Summary
Denne protokol beskriver to metoder til måling af caspaseaktivitet gennem et fluorogent substrat ved hjælp af flowcytometri eller et spektrofluorometer.
Abstract
Aktiveringen af cysteinproteaser, kendt som caspaser, forbliver en vigtig proces i flere former for celledød. Caspaser er kritiske initiatorer og bødler af apoptose, den mest studerede form for programmeret celledød. Apoptose opstår under udviklingsprocesser og er en nødvendig begivenhed i vævshomeostase. Pyroptose er en anden form for celledød, der udnytter caspaser og er en kritisk proces i aktivering af immunsystemet gennem aktivering af inflammasomet, hvilket resulterer i frigivelse af medlemmer af interleukin-1 (IL-1) familien. For at vurdere caspaseaktivitet kan målsubstrater vurderes. Følsomhed kan dog være et problem, når man undersøger enkeltceller eller aktivitet på lavt niveau. Vi demonstrerer, hvordan et fluorogent substrat kan anvendes med et populationsbaseret assay eller enkeltcelleassay ved flowcytometri. Med korrekt kontrol kan forskellige aminosyresekvenser bruges til at identificere, hvilke caspaser der er aktive. Ved hjælp af disse assays er det samtidige tab af hæmmere af apoptoseproteiner ved tumornekrosefaktor (TNF) stimulering blevet identificeret, hvilket primært inducerer apoptose i makrofager snarere end andre former for celledød.
Introduction
Caspaser er involveret i flere former for programmeret celledød. Apoptose er den mest studerede form for programmeret celledød og er forbundet med caspase aktivitet1. Alle caspaser har en stor og lille katalytisk underenhed. Caspase-1, caspase-4, caspase-5, caspase-9 og caspase-11 har et caspase aktiverings- og rekrutteringsdomæne (CARD), og caspase-8 og caspase-10 indeholder dødseffektordomæner (DED) 2,3,4,5 (tabel 1). Apoptose kan initieres af to hovedveje: den ydre vej og den indre vej. Den ekstrinsiske apoptotiske vej udløses af dødsreceptorer, som er en del af tumornekrosefaktorens superfamilie (TNFSF). Dødsreceptorer besidder DED-domæner, hvilket letter caspase-8-aktivitet6. Den iboende apoptotiske vej involverer aktivering af caspase-9 efter dannelsen af apoptosomet, hvilket kræver frigivelse af cytokrom c og Apaf-17. Aktiveringen af enten initiator caspase, caspase-8 eller caspase-9, fører til spaltning og efterfølgende aktivering af bødlekaspaserne, som er caspase-3, caspase-6 og caspase-7. At identificere, at bødlekaspaserne er aktive, indikerer, at cellerne gennemgår apoptose, og denne aktivering betragtes som en vigtig faktor i definitionen af celledødsmåden.
Caspase-aktivering er også et kritisk tidspunkt for regulering af inflammation og induktion af alternative former for programmeret celledød. For eksempel fører caspase-1-aktivering til modning af proinflammatoriske cytokiner af interleukin-1-familien8. Frigivelsen og aktiveringen af cytokiner fra denne familie, især IL-1β og IL-18, skyldes gasdermin D-spaltning og poredannelse ved plasmamembranen 9,10. Utilstrækkelig membranreparation af gasdermin D-porer kan resultere i en type celledød kendt som pyroptose11. Desuden resulterer caspase-8-aktivitet i hæmning af en caspase-uafhængig celledød kendt som necroptose12. Receptorinteragerende serin/threoninproteinkinase 1 (RIPK1) er en af de kritiske faktorer i nekrotose og i at drive inflammation reguleret af NF-kB. Modeller har vist, at RIPK1 spaltes af caspase-8, hvilket resulterer i begrænsning af NF-kB-signalering, apoptose og nekrotose13,14. Derfor kan identifikation af aktiviteten af forskellige caspaser hjælpe med at forstå den resulterende inflammation og celledødsmodalitet.
Uafhængigt af caspasernes funktion til regulering af celledødsmetoder kan caspaseaktivitet også regulere andre cytokinfamilier, såsom interferon (IFN), som reaktion på infektion15,16. Derudover er caspaser involveret i ikke-celledødsfunktioner, herunder beslutninger om celleskæbne, vævsreparation og regenerering, tumorigenese gennem DNA-reparation og neuronal synapsefunktion. Aktiviteten af caspaser i disse ikke-dødelige roller menes at være begrænset af cellulær lokalisering og mængden af caspaser. Derfor kan kvantificering af niveauet af caspaseaktivitet meget vel definere, om en celle gennemgår celledød, eller om caspase spiller en rolle i en ikke-celledødsfunktion 4,17,18.
Caspase aktivitet kan vurderes ved flere metoder. Western blotting for spaltede caspaser og deres substrater er blevet brugt som indikator for aktivitet, men disse analyser er i bedste fald kvalitative. For at afgøre, om caspaseaktivitet er forbundet med celledød, er en kvantitativ måling ideel. Da caspaser spalter substrater på et genkendelsessted bestående af fire aminosyrer, er kolorimetriske, luminescens eller fluorometriske metoder blevet udviklet. Imidlertid ser caspaser ud til at have plasticitet i deres substratgenkendelse19,20. Genkendelsessekvensen er ikke forbundet med proteindomænerne (tabel 1). Tetrapeptidsekvensen DEVD kan imidlertid bruges til at detektere caspase-3 og caspase-7 aktivitet20,21.
Smac-efterligning er forbindelser rettet mod hæmmere af apoptoseproteiner (IAP'er). Brugen af Smac-efterligning i en delmængde af kræftceller får cellerne til at blive følsomme over for TNF-induceret celledød22. I primære makrofager forårsager Smac-efterligning celledød uden eksogen tilsætning af TNF23,24. Tabet af cIAP1 ved Smac mimetisk induceret nedbrydning resulterer i produktion af TNF. Hvis der opdages caspaseaktivitet, betyder det, at cellerne ikke døde af necroptose, men på en apoptotisk måde. I denne metode anvendes påvisning af spaltet DEVD-substrat til at identificere caspase-3/caspase-7-aktivitet. Yderligere eksperimenter til bekræftelse af apoptotisk celledød er blevet offentliggjort tidligere24.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført med godkendelse og i overensstemmelse med retningslinjerne fra det dyreetiske udvalg ved universitetet i Zürich (#ZH149/19). C57Bl/6J-hanmus i alderen 8-16 uger, opdrættet og anbragt under specifikke patogenfrie (SPF) betingelser, blev anvendt til denne undersøgelse. De intakte knogler kan opbevares på is i steril Hanks bufferede saltopløsning (HBSS) med 2% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS). Knoglemarv blev opsamlet fra lårbenet og tibia af musen25 på differentieringsdagen. Begge metoder til vurdering af caspaseaktivitet kan anvendes til andre celletyper, herunder både primær og transformeret.
1. Differentiering af knoglemarvsafledte makrofager (BMDM'er)
BEMÆRK: Udfør alle trin i en vævskultur laminær strømningshætte, og brug sterile aseptiske teknikker.
- Klargør en 1 ml sprøjte med en 21 G kanyle.
- Tilsæt 5 ml HBSS + 2% FBS til et 15 ml rør.
- Brug sterile tang til at tage en udskåret lårben og indsæt nålen i lårbenets åbning. Hold lårbenet i HBSS + 2% FBS, skyl knoglemarven ud, indtil knoglen er hvid. Skyl skinnebenet på samme måde. Fortsæt med at skylle opløsningen for at opnå en enkeltcellesuspension.
- Centrifuger enkeltcellesuspensionen ved 200 x g i 4 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten fjernes ved hjælp af en vakuumaspirator. Bank på røret for forsigtigt at resuspendere pelleten. Tilsæt 1 ml lysisbuffer med røde blodlegemer (se materialetabel), og bland forsigtigt med en P1.000-pipette. Inkuber ved RT i 1 min.
- Tilsæt 10 ml HBSS + 2% FBS, og centrifuger ved 200 x g i 4 minutter ved RT.
- Supernatanten fjernes og resuspenderes i 10 ml knoglemarvsafledt makrofagdyrkningsmedium (BMDM).
BEMÆRK: BMDM-dyrkningsmedium består af DMEM med lavt glukoseindhold med tilsætning af 10% FBS, 20 ng / ml M-CSF, penicillin (50 E / ml) og streptomycin (50 μg / ml) (se materialetabel). Alternativt kan 20% L929-konditioneret medium erstattes af M-CSF. - Tilsæt 15 ml BMDM dyrkningsmedium i to 15 cm petriskåle. Der tilsættes 5 ml enkeltcelleopløsning til hver plade.
BEMÆRK: Brug ikke vævskulturbehandlede plader. Vævskulturbehandlede plader begrænser differentieringen. - Anbring opvasken ved 37 °C, 5% CO2, i 6 dage.
BEMÆRK: BMDM'erne kan høstes efter 5-7 dage. Længere inkubationstider for differentiering fører til øget anti-apoptotisk proteinekspression26.
2. Høst, såning og behandling af celler
BEMÆRK: Udfør alle trin i en vævskultur laminær strømningshætte, og brug sterile aseptiske teknikker. Fuldt differentierede makrofager klæber til pladen, hvilket muliggør let adskillelse, mens flydende celler kan kasseres. Fosfatbufret saltvand (PBS) kan anvendes med eller uden Ca 2+ og Mg2+.
- Efter 6 dages inkubation fjernes de flydende celler og mediet fra pladen ved hjælp af en aspirator.
- Der tilsættes 5 ml PBS til hver 15 cm plade. Fjern PBS fra pladen ved hjælp af en aspirator.
- Tilsæt 2 ml trypsin (se materialetabel) til hver plade. Inkuber pladen, indtil forsigtigt tryk på pladen løsner cellerne. Tag 5 ml BMDM kulturmedium, og høst cellerne fra pladen.
- Overfør til den anden 15 cm plade, og høst cellerne af pladen. Fjern cellesuspensionen fra pladen i et 50 ml rør. Tag yderligere 5 ml BMDM-dyrkningsmedium, og vask begge plader for at sikre, at alle cellerne er blevet opsamlet. Anbring cellesuspensionen i det samme 50 ml rør.
- Tag 10 μL af cellesuspensionen, og tæl ved hjælp af et hæmacytometer ved hjælp af en 1: 1 fortynding med trypanblåt.
BEMÆRK: Automatiske celletællere kan også bruges, når de kalibreres til makrofagernes størrelse. - Frø makrofagerne med en densitet på 1 x 106 celler / ml. BMDM'er podet ved 2 x 10 6 celler / brønd i en 6-brønds plade giver ca. 2 mg / ml total protein. Lad cellerne klæbe til pladen i mindst 6 timer før behandling.
BEMÆRK: For andre celletyper skal den optimale koncentration bestemmes. - Behandl makrofagerne med Smac-mimetisk (forbindelse A, se materialetabel)22 ved 250 nM og 500 nM i 16 timer.
BEMÆRK: Inkluder en positiv kontrol for at inducere apoptose og caspase-3 spaltning for at sikre, at analysen virker. Almindelige apoptoseinduktorer omfatter staurosporin og etoposid. For at mange cellelinjer skal gennemgå apoptose, er 0,1-10 μM til 16 timers stimulering tilstrækkelig.
3. Fremstilling af cellelysater fra behandlede celler
BEMÆRK: Dette trin skal udføres på is, og reagenserne og materialerne skal forkøles.
- Overfør pladerne indeholdende de behandlede celler til isen. Mediet fra cellekulturen opsamles i et 1,5 ml rør, centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, aspireres til mediet, og røret lægges på is. Dette tillader indsamling af de celler, der har løsnet sig fra pladen.
- Tilsæt 1 ml kold PBS til cellekulturpladen til vask af cellerne, og aspirer al PBS. Tilsæt 100 μL trypsin til cellerne (hvis du arbejder med en 6-brøndskål). Lad trypsinet løfte cellerne fra pladen, og saml dem i 1,5 ml røret. Brug 1 ml kold PBS for at sikre, at alle cellerne er blevet opsamlet.
BEMÆRK: Hvis du arbejder med suspensionsceller, skal du forsigtigt overføre mediet og cellerne til et 1,5 ml rør. - Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes og resuspenderes i 100 μL DISC lysisbuffer (150 mM natriumchlorid, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 20 mM Tris, pH 7,5, se materialetabel).
- Inkuber prøverne på is i 20 min.
- Lysaterne centrifugeres ved ~12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pelletere den uopløselige fraktion.
- Overfør 25 μL af lysatet til en hvid fladbundet 96-brøndplade til caspase-3/caspase-7-aktivitetsanalysen (trin 5).
BEMÆRK: Forstyr ikke pillen. Dette er den uopløselige fraktion af cellelysatet. - 10 μL af det resterende lysat overføres til en gennemsigtig fladbundet 96-brøndsplade til bicinchoninsyre-assayet (BCA) (trin 4). Dette vil blive brugt til normalisering af prøverne.
- Opbevar begge plader på is til videre behandling.
BEMÆRK: På dette trin kan pladerne forsegles med et klæbende dæksel og opbevares ved -20 °C i ca. 4 uger.
4. Proteinkvantificering ved hjælp af BCA-analysen
BEMÆRK: Andre reagenser eller assays kan bruges til at kvantificere mængden af protein i hver prøve. I det populationsbaserede assay kan prøverne sammenlignes ved at normalisere mængden af protein, der anvendes i analysen.
- Forbered standard proteinkoncentrationer mellem 0 μg / ml og 2.000 μg / ml (0 μg / ml, 25 μg / ml, 125 μg / ml, 250 μg / ml, 500 μg / ml, 750 μg / ml, 100 μg / ml, 1.500 μg / ml, 2.000 μg / ml) med bovin serumalbumin (BSA). Forbered kun emner med lysisbuffer.
- Der tilsættes 10 μL af hver standard i den fladbundede plade med 96 brønde indeholdende prøverne, jf. trin 3.7.
- Bland BCA-reagens 1 med BCA-reagens 2 i forholdet 50:1 (se materialetabel). Der tilsættes 200 μL blandet BCA-reagens til hver prøve og standard.
- Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
- Absorbansen måles ved 562 nm på et fluorometrisk instrument, og proteinkoncentrationen kvantificeres med standardkurven.
5. Populationsbaseret assay for caspase-3/caspase-7-aktivitet
BEMÆRK: Lad ikke cellelysaterne i pladen sidde på is i mere end 3 timer. Hvis caspase aktivitet er til stede, øges dette over tid på trods af at prøven er på is. Hvis prøverne var frosne, skal de tøs op på is og fortsættes straks, når lysaterne er optøet.
- Start det fluorometriske instrument (se materialetabellen), og opvarm maskinen til 37 °C. Forbered scriptet som nævnt:
- Udfør individuelle aflæsninger hvert minut i 40 minutter for at bestemme reaktionens kinetik.
- Excitationen indstilles til 360 nm og emissionen til 465 nm. Ti blink pr. Brønd er tilstrækkeligt.
- Forbered den positive kontrol af rekombinant caspase-3 (se materialetabel). Bland 1 U af det rekombinante caspase-3-enzym i 50 μL lysisbuffer (rør 1). Der tilsættes 25 μL lysisbuffer til yderligere tre reagensglas. Overfør 25 μL fra rør 1 til rør 2. Bland ved pipettering.
- Gentag for rør 3 og rør 4. Rør 5 indeholder kun 50 μL lysisbuffer. Der tilsættes 25 μL af hver standard i den hvide fladbundede plade med 96 brønde til caspase-3-aktivitetsanalysen, nævnt i trin 3.6.
- Forbered en masterreaktionsblanding til caspaseaktivitetsanalyse på is. For en reaktion blandes 50 μL 2x caspase spaltningsbuffer (0,2M HEPES pH 7,5; 20% saccharose eller PEG; 0,2% CHAPS), 5 μL 1 mM DEVD-AMC (caspase-3 tetrapeptidsubstrat), 2 μL 500 mM DTT og 18 μL deioniseret vand (se materialetabel).
- Der tilsættes 75 μL af reaktionsblandingen til hver prøve og standard for at opnå et samlet reaktionsvolumen på 100 μL.
- Fluorescensen måles straks ved hjælp af det fluorometriske instrument, der er opstillet i trin 5.1.
- For hver fluorescerende måling trækkes fluorescensaflæsningen for blindprøven (kun lysisbuffer) fra prøvens fluorescens. Aflæsningen normaliseres ved at dividere med prøvens proteinkoncentration (beregnet i trin 4.5)27:
- Beregn hastigheden af caspaseaktivitet ved at bestemme hældningen af den normaliserede fluorescens på y-aksen og tiden på x-aksen.
6. Enkeltcelleanalyse (flowcytometrianalyse) til caspase-3 / caspase-7-aktivitet
- Seed cellerne som beskrevet i punkt 2.
- Høst cellerne i et 5 ml polystyrenrør. Hvis du arbejder med klæbende celler, skal du samle mediet i 5 ml røret. Tilsæt 1 ml kold PBS til cellekulturpladen, og saml PBS i 5 ml røret. Tilsæt trypsin til cellerne (100 μL, hvis du arbejder med 6-brøndskåle). Lad trypsin løfte cellerne fra pladen, og saml i 5 ml røret. Brug 1 ml kold PBS for at sikre, at alle cellerne er blevet opsamlet.
BEMÆRK: Hvis du arbejder med suspensionsceller, skal du forsigtigt overføre mediet og cellerne til et 5 ml rør. - Prøverne centrifugeres ved 300 x g i 5 min. 4 °C. Supernatanten fjernes ved hjælp af en vakuumaspirator.
- Forbered farvningsblandingen. Den optimale farvningskoncentration er 1 x 10 6-2 x 106 celler i 50 μL. Fortynd det fluorogene substrat i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel, flowcytometri). Der udtages 1 μL stamsubstrat, og fortyndes i 150 μL PBS. Der tilsættes 50 uL pr. prøve.
- Prøverne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter beskyttet mod lys med blanding hvert 15. minut.
- Med flowcytometeret, der anvendes i denne undersøgelse, skal du bruge den røde laser ved 640 nm og detektere ved hjælp af 675/25 nm. Kør den ubejdsede kontrolprøve først, og få mindst 10.000 hændelser af den ønskede population. Udeluk affaldet ved hjælp af en port (P1) på et FSC-A og SSC-A prikplot.
- Brug et histogram, der viser hændelserne i P1-porten og detektion for caspasesubstratet (y-aksen) til at bestemme medianfluorescensintensiteten (MFI).
BEMÆRK: Caspasesubstratet beskrevet i denne metode kræver en excitation ved 590 nm og udsender ved 628 nm.
- Brug et histogram, der viser hændelserne i P1-porten og detektion for caspasesubstratet (y-aksen) til at bestemme medianfluorescensintensiteten (MFI).
Representative Results
Primære musemakrofager blev differentieret i 6 dage. Efter 6 dage blev cellerne høstet, talt og sået. Følgende behandlinger blev anvendt: ingen behandling og Smac-mimetisk (forbindelse A)22 ved 250 nM og 500 nM i 16 timer (figur 1). Eksperimentet blev udført i to eksemplarer for at gøre det muligt at vurdere caspase-3/caspase-7-aktivering enten ved et populationsbaseret assay eller enkeltcelleanalyse ved hjælp af flowcytometri.
Proteinkoncentrationen i cellelysaterne blev kvantificeret ved hjælp af BCA-analysen (supplerende tabel 1). Dette er nødvendigt for at sikre, at mængden af protein, der anvendes i caspase-3/caspase-7-aktivitetsassayet, er den samme mellem prøverne. I dette populationsbaserede assay kan dataene præsenteres på to måder. Den første er at vise kinetikken ved at plotte den justerede fluorescens (y-akse) versus tid (x-akse) (figur 2A). Alternativt kan hældningen beregnes for direkte at sammenligne prøverne (figur 2B). Stigningen i hældning ved 500 nM Smac-mimetisk behandling var ikke signifikant baseret på en almindelig envejs ANOVA med flere sammenligninger (Dunnetts multiple sammenligningstest28).
Til analyse af caspase-3/caspase-7-aktivitet ved hjælp af flowcytometri blev cellerne og supernatanten høstet. Ufarvede celler eller fluorescens minus en blev brugt som negativ kontrol såvel som de ubehandlede celler. Et histogram af cellerne indsamlet ved flowcytometri viste et skift i fluorescens for cellerne behandlet med Smac-efterligning sammenlignet med de ubehandlede celler (figur 2C). Dataene kan vises enten som median fluorescensintensitet (figur 2D) eller som en foldændring over de ubehandlede celler (figur 2E).
Figur 1: Flowdiagram over undersøgelsen . (A) Femurer og skinneben blev udskåret fra C57Bl/6-mus. Knoglerne blev skyllet og differentieret i 20 ng / mL M-CSF i 6 dage. (B) På dag 6 blev makrofager høstet og gensået til behandling. Et sæt celler blev høstet for lysater og vurderet ved fluorogen aktivitet, mens det andet sæt blev høstet, inkuberet med det fluorogene substrat og vurderet ved flowcytometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kinetisk analyse for caspase-3/caspase-7-aktivitet og substratspaltning ved flowcytometri. (A,B) Repræsentative data for kinetisk assay for caspase-3/caspase-7-aktivitet (C-E) og substratspaltning ved flowcytometri. Makrofagerne blev behandlet med to koncentrationer af Smac-mimetisk (forbindelse A; 250 nM og 500 nM) i 16 timer. (A) Påvisning af det spaltede DEVD AFC-substrat over tid. Dataene blev normaliseret til proteinkoncentrationen i prøven. (B) Spaltningshastigheden (hældningen) af DEVD AFC for hver prøve blev normaliseret til den ubehandlede hældning og præsenteret som foldændringen over de ubehandlede celler. (C) Flowcytometriske histogrammer af cellerne inkuberet med caspase-3-substratet. (D,E) MFI-sammenligning og foldændring i MFI'en sammenlignet med den ubehandlede prøve. Hvert datapunkt repræsenterer en uafhængig stikprøve. gennemsnit ± standardfejl for middelværdien er vist *p < 0,05 ved hjælp af en envejs ANOVA og flere sammenligningstest (Dunnetts multiple sammenligningstest). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Caspase | Art | Substrat sekvens | Protein domæner | ||
| Caspase-1 | Hs, Mm | (W/L) EHD | CARD, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-2 | Hs, Mm | DEXD | CARD, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-4 | Hs | (W/L) EHD | CARD, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-5 | Hs | (W/L) EHD | CARD, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-9 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | CARD, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-11 | Mm | (W/L) EHD | CARD, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-12 | Mm | ATAD | CARD, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-8 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | DED, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-10 | Hs | (I/V/L) E(H/T)D | DED, stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-3 | Hs, Mm | DEXD | Stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-6 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | Stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| Caspase-7 | Hs, Mm | DEXD | Stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| CASPASE-14 | HS, MM | (W/L) EHD | Stort domæne, lille katalytisk domæne | ||
| KORT | CASPASE Aktivering og rekruttering domæne | ||||
| DED | Domænet Dødseffektor | ||||
| Hs | homo sapien | ||||
| Mm | mus musculus | ||||
Tabel 1: Substratspecificitet og proteindomænerne for caspaserne. Tabellen er tilpasset fra McStay et al.20; Shalini et al.3; og van Opdenbosch og Lamkanfi4.
Supplerende tabel 1: DEVD kinetisk analyse. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
I denne metode anvendes et fluorogent substrat i et populationsbaseret assay eller enkeltcelleanalyse til måling af caspase-3/caspase-7-aktivitet. Begge metoder måler caspaseaktiviteten kvantitativt baseret på spaltningen af et substrat. En fordel er evnen til at udnytte disse metoder til adskillige prøver. Med disse metoder detekteres caspase-3/caspase-7-aktivitet i primære makrofager behandlet med Smac-mimetik.
Et kritisk aspekt af det populationsbaserede fluorometriske assay er tiden fra lysis til aflæsning af fluorescensen. Prøverne skal opbevares på is under hele proceduren, især inden analysen "aflæses". Dette forhindrer for tidlig spaltning og fluorescens af substratet. Ved hjælp af det populationsbaserede assay kan der kræves mindre optimering. Mængden af protein, der anvendes i analysen, normaliseres, hvilket gør det muligt at sammenligne prøverne direkte. En advarsel er, at i et sent stadium af apoptotisk celledød reduceres den samlede proteinmængde; Derfor er påvisning af caspaseaktivitet muligvis ikke mulig. Forskellige kinetik eller forskellige behandlingsdoser anbefales for at omgå dette problem. Derudover kan anden software bruges til nøjagtigt at vurdere hastigheden af caspaseaktivitet udover den software, der er beskrevet i denne metode.
Til flowcytometrisk analyse kræves der nok begivenheder eller celler til at gates populationerne trygt. Derudover kan der kræves mere optimering i det flowbaserede assay for at opnå det optimale forhold mellem substrat og cellenummer. Med flowcytometri egner denne metode sig imidlertid til måling af yderligere parametre, såsom celleoverflademarkører til identifikation af celletype.
Både populations- og enkeltcellemetoderne kunne bruges til andre caspaser. Det er dog vigtigt at huske, at genkendelsessekvensen er mindre diskrimineret for andre caspaser. Som sådan skal andre metoder til caspaseaktivitet anvendes. Dette omfatter hæmning af caspaseaktivitet, CRISPR eller knock-down af specifikke caspaser og western blotting for at detektere spaltningen af kendte substrater.
En alternativ metode til påvisning af caspaseaktivitet er time-lapse imaging. Det samme permeable caspasesubstrat kunne anvendes sammen med andre levedygtighedsmarkører, såsom annexin V, til at give information om kinetikken ved celledød. Billeddannelse ville også adskille caspaseaktiviteten og celleoverlevelsen, hvilket muliggør påvisning af subletale mængder caspaseaktivitet i en cellepopulation. De ikke-dødelige funktioner af caspase-3/caspase-7 er forbundet med antiviral regulering i medfødte immunceller29, især aktiveringen af type I IFN via mitokondrie-DNA-frigivelse15,16. Disse analyser til måling af caspaseaktivitet er således kritiske for at identificere forskellige former for celledød og kan være nyttige til vurdering af ikke-celledødsfunktioner.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
W.W.W. støttes af Clöetta Medical Research Fellow-tilskud, S.R. støttes af CanDoc UZH Forschungskredit, og J.T. støttes af det kinesiske stipendieråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| 15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
| 37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
| 6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
| 96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
| 96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
| Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
| BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
| b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
| caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
| CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
| DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
| EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
| Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
| FBS | Thermoscientific | 26140 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
| Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
| M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
| M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | |
| PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
| protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
| Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
| sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
| sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
| Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
| sucrose | Sigma | 1.07687 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |
References
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Nicholson, D. W., Thornberry, N. A.
- Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Jiang, X., Wang, X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).
- Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -D. Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation. Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
- Rühl, S., et al. ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation. Science. 362 (6417), 956-960 (2018).
- Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis. Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).
- Newton, K., et al. Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis. Nature. 574, 428-431 (2019).
- Fritsch, M., et al. Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis. Nature. 575, 683-687 (2019).
- White, M. J., et al. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production. Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).
- Rongvaux, A., et al. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Kuranaga, E.
- Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. The role of caspases as executioners of apoptosis. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).
- Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis. FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Vince, J. E., et al. IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis. Cell. 131 (4), 682-693 (2007).
- McComb, S., et al. cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation. Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).
- Wong, W. W. -L., et al. cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner. Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-Protocol. 5 (20), e1631 (2015).
- Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells. Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).
- Mackridge, A., Rowe, P. One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests. Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 93-103 (2018).
- Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. Caspases control antiviral innate immunity. Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).
