Summary
本文提出了两种基于荧光 原位 杂交的方法，以确定X染色体畸变女性非移植和移植卵巢皮层组织中卵巢细胞的X染色体含量。
Abstract
全世界有数百万人处理有关生育的问题。生育能力下降，甚至不孕症，可能是由于许多不同的原因，包括遗传性疾病，其中染色体异常是最常见的。荧光 原 位杂交（FISH）是检测人类染色体畸变的众所周知且常用的方法。FISH主要用于分析具有数值或结构染色体畸变的雄性精子中的染色体异常。此外，该技术也经常应用于女性，以检测已知会导致卵巢发育不良的X染色体畸变。然而，仍然缺乏关于淋巴细胞和/或颊细胞中X染色体畸变的女性卵巢细胞的X染色体含量的信息。
本研究的目的是通过提出两种基于FISH的方法来鉴定卵巢细胞的X染色体含量，从而推进有关女性X染色体畸变的基础研究。首先，描述了一种测定X染色体畸变女性非移植卵巢皮层组织中分离的卵巢细胞（卵母细胞，颗粒细胞和基质细胞）的X染色体含量的方法。第二种方法旨在通过确定卵巢组织中新形成的二级和窦卵泡的卵巢细胞的X染色体含量来评估染色体畸变对卵泡发生的影响，这些卵巢组织中来自长期移植到免疫功能低下小鼠后具有X染色体畸变的雌性。这两种方法都可能有助于未来的研究，以深入了解具有X染色体畸变的女性的生殖潜力。
Introduction
不孕症是男性或女性生殖系统的健康问题，影响全世界约1.86亿育龄人1。在至少35%的不孕夫妇中，不孕症是由女性生殖系统疾病引起的2。导致女性不孕的因素很多，如遗传因素、生殖道异常、内分泌功能障碍、炎症性疾病、医源性治疗等3。
遗传异常存在于大约 10% 的不育女性中4，5。在所有遗传异常中，X染色体畸变是卵巢发育不全的最常见原因2。一些研究报告，患有特纳综合征 （TS） 或三重 X 综合征的女性的 X 染色体畸变与生殖细胞加速丢失或卵子生成受损导致的卵巢早衰有关6，7，8。
X染色体畸变可分为：1）数值畸变，其中X染色体数量不同但X染色体完整;2）结构畸变，其中X染色体获得或失去遗传物质3，9。X染色体的数值畸变比结构异常更常见，通常是由细胞分裂过程中的自发错误引起的3，9。当减数分裂期间发生这种错误时，可能会导致非整倍体配子，并最终导致所有细胞中染色体畸变的后代。当体细胞中由于个体发生早期有丝分裂过程中发生的错误而导致体细胞中出现染色体缺陷时，可能会导致嵌合体。在这些个体中，存在具有正常X染色体含量的细胞和具有X染色体畸变的细胞。
在 1980 年代，开发了一种称为荧光 原位 杂交 （FISH） 的细胞遗传学技术，用于可视化和定位中期和间期染色体10，11 上的特定核酸序列。该技术使用荧光标记的DNA探针与染色体中的特定序列结合，然后可以使用荧光显微镜将其可视化。
如今，FISH被广泛用作临床诊断工具，被认为是检测染色体畸变的金标准10。在生殖医学领域，对精子的FISH分析已被用于深入了解体细胞中具有数字或结构染色体畸变的男性精子的X染色体含量12，13，14。这些研究表明，与具有正常核型12，13，14的男性相比，染色体畸变的男性更有可能在其精液中出现更高的非整倍体精子的频率。
与精子相反，对染色体畸变个体卵巢细胞（包括卵母细胞、颗粒/膜细胞和基质细胞）的 X 染色体含量知之甚少，以及这些细胞的非整倍性对其生殖潜力的可能后果。与精子相比，卵巢细胞核型信息稀缺的一个重要原因是女性必须接受侵入性手术，例如卵泡穿刺或手术以获得卵母细胞或卵巢皮层组织。因此，很难获得用于研究目的的雌配子。
目前，荷兰正在进行一项观察性干预研究，以探索卵巢组织冷冻保存对TS15年轻女性的疗效。患者的卵巢皮层组织的一个片段可用于鉴定卵巢细胞的X染色体含量16，17。作为研究的一部分，开发了一种基于解离卵巢皮层组织的FISH的新方法，以确定在非卵巢体细胞（如淋巴细胞或颊细胞）中携带染色体畸变的女性卵巢细胞中是否存在染色体畸变。此外，还确定了卵巢细胞中非整倍性对卵泡生成的影响。为此，修改了一个已建立的FISH方案，以便在免疫功能低下的小鼠长期异种移植期间人工诱导的卵泡生成后分析卵巢皮层组织的组织学切片。在这项研究中，我们提出了两种基于FISH的方法来确定X染色体畸变女性非移植和移植卵巢皮层组织中卵巢细胞中的X染色体含量，旨在提高该主题的基础科学。
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Protocol
特纳生育研究方案已获得涉及人类受试者研究的中央委员会（NL57738.000.16）的批准。本研究共获取93例TS女性卵巢皮层组织。需要安全预防措施的材料列于 表1中。
表 1：安全预防措施。
| 材料 | 危险 | ||
| 醋酸 | 严重的皮肤灼伤和呼吸系统刺激 | ||
| 胶原 酶 | 刺激眼睛、呼吸系统和皮肤 | ||
| 达皮 | 刺激眼睛、呼吸系统和皮肤 | ||
| 脱氧核糖核酸酶 I | 刺激眼睛、呼吸系统和皮肤 | ||
| 乙醇 | 高度易燃 | ||
| 甲醛 | 吸入、摄入和皮肤接触后有毒 | ||
| 甲酰胺 （在荧光探针中） |
可能会伤害未出生的孩子 | ||
| 解放酶 | 刺激眼睛、呼吸系统和皮肤 | ||
| 甲醇 | 高度易燃，吸入、摄入和皮肤接触有毒 | ||
| 诺尼德 P40 | 刺激皮肤或眼睛 | ||
| 胃蛋白酶 | 刺激眼睛、呼吸系统和皮肤 | ||
| 蛋白酶K | 吸入后呼吸困难 | ||
| 二甲苯 | 高度易燃，吸入和皮肤接触后有毒。避免接触眼睛。 | ||
表 1：需要安全预防措施的材料。
1. 对分离的单个卵巢皮层细胞进行 FISH
- 解离卵巢皮层组织以获得单个细胞
- 使用手术刀将冷冻保存/解冻的卵巢皮层组织切成大约 1 mm x 1 mm x 1 mm 的小块。
- 在含有 0.1 mg/mL 组织解离酶混合物、10 μg/mL DNase I 和 1 mg/mL 溶 组织梭菌 胶原酶 I 的 4 mL 预热 （37 °C） L15 培养基中酶消化组织碎片，在 37 °C 下最多 75 分钟。 每 15 分钟上下移取消化混合物。
- 通过添加 4 mL 补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的冷 L15 来停止酶消化。用 8 mL 冷 L15 培养基以 500 x g 离心洗涤解离的组织一次，并在不涡旋的情况下重悬于 500 μL L15 培养基中以避免损坏细胞。
- 将含有大部分单个基质细胞和小卵泡（被单层颗粒细胞包围的卵母细胞）的细胞悬液转移到塑料培养皿中，并在体视显微镜（100倍放大）下检查细胞悬液。
- 使用75μm塑料移液管手动拾取小卵泡（<50μm），并将卵泡转移到4°C下补充有10%FBS的L15培养基液滴中，以防止卵泡聚集。进行卵泡拾取最多30分钟。为了在FISH分析之前改善滤泡细胞扩散，将纯化的卵泡转移到0.06%胰蛋白酶，1mg / mL乙二胺四乙酸（EDTA）和1mg / mL葡萄糖的溶液中，并在37°C下孵育20分钟。
- 使用75μm塑料移液管从皮层细胞悬液中获取卵巢基质细胞，特别注意避免被小卵泡污染。
- 单个卵巢细胞的FISH分析
- 将处理过的卵巢卵泡（推荐n = 5-20）与胰蛋白酶/ EDTA /葡萄糖或基质细胞（n > 1，000）转移到5μL的0.15mM KCl / 15μLDulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）的液滴上载玻片上，并在37°C下孵育20分钟。
- 在室温（RT）下干燥并将载玻片预固定在300μL的0.05mM KCl/7.5%乙酸/22.5%甲醇中2分钟。在室温下用甲醇/乙酸（3：1）覆盖载玻片2分钟以完成固定。
- 通过在 5 L 蒸馏水中加入 876 克氯化钠和 441 克柠檬酸三钠二水合物制成 20 倍标准柠檬酸钠 （SSC）。接下来，将 100 mL 的 20x SSC 加入 900 mL 软化 （demi） 水中以获得 2x SSC。在73°C下用2x SSC洗涤样品，用100μL的2%蛋白酶K覆盖，并用盖玻片密封。将载玻片在37°C下在杂交站中孵育10分钟。
- 取下盖玻片并在室温下在DPBS中清洗载玻片5分钟。 在室温下用1%甲醛固定样品5分钟。在此阶段，材料尚未完全附着在载玻片上，因此不应放置在摇晃的平台上。
- 在室温下在DPBS中洗涤载玻片5分钟，然后在随后的70%，80%，90%和100%乙醇中脱水2分钟。风干脱水样品，并与荧光标记的探针杂交。
- 选择一种X染色体着丝粒特异性探针和另一种染色体特异性着丝粒探针作为对照，以确定卵巢细胞的X染色体含量。在这种情况下，使用直接用荧光染料SpectrumGreen标记的X染色体（CEP X [DXZ1]）和直接用荧光染料SpectrumOrange标记的18号染色体（CEP 18 [D18Z1]）的着丝粒特异性探针。
- 向样品中加入 1 μL CEP X、1 μL CEP 18 和 18 μL 杂交缓冲液，并用粘在载玻片上的盖玻片密封，以防止探针在杂交过程中蒸发。将载玻片转移到杂交站，在73°C下变性3分钟，然后在37°C孵育过夜期间杂交。
- 杂交后，从载玻片上取下盖玻片和任何剩余的胶水。在72°C下在0.4x SSC / 0.3%吐温-20中洗涤载玻片2分钟，然后在室温下在2x SSC / 0.1%吐温-20中孵育1分钟。
- 随后在70%、80%、90%和100%乙醇中孵育2分钟，并在黑暗中风干，使载玻片脱水。用含有 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的封片剂覆盖载玻片。在通过荧光显微镜分析之前，在-20°C下保持至少10分钟。
- 成像
- 使用链接到图像处理软件的荧光显微镜检查X染色体的信号。
- 首先，选择荧光染料DAPI。
- 通过选择“新细胞”> 在 630 倍放大倍率下实时>捕获来获取图像。将出现一个带有阈值的新窗口。将阈值的蓝色条设置为 0 以最小化背景，将红色条设置为最大值 （255） 以使信号更亮。单击接受。
- 将出现一个带有增强功能的新窗口，其中包含更暗/更亮 （12）、半径 （3） 和深度 （1） 的建议。使用建议的值，如果不满意，请进行调整。
- 其次，选择荧光染料光谱橙色，然后单击捕获。
- 将阈值的蓝色条设置为 0 以最小化背景，将红色条设置为最大值 （255） 以使信号更亮。单击接受。
- 将显示具有增强功能的窗口，并建议显示更暗/更亮 （-11）、半径 （2.7） 和深度 （0.6）。使用建议的值，如果不满意，请进行调整。
- 最后，选择 荧光染料光谱绿 ，然后单击 捕获。
- 将阈值的蓝色条设置为 0 以最小化背景，将红色条设置为最大值 （255） 以使信号更亮。单击接受。
- 将显示具有增强功能的窗口，并显示更暗/更亮 （0）、半径 （3） 和深度 （0） 的建议。使用建议的值，如果不满意，请进行调整。将图像保存在新创建的文件中。
注意：仅当对照染色体18的两个信号可见时，才评估体细胞。在大多数卵母细胞中，每条染色体只能检测到一个信号。
- 首先，选择荧光染料DAPI。
- 分析后将载玻片储存在4°C的黑暗中，以防止信号丢失。
- 使用链接到图像处理软件的荧光显微镜检查X染色体的信号。
2. 移植卵巢皮层组织石蜡切片上的 FISH
注意：将18名患有TS的女性的冷冻保存/解冻卵巢皮层组织的一个片段异种移植到严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中5个月。异种移植程序之前已经描述过，并在鲁汶天主教大学（比利时布鲁塞尔）按照动物研究委员会关于动物福利的当地指导方针（参考2014/UCL/MD/007）进行18，19。
- 选择含有卵泡的异种移植卵巢皮层组织切片
- 将异种移植的卵巢皮层组织固定在4%甲醛中，并将组织嵌入石蜡中。用手术刀修剪块以去除多余的石蜡，并在旋转切片机上将石蜡块切割成 4 μm 厚。
- 选择石蜡带的每七个切片进行苏木精和伊红 （HE） 染色，以确定哪些切片含有卵泡。将该切片置于40-45°C的水浴中，并将它们安装在免疫组织化学显微镜载玻片上。
- 脱蜡和HE染色
- 将载玻片放在60°C的炉子上10分钟，然后将载玻片浸入100%二甲苯中5分钟。没有必要将滑梯直接放在炉子上。在100%乙醇中水合切片15秒，然后在96%乙醇中水合2 x 15秒。用自来水冲洗载玻片2分钟。
- 将载玻片用苏木精染色10分钟，然后在自来水中短暂冲洗载玻片。将载玻片短暂浸入碳酸氢盐溶液（100g硫酸镁和10g碳酸氢钠在5L蒸馏水中）。用自来水冲洗载玻片5分钟。
- 用伊红对载玻片复染4分钟，并用100%乙醇脱水载玻片三次，然后用二甲苯脱水。盖玻片上的HE染色剂，并在光学显微镜下评估HE切片，以选择具有卵泡的切片（100倍放大）。
- DNA鱼石蜡切片的预处理和杂交
- 从石蜡色带中选择位于包含卵泡的切片之前或之后的新切片。在载玻片上安装一个部分。在56°C的炉子上干燥石蜡部分至少45分钟。 没有必要将滑梯直接放在炉子上。
- 将切片在二甲苯中脱蜡10分钟。将载玻片浸入99.5%乙醇中，并在自来水中冲洗5分钟。用目标检索溶液（低pH）在96°C下预处理载玻片10分钟。 冷却后，用蒸馏水冲洗载玻片。
- 用0.01M盐酸处理载玻片5分钟，然后在37°C下消化胃蛋白酶消化（200U / mL）15分钟。 再次用0.01M盐酸冲洗载玻片，随后在PBS中冲洗载玻片。
- 将载玻片固定在1%甲醛/ PBS中5分钟。在PBS中短暂冲洗载玻片，然后在半水中再次冲洗。将载玻片在99.5%乙醇中脱水，并使其风干。
- 选择一个X染色体着丝粒特异性探针和另一个染色体特异性着丝粒探针作为对照，以确定颗粒细胞的X染色体含量。在这里，18号染色体被用作对照。
- 在预处理的载玻片上应用 5 μL 直接用荧光染料光谱绿标记的探针 CEP 18 （D18Z1） 和直接用荧光染料光谱红色标记的探针 CEP X （DXZ1）。应用盖玻片并用照片胶密封该区域。将载玻片放入杂交器中，在80°C下变性10分钟，并在37°C下杂交过夜。
- 第二天，在42°C下在2x SSC中冲洗载玻片5分钟，然后在73°C下用0.3%Nonidet P40冲洗2分钟和1分钟。 刷新2x SSC并在室温下再次冲洗载玻片5分钟。盖上比色皿，使切片保持在黑暗中。
- 用蒸馏水短暂冲洗载玻片。将载玻片在99.5%乙醇中脱水，然后再次风干。最后，用含有DAPI和安装介质的溶液安装载玻片。
- 成像
- 在630倍放大倍率的荧光显微镜下分析结果。打开计算机上的图像处理软件。选择 FISH 作为配置文件。
- 检查DAPI发射是否设置为431 nm，激发设置为359 nm，德克萨斯红发射设置为613 nm，激发设置为595 nm，FITC发射是否设置为519 nm，激发是否设置为495 nm。
- 通过选择实时>捕获单个图像来获取图像。通过移动左侧“图像”菜单中的“曝光滑块”和“增益滑块”来调整曝光和增益，从而优化图像质量（例如，曝光：212 ms，增益：7.9）。所需的曝光和增益可能因图像而异;观察此过程期间的变化以获得优化的图像。将图像保存在新创建的文件中。
- 分析后将载玻片储存在4°C的黑暗中，以防止信号丢失。
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Representative Results
移植前分离卵巢细胞上的 FISH
使用具有45，X / 46，XX（患者A）或45，X / 46，XX / 47，XXX（患者B）TS的女性冷冻保存的卵巢皮层组织来说明使用该协议的结果。在患者A中，50%的淋巴细胞具有45，X核型，50%具有46，XX。在患者B中，38%的淋巴细胞为45，X，28%为46，XX，34%为47，XXX。X号染色体（绿色）和18号染色体的着丝粒特异性探针作为对照（红色）用于确定从未接受异种移植的TS患者的卵巢皮层组织中分离的单个颗粒细胞，基质细胞和卵母细胞的X染色体含量（图1）。
图1：移植前从卵巢皮层组织中分离的卵巢细胞的FISH分析。 用荧光特异性探针分析来自单个原始卵泡（A，B）和（C，D）周围基质细胞的卵母细胞（箭头）和颗粒细胞，以检测X染色体（绿色信号）和对照18号染色体（红色信号）。白色箭头表示 45，X 细胞系，黄色箭头表示 46，XX 细胞系，红色箭头表示 47，XXX 细胞系。并非所有荧光信号都在同一焦点平面上。条形代表 10 μm。FISH信号的放大倍数设置为630倍。 请点击此处查看此图的大图。
在FISH之前用胰蛋白酶处理和不使用胰蛋白酶处理的单个原始卵泡之间的差异如图 2所示。通过在FISH分析之前使用胰蛋白酶，颗粒细胞团和卵母细胞的聚集较少，从而可以分析单个颗粒细胞和卵母细胞的X染色体含量。由于卵母细胞DNA的不规则形状，大小和弥漫外观，卵母细胞的DNA可以很容易地与周围颗粒细胞的DNA区分开来。此外，由于这些细胞中四个姐妹染色单体的接近，因此在小卵泡的卵母细胞中仅观察到每个染色体的一个强FISH信号。卵母细胞的X染色体含量可以通过使用X染色体的FISH信号与18号染色体的表面比来确定。
图 2：在 FISH 之前用胰蛋白酶和不使用胰蛋白酶处理的小卵泡。 （A）卵巢皮层组织的酶消化导致大部分解离细胞的悬浮液，但留下原始卵泡，由被单层颗粒细胞包围的完整卵母细胞组成（图A中的箭头）。（B）从细胞悬液中精心挑选小卵泡，但由于颗粒细胞的聚集，在FISH后难以解释信号（C）。（D，E）在FISH之前用胰蛋白酶对分离的卵泡进行额外消化导致单个颗粒细胞在卵泡表面收缩成球形形态，并且更有可能从卵泡中解离以进行FISH分析。卵母细胞来源的FISH信号由箭头表示。黑条代表 100 μm，白条代表 10 μm。FISH信号的放大倍数设置为630倍。图D经Peek等人许可转载。16. 请点击此处查看此图的大图。
移植卵巢皮层组织石蜡切片上颗粒细胞的FISH分析
发现二级和窦卵泡不太容易受到酶消化的影响，这使得先前描述的组织解离方法获得单个卵巢细胞不适合在长期异种移植后生长卵巢组织中发现的卵泡。因此，使用4μm组织学切片优化FISH方案，以确定移植后卵巢皮层组织中二级和窦卵泡颗粒细胞的X染色体含量（图3）。在这种情况下，由于卵泡中卵母细胞的直径较大，卵母细胞中X染色体或对照染色体的FISH信号不太可能在单个4μm切片中捕获。
图3：异种移植后卵巢皮层组织切片的组织学和FISH染色。 （一，二）苏木精/伊红染色显示异种移植 5 个月后卵巢皮质组织中的二级和窦卵泡形态正常。（中，四）通过FISH分析测定这些卵泡颗粒细胞的X染色体含量。在此图中，X染色体显示为红色，18号染色体显示为绿色。 面板 A 中的条形代表 50 μm，面板 B 中的条代表 20 μm，面板 C 和 D 中的条形代表 10 μm。FISH信号的放大倍数设置为630倍。 请点击此处查看此图的大图。
作为第一步，使用不同的组织固定技术进行实验，以确定哪种方法产生最佳的FISH信号。对固定在Bouin溶液中并随后浸入4%甲醛中的移植组织以及仅固定在4%甲醛中的移植组织进行FISH分析。首先固定在Bouin中的移植组织在图像上显示出绿色雾霾，因此难以准确计算FISH信号的数量（图4）。
图4：移植的卵巢皮层组织仅固定在Bouin溶液和甲醛 中。 （A）将移植的卵巢皮层组织固定在Bouin溶液中，由于绿色雾霾，滤泡细胞中的荧光信号模糊且大部分模糊。（B）固定在甲醛中的卵巢皮层组织仅提供易于解释的出色荧光信号。条形代表 10 μm。FISH信号的放大倍数设置为630倍。 请点击此处查看此图的大图。
为了确定组织学切片中滤泡颗粒细胞的X染色体含量，不可能简单地计数颗粒细胞的FISH信号。由于组织的切片，单个颗粒细胞的部分染色体可能在某个组织学切片中丢失。因此，有必要首先确定由于切片而丢失的FISH信号的百分比，然后再最终确定移植组织后新形成的二级和窦卵泡中由于非整倍性而导致的颗粒细胞群X染色体含量的损失。
通过确定非非整倍体对照染色体18的每个颗粒细胞的FISH信号数量，可以计算由于切片而丢失的FISH信号的百分比。预计由于切片，相同百分比的X染色体丢失。颗粒细胞群中X染色体FISH信号数量的任何额外减少都是由于非整倍性。然而，使用对照染色体的FISH信号来确定由于非整倍性引起的X染色体丢失需要X染色体和对照染色体的FISH信号的检测灵敏度非常相似。因此，确定了两种FISH探针在非非整倍体46，XX个体组织学切片中生长卵泡的颗粒细胞中的检测灵敏度。当染色体X/对照染色体FISH信号的比率接近1时，可以假设两个探针的检测灵敏度确实非常相似，因此FISH探针可用于确定异种移植后卵巢组织学切片中生长卵泡的颗粒细胞群中的非整倍性水平。
例
当分析来自46，XX个体卵巢的卵泡的130个颗粒细胞中的18号染色体信号的数量时，预计存在260个信号。然而，在这些细胞的4μm切片中，仅观察到204个染色体18信号。这表明 21.5% 的信号由于切片而丢失 （（260-204）/260 x 100 = 21.5%）。因此，由于切片，每个颗粒细胞的18号染色体信号数减少到204/130 = 1.57。
接下来，分析移植到患有TS的女性卵巢组织后窦卵泡颗粒细胞中的X染色体数量。总共统计了 191 个 X 染色体信号和 199 个 18 号染色体信号。颗粒细胞的数量可以通过将18号染色体的信号总数除以每个颗粒细胞的18号染色体信号数（199/1.57 = 127个颗粒细胞）来确定。最后，通过将18号染色体和X染色体信号的差异除以颗粒细胞的数量（即[199-191]/127 x 100 = 6%的颗粒细胞为45，X，这些细胞中的94%为46，XX），可以确定45，X颗粒细胞的百分比。
值得注意的是，在具有47，XXX细胞系的患者中，只能确定具有47，XXX核型的颗粒细胞的最小百分比，因为45，X和47，XXX颗粒细胞的混合物具有与46，XX颗粒细胞相同数量的X染色体信号。
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Discussion
FISH 分析是一种众所周知的技术，用于检测男性和女性淋巴细胞或颊细胞中的 X 染色体畸变10.一些研究已经描述了FISH对X染色体畸变的男性配子的影响，但FISH获得的关于X染色体畸变女性卵巢细胞的详细信息仍然缺乏14。本文提出了基于FISH的新方法，以确定X染色体畸变女性的非移植和移植卵巢皮层组织的卵巢细胞中是否存在非整倍性。
在非移植卵巢皮层组织中分离单个卵巢细胞的方案的主要挑战在于组织的酶消化，这需要事先进行一些练习。为了获得足够的卵巢细胞的准确FISH信号，重要的是要严格遵循有关酶消化，孵育时间和指示温度的步骤。在此过程中，偏离方案会导致卵巢细胞大量损失，对于卵巢储备已经较低的患者尤其应避免这种情况。该方法的另一个关键步骤是用胰蛋白酶处理纯化的原始卵泡，以防止卵母细胞和颗粒细胞团聚集，从而排除了对单个细胞的分析。如果不用胰蛋白酶处理，可以通过FISH可靠分析的单个颗粒细胞的数量会严重减少。
对长期移植后取出的卵巢皮层组织的FISH分析需要不同的技术，因为发现只有小卵泡对获得单个卵巢细胞所必需的酶消化足够敏感。此外，与卵巢皮层组织的自体移植类似，在移植物被宿主充分血运重建之前，由于缺氧和缺乏营养，许多卵泡在移植后丢失20。因此，预计移植后的卵泡数量将大大低于移植前。对于这种用于组织学切片的FISH技术，重要的是将移植组织固定在4%甲醛中，以获得最佳的FISH信号。在实验室中常规使用Bouin固定剂固定卵巢皮层组织，虽然与标准HE染色结合使用时可提供出色的结果，但在FISH之前用Bouin固定组织会导致难以解释的弱和模糊的荧光信号。
尽管该协议已被证明可以成功确定卵巢细胞的X染色体含量，但它仍然存在一些局限性。一个限制是这些方法只能用于分析具有数值像差的女性卵巢细胞。数值像差可以通过使用针对重复序列的探头来检测21。这些探针在着丝粒区域杂交多个重复碱基对序列，产生强烈的杂交信号。相比之下，结构像差只能通过使用针对独特单个序列的探针来检测。这些探针与单倍体基因组中仅出现一次的序列杂交，与数值像差相比，FISH信号强度要低得多。由于这些相对较弱的FISH信号，很难正确确定具有结构畸变的女性卵巢细胞的X染色体含量。
其次，由于减数分裂I22前期四个姐妹染色单体的接近，非移植组织中小卵泡卵泡卵母细胞的FISH信号难以分析。卵母细胞中仅存在一个强杂交信号，因此不可能简单地计算卵母细胞中的信号数量来确定X染色体含量。相反，应使用染色体X和18个FISH信号的表面比率来确定这些细胞中的X染色体含量。只有当卵母细胞中的FISH信号明显存在时，才能可靠地确定这一点。
此外，移植组织上的FISH只能用于确定来自二级和窦卵泡的颗粒细胞的X染色体含量，因为移植组织组织组织学切片中的小滤泡只有少数可以正确分析的颗粒细胞。此外，由于卵母细胞的直径较大，使用这种方法无法准确测定卵母细胞的X染色体含量。
最后，与雄性配子相比，获得雌性配子仍然具有挑战性，因为需要侵入性手术来获得卵巢细胞或卵巢皮层组织。因此，这些方法最有可能应用于研究环境。
总之，对患有X染色体畸变的女性的非移植和移植卵巢皮层组织的卵巢细胞进行FISH分析是一种独特而有用的技术，可以深入了解该特定组中卵巢细胞的X染色体含量。这些技术表明，冷冻保存来自X染色体畸变的女性卵巢皮层组织是可能的，并且冷冻保存的原始卵泡能够生长到次级和窦卵泡。然而，应该记住，这两种方法都旨在促进未来对X染色体畸变女性的研究，而不是旨在用作诊断工具，以在临床实践中筛选X染色体畸变女性的生殖结果。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢Marjo van Brakel，Dominique Smeets，Guillaume van de Zande，Patricia van Cleef和Milan Intezar的专业知识和技术援助。资金来源：默克雪兰诺（A16-1395），Goodlife和Ferring。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
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