Summary
Metoder för att mäta ALDH1A1-aktivitet i levande celler är kritiska inom cancerforskning på grund av dess status som en biomarkör för stamhet. I denna studie använde vi en isoformselektiv fluorogen sond för att bestämma de relativa nivåerna av ALDH1A1-aktivitet i en panel med fem äggstockscancercellinjer.
Abstract
Återfall efter cancerbehandling tillskrivs ofta persistensen av en subpopulation av tumörceller som kallas cancerstamceller (CSC), som kännetecknas av deras anmärkningsvärda tumörinitierande och självförnyelsekapacitet. Beroende på tumörens ursprung (t.ex. äggstockar) kan CSC-ytans biomarkörprofil variera dramatiskt, vilket gör identifieringen av sådana celler via immunhistokemisk färgning till en utmanande strävan. Tvärtom har aldehyddehydrogenas 1A1 (ALDH1A1) framstått som en utmärkt markör för att identifiera CSC, på grund av dess bevarade uttrycksprofil i nästan alla stamceller inklusive CSC. ALDH1A1-isoformen tillhör en superfamilj av 19 enzymer som är ansvariga för oxidationen av olika endogena och xenobiotiska aldehyder till motsvarande karboxylsyraprodukter. Chan et al. utvecklade nyligen AlDeSense, en isoform-selektiv "turn-on" sond för detektering av ALDH1A1-aktivitet, samt ett icke-reaktivt matchande kontrollreagens (Ctrl-AlDeSense) för att ta hänsyn till färgning utanför målet. Detta isoformselektiva verktyg har redan visat sig vara ett mångsidigt kemiskt verktyg genom detektion av ALDH1A1-aktivitet i K562 myeloiska leukemiceller, mammosfärer och melanom-härledda CSC-xenotransplantat. I denna artikel visades sondens användbarhet genom ytterligare fluorimetri, konfokalmikroskopi och flödescytometriexperiment där den relativa ALDH1A1-aktiviteten bestämdes i en panel med fem äggstockscancercellinjer.
Introduction
Cancerstamceller (CSC) är en subpopulation av tumörceller som uppvisar stamcellsliknande egenskaper1. I likhet med sina icke-cancerösa motsvarigheter har CSC den extraordinära förmågan att självförnya och föröka sig. Tillsammans med andra inbyggda mekanismer, såsom uppreglering av ATP-bindande kassetttransportörer, är CSC ofta förskonade från initiala kirurgiska debulkinginsatser, liksom efterföljande adjuvansbehandling2. På grund av deras kritiska roll i behandlingsresistens3, återfall4 och metastaser5 har CSC blivit en prioritet inom cancerforskningen. Även om det finns en mängd olika cellyteantigener (t.ex. CD133) som kan användas för att identifiera CSC6, har utnyttjande av den enzymatiska aktiviteten hos aldehyddehydrogenaser (ALDH) som finns i cytoplasman framkommit som ett attraktivt alternativ7. ALDH är en superfamilj av 19 enzymer som är ansvariga för att katalysera oxidationen av reaktiva endogena och xenobiotiska aldehyder till motsvarande karboxylsyraprodukter8.
I allmänhet är aldehydavgiftning avgörande för att skydda celler från oönskade tvärbindningshändelser och oxidativ stress som kan skada stamcellsintegriteten9. Dessutom kontrollerar 1A1-isoformen retinsyrametabolismen, vilket i sin tur påverkar stamhet via retinaldehydsignalering10. AlDeSense 11,12, en liten molekylär aktivitetsbaserad avkänningssond (ABS) för att selektivt detektera ALDH1A1-aktivitet, utvecklades nyligen. ABS-konstruktioner uppnår analytdetektering genom en kemisk förändring snarare än en bindningshändelse, vilket möjliggör hög selektivitet och minskade svar utanför målet13,14,15,16. Designprincipen för den isoformselektiva fluorogena sonden bygger på en donator-fotoinducerad elektronöverföring (d-PeT) släckningsmekanism17, härrörande från aldehydfunktionsgruppen, som tjänar till att undertrycka sondens fluorescerande signatur18. Vid ALDH1A1-medierad omvandling till karboxylsyran frigörs strålningsavslappning för att ge en mycket fluorescerande produkt. Eftersom d-PeT-släckning aldrig är 100% effektiv, beaktades den kvarvarande fluorescensen som kan leda till möjliga falska positiva resultat vid upprättandet av denna analys genom utveckling av Ctrl-AlDeSense, ett icke-responsivt reagens med matchande fotofysiska egenskaper (t.ex. kvantutbyte) och ett identiskt cytoplasmatiskt färgningsmönster i celler. När den används i tandem kan denna unika parning på ett tillförlitligt sätt skilja celler med hög ALDH1A1-aktivitet från de som uppvisar låga nivåer via fluorimetri, molekylär avbildning och flödescytometri. Flera viktiga fördelar är förknippade med användningen av isoformselektiva aktiverbara färgämnen jämfört med traditionella immunhistokemiska metoder. Till exempel antas CSC vara begravda djupt inne i en tumör och är därmed mer tillgängliga för en liten molekyl i förhållande till stora antikroppar19. Dessutom modifierar den välta fluorescerande produkten inte kovalent någon cellulär komponent, vilket innebär att den lätt kan avlägsnas via tvättcykler för att lämna en CSC i ett oförändrat tillstånd. Slutligen identifierar turn-on-svaret endast livskraftiga celler och funktioner, ungefär som MTT-analysen, på grund av dess beroende av NAD + -kofaktorn.
Figur 1: Schematisk demonstration av fluorescerande tändning av AlDeSense. Det isoformselektiva färgämnet aktiveras av ALDH1A1 och kan användas för att identifiera förhöjd ALDH1A1-aktivitet i äggstockscancerceller via fluorimetri, molekylär avbildning och flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I tidigare arbete stratifierade den isoformselektiva fluorogena sondanalysen framgångsrikt ALDH höga (ALDH +) celler från ALDH låga (ALDH-) celler i K562 humana kroniska leukemiceller, MDA-MB-231 humana bröstcancerceller och B16F0 murina melanomceller. Detta är viktigt eftersom högt ALDH1A1-proteinuttryck för många cancertyper innebär en sämre klinisk prognos20. Detta förutsätter att förhöjda nivåer av ALDH1A1 indikerar CSC som kan undvika behandling, utveckla resistens och sprida sig i hela kroppen. Men när det gäller äggstockscancer finns det studier som rapporterar motsatt resultat (högt ALDH1A1-uttryck är kopplat till förbättrad patientöverlevnad)21,22,23,24. Även om detta kan verka motsägelsefullt vid första anblicken, korrelerar uttrycket inte nödvändigtvis med enzymaktivitet, vilket kan påverkas av förändringar i tumörmikromiljön (t.ex. pH-flöde, syregradienter), tillgängligheten av NAD + -kofaktorn eller aldehydsubstraten, nivåer av karboxylsyror (produkthämning) och posttranslationella modifieringar som kan förändra enzymaktiviteten25 . Dessutom är äggstockscancer uppdelad i fem huvudsakliga histologiska typer (höggradig serös, låggradig serös, endometrioid, klar cell och mucinös), som vi antar kommer att innehålla varierande nivåer av ALDH1A1-aktivitet26. Med målet att undersöka ALDH1A1-aktivitet i äggstockstumörer användes en isoformselektiv fluorogen sondanalys för att identifiera ALDH1A1 + -populationer i en panel med fem äggstockscancercellinjer som tillhör de olika histologiska typerna som nämns ovan. Cellinjerna som testades i denna studie inkluderar BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 och PEO4-celler, som täcker klarcelliga och serösa histotyper. Här betonades sondens mångsidighet och generaliserbarhet för att identifiera CSC för de forskare som försöker utföra liknande studier i andra odödliga cancercellinjer samt patientprover. Användningen av AlDeSense kommer att belysa de biokemiska vägar som är involverade i CSC-underhåll i komplexa vävnadsmikromiljöer och potentiellt fungera som ett kliniskt verktyg för att bestämma prognos och mäta canceraggressivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mät total ALDH1A1-aktivitet i äggstockscancercellhomogenat via fluorimetri
- Tina 1 × 106 celler i en T25-cellodlingskolv i 5 ml av följande cellodlingsmedium:
- IGROV-1 och PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (P / S).
- BG-1 och Caov-3: Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) med 10% FBS och 1% P/S.
- OVCAR-3: RPMI 1640 med 20% FBS, 1% P/S och 0,01 mg/ml insulin.
- Håll cellerna i en inkubator vid 37 °C och 5%CO2 i två till tre passager. Se till att cellerna inte överstiger 80% -90% sammanflöde innan de passerar.
- Trypsinisera cellerna i 0,25% trypsin i 10 minuter, räkna dem med en automatiserad cellräknare och pellet 1 × 107 celler via centrifugering (180 × g) vid 25 ° C i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten försiktigt via aspiration, tvätta pelleten genom att suspendera cellerna i 1 ml 1x PBS och pellet cellerna igen via centrifugering under samma betingelser som beskrivs i steg 4.
- Resuspendera cellerna i en lösning av 1x proteashämmare i 1x PBS. Använd 1 ml av denna lösning per 2,5 × 106 celler.
- Sonicate cellsuspensionen på is i 2 min (1 s puls, 40% amplitud) med en cell homogenisator sond.
- Pelletslösliga/membranfraktioner via centrifugering (3 200 × g) vid 25 °C i 15 minuter. Ta bort och behåll supernatanten, eftersom detta är homogenatet som kommer att användas i efterföljande steg. Separera homogenaten i tre kyvetter för att utföra experimentet i tre exemplar.
- Tillsätt sonden till homogenatet så att en slutlig sondkoncentration på 4 μM erhålls. Pipettera upp och ner tre gånger för att blanda lösningen väl.
- Mät fluorescerande signal omedelbart efter tillsats och efter önskade inkubationstider på en fluorimeter. Inkubationstiden kan optimeras för att se maximal vikning (1 h i detta experiment). Inkubationstiden måste vara konstant över alla cellinjer som jämförs.
- Ställ in excitationsvåglängden på 496 nm.
- Ställ in utsläppet på 510-600 nm.
- Ställ in slitsbredden på 0,5 mm.
- Pipettera lösningen till en 1 ml kvartskyvett, placera i fluormätaren och tryck på skanning.
- Dela den slutliga fluorescensintensiteten vid 516 nm (maximal fluorescerande våglängd) med intensiteten vid samma våglängd från den ursprungliga avläsningen för att bestämma veckaktiveringen av det isoformselektiva färgämnet.
2. Användning av fluorescensmikroskopi till bildceller med hög ALDH1A1-aktivitet
- Tina 1 × 106 celler i en T25-cellodlingskolv i 5 ml lämpligt cellodlingsmedium.
- Håll cellerna i en inkubator vid 37 °C och 5%CO2 i två till tre passager. Se till att cellerna inte överstiger 80% -90% sammanflöde innan de passerar.
- Dagen före konfokal avbildning × platta 4 105 celler i ett kammarglas med 8 brunnar.
- Belägg botten av varje brunn med poly-L-lysin (0,1 mg/ml, 100 μl per brunn) i 10 minuter, därefter aspirerande.
- Tvätta varje brunn 3x genom att tillsätta vatten av cellodlingskvalitet (100 μL per brunn) och aspirera.
- Trypsinisera cellerna i 0,25% trypsin i 10 minuter, räkna dem med en automatiserad cellräknare och platta cellerna vid 4 × 105 celler per brunn.
- Låt cellerna sätta sig och fästa över natten (12-16 timmar).
- Aspirera odlingsmediet och tillsätt serumfria medier (500 μL per brunn), kompletterat med 2 μM sond eller kontrollsonden.
- Inkubera med sonden vid rumstemperatur i 30 minuter och avbilda cellerna omedelbart.
- Slå på konfokalmikroskopet och justera för provet.
- Ladda provet försiktigt vid lägsta förstoring; Hitta cellerna för att säkerställa korrekt positionering.
- Se till att objektivlinsen är vid 10x förstoring och lokalisera cellerna.
- För detta experiment krävs FITC-kanalen (excitation: 488 nm laser; emission: 516-521 nm) och T-PMT (överfört ljus) kanal. Leta reda på och fokusera på cellerna med T-PMT för att fokusera på samma z-plan under hela experimentet för att ta bort bias.
- Justera lasereffekten och FITC-förstärkningen till lämplig inställning, där signalen från Ctrl-AlDeSense AM-samplingarna är minimalt detekterbar, samtidigt som signalen visas i AlDeSense AM-prover. Varje parameter kan justeras genom att skjuta motsvarande stapel. Inställningarna kan behöva justeras några gånger för att identifiera rätt parametrar. När du har optimerat slutför du resten av experimentet inom den cellinjen med identiska parametrar.
- Ta tre bilder per brunn för totalt tre brunnar per behandlingstillstånd (totalt nio bilder). Fokusera på rätt plan med T-PMT för att undvika bias i stället för att använda fluorescenskanalen eller den sammanslagna bilden.
- Bearbeta bilderna för att bestämma procentandelen ALDH1A1 + -celler.
- Använd bildbehandlingsprogram, dela czi-filen i olika kanaler.
- Räkna det totala antalet celler och det totala antalet fluorescerande celler.
- För att bestämma procentandelen ALDH1A1 + -celler, dela antalet fluorescerande celler med det totala antalet celler i varje bild. Det är absolut nödvändigt att räkna på samma sätt för varje bild utan att manipulera bilderna, eftersom till exempel justering av ljusstyrkan kan lägga till en förvirrande variabel.
3. Tillämpning av flödescytometri för att identifiera celler med hög ALDH1A1-aktivitet
- Tina 1 × 106 celler i en T25-cellodlingskolv i 5 ml lämpligt cellodlingsmedium.
- Håll cellerna i en inkubator vid 37 °C och 5%CO2 i två till tre passager. Se till att cellerna inte överstiger 80% -90% sammanflöde innan de passerar.
- Trypsinisera, räkna och pelletera cellerna i ett 15 ml centrifugrör via centrifugering (180 × g) vid 25 °C i 5 minuter.
- Resuspendera cellerna i 1 ml 2 μM sond-/kontrollsondlösning i PBS. Gunga cellerna vid rumstemperatur i 60 minuter för att säkerställa att exponeringen för färgämnet är jämn.
- Efter inkubationstiden pelleteras cellerna genom centrifugering (180 × g) vid 25 °C i 5 minuter. Resuspendera cellerna i 0,5 ml PBS. Kör cellerna genom en cellsil (35 μm nylonnät) för att avlägsna cellklumpar som kan täppa till flödescytometern. Placera cellerna omedelbart på is.
- Slå på instrumentet och kör startprotokollet.
- Kontrollera om det finns mantelvätska och tomt avfall.
- Kör linjerna med 10% blekmedel och vatten i 5 minuter vardera.
- Kör kvalitetskontrollpärlor för att säkerställa korrekt funktion.
- På inställningsfliken väljer du FSC (forward scatter), SSC (side scatter) och FITC (fluoresceinisotiocyanat) som fluorescensfilter .
- Rita följande grafer för att grinda för livskraft, singlets och fluorescens. Optimera lasereffekten (specifik för användarens instrument) så att cellpopulationerna ligger inom de givna parametrarna för vidare analys.
- FSC-A kontra SSC-A spridningsdiagram: huvudcellpopulationen är nära mitten av diagrammet.
- FSC-A kontra FSC-W spridningsdiagram: smalt horisontellt band som indikerar singlets (snarare än cellklumpar).
- FITC-A kontra FSC-A-spridningsdiagram: observera fördelningen av celler sorterade efter den isoformselektiva fluorogena påslagningssonden.
- FITC-A-histogram: observera förändringen i befolkningen baserat på FITC för att bestämma procentandelen ALDH1A1 + -celler.
- För att optimera FITC-lasereffekten, kör ett prov med sonden så att histogramkurvans högra svans är nära den maximala FITC-A-signalen. Kör sedan ett prov med kontrollsonden. En befolkningsförändring bör kunna observeras för att avslöja det maximala dynamiska omfånget. Lasereffektoptimeringssteget kan behöva upprepas flera gånger, men lasereffekten bör inte ändras över prover när en inställning har utsetts för ett experiment.
- Kör varje prov för 10 000 räkningar (gjort i tre exemplar).
- Upprepa steg 3.12 för varje cellinje, eftersom det kommer att finnas variationer i upptag och ALDH1A1-aktivitet.
- Efter avslutad provinsamling, kör linjerna med 10% blekmedel och vatten i 5 minuter vardera och initiera sedan avstängning av instrumentet.
- Bearbeta data med hjälp av flödescytometriprogramvaran och grinda den önskade cellpopulationen. Ställ in grindarna så att alla händelser hamnar i antingen ALDH1A1- eller ALDH1A1+-grinden. Använd rektangelgrindvalet och ställ in ALDH1A1-grinden så att >99,5% av händelserna i kontrollsondproverna inträffar inom denna grind. De återstående cellerna kommer att betraktas som ALDH1A1+. Samma grindar kan sedan appliceras på sondprovet för att kvantifiera antalet händelser som anses vara ALDH1A1- och ALDH1A1+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Total ALDH1A1-aktivitet av äggstockscancercellhomogenat
De genomsnittliga vikningsvarven för varje cellinje erhållen från denna analys är: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); och OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (figur 2).
Figur 2: Fluorescerande vikningständning av isoformselektivt färgämne i homogenater av varje cellinje för äggstockscancer mätt med fluorimetri (medelvärde ± standardavvikelse) (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Molekylär avbildning av ALDH1A1+ subpopulationer i odlade äggstockscancerceller
Vid inkubation av cellerna med en sond eller kontrollsond bestämdes procentandelen ALDH1A1 + -celler i varje cellinje. Genom att ställa in lasereffekten och förstärkningen för att minimera signalen i det Ctrl-AlDeSense AM-behandlade provet optimerades fluorescenssignalen i AlDeSense AM-behandlade celler (figur 3). Genom att räkna antalet ALDH1A1 + -celler bestämdes andelen ALDH1A1 + -celler att vara: BG-1 (3.2% ± 1.6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); OVCAR-3 (39,8% ± 3,9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); och Caov-3 (93,7 % ± 3,4 %) (figur 4).
Figur 3: Representativa konfokala bilder . (A,C,E,G,I) Ctrl-AlDeSense AM-färgade celler och (B,D,F,H,J) AlDeSense AM-färgade celler. Från vänster till höger uppvisar bilderna ljusfält, fluorescens och sammansmältning. Skalstaplarna är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Den genomsnittliga procentandelen ALDH1A1 + -celler i varje cellinje för äggstockscancer mätt med konfokalmikroskopi (medelvärde ± standardavvikelse) (n = 9). Andelen ALDH1A1 + -celler är BG-1 (3.2% ± 1.6%); PEO4 (18,0% ± 3,6%); OVCAR-3 (39,8% ± 3,9%); IGROV-1 (51,7% ± 5,4%); och Caov-3 (93,7 % ± 3,4 %). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Identifiera population av ALDH1A1 + -celler med flödescytometri
Med tillämpningen av den isoformselektiva fluorogena sonden identifierades populationen av ALDH1A1 + -celler framgångsrikt över olika äggstockscancercellinjer. Under den postexperimentella dataanalysen kunde ALDH1A1 + -cellpopulationen inom varje cellinje kvantifieras genom grindning för de översta 0,5% av de ljusaste cellerna inom den Ctrl-AlDeSense AM-behandlade populationen (figur 5). Analys av panelen av äggstockscancerceller har avslöjat procentandelarna av ALDH1A1 + -celler är: BG-1 (4.9% ± 0.4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); OVCAR-3 (7,6% ± 0,1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); och Caov-3 (70,1 % ± 2,4 %) (figur 6).
Figur 5: Representativa spridningsdiagram och histogramövertäckning. (A,D,G,J,M) Representativa spridningsdiagram för Ctrl-AlDeSense AM-färgning efter en 1 h inkubation med celler. (B,E,H,K,N) Representativa spridningsdiagram för AlDeSense AM-färgning efter en 1 h inkubation med celler. (C,F,L,J,O) Histogramöverlägg av Ctrl-AlDeSense AM och AlDeSense AM-färgning av dessa villkor. Cellinjer som färgas är (A-C) BG-1, (D-F) PEO4, (G-I) OVCAR-3, (J-L) IGROV-1 och (M-O) Caov-3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Den genomsnittliga procentandelen ALDH1A1 + -celler i varje äggstockscancercellinje mätt med flödescytometri (medelvärde ± standardavvikelse) (n = 3). Andelen ALDH1A1 + -celler var BG-1 (4.9% ± 0.4%); PEO4 (5,66% ± 0,9%); OVCAR-3 (7,6% ± 0,1%); IGROV-1 (35,4% ± 2,8%); och Caov-3 (70,1 % ± 2,4 %). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Medan flera ALDH-isoformer (dvs. ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 och ALDH3A1) har kopplats till CSC, valdes ALDH1A1 som mål för denna studie eftersom uttrycksnivåerna i samband med äggstockscancer är förhöjda 21,27, och denna isoform har visat sig förvärra läkemedelsresistens28,29 och förbättra tumörgenes 30,31 . Resultat från konfokal avbildning och flödescytometri är i överensstämmelse i ordningen för den ökande populationen av ALDH1A1 + -celler. Dessutom avslöjar cellhomogenatexperimenten den genomsnittliga aktiviteten inom en cellinje. I samband med detta kan slutsatser om mängden aktivitet inom ALDH1A1+ subpopulationer av varje cellinje extrapoleras. Man kan dra slutsatsen att BG-1 har den lägsta ALDH1A1-aktiviteten och den lägsta ALDH1A1 + -populationen. Observera att vi valde BG1-cellinjen som skulle användas som en negativ kontroll i denna studie på grund av det försumbara uttrycket av ALDH1A1. Dessutom avslöjade konfokal avbildning och flödescytometri den största andelen ALDH1A1 + -celler i Caov-3-celler, men cellinjens totala aktivitet var bara tredje högst. Alternativt innehöll OVCAR-3-celler den tredje högsta ALDH1A1 + -populationen men uppvisade den högsta totala aktiviteten. Extrapolering från dessa resultat har subpopulationen av ALDH1A1+ OVCAR-3-celler högre aktivitet än subpopulationen av ALD1A1+ Caov-3-celler. Genom ytterligare analys av ALDH1A1-populationen inom cellinjer eller vävnadsprover, kan ALDH1A1s roll belysas ytterligare och fenotypiska förändringar som ett resultat av förhöjd ALDH1A1-aktivitet kan undersökas.
| Cellinje | Histologisk typ | Fluorimetri (vik, slå på) | Konfokal (% positiv) | Flöde (% positivt) | ||
| BG-1 | Dåligt differentierat adenokarcinom | 1.12 | 3.2 | 4.9 | ||
| PEO4 | Höggradigt seröst cystadenokarcinom | 2.51 | 18.0 | 5.7 | ||
| OVCAR-3 | Höggradigt seröst adenokarcinom | 10.25 | 39.8 | 7.6 | ||
| IGROV-1 | Endometrioid adenokarcinom | 1.30 | 51.7 | 35.4 | ||
| Caov-3 | Höggradigt seröst adenokarcinom | 1.72 | 93.7 | 70.1 | ||
Tabell 1: Sammanfattning av resultat från cellhomogenat, konfokalmikroskopi och flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Panselektivitet är en stor begränsning av många ALDH-sonder; Flera isoformselektiva exempel har dock nyligen rapporterats 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Den isoformselektiva fluorogena sonden som används i denna studie representerar den första rationellt utformade sonden som endast reagerar med ALDH1A1-isoformen, även i närvaro av konkurrerande enzymer som finns i stora överskottsmängder11,12. Ett annat kännetecken för denna sond är dess unika fluorogena natur, som kännetecknas av låg fluorescensemission före sondaktivering. Detta strider mot kommersiella satser såsom Aldefluor-testet, som har ett fluorescerande substrat (BODIPY-aminoacetaldehyd [BAAA]) som alltid är i "on-state"32. BAAA identifierar ALDH+-celler utifrån förutsättningen att den aktiverade karboxylatprodukten (som är lika fluorescerande) hålls kvar i större utsträckning i celler som uttrycker ALDH i höga nivåer. För att ta hänsyn till icke-specifik ackumulering av sonden i ALDH-celler måste en hämmare appliceras för att blockera ALDH som finns i ett kontrollprov. Detta åtföljs emellertid av flera anmärkningsvärda nackdelar. För det första, om avsikten är att identifiera CSC via ALDH1A1-aktivitet, misslyckas tillämpningen av inhibitorstrategin eftersom den också blockerar andra isoformer i varierande utsträckning. För det andra kan inhibitorns icke-specifika beteende försämra en cells förmåga att avgifta reaktiva aldehyder på global nivå. Den första av dessa problem behandlas i utformningen av AlDeSense, eftersom den bara reagerar med en enda isoform som nämnts ovan (kompletterande figur 1). För att förbättra det andra problemet ersätter Ctrl-AlDeSense hämmarens roll. Specifikt uppvisar kontrollreagenset en nästan identisk fluorescerande signal som oaktiverad AlDeSense, tas upp i lika stor utsträckning av celler och lokaliseras huvudsakligen till cytoplasman. Varje signal utanför baslinjen som fastställts av kontrollen måste därför representera ALDH1A1-medierad sondaktivering.
Kompletterande figur 1: Reaktiviteten hos AlDeSense och ALDEFLUOR. (A) Normaliserad fluorescenständning av AlDeSense efter inkubation med varje ALDH-isoform och (B) reaktivitet av ALDEFLUOR med varje ALDH-isoform. Alla mätningar gjordes i tre exemplar; felstaplar är ± SD. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Den första tillämpningen av den isoformselektiva fluorogena sonden som valts för att belysa är mätningen av ALDH1A1-aktivitet i cellhomogenat. Under omständigheter där specialiserad instrumentering som konfokalmikroskop eller flödescytometrar inte är tillgängliga kan användningen av vanliga fluorimetrar snabbt rapportera om total ALDH1A1-aktivitet i ett prov. I linje med detta breddar den enkla provberedningen (homogenater kan nås från prover som sträcker sig från cellkulturer till utskuren vävnad) tillämpligheten av denna analys. Det finns några viktiga parametrar som måste beaktas vid optimering av den isoformselektiva fluorogena sonden för användning med homogenat. Den första handlar om att modulera antalet celler per lysatprov. Till exempel, om det dynamiska området, definierat som omfattningen av fluorescerande signalförändring, inte är tillräckligt lågt, kan antalet celler per prov ökas. På samma sätt kan inkubationstiden också justeras så att mer fluorogen sond kan aktiveras för att ge en starkare fluorescerande avläsning. Det är dock anmärkningsvärt att en stor begränsning av denna metod är oförmågan att skilja mellan subpopulationer av celler som uppvisar varierande nivåer av ALDH1A1-aktivitet. Eftersom celler kombineras och lyseras oavsett deras ALDH1A1-status beräknas mängden enzymaktivitet i genomsnitt över alla celler som finns i provet. Detta resulterar i ett annat resultat jämfört med konfokalmikroskopi och flödescytometrianalyser, där det är andelen ALDH+ -celler som rapporteras. Medan BG-1-celler visar det lägsta vikningssvaret, liksom den minsta populationen av ALDH1A1 + -celler, blir ordningen på de återstående fyra cellinjerna inkonsekvent. Till exempel identifierar homogenatanalysen OVCAR-3-celler för att ha den högsta totala ALDH1A1-aktiviteten, medan den bara rankas tredje baserat på konfokalmikroskopi och flödescytometri. Vår tolkning av dessa data är att en ALDH1A1 + -cell måste ha varierande aktivitetsnivåer. Slutligen är det viktigt att notera att denna typ av "turn-on" -experiment inte skulle vara möjligt med ackumuleringsbaserade sonder.
Dessutom är den isoformselektiva fluorogena sonden ett molekylärt bildmedel för visualisering av ALDH1A1 + cellpopulationer. Observera att även om konfokalmikroskopi användes i denna demonstration, är denna fluorogena sond kompatibel med ett stort sortiment av bildinställningar, inklusive automatiserade cellräknare, epifluorescensmikroskop och bredfältbelysningsinstrument. Ett av de viktigaste stegen i detta experiment är användningen av Ctrl-AlDeSense för att fastställa lämpliga tröskelparametrar (t.ex. pinhole-storlek, lasereffekt, FITC-förstärkning). I detta avseende bör inställningarna justeras så att Ctrl-AlDeSense-signalen ligger strax ovanför bakgrunden. I händelse av att en användare finner att det är nödvändigt att öka lasereffekten för att se denna signal, rekommenderas förlängning av färgfärgningsperioden eller laddningskoncentrationen framför att öka lasereffekten (över 50%) på grund av ökad fototoxicitet eller sondblekning. En begränsning av konfokal avbildning är variabilitet vid grindning med Ctrl-AlDeSense. Trots denna varning var den observerade cellinjeordningen baserad på ökande procentandelar ALDH1A1 + -celler identiska med resultaten erhållna via flödescytometri. Till skillnad från molekylär avbildning, där det maximala antalet celler som visualiseras begränsas av synfältet, analyserar ett typiskt flödescytometriexperiment upp till tiotusentals celler. Övervägandena om färgningstid och belastningskoncentration liknar det som diskuteras för molekylär avbildning. Ett ytterligare element som måste beaktas är jämn färgfärgning i cellsuspensionen för att säkerställa att falskt positiva ALDH1A1 + -populationer inte felidentifieras.
Avslutningsvis belyser den här artikeln processen för att optimera AlDeSense för en mängd olika modaliteter, med hjälp av äggstockscancerceller som ett exempel. Detta representerar ett viktigt första steg mot att svara på varför motstridiga rapporter finns om ALDH1A1-uttryck i denna cancertyp21,22,23,24. Utöver vad vi har visat ser vi framför oss att denna isoformselektiva fluorogena sond kan användas i en screeningkampanj med hög genomströmning för att identifiera ALDH1A1-selektiva hämmare som kan dyka upp som läkemedelskandidater. Dessutom kan denna sond fortsätta att användas för att identifiera CSC hos levande djur, vilket vi har visat i vår första publikation11. Den gröna ljusemitterande egenskapen hos den isoformselektiva fluorogena sonden primar den för multiplexeringsexperiment där den kan användas tillsammans med rödemitterande fluorescerande proteiner, småmolekylära färgämnen eller analytresponsiva sonder. Dessutom finns en röd version av den isoformselektiva fluorogena sonden, som ytterligare kan utöka denna multiplexeringskapacitet12. Slutligen, på den medicinska fronten, kan denna sond användas som ett prognostiskt verktyg i den kliniska miljön för beslutsfattande om vårdbehandling. Kvantifiering av ALDH1A1-aktivitet och ALDH1A1 + -cellpopulationer kan fungera som en metod för att bestämma canceraggressivitet, vilket möjliggör personliga behandlingsstrategier för bättre livskvalitet. Dessutom, med hjälp av AlDeSense, kan en avläsning levereras och tolkas på några timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi avslöjar ett sökt patent (US20200199092A1) för AlDeSense-tekniken.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R35GM133581 till JC) och Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (tilldelas SG). JC tackar Camille och Henry Dreyfus Foundation för stöd. Författarna tackar Dr. Thomas E. Bearrood för hans första bidrag till att förbereda lager av AlDeSense och AlDeSense AM. Vi tackar Oliver D. Pichardo Peguero och Joseph A. Forzano för deras hjälp med att förbereda olika syntetiska prekursorer. Vi tackar professor Erik Nelson (Institutionen för molekylär och integrativ fysiologi, UIUC) för Caov-3-, IGROV-1- och PEO4-celler. Vi tackar Prof. Paul Hergenrother (Institutionen för kemi, UIUC) för BG-1-celler. Vi tackar Core Facilities vid Carl R. Woese Institute for Genomic Biology för tillgång till Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop och motsvarande programvara. Vi tackar flödescytometrifaciliteten för tillgång till BD LSR II CMtO Analyzer. Vi tackar Dr. Sandra McMasters och Cell Media Facility för hjälp med att förbereda cellodlingsmedia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25-050-CI | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| BG-1 | A gift provided by the Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| BioLite 25cm2 Flask | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biosafety Cabinet 1300 series A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | Provided by UIUC CMtO | ||
| FL microscope | EVOS | ||
| Fluorometer | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R Incubated Shaker | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Coverglass System | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | A gift provided by the Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | Prepared by UIUC cell media facility | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL Insulin | Prepared by UIUC cell media facility |
References
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
- Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
- Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
- Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
- Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
- Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
- Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
- Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
- Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
- East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
- Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
- Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
- Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
- Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
- Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142 (2014).
- Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
- Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277 (2010).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
- Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
- Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
- Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
- Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502 (2019).
- Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
- Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
- Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
- Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
- Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
- Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662 (2014).
- Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
- Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
- Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
- Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
- Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
- Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
- Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).
