Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

قياس نشاط كاسباز باستخدام مقايسة الفلورومترية أو قياس التدفق الخلوي

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64745
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Experimental Immunology, University of Zürich

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقتين لقياس نشاط الكاسباس من خلال ركيزة فلورية باستخدام قياس التدفق الخلوي أو مقياس الطيف الفلوري.

Abstract

لا يزال تنشيط بروتياز السيستين ، المعروف باسم caspases ، عملية مهمة في أشكال متعددة من موت الخلايا. Caspases هي المبادرين والجلادين الحرجة لموت الخلايا المبرمج ، وهو الشكل الأكثر دراسة لموت الخلايا المبرمج. يحدث موت الخلايا المبرمج أثناء العمليات التنموية وهو حدث ضروري في توازن الأنسجة. Pyroptosis هو شكل آخر من أشكال موت الخلايا التي تستخدم caspases وهي عملية حاسمة في تنشيط الجهاز المناعي من خلال تنشيط الالتهاب ، مما يؤدي إلى إطلاق أفراد عائلة interleukin-1 (IL-1). لتقييم نشاط caspase ، يمكن تقييم الركائز المستهدفة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الحساسية مشكلة عند فحص الخلايا المفردة أو النشاط منخفض المستوى. نوضح كيف يمكن استخدام الركيزة الفلورية مع مقايسة سكانية أو مقايسة أحادية الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. مع الضوابط المناسبة ، يمكن استخدام تسلسلات مختلفة من الأحماض الأمينية لتحديد الكاسباس النشط. باستخدام هذه المقايسات ، تم تحديد الخسارة المتزامنة لمثبطات بروتينات موت الخلايا المبرمج عند تحفيز عامل نخر الورم (TNF) ، والذي يؤدي في المقام الأول إلى موت الخلايا المبرمج في الضامة بدلا من الأشكال الأخرى لموت الخلايا.

Introduction

تشارك Caspases في عدة أشكال من موت الخلايا المبرمج. موت الخلايا المبرمج هو الشكل الأكثر دراسة لموت الخلايا المبرمج ويرتبط بنشاط الكاسباز1. تمتلك جميع الكاسباس وحدة فرعية تحفيزية كبيرة وصغيرة. يمتلك Caspase-1 و caspase-4 و caspase-5 و caspase-9 و caspase-11 مجال تنشيط وتجنيد caspase (CARD) ، ويحتوي caspase-8 و caspase-10 على مجالات مستجيب الموت (DED) 2،3،4،5 (الجدول 1). يمكن أن يبدأ موت الخلايا المبرمج من خلال مسارين رئيسيين: المسار الخارجي والمسار الداخلي. يتم تشغيل مسار موت الخلايا المبرمج الخارجي بواسطة مستقبلات الموت ، والتي تعد جزءا من عائلة عامل نخر الورم (TNFSF). تمتلك مستقبلات الموت مجالات DED ، مما يسهل نشاط caspase-86. يتضمن مسار موت الخلايا المبرمج الجوهري تنشيط caspase-9 بعد تكوين apoptosome ، مما يتطلب إطلاق السيتوكروم c و Apaf-17. يؤدي تنشيط أي من كاسباز البادئ أو كاسباس -8 أو كاسباس -9 إلى الانقسام والتنشيط اللاحق لكاسباس الجلاد ، وهي كاسباس -3 وكاسباس -6 وكاسباس -7. يشير تحديد أن كاسباس الجلاد نشط إلى أن الخلايا تخضع لموت الخلايا المبرمج ، ويعتبر هذا التنشيط عاملا مهما في تحديد طريقة موت الخلايا.

يعد تنشيط Caspase أيضا منعطفا حاسما لتنظيم الالتهاب وتحريض أشكال بديلة من موت الخلايا المبرمج. على سبيل المثال ، يؤدي تنشيط caspase-1 إلى نضوج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في عائلة interleukin-18. ينتج إطلاق وتنشيط السيتوكينات من هذه العائلة ، وخاصة IL-1β و IL-18 ، عن انشقاق gasdermin D وتكوين المسام في غشاء البلازما 9,10. يمكن أن يؤدي الإصلاح غير الكافي لغشاء مسام gasdermin D إلى نوع من موت الخلايا يعرف باسم pyroptosis11. علاوة على ذلك ، يؤدي نشاط caspase-8 إلى تثبيط موت الخلايا المستقلة عن caspase المعروف باسم necroptosis12. يعد بروتين سيرين / ثريونين كيناز 1 (RIPK1) المتفاعل مع المستقبلات أحد العوامل الحاسمة في التنخر وفي الالتهاب الدافع الذي ينظمه NF-kB. أظهرت النماذج أن RIPK1 مشقوق بواسطة caspase-8 ، مما يؤدي إلى الحد من إشارات NF-kB ، وموت الخلايا المبرمج ، والتنخر13،14. لذلك ، يمكن أن يساعد تحديد نشاط الكاسباسات المختلفة في فهم الالتهاب الناتج وطريقة موت الخلايا.

بغض النظر عن وظيفة الكاسباز في تنظيم طرق موت الخلايا ، يمكن لنشاط الكاسباز أيضا تنظيم عائلات السيتوكينات الأخرى ، مثل الإنترفيرون (IFN) ، استجابة للعدوى15,16. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك الكاسباز في وظائف الموت غير الخلوي ، بما في ذلك قرارات مصير الخلية ، وإصلاح الأنسجة وتجديدها ، وتكوين الأورام من خلال إصلاح الحمض النووي ، ووظيفة المشبك العصبي. يعتقد أن نشاط الكاسباز في هذه الأدوار غير القاتلة محدود بسبب التوطين الخلوي وكمية الكاسباز. لذلك ، فإن تحديد مستوى نشاط الكاسباز قد يحدد جيدا ما إذا كانت الخلية تخضع لموت الخلية أو ما إذا كان الكاسباز يلعب دورا في وظيفة موت غير الخلية4،17،18.

يمكن تقييم نشاط Caspase بطرق متعددة. تم استخدام النشاف الغربي للكاسباس المشقوق وركائزها كمؤشر للنشاط ، ولكن هذه المقايسات نوعية في أحسن الأحوال. لتحديد ما إذا كان نشاط الكاسباز مرتبطا بموت الخلايا ، يكون القياس الكمي مثاليا. نظرا لأن الكاسباس يشق ركائز في موقع التعرف الذي يتكون من أربعة أحماض أمينية ، فقد تم تطوير طرق قياس الألوان أو التلألؤ أو القياس الفلوري. ومع ذلك ، يبدو أن الكاسباز لديه مرونة في التعرف على الركيزة 19,20. لا يرتبط تسلسل التعرف بمجالات البروتين (الجدول 1). ومع ذلك ، يمكن استخدام تسلسل رباعي الببتيد DEVD للكشف عن نشاط caspase-3 و caspase-720,21.

محاكيات Smac هي مركبات تستهدف مثبطات بروتينات موت الخلايا المبرمج (IAPs). يؤدي استخدام محاكيات Smac في مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية إلى أن تصبح الخلايا حساسة لموت الخلايا الناجم عن عامل نخر الورم22. في الضامة الأولية ، تسبب محاكيات Smac موت الخلايا دون إضافة خارجية لعامل نخر الورم23,24. يؤدي فقدان cIAP1 عن طريق التحلل الناجم عن محاكاة Smac إلى إنتاج عامل نخر الورم. إذا تم الكشف عن نشاط caspase ، فهذا يعني أن الخلايا لم تموت عن طريق necroptosis ولكن بطريقة موت الخلايا المبرمج. في هذه الطريقة ، يتم استخدام الكشف عن ركيزة DEVD المشقوقة لتحديد نشاط caspase-3 / caspase-7. تم نشر المزيد من التجارب لتأكيد موت الخلايا المبرمج سابقا24.

Protocol

تم إجراء الدراسة الحالية بموافقة واتباع إرشادات لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة زيورخ (#ZH149/19). تم استخدام ذكور الفئران C57Bl / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 8-16 أسبوعا ، والتي تم تربيتها وإيواؤها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، في هذه الدراسة. يمكن الاحتفاظ بالعظام السليمة على الجليد في محلول هانك الملحي المعقم (HBSS) مع مصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 2٪ (FBS). تم جمع نخاع العظم من عظم الفخذ والساق للفأر25 في يوم التمايز. يمكن استخدام كلتا الطريقتين لتقييم نشاط الكاسباز لأنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا الأولية والمحولة.

1. التفريق بين الضامة المشتقة من نخاع العظم (BMDMs)

ملاحظة: نفذ جميع الخطوات في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة ، واستخدم تقنيات معقمة معقمة.

  1. تحضير حقنة 1 مل بإبرة 21 غرام.
  2. أضف 5 مل من HBSS + 2٪ FBS إلى أنبوب 15 مل.
  3. باستخدام ملقط معقم ، خذ عظم الفخذ المستأصل ، وأدخل الإبرة في فتحة عظم الفخذ. عقد عظم الفخذ في HBSS + 2 ٪ FBS ، اغسل نخاع العظم حتى يصبح العظم أبيض. اغسل الساق بنفس الطريقة. استمر في شطف المحلول للحصول على تعليق أحادي الخلية.
  4. جهاز طرد مركزي لنظام التعليق أحادي الخلية عند 200 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام شفاط فراغ. اضغط على الأنبوب لإعادة تعليق الحبيبات برفق. أضف 1 مل من محلول تحلل الخلايا الحمراء (انظر جدول المواد) ، واخلطه برفق باستخدام ماصة P1000. احتضان في RT لمدة 1 دقيقة.
  6. أضف 10 مل من HBSS + 2٪ FBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق في RT.
  7. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 10 مل من وسط زراعة البلاعم المشتقة من نخاع العظم (BMDM).
    ملاحظة: يتكون وسط زراعة BMDM من DMEM منخفض الجلوكوز مع إضافة 10٪ FBS و 20 نانوغرام / مل M-CSF والبنسلين (50 وحدة / مل) والستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكن استبدال 20٪ L929 وسيط مكيف ب M-CSF.
  8. أضف 15 مل من وسط زراعة BMDM إلى طبقين بتري مقاس 15 سم. أضف 5 مل من المحلول أحادي الخلية إلى كل طبق.
    ملاحظة: لا تستخدم الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة. الصفائح المعالجة بزراعة الأنسجة تحد من التمايز.
  9. ضع الأطباق في درجة حرارة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، لمدة 6 أيام.
    ملاحظة: يمكن حصاد BMDMs بعد 5-7 أيام. تؤدي أوقات الحضانة الأطول للتمايز إلى زيادة تعبير البروتين المضاد لموت الخلايا المبرمج26.

2. حصاد الخلايا وبذرها ومعالجتها

ملاحظة: نفذ جميع الخطوات في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة ، واستخدم تقنيات معقمة معقمة. تلتصق البلاعم المتمايزة تماما باللوحة ، مما يسمح بالفصل السهل ، بينما يمكن التخلص من الخلايا العائمة. يمكن استخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع أو بدون Ca 2+ و Mg2+.

  1. بعد 6 أيام من الحضانة ، قم بإزالة الخلايا العائمة والمتوسطة من اللوحة باستخدام شفاط.
  2. أضف 5 مل من PBS إلى كل لوحة 15 سم. قم بإزالة PBS من اللوحة باستخدام شفاط.
  3. أضف 2 مل من التربسين (انظر جدول المواد) إلى كل طبق. احتضان اللوحة حتى يؤدي النقر اللطيف على اللوحة إلى إزاحة الخلايا. خذ 5 مل من وسط زراعة BMDM ، واحصد الخلايا من اللوحة.
    1. انقله إلى الطبق الثاني مقاس 15 سم ، واحصد الخلايا من الطبق. قم بإزالة معلق الخلية من اللوحة إلى أنبوب سعة 50 مل. خذ 5 مل إضافية من وسط زراعة BMDM ، واغسل كلا اللوحين للتأكد من جمع جميع الخلايا. ضع معلق الخلية في نفس الأنبوب سعة 50 مل.
  4. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، وعد باستخدام مقياس الدم باستخدام تخفيف 1: 1 مع تريبان الأزرق.
    ملاحظة: يمكن استخدام عدادات الخلايا الأوتوماتيكية أيضا عند معايرتها لحجم البلاعم.
  5. بذر البلاعم بكثافة 1 × 106 خلايا / مل. توفر BMDMs المصنفة في 2 × 106 خلايا / بئر في لوحة 6 آبار ما يقرب من 2 ملغ / مل من البروتين الكلي. اسمح للخلايا بالالتصاق باللوحة لمدة لا تقل عن 6 ساعات قبل العلاج.
    ملاحظة: بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى ، يجب تحديد التركيز الأمثل.
  6. عالج البلاعم بمحاكاة Smac (المركب A ، انظر جدول المواد)22 عند 250 نانومتر و 500 نانومتر لمدة 16 ساعة.
    ملاحظة: قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي للحث على موت الخلايا المبرمج وانقسام كاسباز -3 لضمان عمل الفحص. تشمل محرضات موت الخلايا المبرمج الشائعة ستوروسبورين وإيتوبوسيد. بالنسبة للعديد من خطوط الخلايا للخضوع لموت الخلايا المبرمج ، يكفي 0.1-10 ميكرومتر لمدة 16 ساعة من التحفيز.

3. تحضير محللات الخلايا من الخلايا المعالجة

ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة على الجليد ، ويجب تبريد الكواشف والمواد مسبقا.

  1. انقل الألواح التي تحتوي على الخلايا المعالجة إلى الجليد. اجمع الوسط من مزرعة الخلية في أنبوب سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واستنشاق الوسط ، ووضع الأنبوب على الجليد. هذا يسمح بجمع الخلايا التي انفصلت عن اللوحة.
  2. أضف 1 مل من PBS البارد إلى لوحة زراعة الخلايا لغسل الخلايا ، واستنشاق جميع PBS. أضف 100 ميكرولتر من التربسين إلى الخلايا (إذا كنت تعمل مع طبق 6 آبار). اسمح للتربسين برفع الخلايا عن الصفيحة ، وقم بتجميعها في أنبوب سعة 1.5 مل. استخدم 1 مل من PBS البارد لضمان جمع جميع الخلايا.
    ملاحظة: في حالة العمل مع خلايا التعليق ، انقل الوسط والخلايا برفق إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في محلول تحلل DISC 100 ميكرولتر (150 mM كلوريد الصوديوم ، 2 mM EDTA ، 1٪ Triton X-100 ، 10٪ glycerol ، 20 mM Tris ، درجة الحموضة 7.5 ، انظر جدول المواد).
  4. احتضان العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  5. أجهزة الطرد المركزي المحللات عند ~ 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 °C لتكوير الجزء غير القابل للذوبان.
  6. انقل 25 ميكرولتر من المحللة إلى صفيحة بيضاء مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا لمقايسة نشاط caspase-3 / caspase-7 (الخطوة 5).
    ملاحظة: لا تزعج الحبيبات. هذا هو الجزء غير القابل للذوبان من محللة الخلية.
  7. انقل 10 ميكرولتر من المحللة المتبقية إلى صفيحة شفافة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا لمقايسة حمض البيسينشونيك (BCA) (الخطوة 4). سيتم استخدام هذا لتطبيع العينات.
  8. احتفظ بكلا اللوحين على الجليد لمزيد من المعالجة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إغلاق الألواح بغطاء لاصق وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع تقريبا.

4. قياس كمية البروتين باستخدام مقايسة BCA

ملاحظة: يمكن استخدام الكواشف أو المقايسات الأخرى لتحديد كمية البروتين في كل عينة. في الفحص السكاني ، يمكن مقارنة العينات عن طريق تطبيع كمية البروتين المستخدمة في الفحص.

  1. تحضير تركيزات البروتين القياسية بين 0 ميكروغرام / مل و 2000 ميكروغرام / مل (0 ميكروغرام / مل ، 25 ميكروغرام / مل ، 125 ميكروغرام / مل ، 250 ميكروغرام / مل ، 500 ميكروغرام / مل ، 750 ميكروغرام / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، 1500 ميكروغرام / مل ، 2000 ميكروغرام / مل) مع ألبومين مصل البقر (BSA). تحضير الفراغات مع المخزن المؤقت للتحلل فقط.
  2. أضف 10 ميكرولتر من كل معيار إلى لوحة 96 بئر مسطحة القاع تحتوي على العينات المذكورة في الخطوة 3.7.
  3. امزج كاشف BCA 1 مع كاشف BCA 2 بنسبة 50: 1 (انظر جدول المواد). أضف 200 ميكرولتر من كاشف BCA المختلط إلى كل عينة ومعيار.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر على أداة قياس فلورية ، وحدد تركيز البروتين باستخدام المنحنى القياسي.

5. الفحص السكاني لنشاط caspase-3 / caspase-7

ملاحظة: لا تسمح للخلية بالجلوس على الجليد لأكثر من 3 ساعات. إذا كان نشاط الكاسباز موجودا ، فإن هذا يزداد بمرور الوقت على الرغم من وجود العينة على الجليد. إذا تم تجميد العينات ، قم بإذابتها على الجليد ، وتابع على الفور بمجرد إذابة المحللات.

  1. ابدأ تشغيل أداة قياس الفلورومتر (انظر جدول المواد) وقم بتسخين الماكينة إلى 37 درجة مئوية. قم بإعداد البرنامج النصي كما هو مذكور:
    1. قم بإجراء قراءات فردية كل دقيقة لمدة 40 دقيقة من أجل تحديد حركية التفاعل.
    2. اضبط الإثارة على 360 نانومتر والانبعاث على 465 نانومتر. عشر ومضات لكل بئر كافية.
  2. قم بإعداد التحكم الإيجابي في caspase-3 المؤتلف (انظر جدول المواد). امزج 1 U من إنزيم caspase-3 المؤتلف في 50 ميكرولتر من محلول التحلل (الأنبوب 1). أضف 25 ميكرولتر من محلول التحلل إلى ثلاثة أنابيب إضافية. نقل 25 ميكرولتر من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2. تخلط عن طريق ماصة العينات.
    1. كرر للأنبوب 3 والأنبوب 4. سيحتوي الأنبوب 5 على 50 ميكرولتر فقط من محلول التحلل. أضف 25 ميكرولتر من كل معيار إلى اللوحة البيضاء ذات القاع المسطح المكونة من 96 بئرا لفحص نشاط caspase-3 ، المذكور في الخطوة 3.6.
  3. قم بإعداد مزيج تفاعل رئيسي لمقايسة نشاط الكاسباز على الجليد. لتفاعل واحد ، امزج 50 ميكرولتر من محلول انقسام كاسباز 2x (0.2M HEPES pH 7.5 ؛ 20٪ سكروز أو PEG ؛ 0.2٪ CHAPS) ، 5 ميكرولتر من 1 mM DEVD-AMC (ركيزة كاسباز -3 رباعي الببتيد) ، 2 ميكرولتر من 500 mM DTT ، و 18 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات (انظر جدول المواد).
  4. أضف 75 ميكرولتر من مزيج التفاعل إلى كل عينة ومعيار للحصول على حجم تفاعل إجمالي قدره 100 ميكرولتر.
  5. قم بقياس التألق على الفور باستخدام أداة القياس الفلوري التي تم إعدادها في الخطوة 5.1.
  6. لكل قياس فلوري ، اطرح قراءة التألق للفراغ (مخزن التحلل فقط) من مضان العينة. تطبيع القراءة بالقسمة على تركيز البروتين للعينة (محسوبة في الخطوة 4.5)27:
    Equation 1
  7. احسب معدل نشاط caspase عن طريق تحديد ميل التألق الطبيعي على المحور y والوقت على المحور السيني.

6. مقايسة الخلية الواحدة (تحليل قياس التدفق الخلوي) لنشاط caspase-3 / caspase-7

  1. بذر الخلايا كما هو موضح في القسم 2.
  2. احصد الخلايا في أنبوب بوليسترين سعة 5 مل. إذا كنت تعمل مع خلايا ملتصقة ، فقم بجمع الوسيط في أنبوب سعة 5 مل. أضف 1 مل من PBS البارد إلى لوحة زراعة الخلايا ، واجمع PBS في أنبوب 5 مل. أضف التربسين إلى الخلايا (100 ميكرولتر في حالة العمل مع أطباق 6 جيدا). اسمح للتربسين برفع الخلايا عن اللوحة ، وتجميعها في أنبوب سعة 5 مل. استخدم 1 مل من PBS البارد لضمان جمع جميع الخلايا.
    ملاحظة: في حالة العمل مع خلايا التعليق ، انقل الوسط والخلايا برفق إلى أنبوب سعة 5 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي للعينات على 300 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام شفاط فراغ.
  4. تحضير مزيج تلطيخ. تركيز التلوين الأمثل هو 1 × 106-2 × 106 خلايا في 50 ميكرولتر. تمييع الركيزة الفلوروجينية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد ، قياس التدفق الخلوي). خذ 1 ميكرولتر من ركيزة المخزون ، وخفف في 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. أضف 50 ميكرولتر لكل عينة.
  5. احتضان العينات على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء ، مع الخلط كل 15 دقيقة.
  6. باستخدام مقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذه الدراسة ، استخدم الليزر الأحمر عند 640 نانومتر ، واكتشف باستخدام 675/25 نانومتر. قم بتشغيل عينة التحكم غير الملوثة أولا ، واحصل على ما لا يقل عن 10000 حدث من السكان المطلوبين. استبعد الحطام باستخدام بوابة (P1) على مخطط نقطي FSC-A و SSC-A.
    1. استخدم مدرجا بيانيا يعرض الأحداث في بوابة P1 والكشف عن ركيزة caspase (المحور y) لتحديد متوسط شدة التألق (MFI).
      ملاحظة: تتطلب ركيزة الكاسباز الموصوفة في هذه الطريقة إثارة عند 590 نانومتر وتنبعث عند 628 نانومتر.

Representative Results

تم تمييز بلاعم الفأر الأولية لمدة 6 أيام. بعد 6 أيام ، تم حصاد الخلايا وعدها وبذرها. تم استخدام العلاجات التالية: لا علاج ومحاكاة Smac (المركب A)22 عند 250 نانومتر و 500 نانومتر لمدة 16 ساعة (الشكل 1). تم إجراء التجربة في نسختين للسماح بتقييم تنشيط caspase-3 / caspase-7 إما عن طريق الفحص القائم على السكان أو تحليل الخلية الواحدة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

تم تحديد تركيز البروتين في محللات الخلية باستخدام مقايسة BCA (الجدول التكميلي 1). يعد ذلك ضروريا للتأكد من أن كمية البروتين المستخدمة في مقايسة نشاط caspase-3 / caspase-7 هي نفسها بين العينات. في هذا الفحص القائم على السكان ، يمكن تقديم البيانات بطريقتين. الأول هو إظهار الحركية عن طريق رسم التألق المعدل (المحور ص) مقابل الوقت (المحور السيني) (الشكل 2 أ). بدلا من ذلك ، يمكن حساب المنحدر لمقارنة العينات مباشرة (الشكل 2 ب). لم تكن الزيادة في الانحدار عند معالجة محاكاة Smac 500 نانومتر كبيرة بناء على ANOVA العادي أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة (اختبار المقارنة المتعددةلدونيت 28).

لتحليل نشاط caspase-3 / caspase-7 باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تم حصاد الخلايا والمادة الطافية. تم استخدام الخلايا غير الملوثة أو التألق ناقص واحد كعنصر تحكم سلبي ، وكذلك الخلايا غير المعالجة. أظهر الرسم البياني للخلايا التي تم جمعها عن طريق قياس التدفق الخلوي تحولا في التألق للخلايا المعالجة بمحاكاة Smac مقارنة بالخلايا غير المعالجة (الشكل 2C). يمكن عرض البيانات إما كمتوسط شدة مضان (الشكل 2D) أو كتغيير في الطيات على الخلايا غير المعالجة (الشكل 2E).

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي للدراسة . (أ) تم استئصال عظم الفخذ والساق من فئران C57Bl/6. تم مسح العظام وتمييزها في 20 نانوغرام / مل M-CSF لمدة 6 أيام. (ب) في اليوم 6، تم حصاد البلاعم وإعادة بذرها للعلاج. تم حصاد مجموعة واحدة من الخلايا من أجل المحللات وتقييمها من خلال النشاط الفلوروجيني ، بينما تم حصاد المجموعة الأخرى ، وتحضينها بالركيزة الفلورية ، وتقييمها عن طريق قياس التدفق الخلوي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: المقايسة الحركية لنشاط caspase-3 / caspase-7 وانقسام الركيزة عن طريق قياس التدفق الخلوي. (أ ، ب) بيانات تمثيلية للمقايسة الحركية لنشاط كاسباز -3 / كاسباس -7 (C-E) وانقسام الركيزة عن طريق قياس التدفق الخلوي. تمت معالجة البلاعم بتركيزين من محاكاة Smac (المركب A ؛ 250 نانومتر و 500 نانومتر) لمدة 16 ساعة. (A) الكشف عن ركيزة DEVD AFC المشقوقة بمرور الوقت. تم تطبيع البيانات مع تركيز البروتين في العينة. (ب) تم تسوية معدل الانقسام (المنحدر) ل DEVD AFC لكل عينة إلى المنحدر غير المعالج وعرضه كتغير الطية على الخلايا غير المعالجة. (ج) مدرج تكراري خلوي للخلايا المحتضنة بركيزة كاسباز-3. (د، ه) مقارنة MFI وتغيير الطي في MFI مقارنة بالعينة غير المعالجة. تمثل كل نقطة بيانات عينة مستقلة. متوسط ± يتم عرض الخطأ المعياري للمتوسط ؛ * p < 0.05 باستخدام اختبارات ANOVA أحادية الاتجاه واختبارات مقارنة متعددة (اختبار المقارنة المتعددة ل Dunnett). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

كاسباس جنس تسلسل الركيزة مجالات البروتين
كاسباس-1 Hs ، مم (واط/لتر) اي اتش دي CARD ، مجال كبير ، مجال تحفيزي صغير
كاسباس-2 Hs ، مم ديكسد CARD ، مجال كبير ، مجال تحفيزي صغير
كاسباس-4 النظام المنسق (واط/لتر) اي اتش دي CARD ، مجال كبير ، مجال تحفيزي صغير
كاسباس-5 النظام المنسق (واط/لتر) اي اتش دي CARD ، مجال كبير ، مجال تحفيزي صغير
كاسباس-9 Hs ، مم (ط/خ/ل) ه (ح / ر) د CARD ، مجال كبير ، مجال تحفيزي صغير
كاسباس -11 المليمتر (واط/لتر) اي اتش دي CARD ، مجال كبير ، مجال تحفيزي صغير
كاسباس-12 المليمتر أتاد CARD ، مجال كبير ، مجال تحفيزي صغير
كاسباس-8 Hs ، مم (ط/خ/ل) ه (ح / ر) د دائرة التنمية الاقتصادية ، مجال كبير ، مجال حفاز صغير
كاسباس-10 النظام المنسق (ط/خ/ل) ه (ح / ر) د دائرة التنمية الاقتصادية ، مجال كبير ، مجال حفاز صغير
كاسباس-3 Hs ، مم ديكسد مجال كبير ، مجال حفاز صغير
كاسباس-6 Hs ، مم (ط/خ/ل) ه (ح / ر) د مجال كبير ، مجال حفاز صغير
كاسباس-7 Hs ، مم ديكسد مجال كبير ، مجال حفاز صغير
كاسباس-14 النظام المنسق، مم (واط/لتر) اي اتش دي مجال كبير ، مجال حفاز صغير
بطاقة نطاق تفعيل وتوظيف Caspase
دائرة التنمية الاقتصادية مجال مستجيب الموت
النظام المنسق الإنسان العاقل
المليمتر موس العضلات

الجدول 1: خصوصية الركيزة ومجالات البروتين من caspases. الجدول مقتبس من McStay et al.20; شاليني وآخرون 3; وفان أوبدنبوش ولامكانفي4.

الجدول التكميلي 1: التحليل الحركي DEVD. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

في هذه الطريقة ، يتم استخدام الركيزة الفلورية في الفحص القائم على السكان أو تحليل الخلية الواحدة لقياس نشاط caspase-3 / caspase-7. تقيس كلتا الطريقتين نشاط الكاسباز بطريقة كمية بناء على انشقاق الركيزة. ميزة واحدة هي القدرة على استخدام هذه الأساليب للعديد من العينات. باستخدام هذه الطرق ، يتم الكشف عن نشاط caspase-3 / caspase-7 في البلاعم الأولية المعالجة بمحاكاة Smac.

أحد الجوانب الحاسمة للمقايسة الفلورومترية القائمة على السكان هو الوقت من التحلل إلى قراءة التألق. يجب الاحتفاظ بالعينات على الجليد طوال الإجراء ، خاصة قبل "قراءة" الفحص. هذا يمنع الانقسام المبكر ومضان الركيزة. باستخدام الفحص القائم على السكان ، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين أقل. يتم تطبيع كمية البروتين المستخدمة في الفحص ، مما يسمح بمقارنة العينات مباشرة. أحد التحذيرات هو أنه في مرحلة متأخرة من موت الخلايا المبرمج ، يتم تقليل إجمالي كمية البروتين. وبالتالي ، قد لا يكون الكشف عن نشاط Caspase ممكنا. يوصى بحركية مختلفة أو جرعات علاج مختلفة للتحايل على هذه المشكلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام برامج أخرى لتقييم معدل نشاط caspase بدقة إلى جانب البرنامج الموضح في هذه الطريقة.

بالنسبة لفحص قياس التدفق الخلوي ، يلزم وجود أحداث أو خلايا كافية لبوابة السكان بثقة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين في الفحص القائم على التدفق لتحقيق النسبة المثلى من الركيزة إلى رقم الخلية. ومع ذلك ، مع قياس التدفق الخلوي ، فإن هذه الطريقة تفسح المجال لقياس معلمات إضافية ، مثل علامات سطح الخلية لتحديد نوع الخلية.

يمكن استخدام كل من السكان وطرق الخلية الواحدة لكاسباسات أخرى. ومع ذلك ، من المهم أن تتذكر أن تسلسل التعرف أقل تمييزا بالنسبة للكاسباسات الأخرى. على هذا النحو ، يجب استخدام طرق أخرى لنشاط caspase. وهذا يشمل تثبيط نشاط الكاسباز ، كريسبر أو ضربة قاضية لكاسباس معينة ، والنشاف الغربي للكشف عن انشقاق الركائز المعروفة.

إحدى الطرق البديلة للكشف عن نشاط الكاسباز هي التصوير بفاصل زمني. يمكن استخدام نفس ركيزة الكاسباز القابلة للنفاذ جنبا إلى جنب مع علامات أخرى للصلاحية ، مثل الملحق الخامس ، لتوفير معلومات عن حركية موت الخلايا. سيفصل التصوير أيضا نشاط الكاسباز وبقاء الخلية ، مما يسمح بالكشف عن الكميات شبه المميتة من نشاط الكاسباز في مجموعة الخلايا. ترتبط الوظائف غير المميتة ل caspase-3 / caspase-7 بالتنظيم المضاد للفيروسات في الخلايا المناعية الفطرية29 ، وخاصة تنشيط النوع الأول IFN عبر إطلاق الحمض النووي للميتوكوندريا15,16. وبالتالي ، فإن هذه المقايسات لقياس نشاط الكاسباز ضرورية لتحديد الأنماط المختلفة لموت الخلايا وقد تكون مفيدة في تقييم وظائف الموت غير الخلوي.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يتم دعم WWW من خلال منحة زميل أبحاث طبية Clöetta ، ويتم دعم SR من قبل CanDoc UZH Forschungskredit ، ويتم دعم JT من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microfuge tubes Sarstedt 72.706.400
15 cm Petri plates Sarstedt 82.1184.500
37 degree incubator shaker IKA shaker KS 4000i 97014-816 distributed by VWR
6-well cell culture dish Sarstedt 83.392
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile Sigma CLS3600
96 well flat plate Sarstedt 82.1581
Ac-DEVD-AFC Enzo Life Sciences ALX-260-032-M005 Caspase-3 substrate
BD Fortessa BD any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work
b-glycerolphosphate Sigma G9422-10G
caspase-3 recombinant  Enzo Life Sciences ALX-201-059-U025
CHAPS Sigma 1.11662
DMEM, low glucose, pyruvate Thermoscientific 31885023
DMSO Sigma D8418-250ML
EDTA Sigma 03685-1KG
EGTA Sigma 324626-25GM
Etoposide MedChem Express HY-13629
FBS Thermoscientific 26140
Flow cytometry tubes Falcon 352008
Flowjo Flowjo A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice
Glycerol Sigma G5516-500ML
HEPES Sigma H4034
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging Immunochemistry Technologies 935
M-CSF ebioscience 14-8983-80 now a subsidiary of Thermoscientific
M-Plex Tecan any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors
NaCl Roth 3957.1
PBS pH 7.4 Thermoscientific 10010023
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Thermoscientific 10378016
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 protein concentration assay
protease inhibitors Biomol P9070.100
Smac mimetic, Compound A Tetralogics also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007
Sodium Fluoride Sigma S7920-100G
sodium orthovanadate Sigma S6508-10G
sodium pyrophosphate Sigma P8010-500G
Staurosporine MedChem Express HY-15141
sucrose Sigma 1.07687
Tris Base Sigma T1503-1KG
Triton X100 Sigma T8787-50ML
TrypLE Thermoscientific A1285901 In the protocol, it is listed as Trypsin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
  2. Nicholson, D. W., Thornberry, N. A. Caspases: Killer proteases. Trends in Biochemical Sciences. 22 (8), 299-306 (1997).
  3. Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).
  4. Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
  5. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  6. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  7. Jiang, X., Wang, X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).
  8. Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -D. Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation. Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).
  9. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  10. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  11. Rühl, S., et al. ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation. Science. 362 (6417), 956-960 (2018).
  12. Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis. Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).
  13. Newton, K., et al. Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis. Nature. 574, 428-431 (2019).
  14. Fritsch, M., et al. Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis. Nature. 575, 683-687 (2019).
  15. White, M. J., et al. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production. Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).
  16. Rongvaux, A., et al. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).
  17. Nakajima, Y. -I., Kuranaga, E. Caspase-dependent non-apoptotic processes in development. Cell Death and Differentiation. 24, 1422-1430 (2017).
  18. Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. The role of caspases as executioners of apoptosis. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).
  19. Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis. FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).
  20. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).
  21. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  22. Vince, J. E., et al. IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis. Cell. 131 (4), 682-693 (2007).
  23. McComb, S., et al. cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation. Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).
  24. Wong, W. W. -L., et al. cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner. Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).
  25. Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-Protocol. 5 (20), e1631 (2015).
  26. Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells. Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).
  27. Caspase activity assay buffer. Cold Spring Harbor Protocols. , (2015).
  28. Mackridge, A., Rowe, P. One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests. Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 93-103 (2018).
  29. Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. Caspases control antiviral innate immunity. Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 193،
قياس نشاط كاسباز باستخدام مقايسة الفلورومترية أو قياس التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tong, J., Rufli, S., Wong, W. W. L.… More

Tong, J., Rufli, S., Wong, W. W. L. Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e64745, doi:10.3791/64745 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter