Summary
מאמר זה מציג שתי שיטות המבוססות על הכלאה פלואורסצנטית באתרו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.
Abstract
מיליוני אנשים ברחבי העולם מתמודדים עם נושאים הקשורים לפוריות. ירידה בפוריות, או אפילו אי פוריות, עשויה לנבוע מסיבות רבות ושונות, כולל הפרעות גנטיות, אשר הפרעות כרומוזומליות הן הנפוצות ביותר. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) היא שיטה ידועה ונפוצה לאיתור סטיות כרומוזומליות בבני אדם. FISH משמש בעיקר לניתוח הפרעות כרומוזומליות בזרעונים של זכרים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות. יתר על כן, טכניקה זו מיושמת לעתים קרובות גם אצל נשים כדי לזהות סטיות כרומוזומליות X הידועות כגורמות לדיסגנזה שחלתית. עם זאת, מידע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים ו / או תאים buccal עדיין חסר.
מטרת מחקר זה היא לקדם מחקר בסיסי לגבי סטיות כרומוזומליות X בנקבות, על ידי הצגת שתי שיטות המבוססות על FISH לזיהוי התוכן הכרומוזומלי X של תאי השחלה. ראשית, מתוארת שיטה לקביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה מבודדים (ביציות, תאי גרנולוזה ותאי סטרומה) ברקמת קליפת השחלות שלא הושתלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X. השיטה השנייה מכוונת להערכת ההשפעה של סטיות כרומוזומליות על פוליקולוגנזה על ידי קביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה של זקיקים משניים ואנטרליים שזה עתה נוצרו ברקמת השחלה, מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X לאחר השתלה ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. שתי השיטות יכולות להיות מועילות במחקר עתידי כדי לקבל תובנה לגבי פוטנציאל הרבייה של נקבות עם סטיות כרומוזומליות X.
Introduction
אי פוריות היא בעיה בריאותית של מערכת הרבייה הגברית או הנשית, המשפיעה על כ -186 מיליון אנשים בגיל הפוריות ברחבי העולם1. לפחות 35% מהזוגות העקרים, אי פוריות נגרמת על ידי הפרעה של מערכת הרבייה הנשית2. ישנם גורמים רבים שיכולים לגרום לאי פוריות נשית, כגון גורמים גנטיים, הפרעות בדרכי המין, תפקוד אנדוקריני, מחלות דלקתיות וטיפול יאטרוגני3.
הפרעות גנטיות קיימות בכ -10% מהנקבות העקרים 4,5. מכל ההפרעות הגנטיות, סטיות כרומוזום X הן הגורם השכיח ביותר לדיסגנזה שחלתית2. מספר מחקרים דיווחו כי סטיות כרומוזומליות X אצל נשים עם תסמונת טרנר (TS) או תסמונת X משולש קשורות לאי ספיקת שחלות מוקדמת עקב אובדן מואץ של תאי נבט או פגיעה באוגנזה 6,7,8.
ניתן לחלק סטיות של כרומוזום X ל: 1) סטיות מספריות, שבהן מספר כרומוזומי X שונה אך כרומוזומי X שלמים; ו-2) סטיות מבניות, שבהן כרומוזום X צבר או איבד חומר גנטי 3,9. סטיות מספריות של כרומוזום X שכיחות יותר מהפרעות מבניות ונגרמות לעיתים קרובות על ידי טעויות ספונטניות במהלך חלוקת התא 3,9. כאשר שגיאה כזו מתרחשת במהלך מיוזה, היא עלולה להוביל לגמטות אנאופלואידיות ובסופו של דבר לצאצאים עם סטיות כרומוזומליות בכל התאים. כאשר פגמים כרומוזומים מתעוררים בתאים סומטיים כתוצאה מטעויות המתרחשות במהלך מיטוזה בשלבים המוקדמים של האונטוגנזה, הדבר עלול להוביל למוזאיקה. אצל אנשים אלה, שני תאים עם תוכן כרומוזומלי X נורמלי ותאים עם סטיות כרומוזומליות X נמצאים.
בשנות ה-80 של המאה ה-20 פותחה שיטה ציטוגנטית הנקראת הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לדמיין ולאתר רצפים ספציפיים של חומצות גרעין על כרומוזומים מטא-פאזיים ובין-פאזיים10,11. טכניקה זו משתמשת בבדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית כדי להיקשר לרצף מסוים בכרומוזום, אשר לאחר מכן ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
כיום, FISH נמצא בשימוש נרחב ככלי אבחון קליני ונחשב לתקן הזהב באיתור סטיות כרומוזומליות10. בתחום רפואת הרבייה, ניתוח FISH על זרע שימש כדי לקבל תובנה לגבי התוכן כרומוזומלי X של זרעונים אצל גברים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות בתאים סומטיים12,13,14. מחקרים אלה הראו כי גברים עם סטיות כרומוזומליות היו בסיכון גבוה יותר להיות בעלי תדירות גבוהה יותר של זרעונים אנאופלואידים נוכחים בזרע שלהם בהשוואה לזכרים עם קריוטיפים נורמליים12,13,14.
בניגוד לזרעונים, מעט מאוד ידוע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה (כולל ביציות, תאי גרנולוסה/תקה ותאי סטרומה) אצל אנשים עם סטייה כרומוזומלית, כמו גם על ההשלכות האפשריות של אנופלואידיות של תאים אלה על פוטנציאל הרבייה שלהם. סיבה חשובה למידע המועט על הקריוטיפ של תאי השחלות בהשוואה לזרעונים היא העובדה שנשים צריכות לעבור הליך פולשני כגון ניקוב זקיק או ניתוח להשגת ביציות או רקמת קליפת השחלות. לכן, קשה להשיג גמטות נקביות למטרות מחקר.
כיום, מחקר התערבות תצפית מבוצע בהולנד כדי לחקור את היעילות של שימור בהקפאה של רקמת השחלות בנשים צעירות עם TS15. מקטע אחד של רקמת קליפת השחלות של המטופלת היה זמין לזיהוי התוכן כרומוזומלי X של תאי השחלה16,17. במסגרת המחקר פותחה שיטה חדשנית המבוססת על FISH של רקמת קליפת השחלות המנותקת כדי לקבוע אם קיימות סטיות כרומוזומליות בתאי שחלה בנקבות הנושאות סטייה כרומוזומלית בתאים סומטיים שאינם שחלתיים, כגון לימפוציטים או תאים בוקאליים. בנוסף, נקבעה גם השפעת האנאופלואידיות בתאי השחלה על פוליקולוגנזה. לשם כך שונה פרוטוקול FISH מבוסס המאפשר ניתוח של מקטעים היסטולוגיים ברקמת קליפת השחלות לאחר פוליקולוגנזה מלאכותית במהלך השתלת קסנו ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. במחקר זה אנו מציגים שתי שיטות המבוססות על FISH לקביעת התוכן הכרומוזומלי X בתאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת בנקבות עם סטיות כרומוזומליות X, במטרה לשפר את המדע הבסיסי בנושא זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול מחקר TurnerFertility אושר על ידי הוועדה המרכזית למחקר המערב נבדקים אנושיים (NL57738.000.16). במחקר זה התקבלה רקמת קליפת המוח השחלתית של 93 נשים עם TS. חומרים הדורשים אמצעי בטיחות מפורטים בטבלה 1.
טבלה 1: אמצעי בטיחות.
| חומר | הזארד | ||
| חומצה אצטית | כוויות עור חמורות וגירוי של מערכת הנשימה | ||
| קולגנאז | מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור | ||
| דאפי | מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור | ||
| DNase I | מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור | ||
| אתנול | דליק מאוד | ||
| פורמלדהיד | רעיל לאחר שאיפה, בליעה ומגע עם העור | ||
| פורממיד (בבדיקות פלואורסצנטיות) |
עלול לפגוע בילד שטרם נולד | ||
| ליבראסה | מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור | ||
| מתנול | דליק מאוד, רעיל בשאיפה, בליעה ומגע עם העור | ||
| נונידט P40 | מגרה את העור או העיניים | ||
| פפסין | מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור | ||
| פרוטאינאז K | קשיי נשימה לאחר שאיפה | ||
| קסילן | דליק מאוד, רעיל לאחר שאיפה ומגע עם העור. יש להימנע ממגע עם העיניים. | ||
טבלה 1: חומרים הדורשים אמצעי בטיחות.
1. דגים על תאי קליפת שחלה בודדים מבודדים
- דיסוציאציה של רקמת קליפת השחלות כדי להשיג תאים בודדים
- חתכו את רקמת קליפת השחלות המשומרת/מופשרת לחתיכות קטנות של כ-1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ באמצעות אזמל.
- לעכל אנזימטית את מקטעי הרקמה ב 4 מ"ל של מחומם מראש (37 ° C) L15 בינוני המכיל 0.1 מ"ג / מ"ל תערובת אנזימי דיסוציאציה רקמה, 10 מיקרוגרם / מ"ל DNase I, ו 1 מ"ג / מ"ל collagenase I מ C. histolyticum במשך מקסימום של 75 דקות ב 37 ° C. מקפצים את תערובת העיכול מעלה ומטה כל 15 דקות.
- עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת 4 מ"ל של L15 קר בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). שטפו את הרקמה המנותקת פעם אחת עם 8 מ"ל של מדיום L15 קר על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם והשהו מחדש ב 500 μL של מדיום L15 ללא מערבולות כדי למנוע נזק לתאים.
- מעבירים את תרחיף התא המכיל בעיקר תאי סטרומה בודדים וזקיקים קטנים (ביציות מוקפות בשכבה אחת של תאי גרנולוזה) לצלחת פטרי פלסטית ובוחנים את תרחיף התא תחת סטריאומיקרוסקופ (הגדלה פי 100).
- הרימו את הזקיקים הקטנים (<50 מיקרומטר) באופן ידני באמצעות פיפטה פלסטית של 75 מיקרומטר והעבירו את הזקיקים לטיפה של L15 בינוני בתוספת 10% FBS ב 4 °C כדי למנוע הצטברות של זקיקים. בצעו איסוף זקיקים למשך 30 דקות לכל היותר. כדי לשפר את התפשטות תאי הזקיקים לפני ניתוח FISH, להעביר את הזקיקים מטוהרים לתמיסה של 0.06% טריפסין, 1 מ"ג / מ"ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ו 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז לדגור במשך 20 דקות ב 37 ° C.
- להשיג תאי סטרומה השחלות מן ההשעיה התא קליפת המוח באמצעות פיפטה פלסטיק 75 מיקרומטר, תוך הקפדה מיוחדת כדי למנוע זיהום עם זקיקים קטנים.
- ניתוח FISH של תאי שחלה בודדים
- העבר את זקיקי השחלות המטופלים (מומלץ n = 5-20) עם טריפסין/EDTA/גלוקוז או תאי סטרומה (n > 1,000) לטיפות של 5 μL של 0.15 mM KCl/15 μL של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) על מגלשה ודגור במשך 20 דקות ב 37 ° C.
- יבשו וקיבעו מראש את המגלשות ב-300 מיקרוליטר של 0.05 mM KCl/7.5% חומצה אצטית/22.5% מתנול למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT). כסו את המגלשות במתנול/חומצה אצטית (3:1) למשך 2 דקות ב-RT כדי לסיים את הקיבוע.
- הכינו נתרן ציטראט סטנדרטי פי 20 (SSC) על ידי הוספת 876 גרם נתרן כלורי ו-441 גרם טרי-נתרן ציטראט דיהידרט ב-5 ליטר מים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף 100 מ"ל של SSC 20x ל 900 מ"ל של מים demineralized (demi) כדי לקבל 2x SSC. שטפו את הדגימה ב-2x SSC ב-73°C, כסו אותה ב-100 μL של 2% פרוטאינאז K, ואטמו אותה בכיסוי. דגרו על המגלשות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתחנת ההכלאה.
- הסר את הכיסוי ושטוף את המגלשות במשך 5 דקות ב- DPBS ב- RT. קבע את הדגימה למשך 5 דקות עם 1% פורמלדהיד ב- RT. בשלב זה, החומר עדיין אינו מחובר במלואו למגלשות הזכוכית ולכן אין להניחו על משטח ניעור.
- שטפו את המגלשות במשך 5 דקות ב-DPBS ב-RT, ולאחר מכן התייבשו ב-70%, 80%, 90% ו-100% אתנול למשך 2 דקות כל אחת. יבשו באוויר את הדגימה המיובשת והכליאו אותה עם בדיקות עם תווית פלואורסצנטית.
- בחר בדיקה ספציפית לצנטרומר עבור כרומוזום X ובדיקה צנטרומרית ספציפית לכרומוזום אחר כבקרה כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי השחלה. במקרה זה, נעשה שימוש בבדיקות ספציפיות לצנטרומרה עבור כרומוזום X (CEP X [DXZ1]) המסומן ישירות עם פלואורוכרום ספקטרוםירוק וכרומוזום 18 (CEP 18 [D18Z1]) המסומן ישירות עם פלואורוכרום ספקטרום.
- הוסף 1 μL של CEP X, 1 μL של CEP 18 ו- 18 μL של חיץ ההכלאה לדגימה ואטם עם מכסה המודבק לשקופיות כדי למנוע אידוי של הבדיקה במהלך הכלאה. העבר את המגלשות לתחנת ההכלאה לדנטורציה ב 73 ° C למשך 3 דקות, ואחריה הכלאה במהלך דגירה לילה ב 37 °C (77 °F).
- הסר את תלוש הכיסוי ואת כל הדבק שנותר מהמגלשה לאחר הכלאה. שטפו את המגלשות ב-0.4x SSC/0.3% Tween-20 ב-72°C למשך 2 דקות, ולאחר מכן דגירה למשך דקה אחת ב-2x SSC/0.1% Tween-20 ב-RT.
- יש לייבש את המגלשות על ידי דגירות עוקבות של 2 דקות ב-70%, 80%, 90% ו-100% אתנול ולייבש באוויר בחושך. כסו את השקופיות באמצעי הרכבה המכיל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). יש לשמור על טמפרטורה של -20°C למשך 10 דקות לפחות לפני ניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- דימות
- בחן את האותות עבור כרומוזום X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקושר לתוכנת עיבוד תמונה.
- ראשית, בחר DAPI פלואורוכרום.
- קבל תמונה על-ידי בחירה באפשרות New Cell > Live > Capture בהגדלה של 630x. יופיע חלון חדש עם הסף. הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.
- יופיע חלון חדש עם שיפור עם הצעה לכהה/בהיר יותר (12), רדיוס (3) ועומק (1). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה.
- שנית, בחר fluorochrome SpectrumOrange ולחץ על לכידה.
- הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.
- החלון עם השיפור יופיע עם הצעה לכהה/בהיר יותר (-11), רדיוס (2.7) ועומק (0.6). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה.
- לבסוף, בחר fluorochrome SpectrumGreen ולחץ על לכידה.
- הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.
- החלון עם השיפור יופיע עם הצעה לכהה/בהיר יותר (0), רדיוס (3) ועומק (0). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה. שמור את התמונה בקובץ חדש שנוצר.
הערה: תאים סומטיים הוערכו רק כאשר שני אותות של כרומוזום הביקורת 18 נראו. ברוב הביציות ניתן היה לזהות רק אות אחד לכל כרומוזום.
- ראשית, בחר DAPI פלואורוכרום.
- אחסן את השקופיות בחושך ב- 4 ° C לאחר ניתוח כדי למנוע אובדן אותות.
- בחן את האותות עבור כרומוזום X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקושר לתוכנת עיבוד תמונה.
2. דגים על קטעי פרפין ברקמת קליפת השחלות המושתלת
הערה: שבר אחד של רקמת קליפת המוח השחלתית המשומרת/מופשרת בהקפאה של 18 נקבות עם TS הושתל בעכברים משולבים חמורים (SCID) למשך 5 חודשים. הליך הקסנוגרפטינג תואר בעבר ונערך באוניברסיטה הקתולית של לוביין (בריסל, בלגיה) בהתאם להנחיות המקומיות של הוועדה לחקר בעלי חיים בנוגע לרווחת בעלי חיים (סימוכין 2014/UCL/MD/007)18,19.
- בחירת מקטעים של רקמת קליפת השחלות המכילה זקיקים
- קיבעו רקמת קליפת השחלות בפורמלדהיד 4% והטמיעו את הרקמה בפרפין. חותכים את הבלוקים עם אזמל כדי להסיר פרפין נוסף וחותכים את גוש הפרפין לעובי 4 מיקרומטר על מיקרוטום סיבוב.
- בחר כל חלק שביעי של סרט פרפין עבור צביעת hematoxylin ו eosin (HE) כדי לקבוע אילו חלקים מכילים זקיקים. שים את החלק באמבט מים ב 40-45 מעלות צלזיוס ולהרכיב אותם על שקופיות מיקרוסקופ immunohistochemistry.
- דה-פרפיניזציה וצביעת HE
- הניחו את המגלשות על כיריים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 60°C, ולאחר מכן טבלו את המגלשות ב-100% קסילן למשך 5 דקות. אין צורך למקם את המגלשות ישירות על הכיריים. לחות את החלקים עבור 15 s ב 100% אתנול, ואחריו 2 x 15 s ב 96% אתנול. שטפו את המגלשות במי ברז במשך 2 דקות.
- הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין למשך 10 דקות ולאחר מכן שטפו את המגלשות לזמן קצר במי ברז. לטבול בקצרה את שקופיות בתמיסת ביקרבונט (100 גרם של מגנזיום גופרתי ו 10 גרם של סודיום ביקרבונט ב 5 L של מים מזוקקים). שטפו את המגלשות במי ברז במשך 5 דקות.
- הכתימו את המגלשות באאוסין למשך 4 דקות וייבשו את המגלשות שלוש פעמים עם 100% אתנול, ולאחר מכן קסילן. מכסים את כתמי ה-HE בשקופיות ומעריכים את קטעי ה-HE תחת מיקרוסקופ אור כדי לבחור את המקטעים עם זקיקים (הגדלה פי 100).
- טיפול מקדים והכלאה של מקטעי פרפין לדגי DNA
- בחר מקטעים חדשים שהיו מונחים לפני או אחרי החלק שהכיל זקיקים מסרט הפרפין. הרכיבו קטע אחד על מגלשת זכוכית. יבשו את חלקי הפרפין למשך 45 דקות לפחות על כיריים בטמפרטורה של 56°C. אין צורך למקם את המגלשות ישירות על הכיריים.
- deparaffinize את החלקים ב xylene במשך 10 דקות. טבלו את המגלשות באתנול 99.5% ושטפו אותן במשך 5 דקות במי ברז. טפל מראש בשקופיות עם תמיסת אחזור מטרה (pH נמוך) למשך 10 דקות ב-96°C. לאחר הקירור, שטפו את המגלשות במים מזוקקים.
- טפל בשקופיות במשך 5 דקות עם חומצה הידרוכלורית 0.01 M, ולאחר מכן עיכול פפסין (200 U / mL) במשך 15 דקות ב 37 ° C. שטפו שוב את המגלשות בחומצה הידרוכלורית 0.01 M ולאחר מכן ב-PBS.
- קבעו את המגלשות בפורמלדהיד/PBS 1% למשך 5 דקות. שטפו את המגלשות לזמן קצר ב-PBS, ולאחר מכן שוב במי דמי. יש לייבש את המגלשות באתנול 99.5% ולתת להן להתייבש באוויר.
- בחר בדיקה ספציפית לצנטרומרה עבור כרומוזום X ובדיקה צנטרומרית ספציפית לכרומוזום אחר כבקרה כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה. כאן, כרומוזום 18 משמש כבקרה.
- יש למרוח 5 μL של בדיקה CEP 18 (D18Z1) המסומנת ישירות ב-fluorochrome SpectrumGreen ו-probe CEP X (DXZ1) המסומן ישירות ב-fluorochrome SpectrumRed על השקופיות שטופלו מראש. יש למרוח כיסוי ולאטום את האזור בדבק צילום. הניחו את המגלשות בהכלאה לדנטורציה ב-80°C למשך 10 דקות והכלאה למשך לילה ב-37°C.
- למחרת, שטפו את המגלשות במשך 5 דקות ב-2x SSC ב-42°C, ולאחר מכן שטיפה של 2 דקות ו-1 דקות ב-0.3% Nonidet P40 ב-73°C. רענן את 2x SSC ושטוף את המגלשות שוב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את הקובט כך שהחלקים נשמרים בחושך.
- שטפו את המגלשות לזמן קצר במים מזוקקים. יש לייבש את המגלשות באתנול 99.5% ולתת להן להתייבש שוב באוויר. לבסוף, טען את השקופיות עם פתרון המכיל DAPI ואמצעי הרכבה.
- דימות
- נתח את התוצאות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 630x. פתח את תוכנת עיבוד התמונה במחשב. בחר FISH כפרופיל.
- בדוק אם פליטת DAPI מוגדרת ל- 431 ננומטר והעירור ל- 359 ננומטר, פליטה אדומה של טקסס ב- 613 ננומטר ועירור ב- 595 ננומטר, ופליטת FITC ב- 519 ננומטר ועירור ב- 495 ננומטר.
- רכשו תמונה באמצעות בחירה באפשרות Live > Capture Single Image. מטב את איכות התמונה באמצעות התאמת החשיפה והרווח באמצעות הזזת מחוון החשיפה והרווח בתפריט 'תמונה ' משמאל (לדוגמה, חשיפה: 212 אלפיות השנייה והרווח: 7.9). החשיפה והרווח הנדרשים עשויים להשתנות בהתאם לתמונה; שימו לב לשינויים במהלך תהליך זה לקבלת תמונה ממוטבת. שמור את התמונה בקובץ חדש שנוצר.
- אחסן את השקופיות בחושך ב- 4 ° C לאחר ניתוח כדי למנוע אובדן אותות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דגים על תאי שחלה מבודדים לפני ההשתלה
רקמת קליפת השחלות בהקפאה מנקבות עם 45,X/46,XX (מטופלת A) או 45,X/46,XX/47,XXX (מטופלת B) TS שימשו להמחשת התוצאות באמצעות פרוטוקול זה. בחולה A, ל-50% מהלימפוציטים היה קריוטיפ 45,X ול-50% היה 46,XX. בחולה B, 38% מהלימפוציטים היו 45,X, 28% היו 46,XX ו-34% היו 47,XXX. בדיקות ספציפיות לצנטרומיר עבור כרומוזום X (ירוק) וכרומוזום 18 כביקורת (אדום) שימשו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה בודדים, תאי סטרומה וביציות שבודדו מרקמת קליפת השחלות של חולי TS ללא השתלת קסנו קודמת (איור 1).
איור 1: ניתוח FISH של תאי שחלה מבודדים מרקמת קליפת המוח השחלתית לפני ההשתלה. ביציות (ראשי חץ) ותאי גרנולוזה מזקיקים קדמוניים בודדים (A,B) ו-(C,D) תאי הסטרומה שמסביב נותחו באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות עבור כרומוזום X (אותות ירוקים) וכרומוזום ביקורת 18 (אותות אדומים). חצים לבנים מציינים 45,X קווי תא, חצים צהובים מציינים 46,XX קווי תאים וחצים אדומים מציינים 47,XXX קווי תא. לא כל האותות הפלואורסצנטיים נמצאים באותו מישור מיקוד. העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. ההגדלה של אותות FISH נקבעה על פי 630. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ההבדלים בין זקיקים קדמוניים בודדים שטופלו עם ובלי טריפסין לפני FISH מוצגים באיור 2. על ידי שימוש בטריפסין לפני ניתוח FISH, מסת תאי הגרנולוזה והביציות היו פחות גושיות, מה שאיפשר ניתוח של התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה וביציות בודדים. ניתן להבחין בקלות בין הדנ"א של הביציות לזה של תאי הגרנולוזה שמסביב בשל הצורה, הגודל והמראה הלא סדיר של הדנ"א מהביציות. בנוסף, רק אות FISH חזק אחד לכל כרומוזום נצפה בביציות של זקיקים קטנים, בשל הקרבה של ארבעת הכרומטידים האחיות בתאים אלה. ניתן לקבוע את תכולת כרומוזומלית X של ביציות באמצעות יחס פני השטח של אות FISH עבור כרומוזום X לזה של כרומוזום 18.
איור 2: זקיקים קטנים שטופלו עם ובלי טריפסין לפני FISH. (A) עיכול אנזימטי של רקמת קליפת המוח השחלתית הביא להשעיה של תאים מנותקים ברובם, אך הותיר את הזקיקים הקדמוניים, המורכבים מביצית שלמה המוקפת בשכבה אחת של תאי גרנולוזה (ראשי חץ בלוח A). (B) זקיקים קטנים נבחרו בקפידה מתרחיף התא, אך סיפקו קשיים בפענוח אותות לאחר FISH עקב התגבשות תאי גרנולוזה (C). (ד,ה) עיכול נוסף של הזקיקים המבודדים עם טריפסין לפני FISH גרם לתאי גרנולוזה בודדים להתכווץ למורפולוגיה כדורית על פני השטח של הזקיקים והיו בעלי סיכוי גבוה יותר להתנתק מהזקיק כדי להיות נגישים לניתוח FISH. אותות FISH שמקורם בביציות מסומנים על ידי חצים. פסים שחורים מייצגים 100 מיקרומטר ופסים לבנים מייצגים 10 מיקרומטר. ההגדלה של אותות FISH נקבעה על פי 630. לוח D שוחזר באישור Peek et al.16. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ניתוח FISH של תאי גרנולוזה על קטעי פרפין ברקמת קליפת השחלות המושתלת
זקיקים שניוניים ואנטרליים נמצאו פחות רגישים לעיכול אנזימטי, מה שהופך את השיטה שתוארה קודם לכן לדיסוציאציה של רקמות להשגת תאי שחלה בודדים שאינם מתאימים לגידול זקיקים הנמצאים ברקמת השחלה לאחר השתלת שחלות ארוכת טווח. לכן, פרוטוקול FISH עבר אופטימיזציה באמצעות מקטעים היסטולוגיים של 4 מיקרומטר כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה של זקיקים משניים ואנטרליים ברקמת קליפת המוח השחלתית לאחר ההשתלה (איור 3). במצב זה, אין זה סביר כי אות FISH של כרומוזום X או כרומוזום הבקרה בביציות יילכד בחתך יחיד של 4 מיקרומטר, בשל הקוטר הגדול של הביציות בזקיקים הגדלים.
איור 3: צביעה היסטולוגית ו-FISH של חלקי רקמת קליפת המוח השחלתית לאחר השתלת קסנו. (א,ב) צביעת Hematoxylin/eosin הראתה תקינות מורפולוגית של זקיקים משניים ואנטרליים ברקמת קליפת המוח השחלתית לאחר 5 חודשים של קסנוגרפטינג. (ג,ד) התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה של זקיקים אלה נקבע על ידי ניתוח FISH. באיור זה, כרומוזום X מוצג באדום וכרומוזום 18 בירוק. הסרגל בלוח A מייצג 50 מיקרומטר, הסרגל בלוח B מייצג 20 מיקרומטר, והעמודות בלוחות C ו- D מייצגות 10 מיקרומטר. ההגדלה של אותות FISH נקבעה על פי 630. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כצעד ראשון, ניסויים עם טכניקות קיבוע שונות של הרקמות בוצעו כדי לקבוע איזו שיטה מביאה את אותות FISH הטובים ביותר. ניתוח FISH בוצע על רקמה מושתלת שהייתה מקובעת הן בתמיסה של בואין ולאחר מכן טובלת בפורמלדהיד 4%, והן ברקמה מושתלת שהייתה מקובעת בפורמלדהיד 4% בלבד. רקמה מושתלת שהתקבעה לראשונה אצל בואין הציגה אובך ירוק על התמונה, מה שהקשה על ספירה מדויקת של מספר אותות ה-FISH (איור 4).
איור 4: רקמת קליפת המוח השחלתית המושתלת מקובעת בתמיסה של Bouin ופורמלדהיד בלבד. (A) קיבוע רקמת קליפת השחלות המושתלת בתמיסה של Bouin הביא לאותות פלואורסצנטיים מטושטשים ומוסתרים במידה רבה בתאים פוליקולריים עקב אובך ירוק. (B) רקמת קליפת המוח השחלתית שהייתה מקובעת בפורמלדהיד סיפקה רק אותות פלואורסצנטיים מצוינים שהיו קלים לפענוח. העמודות מייצגות 10 מיקרומטר. ההגדלה של אותות FISH נקבעה על פי 630. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
על מנת לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה של זקיקים בחתכים היסטולוגיים, לא ניתן פשוט לספור את אותות FISH של תאי גרנולוסה. חלק מהכרומוזומים של תא גרנולוזה בודד עלול ללכת לאיבוד בחלק היסטולוגי מסוים, עקב חתך הרקמה. לכן, יש צורך לקבוע תחילה את אחוז אותות FISH שאבדו עקב חתך לפני שבסופו של דבר לקבוע את אובדן התוכן כרומוזומלי X של אוכלוסיית תאי גרנולוזה עקב aneuploidy בזקיקים משניים ואנטראליים שנוצרו לאחרונה לאחר השתלת הרקמה.
ניתן לחשב את אחוז אותות ה-FISH שאבדו עקב חתך על ידי קביעת מספר אותות FISH לכל תא גרנולוזה של כרומוזום הבקרה הלא-אנופלואידי 18. צפוי כי אותו אחוז של כרומוזום X הולך לאיבוד עקב חתך. כל ירידה נוספת במספר אותות ה-FISH של כרומוזום X באוכלוסיית תאי הגרנולוזה נובעת מאנאופלואידיות. עם זאת, שימוש באותות FISH של כרומוזום ביקורת כדי לקבוע אובדן כרומוזומלי X עקב אנופלואידיות דורש רגישות לזיהוי של אותות FISH של כרומוזום X וכרומוזום הבקרה להיות דומה מאוד. לפיכך נקבעה רגישות הזיהוי של שתי בדיקות FISH בתאי גרנולוזה של זקיקים גדלים בחתכים היסטולוגיים של אנשים שאינם אנופלואידים 46,XX. כאשר היחס בין אותות כרומוזום X לכרומוזום ביקורת FISH קרוב ל-1, ניתן להניח כי רגישות הגילוי של שתי הבדיקות אכן דומה מאוד, וכי ניתן להשתמש בבדיקות FISH כדי לקבוע את רמת האנאופלואידיות באוכלוסיית תאי גרנולוזה של זקיקים גדלים במקטעים היסטולוגיים של רקמת השחלה לאחר השתלת קסנו.
דוגמה
כאשר מנתחים את מספר אותות כרומוזום 18 ב -130 תאי גרנולוזה של זקיק משחלה של אדם 46,XX, צפוי כי קיימים 260 אותות. עם זאת, בחתך של 4 מיקרומטר של תאים אלה, נצפו רק 204 אותות כרומוזום 18. זה מצביע על כך ש -21.5% מהאותות הולכים לאיבוד עקב חתך ((260-204)/260 x 100 = 21.5%). מספר אותות כרומוזום 18 לכל תא גרנולוזה מצטמצם אפוא ל 204/130 = 1.57 עקב חיתוך.
לאחר מכן, מספר כרומוזומי X בתאי גרנולוזה של זקיק אנטראלי לאחר השתלה ברקמת שחלה של נקבה עם TS מנותח. בסך הכל נספרו 191 אותות לכרומוזום X ו-199 אותות לכרומוזום 18. ניתן לקבוע את מספר תאי הגרנולוזה על ידי חלוקת המספר הכולל של אותות לכרומוזום 18 במספר האותות של כרומוזום 18 לכל תא גרנולוזה (199/1.57 = 127 תאי גרנולוזה). לבסוף, ניתן לקבוע את אחוז תאי הגרנולוזה 45,X על ידי חלוקת ההבדל באותות כרומוזום 18 וכרומוזום X עם מספר תאי הגרנולוזה (כלומר, [199-191]/127 x 100 = 6% מתאי הגרנולוזה הם 45,X, ו-94% מהתאים הללו הם 46, XX).
ראוי לציין כי בחולים עם קו תאים 47,XXX, ניתן לקבוע רק את האחוז המינימלי של תאי גרנולוזה עם קריוטיפ 47,XXX, שכן תערובת של 45,X ו 47,XXX תאי גרנולוזה יש את אותו מספר של אותות כרומוזום X כמו 46,XX תאי גרנולוזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח FISH הוא טכניקה ידועה לזיהוי סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים או תאי buccal של זכרים ונקבותכאחד 10. מספר מחקרים תיארו FISH על גמטות של זכרים עם סטיות כרומוזומליות X, אך מידע מפורט שהתקבל על ידי FISH על תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X עדיין חסר14. מאמר זה מציג שיטות חדשניות המבוססות על FISH כדי לקבוע אם אנופלואידיות קיימת בתאי השחלות של רקמת קליפת המוח השחלתית הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.
האתגר העיקרי של הפרוטוקול לבידוד תאי שחלה בודדים ברקמת קליפת השחלות שאינה מושתלת טמון בעיכול האנזימטי של הרקמה, הדורש תרגול מסוים מראש. על מנת לקבל אותות FISH מדויקים של מספיק תאי שחלה, חשוב לעקוב אחר השלבים לגבי עיכול אנזימטי, זמני דגירה, וטמפרטורות מסומנות בקפידה. חריגה מהפרוטוקול עלולה לגרום לאובדן משמעותי של תאי שחלה במהלך התהליך, ויש להימנע מכך במיוחד במטופלות שכבר יש להן רזרבה שחלתית נמוכה. צעד קריטי נוסף בשיטה זו הוא לטפל בזקיקים הקדמוניים המטוהרים עם טריפסין כדי למנוע מביציות וממסת תאי גרנולוזה מלהתגבש, מה שמונע ניתוח של תאים בודדים. ללא טיפול עם טריפסין, מספר תאי גרנולוזה בודדים שניתן לנתח באופן אמין על ידי FISH מופחת באופן חמור.
ניתוח FISH על רקמת קליפת השחלות שנלקחה לאחר השתלה ארוכת טווח דורש טכניקה שונה, מכיוון שרק זקיקים קטנים נמצאו רגישים מספיק לעיכול האנזימטי הדרוש להשגת תאי שחלה בודדים. בנוסף, בדומה להשתלה עצמית של רקמת קליפת השחלות, זקיקים רבים הולכים לאיבוד לאחר ההשתלה עקב היפוקסיה וחוסר חומרים מזינים לפני השתל הוא revascularized מספיק על ידי המארח20. לפיכך, מספר הזקיקים לאחר ההשתלה צפוי להיות נמוך משמעותית מאשר לפני ההשתלה. עבור טכניקת FISH זו המשמשת לחתכים היסטולוגיים, חשוב לקבע את הרקמה המושתלת בפורמלדהיד 4% רק כדי לקבל אותות FISH אופטימליים. קיבוע של רקמת קליפת המוח השחלתית בקיבוע של Bouin משמש באופן שגרתי במעבדה, ובעוד שזה נותן תוצאות מצוינות בשילוב עם צביעת HE סטנדרטית, קיבוע רקמה עם Bouin לפני FISH מוביל אותות פלואורסצנטיים חלשים ומטושטשים שקשה לפרש.
למרות שפרוטוקול זה הוכח כמוצלח בקביעת התוכן כרומוזומלי X של תאי השחלה, עדיין יש לו כמה מגבלות. מגבלה אחת היא שניתן להשתמש בשיטות אלה רק כדי לנתח את תאי השחלות של נקבות עם סטיות מספריות. ניתן לזהות סטיות מספריות באמצעות גשושיות המכוונות לרצפים חוזרים21. גשושיות אלה מבצעות הכלאה של רצפי זוגות בסיסים חוזרים מרובים באזור הצנטרומר, והתוצאה היא אותות הכלאה חזקים. לעומת זאת, סטיות מבניות יכולות להיות מזוהות רק על ידי שימוש בבדיקות כנגד רצפים בודדים ייחודיים. גשושיות אלה עוברות הכלאה לרצפים המתרחשים רק פעם אחת בגנום הפלואידי, והתוצאה היא אות FISH הרבה פחות חזק בהשוואה לסטיות מספריות. בשל אותות FISH חלשים יחסית אלה, קשה לקבוע כראוי את התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה אצל נקבות עם סטיות מבניות.
שנית, אותות FISH של ביציות של זקיקים קטנים ברקמה לא מושתלת קשים לניתוח, בשל קרבתם של ארבעת הכרומטידים האחיות בשלב המיוזה I22. רק אות הכלאה חזק אחד יהיה נוכח בביציות, ולכן לא ניתן פשוט לספור את מספר האותות בביציות כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X. במקום זאת, יש להשתמש ביחס פני השטח של אותות כרומוזום X ו-18 FISH כדי לקבוע את התוכן הכרומוזומלי X בתאים אלה. ניתן לקבוע זאת באופן מהימן רק אם אותות ה-FISH בביציות נוכחים בבירור.
יתר על כן, FISH על רקמה מושתלת יכול לשמש רק כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה מזקיקים משניים ואנטראלים, כמו זקיקים קטנים בחלקים היסטולוגיים של רקמה מושתלת יש רק כמה תאי גרנולוזה שניתן לנתח כראוי. בנוסף, לא ניתן לקבוע במדויק את תכולת כרומוזומלית X של הביציות בשיטה זו בשל הקוטר הגדול של הביציות.
לבסוף, עדיין מאתגר להשיג גמטות נקביות בהשוואה לגמטות זכריות מכיוון שנדרש ניתוח פולשני להשגת תאי שחלה או רקמת קליפת השחלות. לכן, סביר להניח ששיטות אלה ייושמו במסגרת מחקר.
לסיכום, ניתוח FISH של תאי שחלה של רקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X הוא טכניקה ייחודית ושימושית כדי לקבל תובנה לגבי התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה בקבוצה ספציפית זו. טכניקות אלה מראות כי שימור קריוגני של רקמת קליפת המוח השחלתית מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X אפשרי, וכי זקיקים קדמוניים שמורים בהקפאה מסוגלים לגדול לזקיקים משניים ואנטראלים. עם זאת, יש לזכור כי שתי השיטות נועדו להקל על מחקר עתידי בנקבות עם סטיות כרומוזומליות X, ואינן מיועדות לשמש ככלי אבחון לסינון תוצאות הרבייה של נקבות עם סטיות כרומוזומליות X בפרקטיקה הקלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים למרג'ו ואן בראקל, דומיניק סמיטס, גיום ואן דה זנדה, פטרישיה ואן קליף ומילאן אינטזאר על מומחיותם ועזרתם הטכנית. מקורות מימון: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ו-Ferring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A.
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
