistent S. aureus kvantifisert ved CFU / ml ved 24 timer etter eksponering for prøver og kontroller. Bakterier ble sådd med en faktisk tetthet på 7,5 × 105 celler/ml og bekreftet av CFU/ml. Data er representert som gjennomsnitt ± standardavvik, n = 3; *p < 0,05. Equation 1p < 0,05 sammenlignet med CFU på ZC21-prøver. Denne figuren ble modifisert fra Zhang et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representativ kvantifisering av CFU / ml av bakteriell såingstetthet 24 timer etter eksponering for overflatebehandlede Mg-prøver på 1,9 A, 1,9 AA, EPD og A-EPD, og Mg og Ti kontrollprøver. Bakterier ble sådd med en faktisk tetthet på 6 × 106 CFU / ml, representert ved den røde stiplede linjen. Data er representert som gjennomsnitt ± standardavvik; n = 3. *p < 0,05. Den heltrukne svarte linjen indikerer de statistiske analyseresultatene for bakterietettheten på prøveoverflatene. Den blå stiplede linjen indikerer de statistiske analyseresultatene for bakterietettheten på filtrene som dekker prøveflatene. Forkortelser: CFU = kolonidannende enheter; A-EPD = elektroforetisk avsetning etter glødning; EPD = elektroforetisk avsetning før glødning; A = anodisering før annealing; AA = anodisering etter glødning. Denne figuren er modifisert fra Lin et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative SEM-bilder av gramnegativ E. coli og grampositiv S. aureus eksponert for 0-1,2 mg/ml nMgO. (A) E. coli viste lignende morfologi ved 1,2 mg/ml til 2,0 mg/ml nMgO. Av denne grunn vises ett bilde ved 1,2 mg/ml som en representant for E. coli utsatt for høyere nMgO-konsentrasjoner. (B) S. aureus viste også lignende morfologi ved 1,2 mg/ml til 2,0 mg/ml nMgO. Av denne grunn vises ett bilde ved 1,2 mg/ml som en representant for S. aureus eksponert for høyere nMgO-konsentrasjoner17. Skalastenger = 5 μm. nMgO = magnesiumoksid nanopartikler. Denne figuren er modifisert fra Nguyen et al.17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Representative fluorescensbilder av E. coli festet seg på substratene med kvantifisering ved 1 dag, 2 dager og 3 dagers inkubasjon. (A) Fluorescensbilder av E. coli farget med 10 μM tioflavin T. (B) Kvantifisering av E. coli utsatt for materialer av interesse ved bruk av celler / ml. Det var ingen bakteriell adherens til MgY_O etter 2 dagers inkubasjon, og redusert etterlevelse av MgY etter 3 dagers inkubasjon. Skala bar = 10 μm. Denne figuren er modifisert fra Lock et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har presentert fire in vitro-metoder (A-D) for å karakterisere de antibakterielle aktivitetene til nanopartikler og nanostrukturerte overflater. Mens hver av disse metodene kvantifiserer bakterievekst og levedyktighet over tid som respons på nanomaterialer, eksisterer det en viss variasjon i metodene som brukes til å måle den opprinnelige bakterielle såtettheten, veksten og levedyktigheten over tid. Tre av disse metodene, den direkte samkulturmetoden (A)17, den direkte dyrkningsmetoden (C)14 og fokusert-kontakteksponeringsmetoden (D)16, kvantifiserer bakterievekst og levedyktighet etter en periode med eksponering for nanomaterialer ved å telle CFUene per volumenhet. Til sammenligning kvantifiserer den direkte eksponeringsmetoden (B) bakterievekst via diskrete sanntids optiske tetthetsmålinger (OD600). Denne metoden kan også brukes på direkte samkultur, direkte kultur og fokuserte kontakteksponeringsmetoder hvis det er tidsbegrensninger for kvantifisering av CFUer, og / eller en sanntids bakteriell tetthetsavlesning er nødvendig for kinetiske studier. Dersom det ikke er kjent at det er kjent virksomme antibiotika for bakterieartene som skal testes i direkte eksponeringsmetoden, må det gjøres et litteratursøk for å finne riktig antibiotika og deres MIC-verdier for å tjene som referanser for nanomaterialgruppene. En bekreftelse av MIC-verdiene kan gjøres ved å fullføre en standardiseringskurve, som plotter forholdet mellom spektrofotometridataene og kvantifiseringen av kolonidannende enheter på bestemte tidspunkter. Denne prosessen korrelerer antall celler som er tilstede i kultur på bestemte punkter med den respektive optiske tettheten. I tillegg introduseres bakterier ved lag-stadium vekst til nanopartikler i den direkte kokulturmetoden og nanostrukturerte overflater i direkte kultur og fokuserte kontakteksponeringsmetoder. I motsetning til dette blir bakterier i det logaritmiske vekststadiet introdusert til nanopartikler i den direkte eksponeringsmetoden. Videre kvantifiseres bakteriesåtettheter som celler/ml i den direkte kokulturmetoden, den direkte kulturmetoden og eksponeringsmetoden for fokusert kontakt, mens bakteriens optiske tetthet (OD600) måles for å spore sanntidsvekst i den direkte eksponeringsmetoden.

Selv om hver av disse metodene er like i rammeverket, presenterer de også unike egenskaper for å skille effekten av nanopartikler eller nanostrukturerte overflater på bakterier. For eksempel karakteriserer den direkte samkulturmetoden bakterielle responser på økende forhåndsmålte konsentrasjoner av nanopartikler ved CFU / ml kvantifisering (figur 3). Denne metoden genererer minimum hemmende og minimum bakteriedrepende konsentrasjoner (MIC og MBC) av nanopartikler for mikrobielle arter av interesse, og hvis flere arter undersøkes, den mest potente konsentrasjonen (MPC) av nanopartikler17. Identifikasjonen av MIC, MBC90-99.99 og MPC er avgjørende for anvendelse av nanopartikler i nedstrøms applikasjoner. For eksempel kan disse dataene brukes til in vivo-undersøkelser av antibakteriell aktivitet i nanopartikler samtidig som cytokompatibilitet opprettholdes når mindre enn dødelige konsentrasjoner også er identifisert. I motsetning til dette karakteriserer den direkte eksponeringsmetoden nanopartikkelaktivitet som bakteriostatisk eller bakteriedrepende på en måte som ligner klassifiseringen av antibiotika, hvor synergistiske eller uønskede effekter må identifiseres før bruk i forskning eller kliniske innstillinger.

Karakterisering av antibakterielle forbindelser som bakteriostatiske eller bakteriedrepende er relevant for klinisk bruk og in vitro og in vivo forskning38. Av denne grunn, når man utformer metoder for å undersøke disse egenskapene, må eventuelle negative effekter som kan påvirke resultatene identifiseres. Her kategoriserer den direkte eksponeringsmetoden nanopartikler som bakteriostatiske eller bakteriedrepende for spesifikke bakteriearter ved hjelp av sanntidsmålinger av optisk tetthet ved 600 nm (figur 4). Bakterier i den logaritmiske vekstfasen blandes med nanopartikler på MIC-nivå for å skape bakterier og nanopartikkelsuspensjoner. Disse suspensjonene måles diskret i sanntid for å bestemme de pågående effektene av nanopartikkeleksponering på bakteriene. For å verifisere de oppnådde resultatene, fungerer samtidig dyrkede bakterier i suspensjon med bakteriostatiske og bakteriedrepende antibiotika som referanse for å bekrefte vekstratene til nanopartikkeleksponerte bakterier.

Inkorporering av nanopartikler i bioteknologi, klinisk og miljøvitenskap kan ha vidtgående muligheter, men bruk av antibakterielle data fra nanopartikler for in vitro og in vivo studier på nanostrukturerte overflater er utfordrende å oppnå. Av denne grunn presenterte vi direkte kultur og fokuserte kontakteksponeringsmetoder for å karakterisere in vitro antibakterielle aktiviteter av nanostrukturerte overflater. Den direkte kulturmetoden undersøker de antibakterielle effektene av nanostrukturerte overflater når bakterier er i direkte kontakt med materialene av interesse14. Her blir bakterier suspendert i rSBF pluss 10% FBS utsatt for nanostrukturerte overflater, etterfulgt av kvantifisering av bakterievekst over tid for bakterier i direkte kontakt med overflaten og i suspensjon som omgir materialet av interesse (indirekte kontakt) ved bruk av CFU / ml. Tidligere har eksperimentelle resultater som involverer magnesiumlegering nanostrukturer (ZC21 og ZSr41 legeringer) indikert at antibakterielle aktiviteter øker når bakteriene er i direkte kontakt med nanostrukturerte overflater sammenlignet med indirekte kontakt, hvor bakteriene forblir i suspensjon med liten eller ingen kontakt14 (figur 5). Endelig karakteriserer fokusert-kontaktmetoden antibakteriell aktivitet ved grensesnittet til bakterier og en nanostrukturert overflate16. Her undersøkte vi magnesiumoksid anodisert eller elektroforetisk avsatt på overflaten av en bioresorberbar magnesiumlegering for å bestemme potensiell forstyrrelse av bakteriell adhesjon og biofilmdannelse over tid. Forstyrrelsen av biofilmdannelse kan være kritisk for pasientens helbredelsesprosesser, da biofilmer har en tendens til å unngå vertsimmunresponser og antibiotikabehandlinger39 og resultere i infeksjoner som er ekstremt vanskelige å behandle.

Her presenterer vi en metode tilpasset den japanske industristandarden JIS Z 2801:200016. Denne metoden sikrer at bakterier er festet til sterilt nitrocellulosefilterpapir etterfulgt av eksponering for et fast område av nanostrukturert overflate. Dette begrenser karakteriseringen av overflateeffektene på antibakteriell aktivitet til kun testområdet. I de representative resultatene viste anodiseringen før glødning (1.9A), anodisering etter glødning (1.9AA) og elektroforetisk avsetning før glødning (EPD) prøver signifikante effekter på å redusere bakterievekst, så vel som deres tilsvarende filterpapir sammenlignet med magnesium-, titan- og glasskontrollprøvene. Den elektroforetiske avsetningen etter glødning (A-EPD) prøver var også effektive for å redusere bakterievekst, men dette resultatet var mindre signifikant i forhold til resultatene oppnådd for 1.9A, 1.9AA og EPD-prøvene16 (figur 6).

Oppsummert er hver in vitro-metode som presenteres her rimelig enkel å mestre og inkorporerer billige og lett tilgjengelige materialer. Disse metodene kan brukes til å karakterisere interaksjoner mellom et bredt spekter av nanomaterialer og mikrobielle arter som er av interesse for forskere. Å forstå likhetene og forskjellene mellom disse metodene er nødvendig for å designe optimale eksperimenter for å oppfylle forskningsmålene. Her kan den vitenskapelige kunnskapen fra disse in vitro-metodene brukes på nedstrøms medisinske applikasjoner der antibiotika må være begrenset eller representere en ugunstig tilnærming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne setter pris på den økonomiske støtten fra US National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 og NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu), og UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant tildelt Patricia Holt-Torres. Forfatterne setter pris på assistansen fra Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) ved UC-Riverside for bruk av SEM / EDS og Dr. Perry Cheung for bruk av XRD. Forfatterne vil også takke Morgan Elizabeth Nator og Samhitha Tumkur for deres hjelp med eksperimentene og dataanalysene. Eventuelle meninger, funn, konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i denne artikkelen er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Milipore Sigma Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven  MTI Corporation BPG-7082 https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer  Sigma-Aldrich  42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE Fisher Scientific 50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera  Hamamatsu C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-49B
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G5882
Hemocytometer Brightline, Hausser Scientific 1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) PerkinElmer 8000
Inverse microscope Nikon Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth Sigma Life Science  L3022
Luria Bertani Broth + agar Sigma Life Science  L2897
MacroTube 5.0   Benchmark Scientific C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles US Research Nanomaterials, Inc Stock #: US3310   M MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance Mettler Toledo MS105D
Nitrocellulose paper Fisherbrand 09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351172
Petri dish 100 mm VWR 470210-568
Petri dish, 15 mm Fisherbrand FB0875713A
pH meter VWR SP70P
Scanning electron microscopy (SEM) TESCAN  Vega3 SBH
Sonicator VWR 97043-936
Table top centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Table top centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar MP 1010617
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
UV-Vis spectrophotometer  Tecan Infinite 200 PRO https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L VWR N/A
X-ray power defraction  Panalytical N/A PANalytical Empyrean Series 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
  30. MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
  31. CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

Tags

Bioengineering utgave 194 antimikrobielle nanopartikler nanostrukturerte overflater minimum hemmende konsentrasjon (MIC) minimum bakteriedrepende konsentrasjon (MBC) doseavhengig bakterie bakterier
Evaluering av antimikrobielle aktiviteter av nanopartikler og nanostrukturerte overflater <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu,… More

Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu, H. H. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (194), e64712, doi:10.3791/64712 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter