Summary
İn vitro teknikleri kullanarak nanopartiküllerin ve nanoyapılı yüzeylerin antimikrobiyal aktivitelerini değerlendirmek için dört yöntem sunuyoruz. Bu yöntemler, farklı nanopartiküllerin ve nanoyapılı yüzeylerin çok çeşitli mikrobiyal türlerle etkileşimlerini incelemek için uyarlanabilir.
Abstract
Nanopartiküllerin ve gümüş, çinko oksit, titanyum dioksit ve magnezyum oksit gibi nanoyapılı yüzeylerin antimikrobiyal aktiviteleri daha önce klinik ve çevresel ortamlarda ve tüketilebilir gıda ürünlerinde araştırılmıştır. Bununla birlikte, kullanılan deneysel yöntem ve materyallerdeki tutarlılık eksikliği, aynı nanoyapı tipleri ve bakteri türleri üzerinde yapılan çalışmalar arasında bile çelişkili sonuçlarla sonuçlanmıştır. Nanoyapıları bir ürün tasarımında katkı maddesi veya kaplama olarak kullanmak isteyen araştırmacılar için, bu çelişkili veriler klinik ortamlarda kullanımlarını sınırlar.
Bu ikilemle yüzleşmek için, bu makalede, nanopartiküllerin ve nanoyapılı yüzeylerin antimikrobiyal aktivitelerini belirlemek için dört farklı yöntem sunuyoruz ve farklı senaryolarda uygulanabilirliklerini tartışıyoruz. Tutarlı yöntemlerin uyarlanmasının, çalışmalar arasında karşılaştırılabilecek ve farklı nanoyapı tipleri ve mikrobiyal türler için uygulanabilecek tekrarlanabilir verilere yol açması beklenmektedir. Nanopartiküllerin antimikrobiyal aktivitelerini belirlemek için iki yöntem ve nanoyapılı yüzeylerin antimikrobiyal aktiviteleri için iki yöntem sunuyoruz.
Nanopartiküller için, doğrudan ko-kültür yöntemi, nanopartiküllerin minimum inhibitör ve minimum bakterisidal konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılabilir ve doğrudan maruz kalma kültürü yöntemi, nanopartikül maruziyetinden kaynaklanan gerçek zamanlı bakteriyostatik ve bakterisidal aktiviteyi değerlendirmek için kullanılabilir. Nanoyapılı yüzeyler için, doğrudan kültür yöntemi, bakterilerin dolaylı ve doğrudan nanoyapılı yüzeylerle temas halinde yaşayabilirliğini belirlemek için kullanılır ve odaklanmış temasa maruz kalma yöntemi, nanoyapılı bir yüzeyin belirli bir alanındaki antimikrobiyal aktiviteyi incelemek için kullanılır. Nanopartiküllerin ve nanoyapılı yüzeylerin antimikrobiyal özelliklerini belirlerken in vitro çalışma tasarımı için dikkate alınması gereken temel deneysel değişkenleri tartışıyoruz. Tüm bu yöntemler nispeten düşük maliyetlidir, ustalaşması nispeten kolay ve tutarlılık için tekrarlanabilir teknikler kullanır ve çok çeşitli nanoyapı tiplerine ve mikrobiyal türlere uygulanabilir.
Introduction
Sadece ABD'de, yılda 1,7 milyon kişi hastane kaynaklı bir enfeksiyon (HAI) geliştirir ve bu enfeksiyonların her 17'sinden biri ölümle sonuçlanır1. Ek olarak, HAI'ler için tedavi maliyetlerinin yıllık 28 milyar dolar ile 45 milyar dolar arasında değiştiği tahmin edilmektedir 1,2. Bu HAI'lere, genellikle kronik yara enfeksiyonlarından izole edilen ve genellikle olumlu bir hasta sonucu elde etmek için kapsamlı tedavi ve zaman gerektiren metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 ve Pseudomonas aeruginosa4 baskındır.
Son birkaç on yılda, bu ve diğer patojenik bakterilerle ilgili enfeksiyonları tedavi etmek için çoklu antibiyotik sınıfları geliştirilmiştir. Örneğin, rifamisin analogları MRSA, diğer gram-pozitif ve gram-negatif enfeksiyonları ve Mycobacterium spp. enfeksiyonlarını tedavi etmek için kullanılmıştır5. 1990'larda, artan sayıda M. tuberculosis enfeksiyonunu etkili bir şekilde tedavi etmek için, etkinliklerini artırmak için ek ilaçlar rifamisin analogları ile birleştirilmiştir. Bununla birlikte, M. tuberculosis vakalarının yaklaşık% 5'i rifampisin 5,6'ya dirençli olmaya devam etmektedir ve çoklu ilaca dirençli bakteriler7 ile ilgili endişeler artmaktadır. Şu anda, HAI'lerin tedavisinde tek başına antibiyotik kullanımı yeterli olmayabilir ve bu, alternatif antimikrobiyal tedaviler için devam eden bir araştırmaya neden olmuştur1.
Gümüş (Ag)8,9,10 ve altın (Au)11 gibi ağır metaller ve nanopartikül (NP) formunda (sırasıyla AgNP, AuNP, TiO2NP ve ZnONP) titanyum dioksit (TiO2)12 ve çinko oksit (ZnO)13 gibi seramikler antimikrobiyal aktiviteleri açısından incelenmiş ve potansiyel antibiyotik alternatifleri olarak tanımlanmıştır. Ek olarak, magnezyum alaşımları (Mg alaşımları)14,15,16, magnezyum oksit nanopartikülleri 17,18,19,20,21 ve magnezyum hidroksit nanopartikülleri [sırasıyla nMgO ve nMg(OH)2] 22,23,24 gibi biyolojik olarak emilebilir malzemeler , ayrıca incelenmiştir. Bununla birlikte, nanopartiküllerin önceki antimikrobiyal çalışmaları tutarsız malzemeler ve araştırma yöntemleri kullanmış, bu da karşılaştırılması zor veya imkansız olan ve bazen doğada çelişkili olan verilerle sonuçlanmıştır18,19. Örneğin, gümüş nanopartiküllerin minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) ve minimum bakterisidal konsantrasyonu (MBC) farklı çalışmalarda önemli ölçüde değişmiştir. Ipe ve ark.25, gram-pozitif ve gram-negatif bakterilere karşı MIC'leri belirlemek için ortalama parçacık boyutu ~ 26 nm olan AgNP'lerin antibakteriyel aktivitelerini değerlendirdi. P. aeruginosa, E. coli, S. aureus ve MRSA için tanımlanan MIC'ler sırasıyla 2 μg / mL, 5 μg / mL, 10 μg / mL ve 10 μg / mL idi. Buna karşılık, Parvekar ve ark.26, ortalama parçacık boyutu 5 nm olan AgNP'leri değerlendirdi. Bu örnekte, AgNP MIC ve 0.625 mg / mL'lik bir MBC'nin S. aureus'a karşı etkili olduğu bulunmuştur. Ek olarak, Loo ve ark.27, AgNP'leri 4.06 nm boyutunda değerlendirdi. E. coli bu nanopartiküllere maruz kaldığında, MIC ve MBC 7.8 μg / mL'de rapor edildi. Son olarak, Ali ve ark.28, ortalama 18 nm büyüklüğündeki küresel AgNP'lerin antibakteriyel özelliklerini araştırdılar. P. aeruginosa, E. coli ve MRSA bu nanopartiküllere maruz kaldığında, MIC sırasıyla 27 μg / mL, 36 μg / mL, 27 μg / mL ve 36 μg / mL'de tanımlandı ve MBC sırasıyla 36 μg / mL, 42 μg / mL ve 30 μg / mL'de tanımlandı.
Nanopartiküllerin antibakteriyel aktivitesi son yıllarda kapsamlı bir şekilde çalışılmış ve rapor edilmiş olmasına rağmen, çalışmalar arasında doğrudan karşılaştırmalara izin vermek için kullanılan malzemeler ve araştırma yöntemleri için bir standart yoktur. Bu nedenle, materyalleri ve yöntemleri tutarlı tutarken nanopartiküllerin antimikrobiyal aktivitelerini karakterize etmek ve karşılaştırmak için doğrudan ko-kültür yöntemi (yöntem A) ve doğrudan maruz kalma yöntemi (yöntem B) olmak üzere iki yöntem sunuyoruz.
Nanopartiküllere ek olarak, nanoyapılı yüzeyler de antibakteriyel aktiviteler açısından incelenmiştir. Bunlar, grafen nanotabakalar, karbon nanotüpler ve grafit29 gibi karbon bazlı malzemelerin yanı sıra saf Mg ve Mg alaşımlarını içerir. Bu malzemelerin her biri, karbon bazlı materyaller tarafından hücre zarlarına uygulanan fiziksel hasar ve Mg bozunduğunda reaktif oksijen türlerinin (ROS) salınması yoluyla metabolik süreçlere veya DNA'ya verilen hasar dahil olmak üzere en az bir antibakteriyel mekanizma sergilemiştir. Ek olarak, çinko (Zn) ve kalsiyum (Ca) Mg alaşımlarının oluşumunda birleştirildiğinde, Mg matris tane boyutunun rafine edilmesi artar, bu da sadece Mg numunelerine kıyasla substrat yüzeylerine bakteriyel yapışmada bir azalmaya yol açar14. Antibakteriyel aktiviteyi göstermek için, doğrudan ve dolaylı yüzey teması ile bakteriyel koloni oluşturan birimlerin (CFU'lar) nicelleştirilmesi yoluyla zaman içinde nanoyapılı malzemeler üzerinde ve çevresinde bakteriyel yapışmayı belirleyen doğrudan kültür yöntemini (yöntem C) sunuyoruz.
Boyut, şekil ve yönelim dahil olmak üzere yüzeylerdeki nanoyapıların geometrisi, malzemelerin bakterisit aktivitelerini etkileyebilir. Örneğin, Lin ve ark.16 , eloksal ve elektroforetik birikim (EPD) yoluyla Mg substratlarının yüzeylerinde farklı nanoyapılı MgO katmanları ürettiler. Nanoyapılı yüzeye in vitro olarak bir süre maruz kaldıktan sonra, S. aureus'un büyümesi, işlenmemiş Mg'ye kıyasla önemli ölçüde azaltılmıştır. Bu, nanoyapılı yüzeyin, işlenmemiş metalik Mg yüzeyine karşı bakteriyel yapışmaya karşı daha büyük bir gücünü gösterdi. Bu makalede, çeşitli nanoyapılı yüzeylerin antibakteriyel özelliklerinin farklı mekanizmalarını ortaya koymak için, ilgi alanındaki hücre-yüzey etkileşimlerini belirleyen odaklanmış temasa maruz kalma yöntemi (yöntem D) tartışılmıştır.
Bu makalenin amacı, farklı nanopartiküllere, nanoyapılı yüzeylere ve mikrobiyal türlere uygulanabilir dört in vitro yöntem sunmaktır. Karşılaştırılabilirlik için tutarlı, tekrarlanabilir veriler üretmek üzere her yöntem için temel hususları tartışıyoruz. Spesifik olarak, doğrudan ko-kültür yöntemi17 ve doğrudan maruz kalma yöntemi, nanopartiküllerin antimikrobiyal özelliklerini incelemek için kullanılır. Doğrudan ko-kültür yöntemiyle, bireysel türler için minimum inhibitör ve minimum bakterisidal konsantrasyonlar (sırasıyla MIC ve MBC90-99.99) belirlenebilir ve birden fazla tür için en güçlü konsantrasyon (MPC) belirlenebilir. Doğrudan maruz kalma yöntemi sayesinde, nanopartiküllerin minimum inhibitör konsantrasyonlardaki bakteriyostatik veya bakterisidal etkileri, zaman içinde gerçek zamanlı optik yoğunluk okumaları ile karakterize edilebilir. Doğrudan kültür14 yöntemi, nanoyapılı yüzeylerle temas halinde olan bakterileri doğrudan ve dolaylı olarak incelemek için uygundur. Son olarak, odaklanmış temaslı maruz kalma16 yöntemi, bakterilerin doğrudan uygulanması ve hücre-nanoyapı arayüzünde bakteriyel büyümenin karakterizasyonu yoluyla nanoyapılı bir yüzeydeki belirli bir alanın antibakteriyel aktivitesini incelemek için sunulmuştur. Bu yöntem, Japon Endüstri Standardı JIS Z 2801: 200016'dan modifiye edilmiştir ve mikrop-yüzey etkileşimlerine odaklanmak ve mikrobiyal kültürdeki toplu numune bozulmasının antimikrobiyal aktiviteler üzerindeki etkilerini dışlamak için tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Doğrudan ko-kültür ve doğrudan maruz kalma yöntemlerini sunmak için, bakteriyel etkileşimleri göstermek için model bir malzeme olarak magnezyum oksit nanopartikülleri (nMgO) kullanıyoruz. Doğrudan kültürü ve odaklanmış temasa maruz kalma yöntemlerini sunmak için, örnek olarak nanoyapılı yüzeylere sahip bir Mg alaşımı kullanıyoruz.
1. Nanomalzemelerin sterilizasyonu
NOT: Tüm nanomalzemeler mikrobiyal kültürden önce sterilize edilmeli veya dezenfekte edilmelidir. Kullanılabilecek yöntemler arasında ısı, basınç, radyasyon ve dezenfektanlar bulunur, ancak her yöntem için malzemelerin toleransı in vitro deneylerden önce tanımlanmalıdır.
- Nanopartiküller
NOT: Numuneler etanol gibi organik bir çözücüde saklanabilir veya bir tabak veya kutuya paketlenebilir, ardından uygun bir şekilde sterilizasyon veya dezenfeksiyon yapılabilir. Nanopartiküller, doğrudan ko-kültür yöntemi17 ve doğrudan maruz kalma yönteminin gösterilmesi için aşağıdaki yöntem kullanılarak sterilize edildi.- MgO nanopartiküllerini 200 ° C'lik bir konveksiyon fırınında 30 in vitro deneyden önce60 dakika boyunca sterilize edin.
NOT: Bu yöntem seçilmiştir çünkü su buharı ve UV ışığı MgO nanopartiküllerinin (nMgO) yapılarını etkileyebilir17.
- MgO nanopartiküllerini 200 ° C'lik bir konveksiyon fırınında 30 in vitro deneyden önce60 dakika boyunca sterilize edin.
- Dökme malzemeler
NOT: Nanoyapılı malzemeler, doğrudan kültür yönteminin gösterilmesi için aşağıdaki yöntemle sterilize edilmiştir.- Doğrudan kültür yöntemi14 için, in vitro çalışmalara başlamadan önce hazırlanan ZC21, Mg ve T64 numunelerini ultraviyole (UV) radyasyon kullanarak 4 saat boyunca dezenfekte edin.
- Fokuslu temasa maruz kalma yöntemi16 için, in vitro çalışmalara başlamadan önce tüm numuneleri UV radyasyonu kullanarak 2 saat boyunca dezenfekte edin.
- Alternatif olarak, ısıya duyarlı malzemelerin sterilizasyonu için etilen oksit (EtO) kullanın.
2. Doğrudan eş-kültür yöntemi (yöntem A)
NOT: Yöntem A'da, gecikmeli fazlı tohumlama kültüründeki bakteriler, belirli konsantrasyonlardaki nanopartiküllerle doğrudan karıştırılır. Nanopartikül antimikrobiyal aktivitelerinin incelenmesi için, Nguyen ve ark.17 tarafından tanımlanan bir protokolü takip ediyoruz.
- Nanopartiküllerin ve nanoyapıların karakterizasyonu
NOT: Nanoyapı bileşimi ve şekli, X-ışını tozu kırınımı kullanılarak doğrulanır.- Nanopartiküllerin ölçümü
- 3 mL numuneyi üçlü olarak barındırmak için nanopartikülleri mL başına istenen kütlenin 9 katında tartın. Örneğin, 1.8 mg / mL'de 0.2 mg / mL nMgO ağırlığındadır.
NOT: Bu, nanopartiküllerin bakteri kültürlerinde ve et sularında tutarlı bir şekilde dağılmasını sağlar. - Analitik bir terazi kullanılarak önceden tartılmış ve katranlanmış 5,0 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpündeki tüm nanopartikülleri ölçün.
- 3 mL numuneyi üçlü olarak barındırmak için nanopartikülleri mL başına istenen kütlenin 9 katında tartın. Örneğin, 1.8 mg / mL'de 0.2 mg / mL nMgO ağırlığındadır.
- Nanopartiküllerin ölçümü
- Bakteri kültürlerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi
- Her in vitro deney için, bakteri hücresi stoklarını -80 ° C'de depolamadan alın. Her bakteri hücresi stoğundan 10 μL'sini uygun bir büyüme ortamının 5 mL'sine ekleyin.
- Aşılanmış ortamı, gece boyunca yaklaşık 16 saat boyunca 37 ° C'de ve 250 rpm'de bir inkübatör-çalkalayıcıya yerleştirin.
- Staphylococcus türleri yetiştirilirse, her bir gece kültürünün 400 μL'sini 20 mL taze büyüme ortamına (100 μL / 5 mL ortam) yerleştirerek alt kültür yapın ve ek bir 4-6 saat boyunca 37 ° C ve 250 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
- Tohumlama yoğunluğunu belirlemek için bakteri hücrelerinin yıkanması ve sayılması
NOT: İstenen 7.8 × 106 CFU / mL'lik tohumlama yoğunluğu, idrar yolu enfeksiyonunu doğrulamak için gerekenden daha büyük hücre sayısı olarak tanımlanmıştır.- Gece boyunca bakteri kültürünün 1 mL'sini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırarak kültürlenmiş bakterileri toplayın. Gece boyunca bakteri kültürlerinden yeterli sayıda alikot oluşturun ve istenen tohumlama yoğunluklarına ulaşmak için 1.956 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı peletlenmiş hücrelerden çıkarmak ve süpernatantı bir toplama kabına yerleştirmek için pipet. Hücre peletlerini 0.5 mL taze büyüme ortamında yeniden askıya alın. 1 mL süspansiyon aliquot yeniden askıya alınan hücre sayısını altıya düşürmek için 1 mL süspansiyon oluşturmak üzere iki 0,5 mL süspansiyonu birleştirin. Santrifüjlemeyi 1.956 × g'da 10 dakika boyunca tekrarlayın.
- Adım 2.3.2'de olduğu gibi taze büyüme ortamı kullanarak ikinci bir yıkama döngüsünü tamamlayarak askıya alınmış yıkanmış hücrelerin 1 mL alikotlarının sayısını üçe düşürün.
- Adım 2.3.2'de olduğu gibi, hücre peletlerini 0.33 mL Tris tamponu (hidroksimetil) aminometan tamponunda (Tris tamponu, pH 8.5) yeniden askıya almak dışında, üçüncü döngüyü tamamlayın. Her biri 0,33 mL hacimli üç süspansiyonu bir adet 1,5 mL mikrosantrifüjde birleştirin. Santrifüjlemeyi 1.956 × g'da 10 dakika boyunca tekrarlayın.
NOT: Tris tamponu Mg2+ veya Ca2+ iyon31 içermez. Bu, kültür sonrası et suyunda Mg2 + ve Ca2 + iyonlarını ölçmek için endüktif olarak eşleşmiş plazma-optik emisyon spektrometrisinin (ICP-OES) kullanımı için önemlidir. Buna karşılık, fosfat tamponlu salin (PBS)32'de bulunan fosfatlar, örneğin, hem Mg 2 + hem de Ca2 + iyonlarını33,34,35 ayırır ve ICP-OES verilerinin yorumlanmasında karışıklığa neden olur. - Süpernatantı peletlenmiş hücrelerden çıkarın. Hücre peletini, hücre süspansiyonu-gecikme fazlı bakteriyel tohumlama kültürü olarak bilinen 1 mL taze Tris tamponunda yeniden askıya alın.
- Bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyon konsantrasyonunu (hücreler / mL) belirleyin.
- Tohumlama bakteri kültürünün oluşturulması
NOT: Numunenin toplam hacmi 3 mL'dir ve üçlü olarak tamamlanmıştır (toplam 9 mL).- Gerekli bakteri tohumlama kültürünün toplam hacmini belirleyin. Tohumlama kültürünü oluşturmak için, 7,8 × 106 hücre/mL'lik bir tohumlama kültürü oluşturmak için gereken hücre süspansiyonunun hacmini hesaplamak üzere C1V1 = C 2 V2kullanın. Hücre süspansiyonunun hesaplanan hacmini (V1) gerekli büyüme ortamı hacmine (V2) ekleyin.
- CFU / mL'de gerçek bakteri tohumlama yoğunluğunu belirleyin. 10-4'e kadar on kat seri seyreltme oluşturun. 10-4 seyreltmeyi uygun büyüme agarına yayınlayın ve gece boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, koloni sayısını sayın ve CFU / mL'yi hesaplayın.
- Bakteri oluşumu ve nanopartikül kültürleri
- 12 kuyulu, doku işlememiş polistiren plakalarda, ihtiyaç duyulan kuyucuk sayısı için her bir kuyucukta bakteri tohumlama kültürünün 2 mL'sini aliquot.
- Önceden tartılmış nMgO içeren her 5 mL mikrosantrifüj tüpü için, 3 mL bakteri tohumlama kültürü ekleyin. nMgO'yu bakterilerle karıştırmak için kısaca vorteks. Karışımın 1 mL'sini üç ayrı kuyucuğa aliterek önceden ölçülen her nMgO ağırlığının üçlü numunelerini oluşturun. nMgO'yu süspansiyonda tutmak için her 1 mL aliquot yapılmadan önce bakteri / nMgO karışımını 2-3x pipetleyin.
NOT: Kontrol numuneleri sadece 3 mL hücreden, sadece 3 mL ortamdan ve kullanılan nanopartiküllerin en düşük ve en yüksek konsantrasyonlarını içeren 3 mL'den oluşacaktır. Bunlar adım 2.5.2'deki gibi hazırlanır. Tüm kontrol numuneleri üçlü olarak tamamlanır. - Tüm 12 delikli plakaları 24 saat boyunca 37 ° C ve 120 rpm'de inkübe edin.
- nMgO'ya maruz kaldıktan sonra bakteriyel hücre büyümesinin belirlenmesi
- Bakteri kültürlerinin gece boyunca inkübasyonundan sonra, her 3 mL'lik numuneyi ayrı bir 15 mL konik tüpe pipetleyerek toplayın.
- 1:10 seri seyreltme oluşturmak için 96 delikli bir plaka kullanın. Bakteri içeren tüm numuneleri seri olarak seyreltmek için gerekli sütun sayısını belirleyin. Uygun sayıda sütun için B satırındaki her bir kuyucuğa G satırına 180 μL Tris arabelleği ekleyin.
- Bakteri örnekleri içeren her 15 mL konik tüpü kısaca vorteksleyin ve A satırındaki bireysel bir kuyucuğa 50 μL ekleyin.
- A satırındaki her bir kuyucuk için, 20 μL'yi B sırasına aktarın (örneğin, A1'den B1'e) ve 200 μL'lik bir hacim elde etmek için pipetleme ile kısaca karıştırın. Steril bir pipet ucu kullanarak, B sırasındaki kuyudan C sırasındaki kuyuya 20 μL aktarın. G satırındaki kuyu 200 μL içerene kadar bu kalıbı devam ettirin, B satırında 10−1'den G satırında 10−6'ya seri seyreltmeyi tamamlamak.
- Her bir kuyucuğun 100 μL'sini uygun bir büyüme agar plakasına pipet edin ve hücre kültürünü dağıtmak için plaka boyunca yayın. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de bir inkübatör-çalkalayıcıya yerleştirin. Plakaları 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Plakaları inceleyin ve yaklaşık 25-300 koloniye sahip olanları sayın. Mümkünse, aynı seyreltme değerine sahip plakaları seçin. CFU/mL'yi hesaplamak için plaka başına koloni sayısını kullanın.
- İnkübasyon sonrası pH'ın değerlendirilmesi
NOT: Her pH metre modeli için üreticinin talimatlarını izleyin.- pH 4, pH 7 ve pH 10'un standartlaştırıcı çözeltilerini kullanarak bir pH metreyi önceden kalibre edin. pH probunu 15 mL konik tüpe yerleştirerek her bakteri örneğini okuyun.
- ICP-OES için numunelerin hazırlanması
NOT: ICP-OES, Mg2+ veCa2+ iyonlarının konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır. Bu katyonlar, her biri hücresel metabolizmaya katıldığı için önemli kabul edilir.- Adım 2.6.1'de hazırlanan her 15 mL konik tüpü, hücresel ve nanopartikül kalıntılarını pelet etmek için 5 dakika boyunca 5.724 × g'da santrifüjleyin.
- 15 mL'lik bir konik tüp kullanarak, 1:100'lük bir seyreltme oluşturmak için 30 μL'lik süpernatantı 2,97 mL 18,2 Ω filtrelenmiş suya seyreltin.
NOT: Seyreltme faktörü, öngörülen iyon konsantrasyonlarına ve spektrometre cihazının algılama sınırına göre ayarlanabilir. - ICP-OES kullanarak örnekleri okuyun.
3. Doğrudan maruz kalma yöntemi (yöntem B)
NOT: Seçilen bakterilerin büyüme hızı bilinmiyorsa, bu yöntemi uygulamadan önce büyüme eğrisinin standardizasyonu tamamlanmalıdır.
- İlgilenilen nanopartiküllere maruz kaldıktan sonra gerçek zamanlı bakteriyostatik ve bakterisidal aktiviteleri belirleyin.
- Adım 2.1-2.1.2.2'de açıklanan yöntemleri kullanarak istenen nanopartikül konsantrasyonlarını hazırlayın. Kullanılacak nanopartiküllerin her ağırlığından iki set hazırlayın: biri logaritmik büyüme fazında 3 mL alikot bakteri kültürüne eklenecek, diğeri ise kontrol grupları olarak bakterisiz 3 mL alikot büyüme ortamına eklenecektir.
- Test edilecek bakteri türleri için uygun bakteriyostatik ve bakterisidal antibiyotikleri belirleyin.
NOT: Her antibiyotik için minimum inhibitör konsantrasyonunun bilinmesi gerekmektedir.
- Tüm nanopartikül, antibiyotik ve kontrol numuneleri için üçlü 3 mL numuneler için gereken toplam bakteri kültürü hacmini hesaplayın.
NOT: Eşit hacimde steril büyüme ortamı gereklidir. Spektrofotometrinin kullanımı planlanıyorsa, küvetler için gereken 0,5 mL ila 1,0 mL hacmin yerleştirilmesi için gereken toplam hacimde ayarlamalar yapılması gerekir. - 1. Gün: Her in vitro deney için, adım 2.2.1-2.2.2'yi izleyerek gecelik stoklar oluşturun.
- 2. Gün: Plaka okuyucu ayarlarının 600 nm optik yoğunluğa sahip 96 delikli bir plakayı barındırabileceğini onaylayın. Numuneleri 96 delikli bir plaka kullanarak 200 μL alikotta ölçün.
- 0.01'de bir başlangıç bakteri kültürü OD600 belirleyin - nanopartiküllerin ve antibiyotiklerin eklenmesinden önce ilk inkübasyon periyoduna başlamak için kullanılan yoğunluk.
- Gece boyunca bakteri kültürünü inkübatör-çalkalayıcıdan toplayın.
- Test edilecek her malzeme (örneğin, önceden ölçülmüş nanopartiküller veya antibiyotikler) için, 0.01'lik bir OD600'de ayrı bir bakteri kültürü oluşturun. İhtiyaç duyulan hücre kültürü hacmini barındıracak kadar büyük bir kap kullanın (örneğin, sterilize edilmiş bir Erlenmeyer şişesi veya 50 mL konik tüpler).
- Büyüme ortamının üç 200 μL alikotunu üç kuyucuğa ve bakteri kültürünün üç 200 μL alikotunu ek kuyucuklara (örneğin, A1 ila A6) yerleştirerek gece bakteri örneklerini büyüme ortamı ile seyreltin.
- 96 delikli plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve tarayın.
NOT: Ortalama bir değer üretmek için taranan her kuyu için okumaların ortalaması alınır. - Süspansiyondaki bakteri yoğunluğunu hesaplamak için, üçlü bir numune içeren her bir kuyucuk için ortalama değerin ortalamasını alın.
- Bakterilerin optik yoğunluğunu belirlemek için, et suyu numune ortalamasını bakteri ortalamasından çıkarın.
- Bakteriyel süspansiyonu ayarlamaya devam etmek gerekirse, gerektiğinde et suyu veya gece bakteri kültürü eklemeye devam edin ve yaklaşık 0.01'lik bir OD600'e ulaşılana kadar plaka okuyucuda taramayı gerektiği gibi tekrarlayın.
- Logaritmik büyümeye ulaşana kadar 150 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin.
- Bakteri kültürlerini inkübatör çalkalayıcıdan çıkarın.
- OD600 0.01 bakteri kültürünün 3 mL'sini, üçlü olarak test ve kontrol numuneleri için etiketli 15 mL konik tüplere alikotlayın.
- Aliquot 200 μL bakteri kültürü 96 delikli bir plakanın üç kuyucuğuna yerleştirin ve plaka okuyucuyu kullanarak numuneleri ölçün.
- Okumaları daha önce adım 3.4.2.2 ve adım 3.4.2.6-"-0,5 saat okuma" da açıklandığı gibi hesaplayın.
- Bakteri/nanopartikül karışımlarının oluşturulması ve ölçülmesi
- Kontrol numuneleri için etiketli 15 mL konik tüplere bakteri kültürlerine eşit sayıda 3 mL steril büyüme ortamı (üçlü olarak) aliquot edin.
- Bakteri / nanopartikül süspansiyonları ve steril ortam / nanopartikül süspansiyonları hazırlamak için, 15 mL konik tüplerin her üçlü setinden 1 mL bakteri kültürü veya ortamını çıkarın.
- 1 mL alikotları, önceden ölçülmüş nanopartiküller içeren 5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve karıştırmak için kısaca vorteks yapın.
- 5 mL santrifüj tüpünden, nanopartikülleri homojen olarak dağıtmak için bakteri / nanopartikül veya orta / nanopartikül süspansiyonlarının 1 mL alikotunu 15 mL konik tüpe geri döndürün.
NOT: Nanopartikülleri süspansiyonda tutmak için her 1 mL aliquot pipetlenmeden önce bakteri/nanopartikül karışımını 2x-3x pipetleyin.
- Bakteri/antibiyotik karışımlarının oluşturulması ve ölçülmesi
- Bakteriyel / antibiyotik kültürleri oluşturmak için, inkübe edilmiş bakteri kültürünün 3 mL'sini buna karşılık gelen etiketlenmiş 15 mL konik tüplere aliquot edin.
- Tüm numuneler hazırlandıktan sonra, her numunenin 200 μL'sini 96 delikli bir plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına aliquot edin.
- Plakaları plaka okuyucuya yerleştirin ve taramayı başlatın - "0 saat" okuma.
- Numuneleri içeren 15 mL konik tüpleri 37 °C ve 150 rpm'de bir inkübatör-çalkalayıcıya yerleştirin. Tüm verileri daha önce adım 3.4.2.2 ve adım 3.4.2.6'da açıklandığı gibi kaydedin.
- 0 saatlik okumayı tamamladıktan yaklaşık 15 dakika sonra, adım 3.7.2-3.7.3-"0,5 saat" okumasında açıklanan adımları tekrarlayın.
- Belirlenen 0 saatten sonra, adım 3.7.2-adım 3.7.3'te açıklanan adımları altı döngü boyunca her 90 dakikada bir tekrarlayın; 9 saatte tamamlandı.
- Altıncı döngü tamamlandıktan sonra, numuneleri 37 ° C ve 150 rpm'de 15 saat daha inkübatör-çalkalayıcıya yerleştirin. 24 saatlik okumayı elde etmek için adım 3.7.2-3.7.3'te açıklanan adımları tekrarlayın. Tüm verileri daha önce adım 3.4.2.2 ve adım 3.4.2.6'da açıklandığı gibi kaydedin.
4. Doğrudan kültür yöntemi (yöntem C)
NOT: C yönteminde, gecikmeli fazlı tohumlama kültüründeki bakteriler doğrudan ilgilenilen nanoyapılı yüzeylere yerleştirilir. Nanoyapı antimikrobiyal aktivitelerinin incelenmesi için, Zhang ve ark.14 tarafından tanımlanan bir protokolü takip ediyoruz. Bu doğrudan kültür yöntemini göstermek için örnek olarak ZC21 (Mg-Zn-Ca Alaşımı) ve Mg pimleri kullanılmıştır.
- Bakteri kültürlerinin hazırlanması ve büyütülmesi
- Her in vitro deney için, adım 2.2.1-2.2.2'yi izleyerek gecelik stoklar oluşturun.
- Tohumlama yoğunluğunu belirlemek için bakterilerin yıkanması ve sayılması
NOT: İstenen tohumlama yoğunluğu 7,5 × 105 CFU/mL, ortopedik enfeksiyonlara neden olan bildirilen hücre konsantrasyonu olarak tanımlanmıştır14.- Gece boyunca bakteri kültürünü inkübatör-çalkalayıcıdan alın.
- 2.3.2-2.3.2.3 adımını izleyerek bakterileri yıkayın ve toplayın, ancak her yıkama adımı için taze ortamı revize edilmiş simüle edilmiş vücut sıvısı (rSBF) ile değiştirin.
NOT: rSBF, insan kan plazmasının iyonik konsantrasyonunu taklit eden bir tampon çözeltisidir. Bununla birlikte, rSBF sadece inorganik bileşikler içerir ve proteinler gibi herhangi bir biyoorganik bileşik içermez. Bunu çözmek için, fetal sığır serumu (FBS), deneysel koşullar altında kalsifiye dokularda apatitin doğal oluşumunu daha iyi taklit etmek için insan kanının bileşimini simüle etmek için rSBF ile birleştirilir36. - Süpernatantı peletlenmiş hücrelerden çıkarın. Hücre peletini,% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL rSBF'de yeniden askıya alın - hücre süspansiyonu.
- Bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyon konsantrasyonunu (hücreler / mL) belirleyin. Hücre süspansiyonunu,% 10 FBS ile desteklenmiş rSBF'de 7.5 ×10 5 hücre / mL konsantrasyonuna seyreltin. Adım 2.4.1'i izleyerek bir tohumlama kültürü oluşturun.
- Adım 2.4.2'yi izleyerek gerçek tohumlama yoğunluğunu belirleyin.
- Bakteri hücresi süspansiyonunu kültür kuyularındaki numunelere dağıtın.
- Hem numuneleri hem de kontrol numunelerini 48 delikli, doku ile muamele edilmemiş bir polistiren plakanın bireysel kuyucuklarına yerleştirin.
- Aliquot 0.75 mL hücre süspansiyonunu içeren numuneleri ve kontrolleri içeren her bir kuyucuğa yerleştirin. 48 delikli plakaları 37 ° C'de 24 saat boyunca bir inkübatör-çalkalayıcıya yerleştirin ve 120 rpm'de çalkalayın.
- Bakteri konsantrasyonunun karakterizasyonu
- 24 saatlik inkübasyondan sonra, numuneleri toplayın ve ayrı, etiketli toplama tüplerine yerleştirin.
- Her gruptan iki numune toplayın ve bunları ayrı ayrı etiketli 5.0 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Her tüpe 2 mL rSBF ekleyin.
- Adım 4.4.2'de toplanan örnekleri bir sonikasyon banyosuna yerleştirin ve 10 dakika boyunca sonikleştirin. Her 5 dakikalık periyottan sonra, her numuneyi 5 s boyunca vorteks.
- Yeni ayrılmış bakteri hücrelerini içeren rSBF'yi toplayın ve süspansiyonu etiketli, taze bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- Seri seyreltmeler ve bakterilerin kaplanması
- 2.6.2-2.6.6 adımını izleyerek bakteriyel süspansiyonu seri olarak seyreltin ve plakalayın.
- Kültür ortamının inkübasyon sonrası pH'ını adım 2.7'yi izleyerek değerlendirin.
- Adım 2.8'de açıklanan yöntemleri izleyerek ICP-OES için kültür sonrası ortamı hazırlayın.
5. Fokuslu temasa maruz kalma yöntemi (yöntem D)
NOT: D yönteminde, nitroselüloz filtre kağıdı üzerindeki bakteriler, nanoyapılı yüzeylerdeki bir ilgi alanıyla doğrudan temas halindedir. Bu yöntem, bakteri kültürlerinde dökme numune bozunmasının bakteri aktiviteleri ile etkileşimini en aza indirir. Nanoyüzey antimikrobiyal aktivitelerini incelemek için, Lin ve ark.16 tarafından tanımlanan bir protokolü takip ediyoruz.
- Bakteriyel tohumlama kültürü oluşturmak için adım 2.2.1-2.2.2.1'deki yordamları izleyin. Adım 2.4.2'yi izleyerek gerçek tohumlama yoğunluğunu onaylayın.
- Numuneleri kare şeklinde 1 × 1cm2 boyutunda hazırlayın. Tüm numune türlerini üçlü olarak hazırlayın. Gerekirse, numuneleri 15 mm çapında ve 10 mm yüksekliğinde üç boyutlu (3B) bir tutucuya yerleştirin. Numuneyi ve tutucuyu, doku kültürü ile muamele edilmemiş bir polistiren kuyu plakasının bir kuyucuğuna yerleştirin.
- Her birini 1 cm çapında kırparak sterilize edilmiş nitroselüloz kağıtlar hazırlayın. Hazırlanan nitroselüloz kağıtlarını uygun ortamı içeren bir agar plakasına yerleştirin.
- Seyreltilmiş bakteri kültürünün 50 μL'sini filtre kağıdına pipetin.
- Her numune yüzeyinin merkezine uygun bir ortamdan 50 μL pipet edin.
- Sterilize cımbız kullanarak, nitroselüloz kağıdını agar yüzeyinden alın. Nitroselüloz kağıdını dikkatlice çevirin ve numune yüzeyine yerleştirin, böylece bakteriler 50 μL ortam ve ilgilenilen nanoyapılı yüzey ile temas halinde olur.
- Nemi korumak için bir numune içeren her bir kuyucuğa 1 mL Tris tamponu ekleyin. Tüm numuneleri içeren polistiren kuyu plakasını 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin.
- Her numune yüzeyinden nitroselüloz kağıdını toplayın. Her birini 5 mL Tris tamponuna yerleştirin. Toplanan filtre kağıtlarını ve nanoyüzeyli malzeme örneklerini 5 s boyunca vorteks.
- Her numuneyi 10 dakika boyunca sonikleştirin. 5 dakika sonra 5 sn boyunca vorteks ve 10 dakika sonra tekrar vorteks.
- Tris tampon süspansiyonlarını tüm numunelerden toplayın ve her hacmi ayrı ayrı taze toplama tüplerine yerleştirin.
- 2.6.2-2.6.6 adımını izleyerek numuneleri seri olarak seyreltin ve plakalayın.
6. Bakteri ve nanomalzemelerin kültür sonrası karakterizasyonu
- Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile bakteriyel adezyon ve morfolojinin incelenmesi
- Gece boyunca inkübasyondan sonra, numuneler tamamen kaplanana kadar 48 kuyucuklu, doku ile muamele edilmemiş polistiren plakanın her bir kuyucuğuna% 10 glutaraldehit ekleyin. Bakteri hücrelerini sabitlemek için numuneleri 1 saat boyunca inkübe edin.
- Glutaraldehiti bir atık şişeye aspire edin ve yapışkan olmayan bakterileri gidermek için tüm numuneleri Tris tampon çözeltisi ile 3 kat durulayın.
- Numuneleri her biri 30 dakika boyunca% 30,% 75 ve% 100 etanol kullanarak dehidrate edin16.
NOT: Numuneleri kurutmak için kritik noktalı bir kurutucu kullanılması önerilir. Numuneleri oda sıcaklığında 24 saat boyunca hava ile kurutmak ideal değildir. - Numuneleri bir SEM saplamasına sabitlemek için bakır veya karbon bantlar gibi iletken yapışkan bantlar kullanın. Görüntülemeden önce iletkenlik sağlamak için numune yüzeylerini püskürtücü kaplama ile kaplayın (örneğin; platin/paladyum (Pt / Pd) altında yapıştırılmış bakterilerle Mg plakalarını 20 mA16'da 45 sn boyunca kaplayın).
NOT: Kaplama malzemeleri, işleme süresi ve çalışma akımı numune tiplerine bağlı olarak değişebilir. - SEM kullanarak numuneler üzerindeki bakterilerin görüntülerini uygun bir çalışma mesafesi ve hızlanma voltajı ile ve istenen büyütmelerde çekin. Örneğin, 5 mm'lik bir çalışma mesafesinde ve 10 kV16'lık bir hızlanma voltajında görüntü çekmek için ikincil elektron dedektörlü bir SEM kullanın.
- SEM kullanarak kültür sonrası nanomalzeme örneklerinin yüzey morfolojisini inceleyin.
- Nanomalzemeler için, numuneye bağlı olmayan serbest bakterileri gidermek için numuneleri Tris tampon 3x kullanarak yıkayın. Nanopartiküller için, gerektiğinde daha iyi dağılım elde etmek için parçacıkları ultrasonikasyon yoluyla numune özelliklerini etkilemeyen bir çözücüye dağıtın.
- Yıkama işleminden sonra numuneleri kurutun.
- Numuneleri SEM saplamasına yapıştırmak için karbon veya bakır çift taraflı yapışkan bantlar kullanın.
- Görüntülemeden önce, adım 6.1.4'te açıklandığı gibi, bir püskürtme kaplayıcı kullanarak iletken bir Pt/Pd yüzey katmanı oluşturun. Örnek görüntüleri adım 6.1.5'te açıklandığı gibi alın.
- EDS kullanarak yüzey element bileşimini uygun bir hızlanma voltajıyla ve istenen büyütmelerde (örneğin, SEM analizi16'yı gerçekleştirdikten sonra 10 kV'de) analiz edin.
- Bakteriyel adezyonun floresan görüntülemesi
- Floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilecek numuneleri önce Tris tampon 3x ile yıkayarak hazırlayın. Numuneleri oda sıcaklığında hava ile kurutun.
- Her numuneyi, belirlenen protokol37'yi izleyerek 10 μM tiyoflavin T floresan boya ile lekeleyin.
- Elektron çarpan yük bağlantılı cihaz dijital kamerası ile birleştirilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak bakteriyel yapışmanın floresan görüntülemesini gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magnezyum oksit nanopartiküllerinin ve nanoyapılı yüzeylerin antibakteriyel aktivitesinin tanımlanması, farklı malzeme tipleri ve mikrobiyal türler arasında uygulanabilir dört in vitro yöntem kullanılarak sunulmuştur.
Yöntem A ve yöntem B, 24 saat veya daha uzun bir süre boyunca bir gecikme fazında (yöntem A) ve log fazında (yöntem B) nanopartiküllere maruz kaldığında bakteriyel aktiviteleri inceler. Yöntem A, MIC ve MBC ile ilgili sonuçlar sağlarken, yöntem B, nanopartiküllerin inhibitör ve bakterisidal etkilerini belirler. Yöntem C, nanoyapılı yüzeylerle doğrudan ve dolaylı temas ile bakteriyel aktiviteleri inceler ve yöntem D, bir hücre-nanoyapı arayüzünün belirli bir alanındaki bakteri aktivitelerini 24 saat veya daha uzun bir süre boyunca inceler.
Kullanılan yöntemler Şekil 1 ve Şekil 2'de açıklanmıştır ve sonuçları Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 8'de sunulmuştur. nMgO'nun gram-negatif ve gram-pozitif bakteri ve mayaya karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçen temsili deneysel sonuçlar Şekil 3'te görülebilir. MRSA'ya karşı nMgO ve nMg(OH)2'nin antibakteriyel aktiviteleri Şekil 4'te görülebilir. Nanoyapılı yüzeylerin MRSA'ya karşı antibakteriyel aktiviteleri Şekil 5 ve Şekil 6'da görülebilir. Son olarak, magnezyum alaşımlarının E. coli'ye karşı antibakteriyel aktivitesi Şekil 8B'de görülebilir.
Yöntem A'yı kullanarak, tutarlı yöntemler ve malzemeler kullanarak nanopartiküllere maruz kalan bakteriler için MIC'leri ve MBC'leri belirlemek mümkündür. Bu tutarlılık, test edilen nanopartiküllerin en güçlü konsantrasyonunu belirlemek için tanımlanmış MBC'leri kullanarak türler arasında karşılaştırmalar yapılmasına izin verir. Ek olarak, bu yöntem MIC'lerin ve minimal ölümcül konsantrasyonların (MLC'ler17) karşılaştırılması için diğer mikroorganizma sınıflandırmalarına da uygulanabilir. Burada, sterilize edilmiş nanopartiküller, gerekli her konsantrasyonun üçlüsüne izin veren bir miktarda önceden ölçüldü. Bu nanopartiküller, 6 × 10 6-8 × 106 hücre / mL yoğunluğa sahip bir gecikme fazlı mono-bakteri tohumlama kültüründe askıya alındı. Önceden ölçülen nanopartikülleri tohumlama kültürü veya et suyu ile askıya almak için açıklanan yöntem, nanopartikül dağılımında nispeten homolog olan üçlü numuneleri başarıyla oluşturdu ve bu da üçlü numunelerde CFU / mL'deki sapmayı azaltabilir. Bu yöntemin deneysel iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. nMgO'nun gram-negatif ve gram-pozitif bakteriler ve Candida spp üzerindeki antimikrobiyal etkilerinin bir gösterimi. A yönteminin kullanımı Şekil 3'te görülebilir. Burada, gram-negatif Escherichia coli ve Pseudomonas aeruginosa için 1.0 mg / mL nMgO MIC'nin yanı sıra bu türler için sırasıyla 1.0 mg / mL ve 1.6 mg / mL nMgO'luk bir MBC99.99 tanımlanmıştır (Şekil 3A). Gram-pozitif S. epidermidis, S. aureus ve MRSA, sırasıyla 0.5 mg / mL, 0.7 mg / mL ve 1.0 mg / mL nMgO MIC'leri gösterdi. S. epidermidis ve S. aureus için sırasıyla 1.6 mg/mL ve 1.2 mg/mL nMgO MBC 99.99 değerleri saptanırken, MRSA MBC90'ın üzerine çıkmadı (Şekil 3B). İlaca duyarlı ve ilaca dirençli Candida spp., C. albicans ve C. albicans FR'de sırasıyla 1.2 mg / mL ve 1.0 mg / mL nMgO MIC'ler tanımlanmıştır. Buna karşılık, nMgo, C. glabrata ve C. glabrata ERiçin sırasıyla 1.0 ve 0.7 mg / mL'lik MIC değerleri göstermiştir. Ek olarak, her Candida türü 0.7-1.2 mg / mL nMgO'luk bir MBC 90'a ulaştı, ancak sadece C.glabrata ER, 1.2 mg / mL nMgo'da MBC 99.99'a düşürüldü (Şekil 3C). Ek olarak, test edilen türlerin çoğunda, nMgo'nun en güçlü konsantrasyonunun (MPC) tanımlanması belirlenmiştir. MPC, poli-mikrobiyal topluluklar arasında en etkili olan nanopartikül konsantrasyonunu gösterir17.
Yöntem B, logaritmik büyüme fazındaki bakterileri, nanopartiküllerin bakteriyostatik (inhibitör) veya bakterisidal olup olmadığını belirlemek için belirli konsantrasyonlardaki nanopartiküllere maruz bırakır. yöntem A'da tanımlanan MBC'leri kullanarak. Bu yöntem, nanopartikül maruziyetine yanıt olarak bakteriyel büyümedeki değişiklikleri tanımlamak için ayrı zaman dilimleri boyunca spektrofotometri (OD600) ölçümlerini kullanır. Ek olarak, bakteriyostatik veya bakterisidal antibiyotiklere maruz kalan bakteriler, bu nanopartikül aktivitelerinin tanımlanmasında bir referans sağlamak için ayrı kuyucuklarda nanopartiküle maruz kalan bakterilerle eşzamanlı olarak yetiştirilir. Kullanılan nMgO ve nMg(OH)2 konsantrasyonları, nMgO ve nMg(OH)2'ye maruz kalan logaritmik büyüme fazındaki bakteriler kullanılarak yapılan önceki bir çalışmadan türetilmiştir. nMgO ve nMg(OH)2 konsantrasyonları, 5 mM ile 50 mM arasında değişen mM eşdeğerleri kullanılarak tanımlanmıştır. Sonuçlar, nMgO'nun 30 mM'de (1.2 mg / mL nMgO) MRSA'ya bakterisidal olduğunu, nMg (OH) 2'nin ise 50 mM'de (2.9 mg / mL nMg (OH) 2) bakteriyostatik olduğunu göstermiştir. Kullanılan antibiyotik konsantrasyonları literatürden tanımlanmış ve kendi deneylerimizde doğrulanmıştır. Bu yöntemin deneysel iş akışı Şekil 1B'de gösterilmiştir. B yönteminin temsili sonuçları Şekil 4'te görülebilir. Burada, nanopartiküllere maruz kalmayan MRSA, katlanarak 0.85'lik bir OD600'e büyüdü. 1.2 mg / mL nMgO ve 6.25 μg / mL trimetoprim'e maruz kaldığında, bakteriyel büyüme 0.18'lik bir OD 600'e (sırasıyla% 80.2 ve% 81.6) düşürüldü ve 2.9 mg / mL nMg (OH)2, bakteriyel büyümeyi 0.25'lik bir OD 600'e (%70.3) düşürdü. 1.0 μl / mL vankomisine maruz kalmak, MRSA'nın büyümesinde% 99.99'luk bir azalmaya neden oldu, bu da burada kullanılan nMgO ve nMg (OH) 2 konsantrasyonlarının aktivitede bakteriyostatik olduğunu düşündürmektedir.
Yöntem C, nanoyapılı yüzeylerin antibakteriyel aktivitesini inceler. Gecikme fazı büyümesindeki bir bakteri kültürü, CFU'ları yüzeyle doğrudan temas halinde olsun veya olmasın ölçmek için doğrudan nanoyapılı bir yüzeye ekildi. Bu yöntemi kullanarak, doğrudan temas koşulları altında bakteriyel yapışma ve canlılık üzerindeki yüzey etkilerini belirlemek mümkün olmuştur. Nanoyapılı yüzeylerle doğrudan temas halinde olan ve dolaylı temas halinde olan (kültür süspansiyonunda) bakteriler, her koşulda bakteri büyümesini belirlemek için CFU / mL'de toplandı ve ölçüldü. Elde edilen bu veriler, yüzey yapılarında bakteriyel kolonizasyonun azaltılmasının istendiği klinik kullanım için yüzeylerde nanoyapılı malzemelerin aşağı akış uygulamalarında yararlı olabilir. Bu yöntemin deneysel iş akışı Şekil 2A'da gösterilmiştir. C yönteminin temsili sonuçları Şekil 5'te görülebilir. Burada, dolaylı temas ile bakteriyel büyümenin inhibisyonu yoktu. Bununla birlikte, tüm substratlar için bakteriyel yapışma, en önemlisi ZC21 alaşımı ile azaltıldı, bunu sırasıyla T64 (titanyum), magnezyum, sadece cam ve ZSr41 alaşımı izledi. Bu sonuçlar, ZC21'in, test edilen tüm numuneler için MRSA'nın yapışmasına ve büyümesine karşı en güçlü antibakteriyel aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir14.
Yöntem D, bakterilerin filtre kağıdında nanoyapılı bir yüzeye doğrudan yerleştirilmesi yoluyla hücre-nanoyapı arayüzünde belirli bir ilgi alanındaki antibakteriyel aktiviteyi inceler. Bu yöntemi kullanarak, antibakteriyel aktivite ile yüzey kimyası, pürüzlülük ve nanoyapılı yüzeyin alanı gibi yüzey özellikleri arasında bir korelasyon tanımlanabilir16. Bu yöntemin deneysel iş akışı Şekil 2B'de gösterilmiştir. D yönteminin temsili sonuçları Şekil 6'da görülebilir. Burada, 1.9A, 1.9 AA ve EPD örneklerinde veya bunların eşleştirilmiş filtre kağıtlarında uygulanabilir bir S. aureus tanımlanmamıştır. Bununla birlikte, tavlamadan sonra EPD örneklerine maruz kalma (A-EPD), nanoyapılı yüzeydeki ve eşleştirilmiş filtre kağıdındaki birkaç hücreye bakteri büyümesini azaltmıştır. Magnezyum (Mg) içeren numunenin de bakteri üremesi yoktu, ancak eşleştirilmiş filtre kağıdından canlı bakteriler izole edildi. Titanyum ve cam numunelerde veya bunların eşleştirilmiş filtre kağıtlarında S. aureus'un büyümesinde bir azalma görülmemiştir16.
Antimikrobiyal aktiviteleri belirlemek için yukarıda açıklanan yöntemlerin kullanımına ek olarak, nanopartiküllere ve nanoyapılı malzemelere maruz kaldıktan sonra mikroorganizmalarda meydana gelen morfolojik değişiklikleri karakterize etmek için SEM ve floresan mikroskobu kullanılabilir. Maruziyet sonrası gram-negatif Escherichia coli'yi gösteren temsili SEM görüntüleri Şekil 7A'da, pozlama sonrası Gram-pozitif S. aureus'u gösterenler ise Şekil 7B'de sunulmuştur. 5.000x büyütme ile SEM görüntüleme tekniği kullanılarak, 0.5 mg / mL nMgO veya daha yüksek konsantrasyonlara maruz kalan E. coli'deki fenotipik değişiklikler tanımlanabilir17. Floresan mikroskopisi, mikroorganizmalardaki morfolojik değişiklikleri karakterize etmek için de kullanılabilir, ancak potansiyel olarak daha düşük maliyetler ve SEM'den daha fazla erişilebilirlik ile. Şekil 8 , nanoyapılı malzemeye maruz kalan E. coli'nin temsili floresan görüntülerini 1 gün, 2 gün ve 3 gün boyunca MgY_O ve referans E. coli'yi göstermektedir . Başlangıçta sadece bir bakteri türü olan E. coli kullanılmıştır. Gelecekte, MgY_O maruz kalmaya karşı bakteriyel tepkilerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için ek bakteri türlerini aynı ilgi alanlarına maruz bırakmayı düşüneceğiz. Bu sonuçlarda, bireysel E. coli hücreleri ve kolonileri, MgY_O15'in antibakteriyel aktivitesinin kalitatif analizi için tioflavin T boyaması ve bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir ve görüntülenebilir.
Şekil 1: Nanopartikül MIC veya MBC90-99.99'u ve maruziyet sonrası hücre kültürlerinde bakteriyostatik veya bakterisidal aktiviteleri belirlemek için şematik diyagramlar . (A) Doğrudan ko-kültür yöntemi17. (B) Doğrudan maruz kalma yöntemi. Kısaltmalar: CFU = koloni oluşturan birimler; NP'ler = nanopartiküller; OD600 = 600 nm'de optik yoğunluk. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nanoyapılı yüzeylerin hücre-nanoyapı arayüzünde doğrudan ve dolaylı temas ile bakteri üremesini belirlemek için şematik diyagramlar. (A) Doğrudan kültür yöntemi14. (B) Fokuslu temasa maruz kalma yöntemi16. Kısaltmalar: CFU = koloni oluşturan birimler; SEM = taramalı elektron mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 0-2.0 mg/mL nMgO'ya maruz kaldıktan sonra CFU/mL 24 saat ile ölçülen canlı bakteri ve mayaların temsili. (A) E. coli ve P. aeruginosa dahil olmak üzere gram-negatif bakterilerin CFU/mL'si.(B) S. epidermidis, S. aureus ve metisiline dirençli S. aureus dahil olmak üzere gram pozitif bakterilerin CFU/mL'si. (C) İlaca duyarlı C. albicans, ilaca dirençli C. albicans FR, ilaca duyarlı C. glabrata ve ilaca dirençli C. glabrata ER'nin CFU/mL'si.Veriler ortalama ± standart sapma olarak temsil edilir (N = 9). * p ≤ 0.05, ilgili bakteri veya maya için 0-0.7 mg / mL nMgo'daki gruplardan önemli ölçüde daha düşüktür. ^p ≤ 0.05, ilgili mikroorganizma için 0-1 mg / mL nMgo'daki gruplardan anlamlı derecede düşüktür. #p ≤ 0.05, ilgili mikroorganizma için 0-0.5 mg / mL nMgo'daki gruplardan önemli ölçüde daha düşüktür. &p ≤ 0.05, ilgili mikroorganizma17 için 0-0.3 mg / mL nMgO'daki gruplardan anlamlı derecede düşüktür. Bu rakam Nguyen ve ark.17'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: FR = flukonazole dayanıklı; ER = ekinokandin dirençli; nMgO = magnezyum oksit nanopartikülleri; CFU = koloni oluşturan birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Metisiline dirençli S. aureus için gerçek zamanlı olarak alınan optik yoğunluk ölçümlerinin (OD600) gösterimi. MRSA'nın 24 saat boyunca 1.2 mg/mL nMgO, 2.9 mg/mL nMg(OH)2, 6.25 μg/mL trimetoprim ve 1.0 μg/mL vankomisine maruz kalması. p ≤ 0.025: 0.5 saatte 1.0 μg/mL vankomisine maruz kalan MRSA'nın büyümesi, 7.5 saatte 2.9 mg/mL Mg(OH)2'ye maruz kalan MRSA'nın büyümesinden anlamlı derecede düşüktür. ^p ≤ 0.025: aşılama sonrası 24 saatte 1.0 μg / mL vankomisine maruz kalan MRSA'nın büyümesi, 24 saatte 2.9 mg / mL Mg (OH) 2'ye maruz kalan MRSA'nın büyümesinden anlamlı derecede düşüktür. Veriler ortalamanın (SEM) ortalaması ± standart hatası olarak sunulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Numunelere ve kontrollere maruz kaldıktan sonra 24 saat içinde CFU / mL ile ölçülen canlı metisiline dirençli S. aureus'un gösterimi. Bakteriler 7.5 × 105 hücre / mL'lik gerçek bir yoğunlukta tohumlandı ve CFU / mL ile doğrulandı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak temsil edilir, n = 3; *p < 0.05. 
p < ZC21 numunelerinde CFU ile karşılaştırıldığında 0,05. Bu rakam Zhang ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 1.9 A, 1.9 AA, EPD ve A-EPD'nin yüzey işlemden geçirilmiş Mg numunelerine ve Mg ve Ti kontrol numunelerine maruz kaldıktan 24 saat sonra bakteriyel tohumlama yoğunluğunun CFU/mL ile temsili nicelleştirilmesi. Bakteriler, kırmızı kesikli çizgiyle temsil edildiği gibi 6 × 106 CFU / mL'lik gerçek bir yoğunlukta tohumlandı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak temsil edilir; n = 3. *p < 0.05. Düz siyah çizgi, numune yüzeylerindeki bakteri yoğunluğu için istatistiksel analiz sonuçlarını gösterir. Mavi kesikli çizgi, numune yüzeylerini kaplayan filtrelerdeki bakteri yoğunluğu için istatistiksel analiz sonuçlarını gösterir. Kısaltmalar: CFU = koloni oluşturan birimler; A-EPD = tavlamadan sonra elektroforetik birikim; EPD = tavlamadan önce elektroforetik birikim; A = tavlamadan önce eloksallama; AA = tavlama sonrası eloksal. Bu rakam Lin ve ark.16'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: 0-1.2 mg/mL nMgO'ya maruz kalan gram-negatif E. coli ve gram-pozitif S. aureus'un temsili SEM görüntüleri. (A) E. coli, 1.2 mg/mL ila 2.0 mg/mL nMgO'da benzer morfoloji göstermiştir. Bu nedenle, 1.2 mg / mL'deki bir görüntü, daha yüksek nMgO konsantrasyonlarına maruz kalan E. coli'nin bir temsilcisi olarak gösterilmiştir. (B) S. aureus ayrıca 1.2 mg / mL ila 2.0 mg / mL nMgO'da benzer morfoloji göstermiştir. Bu nedenle, 1.2 mg / mL'deki bir görüntü, daha yüksek nMgO konsantrasyonlarına maruz kalan S. aureus'un bir temsilcisi olarak gösterilmiştir17. Ölçek çubukları = 5 μm. nMgO = magnezyum oksit nanopartikülleri. Bu rakam Nguyen ve ark.17'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: E. coli'nin temsili floresan görüntüleri, 1 gün, 2 gün ve 3 günlük inkübasyonda niceleme ile substratlara yapıştırılmıştır. (A) 10 μM tiyoflavin T. (B) Hücreler/mL kullanılarak ilgilenilen malzemelere maruz bırakılan E. coli'nin floresan görüntüleri. 2 günlük inkübasyondan sonra MgY_O bakteriyel bağlılık yoktu ve 3 günlük inkübasyondan sonra MgY'ye bağlılık azaldı. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakam Lock ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanopartiküllerin ve nanoyapılı yüzeylerin antibakteriyel aktivitelerini karakterize etmek için dört in vitro yöntem (AD) sunduk. Bu yöntemlerin her biri, nanomalzemelere yanıt olarak zaman içinde bakteri büyümesini ve canlılığını ölçerken, zaman içinde ilk bakteriyel tohumlama yoğunluğunu, büyümesini ve canlılığını ölçmek için kullanılan yöntemlerde bazı farklılıklar vardır. Bu yöntemlerden üçü, doğrudan eş-kültür yöntemi (A)17, doğrudan kültür yöntemi (C)14 ve odaklanmış temasa maruz kalma yöntemi (D)16, birim hacim başına CFU'ları sayarak nanomalzemelere maruz kaldıktan sonra bakteri büyümesini ve canlılığını ölçer. Buna karşılık, doğrudan maruz kalma yöntemi (B), ayrık gerçek zamanlı optik yoğunluk (OD600) ölçümleri yoluyla bakteri büyümesini ölçer. Bu yöntem, CFU'ları ölçmek için zaman kısıtlamaları varsa ve / veya kinetik çalışmalar için gerçek zamanlı bir bakteri yoğunluğu okuması gerekiyorsa, doğrudan ortak kültür, doğrudan kültür ve odaklanmış temasa maruz kalma yöntemlerine de uygulanabilir. Doğrudan maruz kalma yönteminde test edilecek bakteri türleri için etkili antibiyotikler bilinmiyorsa, nanomalzeme grupları için referans olarak kullanılacak doğru antibiyotikleri ve MIC değerlerini belirlemek için bir literatür taraması yapılmalıdır. MIC değerlerinin doğrulanması, spektrofotometri verileri ile belirli zaman noktalarında koloni oluşturan birimlerin nicelleştirilmesi arasındaki ilişkiyi çizen bir standardizasyon eğrisi tamamlanarak yapılabilir. Bu işlem, kültürde belirli noktalarda bulunan hücrelerin sayısını ilgili optik yoğunlukla ilişkilendirir. Ek olarak, gecikme aşamasındaki büyümedeki bakteriler, doğrudan ko-kültür yönteminde nanopartiküllere ve doğrudan kültür ve odaklanmış temasa maruz kalma yöntemlerinde nanoyapılı yüzeylere tanıtılır. Buna karşılık, logaritmik büyüme aşamasındaki bakteriler, doğrudan maruz kalma yönteminde nanopartiküllere tanıtılır. Ayrıca, bakteri tohumlama yoğunlukları, doğrudan ko-kültür yönteminde, doğrudan kültür yönteminde ve odaklanmış temasa maruz kalma yönteminde hücre / mL olarak ölçülürken, doğrudan maruz kalma yönteminde gerçek zamanlı büyümeyi izlemek için bakterilerin optik yoğunluğu (OD600) ölçülür.
Bu yöntemlerin her biri çerçeve olarak benzer olsa da, nanopartiküllerin veya nanoyapılı yüzeylerin bakteriler üzerindeki etkilerini ayırt etmek için benzersiz özellikler de sunarlar. Örneğin, doğrudan ko-kültür yöntemi, CFU / mL nicelemesi ile önceden ölçülmüş nanopartikül konsantrasyonlarının arttırılmasına karşı bakteriyel tepkileri karakterize eder (Şekil 3). Bu yöntem, ilgilenilen mikrobiyal türler için nanopartiküllerin minimum inhibitör ve minimum bakterisidal konsantrasyonlarını (MIC ve MBC) ve birden fazla tür incelenirse, nanopartiküllerin en güçlü konsantrasyonunu (MPC) üretir17. MIC, MBC90-99.99 ve MPC'nin tanımlanması, aşağı akış uygulamalarında nanopartiküllerin uygulanması için gereklidir. Örneğin, bu veriler nanopartikül antibakteriyel aktivitesinin in vivo incelemelerine uygulanabilirken, ölümcül konsantrasyonlardan daha az konsantrasyonlar da tanımlandığında sitouyumluluğu korur. Buna karşılık, doğrudan maruz kalma yöntemi, nanopartikül aktivitesini, araştırma veya klinik ortamlarda kullanılmadan önce sinerjik veya istenmeyen etkilerin tanımlanması gereken antibiyotiklerin sınıflandırılmasına benzer bir şekilde bakteriyostatik veya bakterisidal olarak karakterize eder.
Antibakteriyel bileşiklerin bakteriyostatik veya bakterisidal olarak karakterizasyonu klinik kullanım ve in vitro ve in vivo araştırmalarla ilgilidir38. Bu nedenle, bu özellikleri incelemek için yöntemler tasarlanırken, sonuçları etkileyebilecek olumsuz etkiler tanımlanmalıdır. Burada, doğrudan maruz kalma yöntemi, nanopartikülleri 600 nm'de gerçek zamanlı optik yoğunluk ölçümlerini kullanarak belirli bakteri türleri için bakteriyostatik veya bakterisidal olarak sınıflandırır (Şekil 4). Logaritmik büyüme fazındaki bakteriler, bakteri ve nanopartikül süspansiyonları oluşturmak için MIC seviyesinde nanopartiküllerle karıştırılır. Bu süspansiyonlar, nanopartikül maruziyetinin bakteriler üzerindeki devam eden etkilerini belirlemek için gerçek zamanlı olarak gizlice ölçülür. Elde edilen sonuçları doğrulamak için, bakteriyostatik ve bakterisidal antibiyotiklerle süspansiyonda eşzamanlı olarak yetiştirilen bakteriler, nanopartiküllere maruz kalan bakterilerin büyüme oranlarını doğrulamak için bir referans görevi görür.
Nanopartiküllerin biyomühendislik, klinik ve çevre bilimlerine dahil edilmesi geniş kapsamlı olanaklara sahip olabilir, ancak nanopartiküllerin antibakteriyel verilerini nanoyapılı yüzeylerde in vitro ve in vivo çalışmalar için kullanmak zordur. Bu nedenle, nanoyapılı yüzeylerin in vitro antibakteriyel aktivitelerini karakterize etmek için doğrudan kültür ve odaklanmış temasa maruz kalma yöntemlerini sunduk. Doğrudan kültür yöntemi, bakteriler ilgilenilen malzemelerle doğrudan temas halinde olduğunda nanoyapılı yüzeylerin antibakteriyel etkilerini inceler14. Burada, rSBF artı% 10 FBS'de asılı kalan bakteriler nanoyapılı yüzeylere maruz bırakılır, ardından yüzeyle doğrudan temas halinde olan ve CFU / mL kullanılarak ilgili malzemeyi çevreleyen süspansiyonda (dolaylı temas) bakteriler için zaman içinde bakteri büyümesinin nicelleştirilmesi izlenir. Daha önce, magnezyum alaşımlı nanoyapıları (ZC21 ve ZSr41 alaşımları) içeren deneysel sonuçlar, bakterilerin nanoyapılı yüzeylerle doğrudan temas halinde olduklarında, bakterilerin çok az temas halinde olduğu veya hiç temas etmediği dolaylı temasa kıyasla antibakteriyel aktivitelerin arttığını göstermiştir14 (Şekil 5). Son olarak, odaklanmış temas yöntemi, bakterilerin arayüzünde ve nanoyapılı bir yüzeyde antibakteriyel aktiviteyi karakterize eder16. Burada, zaman içinde bakteriyel yapışma ve biyofilm oluşumunun potansiyel bozulmasını belirlemek için biyolojik olarak emilebilir bir magnezyum alaşımının yüzeyine eloksallı veya elektroforetik olarak biriken magnezyum oksiti inceledik. Biyofilm oluşumunun bozulması, hastanın iyileşme süreçleri için kritik olabilir, çünkü biyofilmler konakçı bağışıklık tepkilerinden ve antibiyotik tedavilerinden kaçınma eğilimindedir39 ve tedavisi son derece zor olan enfeksiyonlara neden olur.
Burada, Japon Endüstriyel Standardı JIS Z 2801: 200016'dan uyarlanmış bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, bakterilerin steril nitroselüloz filtre kağıdına tutturulmasını ve ardından nanoyapılı yüzeyin sabit bir alanına maruz kalmasını sağlar. Bu, antibakteriyel aktivite üzerindeki yüzey etkilerinin karakterizasyonunu yalnızca test alanıyla sınırlar. Temsili sonuçlarda, tavlamadan önce eloksal (1.9A), tavlamadan sonra eloksal (1.9AA) ve tavlamadan önce elektroforetik birikim (EPD) numuneleri, magnezyum, titanyum ve cam kontrol numunelerine kıyasla bakteri üremesini ve bunlara karşılık gelen filtre kağıtlarını azaltmada önemli etkiler göstermiştir. Tavlama (A-EPD) örneklerinden sonra elektroforetik birikim de bakteri üremesini azaltmada etkiliydi, ancak bu sonuç 1.9A, 1.9AA ve EPD örnekleri16 için elde edilen sonuçlara kıyasla daha az anlamlıydı (Şekil 6).
Özetle, burada sunulan her in vitro yöntemin ustalaşması oldukça kolaydır ve ucuz ve kolayca temin edilebilen malzemeler içerir. Bu yöntemler, araştırmacıların ilgisini çeken çok çeşitli nanomalzemeler ve mikrobiyal türler arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için kullanılabilir. Bu yöntemler arasındaki benzerlikleri ve farklılıkları anlamak, araştırma hedeflerini karşılamak için en uygun deneyleri tasarlamak için gereklidir. Burada, bu in vitro yöntemlerden elde edilen bilimsel bilgi, antibiyotiklerin sınırlandırılması gereken veya olumsuz bir yaklaşımı temsil eden aşağı yönlü tıbbi uygulamalara uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, ABD Ulusal Bilim Vakfı (NSF CBET ödülü 1512764 ve NSF PIRE 1545852), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH NIDCR 1R03DE028631), Kaliforniya Üniversitesi (UC) Regents Fakülte Geliştirme Bursu, Araştırma Tohumu Hibe Komitesi (Huinan Liu) ve Patricia Holt-Torres'e verilen UC-Riverside Lisansüstü Araştırma Mentorluk Programı Hibesinin finansal desteğini takdir etmektedir. Yazarlar, SEM / EDS kullanımı için UC-Riverside'daki Gelişmiş Mikroskopi ve Mikroanaliz Merkezi Tesisi (CFAMM) ve XRD kullanımı için Dr. Perry Cheung tarafından sağlanan yardımı takdir etmektedir. Yazarlar ayrıca Morgan Elizabeth Nator ve Samhitha Tumkur'a deneyler ve veri analizleri konusundaki yardımları için teşekkür eder. Bu makalede ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazarlara aittir ve Ulusal Bilim Vakfı veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
References
- Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
- O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
- Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
- Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
- Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
- Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
- Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
- Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
- Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
- Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
- Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
- Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
- Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
- Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
- Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
- Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
- Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
- Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
- He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
- Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
- Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
- Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
- Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
- Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
- Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
- Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
- Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
- Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
- Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
- MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
- CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
- Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
- Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
- Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
- Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
- Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
- Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
- Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
- Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).
