Summary
Denne artikel præsenterer to metoder baseret på fluorescens in situ hybridisering til bestemmelse af X-kromosomindholdet i ovarieceller i ikke-podet og podet ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser.
Abstract
Millioner af mennesker verden over beskæftiger sig med spørgsmål vedrørende fertilitet. Nedsat fertilitet eller endda infertilitet kan skyldes mange forskellige årsager, herunder genetiske lidelser, hvoraf kromosomale abnormiteter er de mest almindelige. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en velkendt og hyppigt anvendt metode til at detektere kromosomafvigelser hos mennesker. FISH anvendes hovedsageligt til analyse af kromosomale abnormiteter i spermatozoer hos mænd med numeriske eller strukturelle kromosomale aberrationer. Desuden anvendes denne teknik også ofte hos kvinder til at detektere X-kromosomafvigelser, der vides at forårsage ovariedysgenese. Der mangler dog stadig oplysninger om X-kromosomindholdet i ovarieceller fra kvinder med X-kromosomafvigelser i lymfocytter og/eller bukkalceller.
Formålet med denne undersøgelse er at fremme grundforskning vedrørende X-kromosomafvigelser hos kvinder ved at præsentere to metoder baseret på FISH til at identificere X-kromosomindholdet i ovarieceller. For det første beskrives en metode til bestemmelse af X-kromosomindholdet i isolerede ovarieceller (oocytter, granulosaceller og stromale celler) i ikke-podet ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser. Den anden metode er rettet mod at evaluere virkningen af kromosomafvigelser på follikulogenese ved at bestemme X-kromosomindholdet i ovarieceller i nydannede sekundære og antrale follikler i ovarievæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser efter langvarig podning i immunkompromitterede mus. Begge metoder kan være nyttige i fremtidig forskning for at få indsigt i reproduktionspotentialet hos kvinder med X-kromosomafvigelser.
Introduction
Infertilitet er et sundhedsproblem i det mandlige eller kvindelige reproduktive system, der påvirker ca. 186 millioner individer i reproduktiv alderverden over 1. I mindst 35% af infertile par er infertilitet forårsaget af en lidelse i det kvindelige reproduktive system2. Der er mange faktorer, der kan forårsage kvindelig infertilitet, såsom genetiske faktorer, genitale abnormiteter, endokrin dysfunktion, inflammatoriske sygdomme og iatrogen behandling3.
Genetiske abnormiteter er til stede hos ca. 10% af infertile kvinder 4,5. Af alle genetiske abnormiteter er X-kromosomafvigelser den mest almindelige årsag til ovariedysgenese2. Flere undersøgelser har rapporteret, at X-kromosomafvigelser hos kvinder med Turners syndrom (TS) eller Triple X syndrom er forbundet med for tidlig ovariesvigt på grund af et accelereret tab af kimceller eller nedsat oogenese 6,7,8.
Aberrationer af X-kromosomet kan opdeles i: 1) numeriske aberrationer, hvor antallet af X-kromosomer er anderledes, men X-kromosomerne er intakte; og 2) strukturelle aberrationer, hvor X-kromosomet har fået eller mistet genetisk materiale 3,9. Numeriske aberrationer af X-kromosomet er mere almindelige end strukturelle abnormiteter og skyldes ofte spontane fejl under celledeling 3,9. Når en sådan fejl opstår under meiose, kan det føre til aneuploide gameter og i sidste ende til afkom med kromosomafvigelser i alle celler. Når kromosomdefekter opstår i somatiske celler som følge af fejl, der opstår under mitose i de tidlige stadier af ontogenese, kan det føre til mosaikisme. I disse individer er både celler med normalt X-kromosomindhold og celler med X-kromosomafvigelser til stede.
I 1980'erne blev en cytogenetisk teknik kaldet fluorescens in situ hybridisering (FISH) udviklet til at visualisere og lokalisere specifikke nukleinsyresekvenser på metafase og interfasekromosomer10,11. Denne teknik bruger fluorescerende mærkede DNA-sonder til at binde til en bestemt sekvens i kromosomet, som derefter kan visualiseres ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
I dag anvendes FISH i vid udstrækning som et klinisk diagnostisk værktøj og betragtes som guldstandarden til påvisning af kromosomafvigelser10. Inden for reproduktiv medicin er FISH-analyse på sædceller blevet brugt til at få indsigt i X-kromosomindholdet i spermatozoer hos mænd med numeriske eller strukturelle kromosomafvigelser i somatiske celler12,13,14. Disse undersøgelser viste, at mænd med kromosomafvigelser var mere tilbøjelige til at have en højere frekvens af aneuploide spermatozoer til stede i deres sæd sammenlignet med mænd med normale karyotyper12,13,14.
I modsætning til spermatozoer er meget lidt kendt om X-kromosomindholdet i ovarieceller (herunder oocytter, granulosa / theca-celler og stromale celler) hos personer med kromosomafvigelse samt de mulige konsekvenser af aneuploidier af disse celler på deres reproduktive potentiale. En vigtig årsag til den knappe information om karyotypen af ovarieceller sammenlignet med spermatozoer er, at kvinder skal gennemgå en invasiv procedure såsom en follikelpunktur eller operation for at opnå oocytter eller ovariebarkvæv. Kvindelige kønsceller er derfor vanskelige at skaffe til forskningsformål.
I øjeblikket udføres et observationsinterventionsstudie i Holland for at undersøge effekten af kryopræservering af ovarievæv hos unge kvinder med TS15. Et fragment af patientens ovariebarkvæv var tilgængeligt for at identificere X-kromosomindholdet i ovariecellerne16,17. Som en del af undersøgelsen blev der udviklet en ny metode baseret på FISH af dissocieret ovariebarkvæv for at bestemme, om kromosomafvigelser er til stede i ovarieceller hos kvinder, der bærer en kromosomafvigelse i ikke-ovariesomatiske celler, såsom lymfocytter eller bukkalceller. Derudover blev virkningen af aneuploidier i ovarieceller på follikulogenese også bestemt. Til dette formål blev en etableret FISH-protokol modificeret, der muliggør analyse af histologiske sektioner af ovariebarkvæv efter kunstigt induceret follikulogenese under langvarig xenotransplantation hos immunkompromitterede mus. I denne undersøgelse præsenterer vi to metoder baseret på FISH til at bestemme X-kromosomindholdet i ovarieceller i ikke-podet og podet ovariebarkvæv hos kvinder med X-kromosomafvigelser med det formål at forbedre grundvidenskaben om dette emne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
TurnerFertility-undersøgelsesprotokollen er godkendt af Central Committee on Research Involving Human Subjects (NL57738.000.16). I denne undersøgelse blev ovariebarkvævet hos 93 kvinder med TS opnået. Materialer, der kræver sikkerhedsforanstaltninger, er angivet i tabel 1.
Tabel 1: Sikkerhedsforanstaltninger.
| Materiale | Fare | ||
| Eddikesyre | Alvorlige hudforbrændinger og irritation af åndedrætssystemet | ||
| Collagenase | Irriterende for øjne, åndedrætsorganer og hud | ||
| DAPI | Irriterende for øjne, åndedrætsorganer og hud | ||
| DNase I | Irriterende for øjne, åndedrætsorganer og hud | ||
| Ethanol | Meget brandfarlig | ||
| Formaldehyd | Giftig efter indånding, indtagelse og hudkontakt | ||
| formamid (i fluorescensprober) |
Kan skade det ufødte barn | ||
| Liberase | Irriterende for øjne, åndedrætsorganer og hud | ||
| Methanol | Meget brandfarlig, giftig ved indånding, indtagelse og hudkontakt | ||
| Nonidet P40 | Irriterende for hud eller øjne | ||
| Pepsin | Irriterende for øjne, åndedrætsorganer og hud | ||
| Proteinase K | Åndedrætsbesvær efter indånding | ||
| Xylen | Meget brandfarlig, giftig efter indånding og hudkontakt. Undgå kontakt med øjnene. | ||
Tabel 1: Materialer, der kræver sikkerhedsforanstaltninger.
1. FISK på isolerede individuelle ovariebarkceller
- Dissociation af ovariebarkvæv for at opnå individuelle celler
- Det kryopræserverede/optøede æggebarkvæv skæres i små stykker på ca. 1 mm x 1 mm x 1 mm ved hjælp af en skalpel.
- Enzymatisk fordøjes vævsfragmenterne i 4 ml forvarmet (37 °C) L15-medium indeholdende 0,1 mg/ml vævsdissociationsenzymblanding, 10 μg/ml DNase I og 1 mg/ml collagenase I fra C. histolyticum i højst 75 minutter ved 37 °C. Pipet fordøjelsen blandes op og ned hvert 15. minut.
- Stop den enzymatiske fordøjelse ved at tilsætte 4 ml kold L15 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Det dissocierede væv vaskes én gang med 8 ml koldt L15-medium ved centrifugering ved 500 x g og resuspenderes i 500 μL L15-medium uden hvirvel for at undgå beskadigelse af cellerne.
- Cellesuspensionen, der hovedsageligt indeholder individuelle stromale celler og små follikler (oocytter omgivet af et enkelt lag granulosaceller) overføres til en petriskål af plast, og cellesuspensionen undersøges under stereomikroskop (100x forstørrelse).
- De små follikler (<50 μm) opsamles manuelt ved hjælp af en 75 μm plastpipette og folliklerne overføres til en dråbe L15-medium suppleret med 10 % FBS ved 4 °C for at forhindre aggregering af follikler. Udfør follikelopsamling i maksimalt 30 minutter. For at forbedre follikelcellespredningen før FISH-analyse overføres de rensede follikler til en opløsning af 0,06% trypsin, 1 mg / ml ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 1 mg / ml glucose og inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C.
- Udtag stromale celler fra æggestokkene fra cortexcellesuspensionen ved hjælp af en 75 μm plastpipette, idet der udvises særlig omhu for at undgå kontaminering med små follikler.
- FISH-analyse af individuelle ovarieceller
- De behandlede ovariefollikler (anbefalet n = 5-20) overføres med trypsin/EDTA/glucose eller stromale celler (n > 1.000) til dråber på 5 μL 0,15 mM KCl/15 μL Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) på et objektglas og inkuberes i 20 minutter ved 37 °C.
- Objektglassene tørres og præfikseres i 300 μL 0,05 mM KCl/7,5% eddikesyre/22,5% methanol i 2 minutter ved stuetemperatur (RT). Dæk diasene med methanol/eddikesyre (3:1) i 2 minutter ved RT for at afslutte fikseringen.
- Lav 20x standard natriumcitrat (SSC) ved at tilsætte 876 g natriumchlorid og 441 g tri-natriumcitratdihydrat i 5 liter destilleret vand. Derefter tilsættes 100 ml af 20x SSC til 900 ml demineraliseret (demi) vand for at opnå 2x SSC. Prøven vaskes i 2x SSC ved 73 °C, dækkes med 100 μL 2% proteinase K, og forsegles med en dækseddel. Inkuber diasene i 10 minutter ved 37 °C i hybridiseringsstationen.
- Fjern dæksedlen og vask diasene i 5 minutter i DPBS ved RT. Fastgør prøven i 5 minutter med 1% formaldehyd ved RT. På dette stadium er materialet endnu ikke helt fastgjort til glasskinnerne og bør derfor ikke placeres på en rysteplatform.
- Vask lysbillederne i 5 min i DPBS ved RT, efterfulgt af dehydrering i efterfølgende 70%, 80%, 90% og 100% ethanol i 2 min hver. Lufttør den dehydrerede prøve og hybridiser den med fluorescerende mærkede sonder.
- Vælg en centromerspecifik sonde til kromosom X og en anden kromosomspecifik centromerisk sonde som kontrol for at bestemme X-kromosomindholdet i ovarieceller. I dette tilfælde anvendes centromerspecifikke sonder til kromosom X (CEP X [DXZ1]) direkte mærket med fluorochrom SpectrumGreen og kromosom 18 (CEP 18 [D18Z1]) direkte mærket med fluorochrome SpectrumOrange.
- Der tilsættes 1 μL CEP X, 1 μL CEP 18 og 18 μL hybridiseringsbuffer til prøven og forsegles med et dæksel, der limes på objektglassene for at forhindre fordampning af sonden under hybridisering. Objektglassene overføres til hybridiseringsstationen til denaturering ved 73 °C i 3 minutter efterfulgt af hybridisering under en inkubation natten over ved 37 °C.
- Fjern dæksedlen og eventuel resterende lim fra diaset efter hybridisering. Vask objektglassene i 0,4x SSC/0,3% Tween-20 ved 72 °C i 2 min, efterfulgt af inkubation i 1 min i 2x SSC/0,1% Tween-20 ved RT.
- Dehydrer diasene ved efterfølgende 2 minutters inkubationer i 70%, 80%, 90% og 100% ethanol og lufttør i mørke. Objektglassene dækkes med et monteringsmedium, der indeholder 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Må opbevares ved -20 °C i mindst 10 minutter før analyse ved fluorescensmikroskopi.
- Imaging
- Undersøg signalerne for X-kromosomet med et fluorescensmikroskop, der er knyttet til et billedbehandlingssoftware.
- Vælg først fluorochrome DAPI.
- Hent et billede ved at vælge Ny celle > Live > Capture ved 630x forstørrelse. Et nyt vindue med tærsklen vises. Indstil den blå bjælke på tærsklen til 0 for at minimere baggrunden og den røde bjælke til maksimum (255) for at gøre signalerne lysere. Klik på Accepter.
- Et nyt vindue med forbedring vises med et forslag til mørkere/lysere (12), radius (3) og dybde (1). Brug de foreslåede værdier, eller juster dem, hvis du ikke er tilfreds.
- For det andet skal du vælge fluorochrome SpectrumOrange og klikke på Capture.
- Indstil den blå bjælke på tærsklen til 0 for at minimere baggrunden og den røde bjælke til maksimum (255) for at gøre signalerne lysere. Klik på Accepter.
- Vinduet med forbedring vises med et forslag til mørkere/lysere (-11), radius (2,7) og dybde (0,6). Brug de foreslåede værdier, eller juster dem, hvis du ikke er tilfreds.
- Til sidst skal du vælge fluorochrome SpectrumGreen og klikke på Capture.
- Indstil den blå bjælke på tærsklen til 0 for at minimere baggrunden og den røde bjælke til maksimum (255) for at gøre signalerne lysere. Klik på Accepter.
- Vinduet med forbedring vises med et forslag til mørkere/lysere (0), radius (3) og dybde (0). Brug de foreslåede værdier, eller juster dem, hvis du ikke er tilfredse. Gem billedet i en nyoprettet fil.
BEMÆRK: Somatiske celler blev kun evalueret, når to signaler fra kontrolkromosom 18 var synlige. I de fleste oocytter kunne der kun detekteres et signal for hvert kromosom.
- Vælg først fluorochrome DAPI.
- Opbevar objektglassene i mørke ved 4 °C efter analyse for at forhindre tab af signaler.
- Undersøg signalerne for X-kromosomet med et fluorescensmikroskop, der er knyttet til et billedbehandlingssoftware.
2. FISK på paraffinsektioner af podet ovariebarkvæv
BEMÆRK: Et fragment af kryokonserveret/optøet ovariebarkvæv fra 18 hunner med TS blev xenograferet i svære kombinerede immundeficiente (SCID) mus i 5 måneder. Proceduren for xenografting er tidligere beskrevet og blev gennemført på Université Catholique de Louvain (Bruxelles, Belgien) i overensstemmelse med de lokale retningslinjer fra Udvalget for Dyreforskning vedrørende dyrevelfærd (reference 2014/UCL/MD/007)18,19.
- Valg af sektioner af xenografted ovariecortexvæv indeholdende follikler
- Fiksér xenograferet ovariebarkvæv i 4% formaldehyd og indlejr vævet i paraffin. Trim blokkene med en skalpel for at fjerne ekstra paraffin, og skær paraffinblokken til 4 μm tykkelse på et rotationsmikrotom.
- Vælg hver syvende sektion af paraffinbåndet til hæmatoxylin og eosin (HE) farvning for at bestemme, hvilke sektioner der indeholder follikler. Sæt sektionen i et vandbad ved 40-45 °C og monter dem på immunohistokemiske mikroskopglas.
- Deparaffinisering og HE-farvning
- Sæt rutsjebanerne på et komfur i 10 min ved 60 °C, og nedsænk derefter diasene i 100% xylen i 5 min. Det er ikke nødvendigt at placere lysbillederne direkte på komfuret. Hydrat sektionerne i 15 s i 100% ethanol, efterfulgt af 2 x 15 s i 96% ethanol. Skyl rutsjebanerne i postevand i 2 min.
- Plet objektglassene i hæmatoxylin i 10 minutter, og skyl derefter objektglassene kortvarigt i postevand. Nedsænk forsigtigt diasene i en bicarbonatopløsning (100 g magnesiumsulfat og 10 g natriumbicarbonat i 5 liter destilleret vand). Skyl rutsjebanerne i postevand i 5 min.
- Modbejd objektglassene med eosin i 4 minutter og dehydrer diasene tre gange med 100% ethanol efterfulgt af xylen. Dæk HE-pletterne på diasene, og evaluer HE-sektionerne under et lysmikroskop for at vælge sektionerne med follikler (100x forstørrelse).
- Forbehandling og hybridisering af paraffinsektioner til DNA FISH
- Vælg nye sektioner, der lå før eller efter den sektion, der indeholdt follikler fra paraffinbåndet. Monter en sektion på et glasglas. Paraffinsektionerne tørres i mindst 45 minutter på komfuret ved 56 °C. Det er ikke nødvendigt at placere lysbillederne direkte på komfuret.
- Afparaffiniser sektionerne i xylen i 10 min. Dyp diasene i 99,5% ethanol og skyl dem i 5 min i postevand. Forbehandl objektglassene med målhentningsopløsning (lav pH) i 10 minutter ved 96 °C. Efter afkøling skylles diasene i destilleret vand.
- Behandl objektglassene i 5 minutter med 0,01 M saltsyre, efterfulgt af pepsinfordøjelse (200 E/ml) i 15 minutter ved 37 °C. Objektglassene skylles igen i 0,01 M saltsyre og derefter i PBS.
- Fastgør objektglassene i 1% formaldehyd/PBS i 5 min. Skyl objektglassene kort i PBS og derefter igen i demivand. Dehydrer objektglassene i 99,5% ethanol og lad dem lufttørre.
- Vælg en centromerspecifik sonde til kromosom X og en anden kromosomspecifik centromerisk sonde som kontrol for at bestemme X-kromosomindholdet i granulosaceller. Her bruges kromosom 18 som kontrol.
- Påfør 5 μL sonde CEP 18 (D18Z1) direkte mærket med fluorochrom SpectrumGreen og sonde CEP X (DXZ1) direkte mærket med fluorochrom SpectrumRed på de forbehandlede dias. Påfør en dæksel og forsegl området med fotolim. Anbring diasene i en hybridisator til denaturering ved 80 ° C i 10 minutter og hybridisering natten over ved 37 ° C.
- Næste dag skylles diasene i 5 min i 2x SSC ved 42 °C, efterfulgt af en 2 min og en 1 min skylning i 0,3% Nonidet P40 ved 73 °C. Opdater 2x SSC og skyl diasene igen i 5 minutter ved stuetemperatur. Dæk kuvetten, så sektionerne holdes i mørke.
- Skyl rutsjebanerne kort i destilleret vand. Dehydrer objektglassene i 99,5% ethanol og lad dem lufttørre igen. Til sidst monteres gliderne med en opløsning, der indeholder DAPI og monteringsmedium.
- Imaging
- Analyser resultaterne under et fluorescensmikroskop ved 630x forstørrelse. Åbn billedbehandlingssoftwaren på computeren. Vælg FISH som profil.
- Kontroller, om DAPI-emissionen er indstillet til 431 nm og excitationen ved 359 nm, Texas rød emission ved 613 nm og excitation ved 595 nm og FITC-emission ved 519 nm og excitation ved 495 nm.
- Hent et billede ved at vælge Live > Capture Single Image. Optimer billedkvaliteten ved at justere eksponeringen og forstærkningen ved at flytte skyderen Eksponering og forstærkningsskyderen i menuen Billede til venstre (f.eks. eksponering: 212 ms og forstærkning: 7,9). Den krævede eksponering og forstærkning kan variere pr. billede; Overhold ændringerne under denne proces for at få et optimeret billede. Gem billedet i en nyoprettet fil.
- Opbevar objektglassene i mørke ved 4 °C efter analyse for at forhindre tab af signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FISH på isolerede ovarieceller før podning
Kryopræserveret ovariebarkvæv fra kvinder med 45,X/46,XX (patient A) eller 45,X/46,XX/47,XXX (patient B) TS blev anvendt til at illustrere resultaterne ved hjælp af denne protokol. Hos patient A havde 50 % af lymfocytterne en karyotype på 45,X og 50 % havde 46,XX. Hos patient B var 38 % af lymfocytterne 45,X, 28 % 46,XX og 34 % 47,XXX. Centromerspecifikke sonder til kromosom X (grøn) og kromosom 18 som kontrol (rød) blev brugt til at bestemme X-kromosomindholdet i individuelle granulosaceller, stromale celler og oocytter isoleret fra ovariebarkvæv hos TS-patienter uden forudgående xenotransplantation (figur 1).
Figur 1: FISH-analyse af isolerede ovarieceller fra ovariebarkvæv før podning. Oocytter (pilehoveder) og granulosaceller fra enkelte primordiale follikler (A, B) og (C, D) de omgivende stromale celler blev analyseret med fluorescerende specifikke sonder til kromosom X (grønne signaler) og kontrolkromosom 18 (røde signaler). Hvide pile angiver 45,X cellelinjer, gule pile angiver 46,XX cellelinjer, og røde pile angiver 47,XXX cellelinjer. Ikke alle fluorescerende signaler er i samme fokusplan. Barer repræsenterer 10 μm. Forstørrelsen af FISH-signaler blev sat til 630x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Forskellene mellem individuelle primordiale follikler, der blev behandlet med og uden trypsin før FISH, er vist i figur 2. Ved at anvende trypsin før FISH-analysen blev granulosacellemassen og oocytterne mindre klumpede, hvilket tillod analyse af X-kromosomindholdet i individuelle granulosaceller og oocytter. DNA fra oocytter kan let skelnes fra de omgivende granulosaceller på grund af den uregelmæssige form, størrelse og diffuse udseende af DNA fra oocytterne. Derudover observeres kun et stærkt FISH-signal for hvert kromosom i oocytterne i små follikler på grund af nærheden af de fire søsterkromatider i disse celler. X-kromosomindholdet i oocytter kan bestemmes ved at anvende overfladeforholdet mellem FISH-signalet for kromosom X og det for kromosom 18.
Figur 2: Små follikler behandlet med og uden trypsin før FISH. (A) Enzymatisk fordøjelse af ovariebarkvæv resulterede i en suspension af stort set dissocierede celler, men forlod de oprindelige follikler, der består af en intakt oocyt omgivet af et enkelt lag granulosaceller (pilehoveder i panel A). (B) Små follikler blev håndplukket fra cellesuspensionen, men gav vanskeligheder med at fortolke signaler efter FISH på grund af sammenklumpning af granulosaceller (C). (D,E) Yderligere fordøjelse af de isolerede follikler med trypsin før FISH resulterede i, at individuelle granulosaceller trak sig sammen til en sfærisk morfologi på overfladen af folliklerne og var mere tilbøjelige til at adskille sig fra folliklen for at blive tilgængelig for FISH-analyse. Oocytafledte FISH-signaler er angivet med pile. Sorte søjler repræsenterer 100 μm og hvide søjler repræsenterer 10 μm. Forstørrelsen af FISH-signaler blev sat til 630x. Panel D er gengivet med tilladelse fra Peek et al.16. Klik her for at se en større version af dette tal.
FISH-analyse af granulosaceller på paraffinsektioner af podet ovariebarkvæv
Sekundære og antrale follikler viste sig at være mindre modtagelige for enzymatisk fordøjelse, hvilket gør den tidligere beskrevne metode til vævsdissociation til opnåelse af individuelle ovarieceller ikke egnet til dyrkning af follikler, der findes i ovarievævet efter langvarig xenografting. Derfor blev FISH-protokollen optimeret ved hjælp af 4 μm histologiske sektioner til bestemmelse af X-kromosomindholdet af granulosaceller i sekundære og antrale follikler i ovariebarkvæv efter podning (figur 3). I denne indstilling er det usandsynligt, at FISH-signalet fra enten X-kromosomet eller kontrolkromosomet i oocytter ville blive fanget i en enkelt 4 μm sektion på grund af den store diameter af oocytter i de voksende follikler.
Figur 3: Histologisk og FISH-farvning af ovariebarkvævssektioner efter xenotransplantation. (A,B) Hæmatoxylin / eosinfarvning viste morfologisk normale sekundære og antrale follikler i ovariebarkvæv efter 5 måneders xenografting. (C,D) X-kromosomindholdet af granulosaceller i disse follikler blev bestemt ved FISH-analyse. I denne figur er kromosom X vist i rødt og kromosom 18 i grønt. Søjlen i panel A repræsenterer 50 μm, bjælken i panel B repræsenterer 20 μm, og søjlerne i panel C og D repræsenterer 10 μm. Forstørrelsen af FISH-signaler blev sat til 630x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Som et første skridt blev eksperimenter med forskellige fikseringsteknikker af vævene udført for at bestemme, hvilken metode der resulterer i de bedste FISH-signaler. FISH-analyse blev udført på podet væv, der blev fikseret i både Bouins opløsning og efterfølgende nedsænket i 4% formaldehyd, og på podet væv, der kun blev fikseret i 4% formaldehyd. Podet væv, der først blev fikseret i Bouin's, viste en grøn dis på billedet, hvilket gjorde det vanskeligt at tælle antallet af FISH-signaler nøjagtigt (figur 4).
Figur 4: Podet ovariebarkvæv fikseret i Bouins opløsning og formaldehyd kun . (A) Fiksering af podet ovariebarkvæv i Bouins opløsning resulterede i slørede og stort set skjulte fluorescerende signaler i follikulære celler på grund af en grøn dis. (B) Ovariebarkvæv, der var fikseret i formaldehyd, gav kun fremragende fluorescerende signaler, der var lette at fortolke. Barer repræsenterer 10 μm. Forstørrelsen af FISH-signaler blev sat til 630x. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at bestemme X-kromosomindholdet af granulosaceller af follikler i histologiske sektioner er det ikke muligt blot at tælle FISH-signalerne fra granulosaceller. En del af kromosomerne i en individuel granulosacelle kan gå tabt i et bestemt histologisk afsnit på grund af sektionering af vævet. Derfor er det nødvendigt først at bestemme procentdelen af FISH-signaler, der går tabt på grund af sektionering, før man i sidste ende bestemmer tabet af X-kromosomalt indhold i granulosacellepopulationen på grund af aneuploidier i nydannede sekundære og antrale follikler efter podning af vævet.
Procentdelen af tabte FISH-signaler på grund af sektionering kan beregnes ved at bestemme antallet af FISH-signaler pr. granulosacelle i det ikke-aneuploide kontrolkromosom 18. Det forventes, at den samme procentdel af X-kromosomet går tabt på grund af sektionering. Enhver yderligere reduktion i antallet af X-kromosom FISH-signaler i granulosacellepopulationen skyldes aneuploidi. Brug af FISH-signaler fra et kontrolkromosom til bestemmelse af X-kromosomtab på grund af aneuploidi, kræver imidlertid, at detektionsfølsomheden af FISH-signalerne i X-kromosomet og kontrolkromosomet er meget ens. Detektionsfølsomheden af begge FISH-sonder i granulosaceller af voksende follikler i histologiske sektioner af ikke-aneuploide 46,XX individer blev derfor bestemt. Når forholdet mellem kromosom X/kontrolkromosom FISH-signaler er tæt på 1, kan det antages, at begge sonders detektionsfølsomhed faktisk er meget ens, og at FISH-sonderne således kan bruges til at bestemme niveauet af aneuploidier i granulosacellepopulationen af voksende follikler i histologiske sektioner af ovarievæv efter xenotransplantation.
Eksempel
Når man analyserer antallet af kromosom 18-signaler i 130 granulosaceller i en follikel fra en æggestok på et 46,XX-individ, forventes det, at 260 signaler er til stede. I en 4 μm sektion af disse celler blev der imidlertid kun observeret 204 kromosom 18 signaler. Dette indikerer, at 21,5% af signalerne går tabt på grund af sektionering ((260-204)/260 x 100 = 21,5%). Antallet af kromosom 18-signaler pr. granulosacelle reduceres derfor til 204/130 = 1,57 på grund af sektionering.
Dernæst analyseres antallet af X-kromosomer i granulosaceller af en antral follikel efter podning i ovarievæv hos en kvinde med TS. I alt blev der talt 191 signaler for kromosom X og 199 signaler for kromosom 18. Antallet af granulosaceller kan bestemmes ved at dividere det samlede antal signaler for kromosom 18 med antallet af kromosom 18 signaler pr. granulosacelle (199/1,57 = 127 granulosaceller). Endelig kan procentdelen af 45,X granulosaceller bestemmes ved at dividere forskellen i kromosom 18 og kromosom X-signaler med antallet af granulosaceller (dvs. [199-191] / 127 x 100 = 6% af granulosacellerne er 45,X, og 94% af disse celler er 46, XX).
Det er bemærkelsesværdigt, at det hos patienter med en 47,XXX cellelinje kun er muligt at bestemme den mindste procentdel af granulosaceller med en 47,XXX karyotype, da en blanding af 45,X og 47,XXX granulosaceller har det samme antal X-kromosomsignaler som 46,XX granulosaceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FISH-analyse er en velkendt teknik til påvisning af X-kromosomafvigelser i lymfocytter eller bukkalceller hos både mænd og kvinder10. Flere undersøgelser har beskrevet FISH på kønsceller hos mænd med X-kromosomafvigelser, men detaljerede oplysninger opnået af FISH om ovarieceller fra kvinder med X-kromosomafvigelser mangler stadig14. Denne artikel præsenterer nye metoder baseret på FISH til at bestemme, om aneuploidier er til stede i ovariecellerne i ikke-podet og podet ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser.
Den største udfordring ved protokollen til isolering af individuelle ovarieceller i ikke-podet ovariebarkvæv ligger i den enzymatiske fordøjelse af vævet, hvilket kræver en vis praksis på forhånd. For at opnå nøjagtige FISH-signaler om tilstrækkelige ovarieceller er det vigtigt at følge trinene vedrørende enzymatisk fordøjelse, inkubationstider og angivne temperaturer strengt. Afvigelse fra protokollen kan forårsage et betydeligt tab af ovarieceller under processen, og dette bør især undgås hos patienter, der allerede har en lav ovariereserve. Et andet kritisk trin i denne metode er at behandle de rensede primordiale follikler med trypsin for at forhindre oocytter og granulosacellemassen i at klumpe sammen, hvilket udelukker analysen af individuelle celler. Uden behandling med trypsin reduceres antallet af individuelle granulosaceller, der pålideligt kan analyseres af FISH, alvorligt.
FISH-analysen på ovariebarkvæv udtaget efter langvarig podning kræver en anden teknik, da kun små follikler viste sig at være tilstrækkeligt modtagelige for den enzymatiske fordøjelse, der er nødvendig for at opnå individuelle ovarieceller. I lighed med autotransplantation af ovariebarkvæv går mange follikler desuden tabt efter podning på grund af hypoxi og mangel på næringsstoffer, før transplantatet er tilstrækkeligt revaskulariseret af værten20. Antallet af follikler efter podning forventes derfor at være betydeligt lavere end før podning. For denne FISH-teknik, der anvendes til histologiske sektioner, er det vigtigt kun at fiksere det podede væv i 4% formaldehyd for at opnå optimale FISH-signaler. Fiksering af ovariebarkvæv i Bouins fikseringsmiddel anvendes rutinemæssigt i laboratoriet, og selvom dette giver fremragende resultater, når det kombineres med standard HE-farvning, fører fiksering af væv med Bouins før FISH til svage og slørede fluorescerende signaler, der er vanskelige at fortolke.
Selvom denne protokol har vist sig at være vellykket til bestemmelse af X-kromosomindholdet i ovarieceller, har den stadig nogle begrænsninger. En begrænsning er, at disse metoder kun kan bruges til at analysere ovariecellerne hos kvinder med numeriske aberrationer. Numeriske aberrationer kan detekteres ved hjælp af sonder rettet mod gentagne sekvenser21. Disse sonder hybridiserer flere gentagne baseparsekvenser i centromerregionen, hvilket resulterer i stærke hybridiseringssignaler. I modsætning hertil kan strukturelle aberrationer kun detekteres ved hjælp af sonder mod unikke enkeltsekvenser. Disse sonder hybridiseres til sekvenser, der kun forekommer én gang i det haploide genom, hvilket resulterer i et betydeligt mindre intenst FISH-signal sammenlignet med numeriske aberrationer. På grund af disse relativt svage FISH-signaler er det vanskeligt korrekt at bestemme X-kromosomindholdet i ovarieceller hos kvinder med strukturelle aberrationer.
For det andet er FISH-signaler af oocytter af små follikler i ikke-podet væv vanskelige at analysere på grund af nærheden af de fire søsterkromatider i profasen af meiose I22. Kun et stærkt hybridiseringssignal vil være til stede i oocytterne, og derfor er det ikke muligt blot at tælle antallet af signaler i oocytterne for at bestemme X-kromosomindholdet. I stedet skal overfladeforholdet mellem kromosom X og 18 FISH-signaler bruges til at bestemme X-kromosomindholdet i disse celler. Dette kan kun bestemmes pålideligt, hvis FISH-signalerne i oocytterne er tydeligt til stede.
Desuden kan FISH på podet væv kun bruges til at bestemme X-kromosomindholdet i granulosaceller fra sekundære og antrale follikler, da små follikler i histologiske sektioner af podet væv kun har få granulosaceller, der kan analyseres korrekt. Derudover kan X-kromosomindholdet i oocytter ikke bestemmes nøjagtigt ved anvendelse af denne metode på grund af oocytternes store diameter.
Endelig er det fortsat udfordrende at opnå kvindelige kønsceller sammenlignet med mandlige kønsceller, fordi invasiv kirurgi er nødvendig for at opnå ovarieceller eller ovariebarkvæv. Derfor er disse metoder mest tilbøjelige til at blive anvendt i en forskningsindstilling.
Afslutningsvis er FISH-analyse af ovarieceller af ikke-podet og podet ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser en unik og nyttig teknik til at få indsigt i X-kromosomindholdet i ovarieceller i denne specifikke gruppe. Disse teknikker viser, at kryopræservering af ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser er mulig, og at kryopræserverede primordiale follikler er i stand til at vokse til sekundære og antrale follikler. Det skal dog huskes, at begge metoder er beregnet til at lette fremtidig forskning hos kvinder med X-kromosomafvigelser og ikke er designet til at blive brugt som et diagnostisk værktøj til at screene reproduktive resultater hos kvinder med X-kromosomafvigelser i klinisk praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef og Milan Intezar for deres ekspertise og tekniske bistand. Finansieringskilder: Merck Serono (A16-1395), Goodlife og Ferring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A.
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
