Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Messung der Caspase-Aktivität durch ein fluorogenes Substrat unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder einem Spektrofluorometer.
Abstract
Die Aktivierung von Cysteinproteasen, sogenannten Caspasen, bleibt ein wichtiger Prozess bei multiplen Formen des Zelltods. Caspasen sind wichtige Initiatoren und Vollstrecker der Apoptose, der am besten untersuchten Form des programmierten Zelltods. Apoptose tritt während Entwicklungsprozessen auf und ist ein notwendiges Ereignis in der Gewebehomöostase. Pyroptose ist eine andere Form des Zelltods, die Caspasen nutzt und ein kritischer Prozess bei der Aktivierung des Immunsystems durch die Aktivierung des Inflammasoms ist, was zur Freisetzung von Mitgliedern der Interleukin-1 (IL-1) -Familie führt. Um die Caspase-Aktivität zu beurteilen, können Zielsubstrate bewertet werden. Die Empfindlichkeit kann jedoch ein Problem sein, wenn einzelne Zellen oder eine geringe Aktivität untersucht werden. Wir zeigen, wie ein fluorogenes Substrat mit einem populationsbasierten Assay oder Einzelzellassay mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann. Mit der richtigen Kontrolle können verschiedene Aminosäuresequenzen verwendet werden, um zu identifizieren, welche Caspasen aktiv sind. Mit diesen Assays wurde der gleichzeitige Verlust der Inhibitoren von Apoptoseproteinen bei der Stimulation des Tumornekrosefaktors (TNF) identifiziert, der in erster Linie die Apoptose in Makrophagen und nicht andere Formen des Zelltods induziert.
Introduction
Caspasen sind an verschiedenen Formen des programmierten Zelltods beteiligt. Apoptose ist die am besten untersuchte Form des programmierten Zelltods und ist mit der Caspase-Aktivität1 verbunden. Alle Caspasen besitzen eine große und eine kleine katalytische Untereinheit. Caspase-1, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-9 und Caspase-11 besitzen eine Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (CARD), und Caspase-8 und Caspase-10 enthalten Death-Effektor-Domänen (DED)2,3,4,5 (Tabelle 1). Apoptose kann durch zwei Hauptwege initiiert werden: den extrinsischen Weg und den intrinsischen Weg. Der extrinsische apoptotische Signalweg wird durch Todesrezeptoren ausgelöst, die Teil der Tumornekrosefaktor-Superfamilie (TNFSF) sind. Todesrezeptoren besitzen DED-Domänen, die die Caspase-8-Aktivitäterleichtern 6. Der intrinsische apoptotische Weg beinhaltet die Aktivierung von Caspase-9 nach der Bildung des Apoptosoms, was die Freisetzung von Cytochrom c und Apaf-17 erfordert. Die Aktivierung des Initiators Caspase, Caspase-8 oder Caspase-9, führt zur Spaltung und anschließenden Aktivierung der Henker-Caspasen, die Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 sind. Die Identifikation, dass die Henkerskaspasen aktiv sind, deutet darauf hin, dass die Zellen Apoptose durchlaufen, und diese Aktivierung wird als wichtiger Faktor bei der Definition der Art des Zelltods angesehen.
Die Caspase-Aktivierung ist auch ein kritischer Punkt für die Regulierung von Entzündungen und die Induktion alternativer Formen des programmierten Zelltods. Zum Beispiel führt die Caspase-1-Aktivierung zur Reifung von proinflammatorischen Zytokinen der Interleukin-1-Familie8. Die Freisetzung und Aktivierung von Zytokinen aus dieser Familie, insbesondere IL-1β und IL-18, resultieren aus der Gasdermin-D-Spaltung und Porenbildung an der Plasmamembran 9,10. Eine unzureichende Membranreparatur der Gasdermin-D-Poren kann zu einer Art Zelltod führen, der als Pyroptose11 bekannt ist. Darüber hinaus führt die Caspase-8-Aktivität zur Hemmung eines Caspase-unabhängigen Zelltods, der als Nekroptose12 bekannt ist. Die mit Rezeptoren interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1) ist einer der kritischen Faktoren bei der Nekroptose und bei der Förderung von Entzündungen, die durch NF-kB reguliert werden. Modelle haben gezeigt, dass RIPK1 von Caspase-8 gespalten wird, was zu einer Einschränkung der NF-kB-Signalisierung, Apoptose und Nekroptose führt13,14. Daher kann die Identifizierung der Aktivität verschiedener Caspasen helfen, die daraus resultierende Entzündung und die Zelltodmodalität zu verstehen.
Unabhängig von der Funktion der Caspasen bei der Regulierung der Zelltodmodalitäten kann die Caspase-Aktivität auch andere Zytokinfamilien wie Interferon (IFN) als Reaktion auf eine Infektion regulieren15,16. Darüber hinaus sind Caspasen an Nicht-Zelltod-Funktionen beteiligt, einschließlich Zellschicksalsentscheidungen, Gewebereparatur und -regeneration, Tumorentstehung durch DNA-Reparatur und neuronale Synapsenfunktion. Es wird angenommen, dass die Aktivität von Caspasen in diesen nicht-tödlichen Rollen durch die zelluläre Lokalisation und die Anzahl der Caspasen begrenzt ist. Daher kann die Quantifizierung des Niveaus der Caspase-Aktivität durchaus bestimmen, ob eine Zelle einen Zelltod erfährt oder ob die Caspase eine Rolle bei einer Nicht-Zelltod-Funktion spielt 4,17,18.
Die Caspase-Aktivität kann mit mehreren Methoden bewertet werden. Western Blotting für gespaltene Caspasen und ihre Substrate wurde als Indikator für die Aktivität verwendet, aber diese Assays sind bestenfalls qualitativ. Um festzustellen, ob die Caspase-Aktivität mit dem Zelltod einhergeht, ist eine quantitative Messung ideal. Da Caspasen Substrate an einer Erkennungsstelle spalten, die aus vier Aminosäuren besteht, wurden kolorimetrische, Lumineszenz- oder fluorometrische Methoden entwickelt. Caspasen scheinen jedoch Plastizität in ihrer Substraterkennung zu haben 19,20. Die Erkennungssequenz ist nicht mit den Proteindomänen assoziiert (Tabelle 1). Die Tetrapeptidsequenz DEVD kann jedoch verwendet werden, um Caspase-3 und Caspase-7 Aktivität20,21 nachzuweisen.
Smac-Mimetika sind Verbindungen, die auf die Inhibitoren von Apoptoseproteinen (IAPs) abzielen. Die Verwendung von Smac-Mimetika in einer Untergruppe von Krebszellen führt dazu, dass die Zellen empfindlich auf den TNF-induzierten Zelltod reagieren22. In primären Makrophagen verursachen Smac-Mimetika den Zelltod ohne die exogene Zugabe von TNF23,24. Der Verlust von cIAP1 durch Smac-Mimetika-induzierte Degradation führt zur Produktion von TNF. Wenn Caspase-Aktivität nachgewiesen wird, bedeutet dies, dass die Zellen nicht durch Nekroptose, sondern apoptotisch abgestorben sind. Bei dieser Methode wird der Nachweis von gespaltenem DEVD-Substrat verwendet, um die Caspase-3/Caspase-7-Aktivität zu identifizieren. Weitere Experimente, um den apoptotischen Zelltod zu bestätigen, wurden zuvorveröffentlicht 24.
Protocol
Die vorliegende Studie wurde mit Genehmigung und nach den Richtlinien der Tierethikkommission der Universität Zürich (#ZH149/19) durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden männliche C57Bl/6J-Mäuse im Alter von 8 bis 16 Wochen verwendet, die unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen (SPF) gezüchtet und gehalten wurden. Die intakten Knochen können in steriler Hank's gepufferter Kochsalzlösung (HBSS) mit 2% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) auf Eis gehalten werden. Knochenmark wurde am Tag der Differenzierung aus dem Oberschenkelknochen und der Tibia der Maus25 entnommen. Beide Methoden zur Beurteilung der Caspase-Aktivität können für andere Zelltypen verwendet werden, einschließlich primärer und transformierter Zelltypen.
1. Differenzierung von Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs)
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube für Gewebekulturen durch und verwenden Sie sterile aseptische Techniken.
- Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 21-g-Nadel vor.
- Fügen Sie 5 ml HBSS + 2% FBS in ein 15-ml-Röhrchen hinzu.
- Nehmen Sie mit einer sterilen Pinzette einen ausgeschnittenen Oberschenkelknochen und führen Sie die Nadel in die Öffnung des Oberschenkelknochens ein. Halten Sie den Oberschenkelknochen im HBSS + 2% FBS und spülen Sie das Knochenmark aus, bis der Knochen weiß ist. Spülen Sie das Schienbein auf die gleiche Weise. Spülen Sie die Lösung weiter, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
- Die einzellige Suspension wird bei 200 x g 4 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand mit einem Vakuumsauger. Klopfen Sie auf das Röhrchen, um das Pellet vorsichtig zu resuspendieren. Fügen Sie 1 ml Erythrozyten-Lysepuffer hinzu (siehe Materialtabelle) und mischen Sie vorsichtig mit einer P1.000-Pipette. Inkubieren Sie bei RT für 1 min.
- Fügen Sie 10 ml HBSS + 2% FBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 4 min bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 10 ml Knochenmark-Makrophagen-Kulturmedium (BMDM).
HINWEIS: BMDM-Kulturmedium besteht aus niedrigem Glucose-DMEM mit Zusatz von 10% FBS, 20 ng/ml M-CSF, Penicillin (50 U/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) (siehe Materialtabelle). Alternativ kann das M-CSF durch 20% L929-konditioniertes Medium ersetzt werden. - 15 ml BMDM-Nährmedium in zwei 15 cm große Petrischalen geben. Fügen Sie 5 ml der einzelligen Lösung zu jeder Platte hinzu.
HINWEIS: Verwenden Sie keine mit Gewebekulturen behandelten Platten. Mit Gewebekulturen behandelte Platten schränken die Differenzierung ein. - Stellen Sie das Geschirr bei 37 °C, 5%CO2, für 6 Tage.
HINWEIS: Die BMDMs können nach 5-7 Tagen geerntet werden. Längere Inkubationszeiten zur Differenzierung führen zu einer erhöhten anti-apoptotischen Proteinexpression26.
2. Ernte, Aussaat und Behandlung von Zellen
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube für Gewebekulturen durch und verwenden Sie sterile aseptische Techniken. Vollständig differenzierte Makrophagen haften an der Platte, was eine einfache Trennung ermöglicht, während schwimmende Zellen verworfen werden können. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) kann mit oder ohne Ca2+ und Mg2+ verwendet werden.
- Entfernen Sie nach 6 Tagen Inkubation die schwimmenden Zellen und das Medium mit einem Absauggerät von der Platte.
- Fügen Sie 5 ml PBS zu jeder 15-cm-Platte hinzu. Entfernen Sie das PBS mit einem Absauggerät von der Platte.
- Geben Sie 2 ml Trypsin (siehe Materialtabelle) zu jeder Platte. Inkubieren Sie die Platte, bis ein sanftes Klopfen der Platte die Zellen löst. Nehmen Sie 5 ml BMDM-Kulturmedium und entnehmen Sie die Zellen von der Platte.
- Auf die zweite 15-cm-Platte geben und die Zellen von der Platte abnehmen. Nehmen Sie die Zellsuspension von der Platte in ein 50-ml-Röhrchen. Nehmen Sie weitere 5 ml BMDM-Kulturmedium und waschen Sie beide Platten, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt wurden. Geben Sie die Zellsuspension in das gleiche 50-ml-Röhrchen.
- Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und zählen Sie mit einem Hämazytometer in einer 1:1-Verdünnung mit Trypanblau.
HINWEIS: Automatische Zellzähler können ebenfalls verwendet werden, wenn sie für die Größe der Makrophagen kalibriert sind. - Säen Sie die Makrophagen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml. BMDMs, die in 2 x 10 6 Zellen/Well in einer 6-Well-Platte ausgesät werden, liefern etwa 2 mg/ml Gesamtprotein. Lassen Sie die Zellen vor der Behandlung mindestens 6 h an der Platte haften.
HINWEIS: Für andere Zelltypen muss die optimale Konzentration bestimmt werden. - Die Makrophagen werden mit Smac-Mimetikum (Verbindung A, siehe Materialtabelle)22 bei 250 nM und 500 nM für 16 h behandelt.
HINWEIS: Fügen Sie eine Positivkontrolle hinzu, um Apoptose und Caspase-3-Spaltung zu induzieren, um sicherzustellen, dass der Assay funktioniert. Häufige Apoptose-Induktoren sind Staurosporin und Etoposid. Für viele Zelllinien, die Apoptose durchlaufen, sind 0,1-10 μM für 16 Stunden Stimulation ausreichend.
3. Herstellung von Zelllysaten aus behandelten Zellen
HINWEIS: Dieser Schritt muss auf Eis durchgeführt werden, und die Reagenzien und Materialien müssen vorgekühlt werden.
- Die Platten mit den behandelten Zellen werden auf das Eis übertragen. Das Medium aus der Zellkultur in ein 1,5 ml Röhrchen geben, bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, das Medium absaugen und das Röhrchen auf Eis legen. Dies ermöglicht das Sammeln der Zellen, die sich von der Platte gelöst haben.
- Geben Sie 1 ml kaltes PBS in die Zellkulturplatte, um die Zellen zu waschen, und saugen Sie das gesamte PBS ab. Fügen Sie den Zellen 100 μL Trypsin hinzu (wenn Sie mit einer 6-Well-Schale arbeiten). Lassen Sie das Trypsin die Zellen von der Platte heben und sammeln Sie sie in der 1,5-ml-Röhre. Verwenden Sie 1 ml kaltes PBS, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt wurden.
HINWEIS: Wenn Sie mit Suspensionszellen arbeiten, übertragen Sie das Medium und die Zellen vorsichtig in ein 1,5-ml-Röhrchen. - Die Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 100 μL DISC-Lysepuffer (150 mM Natriumchlorid, 2 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 10 % Glycerin, 20 mM Tris, pH 7,5, siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie die Proben für 20 Minuten auf Eis.
- Die Lysate werden bei ~12.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die unlösliche Fraktion zu pelletieren.
- Übertragen Sie 25 μL des Lysats in eine weiße 96-Well-Platte mit flachem Boden für den Caspase-3/Caspase-7-Aktivitätstest (Schritt 5).
HINWEIS: Stören Sie das Pellet nicht. Dies ist die unlösliche Fraktion des Zelllysats. - Übertragen Sie 10 μL des verbleibenden Lysats in eine transparente, flache 96-Well-Platte für den Bicinchoninsäure (BCA)-Assay (Schritt 4). Dies wird für die Normalisierung der Proben verwendet.
- Bewahren Sie beide Platten für die weitere Verarbeitung auf Eis.
HINWEIS: In diesem Stadium können die Platten mit einer Klebeabdeckung versiegelt und bei −20 °C für ca. 4 Wochen gelagert werden.
4. Proteinquantifizierung mit dem BCA-Assay
HINWEIS: Andere Reagenzien oder Assays können verwendet werden, um die Proteinmenge in jeder Probe zu quantifizieren. Im populationsbasierten Assay können die Proben verglichen werden, indem die im Assay verwendete Proteinmenge normalisiert wird.
- Bereiten Sie Standardproteinkonzentrationen zwischen 0 μg/ml und 2.000 μg/ml (0 μg/ml, 25 μg/ml, 125 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml, 100 μg/ml, 1.500 μg/ml, 2.000 μg/ml) mit Rinderserumalbumin (BSA) vor. Bereiten Sie Rohlinge nur mit Lysepuffer vor.
- 10 μl jedes Standards werden in die 96-Well-Platte mit flachem Boden gegeben, die die in Schritt 3.7 genannten Proben enthält.
- Mischen Sie BCA-Reagenz 1 mit BCA-Reagenz 2 im Verhältnis 50:1 (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 200 μL gemischtes BCA-Reagenz zu jeder Probe und jedem Standard hinzu.
- Bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Messen Sie die Absorption bei 562 nm auf einem fluorometrischen Gerät und quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit der Standardkurve.
5. Populationsbasierter Assay für die Caspase-3/Caspase-7-Aktivität
HINWEIS: Lassen Sie die Zelllysate in der Platte nicht länger als 3 Stunden auf Eis sitzen. Wenn Caspase-Aktivität vorhanden ist, nimmt diese mit der Zeit zu, obwohl sich die Probe auf Eis befindet. Wenn die Proben gefroren wurden, tauen Sie sie auf Eis auf und fahren Sie sofort fort, sobald die Lysate aufgetaut sind.
- Starten Sie das fluorometrische Gerät (siehe Materialtabelle) und heizen Sie die Maschine auf 37 °C auf. Bereiten Sie das Skript wie erwähnt vor:
- Führen Sie 40 Minuten lang jede Minute individuelle Messungen durch, um die Kinetik der Reaktion zu bestimmen.
- Stellen Sie die Anregung auf 360 nm und die Emission auf 465 nm ein. Zehn Blitze pro Vertiefung sind ausreichend.
- Bereiten Sie die Positivkontrolle von rekombinantem Caspase-3 vor (siehe Materialtabelle). Mischen Sie 1 E des rekombinanten Caspase-3-Enzyms in 50 μL Lysepuffer (Röhrchen 1). Fügen Sie 25 μL Lysepuffer zu weiteren drei Röhrchen hinzu. 25 μL von Röhrchen 1 auf Röhrchen 2 übertragen. Durch Pipettieren mischen.
- Wiederholen Sie den Vorgang für Röhre 3 und Röhre 4. Röhrchen 5 enthält nur 50 μL Lysepuffer. Geben Sie 25 μl jedes Standards in die weiße 96-Well-Platte mit flachem Boden für den Caspase-3-Aktivitätstest, der in Schritt 3.6 erwähnt wird.
- Bereiten Sie eine Master-Reaktionsmischung für den Caspase-Aktivitätstest auf Eis vor. Für eine Reaktion mischen Sie 50 μL 2x Caspase-Spaltpuffer (0,2 M HEPES pH 7,5; 20 % Saccharose oder PEG; 0,2 % CHAPS), 5 μL 1 mM Devd-AMC (Caspase-3-Tetrapeptidsubstrat), 2 μL 500 mM DTT und 18 μL deionisiertes Wasser (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie jeder Probe und jedem Standard 75 μL der Reaktionsmischung hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl zu erhalten.
- Die Fluoreszenz wird sofort mit dem in Schritt 5.1 eingerichteten fluorometrischen Gerät gemessen.
- Subtrahieren Sie für jede Fluoreszenzmessung den Fluoreszenzwert für den Blindwert (nur Lysepuffer) von der Fluoreszenz der Probe. Normalisieren Sie den Messwert, indem Sie ihn durch die Proteinkonzentration der Probe dividieren (berechnet in Schritt 4.5)27:
- Berechnen Sie die Caspase-Aktivität, indem Sie die Steigung der normierten Fluoreszenz auf der y-Achse und die Zeit auf der x-Achse bestimmen.
6. Einzelzell-Assay (Durchflusszytometrie-Analyse) für Caspase-3/Caspase-7-Aktivität
- Säen Sie die Zellen wie in Abschnitt 2 beschrieben aus.
- Ernten Sie die Zellen in ein 5 ml Polystyrolröhrchen. Wenn Sie mit adhärenten Zellen arbeiten, sammeln Sie das Medium in das 5-ml-Röhrchen. Geben Sie 1 ml kaltes PBS in die Zellkulturplatte und sammeln Sie das PBS in das 5-ml-Röhrchen. Fügen Sie den Zellen Trypsin hinzu (100 μL, wenn Sie mit 6-Well-Schalen arbeiten). Lassen Sie das Trypsin die Zellen von der Platte abheben und sammeln Sie sie in der 5-ml-Röhre. Verwenden Sie 1 ml kaltes PBS, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt wurden.
HINWEIS: Wenn Sie mit Suspensionszellen arbeiten, übertragen Sie das Medium und die Zellen vorsichtig in ein 5-ml-Röhrchen. - Die Proben werden bei 300 x g für 5 min, 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand mit einem Vakuumsauger.
- Bereiten Sie die Färbemischung vor. Die optimale Färbekonzentration beträgt 1 x 10 6-2 x 106 Zellen in 50 μL. Verdünnen Sie das fluorogene Substrat gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle, Durchflusszytometrie). Nehmen Sie 1 μL des Stammsubstrats und verdünnen Sie es in 150 μL PBS. Fügen Sie 50 μl pro Probe hinzu.
- Die Proben werden bei 37 °C 30 min lichtgeschützt inkubiert, wobei alle 15 min gemischt wird.
- Verwenden Sie mit dem in dieser Studie verwendeten Durchflusszytometer den roten Laser bei 640 nm und detektieren Sie mit 675/25 nm. Führen Sie zuerst die ungefärbte Kontrollstichprobe durch und erfassen Sie mindestens 10.000 Ereignisse der gewünschten Population. Schließen Sie die Trümmer mit einem Gate (P1) auf einem FSC-A- und SSC-A-Punktdiagramm aus.
- Verwenden Sie ein Histogramm, das die Ereignisse im P1-Gate und die Detektion für das Caspase-Substrat (y-Achse) anzeigt, um die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) zu bestimmen.
ANMERKUNG: Das in dieser Methode beschriebene Caspase-Substrat erfordert eine Anregung bei 590 nm und emittiert bei 628 nm.
- Verwenden Sie ein Histogramm, das die Ereignisse im P1-Gate und die Detektion für das Caspase-Substrat (y-Achse) anzeigt, um die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) zu bestimmen.
Representative Results
Primäre Mausmakrophagen wurden 6 Tage lang differenziert. Nach 6 Tagen wurden die Zellen geerntet, gezählt und ausgesät. Die folgenden Behandlungen wurden verwendet: keine Behandlung und Smac-Mimetikum (Verbindung A)22 bei 250 nM und 500 nM für 16 h (Abbildung 1). Das Experiment wurde doppelt durchgeführt, um die Aktivierung von Caspase-3/Caspase-7 entweder durch einen populationsbasierten Assay oder eine Einzelzellanalyse mittels Durchflusszytometrie beurteilen zu können.
Die Proteinkonzentration der Zelllysate wurde mit Hilfe des BCA-Assays quantifiziert (Ergänzungstabelle 1). Dies ist notwendig, um sicherzustellen, dass die Menge an Protein, die im Caspase-3/Caspase-7-Aktivitätstest verwendet wird, zwischen den Proben gleich ist. In diesem populationsbasierten Assay können die Daten auf zwei Arten dargestellt werden. Die erste besteht darin, die Kinetik zu zeigen, indem die angepasste Fluoreszenz (y-Achse) in Abhängigkeit von der Zeit (x-Achse) aufgetragen wird (Abbildung 2A). Alternativ kann die Steigung berechnet werden, um die Proben direkt zu vergleichen (Abbildung 2B). Der Anstieg der Steigung bei einer mimetischen Behandlung mit 500 nM Smac war auf der Grundlage einer gewöhnlichen Einweg-ANOVA mit mehreren Vergleichen nicht signifikant (Dunnetts multipler Vergleichstest28).
Für die Analyse der Caspase-3/Caspase-7-Aktivität mittels Durchflusszytometrie wurden die Zellen und der Überstand geerntet. Als Negativkontrolle wurden ungefärbte Zellen oder Fluoreszenz minus eins verwendet, ebenso wie die unbehandelten Zellen. Ein Histogramm der durch Durchflusszytometrie gewonnenen Zellen zeigte eine Verschiebung der Fluoreszenz für die mit Smac-Mimetika behandelten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (Abbildung 2C). Die Daten können entweder als mediane Fluoreszenzintensität (Abbildung 2D) oder als Faltenänderung über den unbehandelten Zellen (Abbildung 2E) dargestellt werden.
Abbildung 1: Flussdiagramm der Studie . (A) Oberschenkelknochen und Tibien wurden von C57Bl/6-Mäusen herausgeschnitten. Die Knochen wurden gespült und 6 Tage lang in 20 ng/mL M-CSF differenziert. (B) Am 6. Tag wurden Makrophagen entnommen und zur Behandlung erneut ausgesät. Ein Satz von Zellen wurde für Lysate geerntet und durch fluorogene Aktivität bewertet, während der andere Satz geerntet, mit dem fluorogenen Substrat inkubiert und durch Durchflusszytometrie beurteilt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Kinetischer Assay für Caspase-3/Caspase-7-Aktivität und Substratspaltung mittels Durchflusszytometrie. (A,B) Repräsentative Daten des kinetischen Assays für Caspase-3/Caspase-7-Aktivität (C-E) und Substratspaltung mittels Durchflusszytometrie. Die Makrophagen wurden mit zwei Konzentrationen von Smac-Mimetikum (Verbindung A; 250 nM und 500 nM) für 16 h behandelt. (A) Nachweis des gespaltenen DEVD-AFC-Substrats über die Zeit. Die Daten wurden auf die Proteinkonzentration in der Probe normiert. (B) Die Spaltungsrate (Steigung) von DEVD AFC für jede Probe wurde auf die unbehandelte Steigung normiert und als Faltenänderung über den unbehandelten Zellen dargestellt. (C) Durchflusszytometrische Histogramme der Zellen, die mit dem Caspase-3-Substrat inkubiert wurden. (D,E) MFI-Vergleich und Faltenveränderung im MFI im Vergleich zur unbehandelten Probe. Jeder Datenpunkt stellt eine unabhängige Stichprobe dar. Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts werden angezeigt; *p < 0,05 unter Verwendung einer Einweg-ANOVA und mehrerer Vergleichstests (Dunnett-Mehrfachvergleichstest). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Caspase | Spezies | Substrat-Sequenz | Proteindomänen | ||
| Caspase-1 | Hs, Mm | (W/L) EHD | CARD, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-2 | Hs, Mm | DEXD | CARD, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-4 | Hs | (W/L) EHD | CARD, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-5 | Hs | (W/L) EHD | CARD, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-9 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | CARD, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-11 | Mm | (W/L) EHD | CARD, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-12 | Mm | ATAD | CARD, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-8 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | DED, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-10 | Hs | (I/V/L) E(H/T)D | DED, große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-3 | Hs, Mm | DEXD | Große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-6 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | Große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-7 | Hs, Mm | DEXD | Große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| Caspase-14 | hs, mm | (W/L) EHD | Große Domäne, kleine katalytische Domäne | ||
| KARTE | Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne | ||||
| DED | Death-Effektor-Domäne | ||||
| Hs | Homo sapien | ||||
| Mm | Musus musculus | ||||
Tabelle 1: Substratspezifität und die Proteindomänen der Caspasen. Die Tabelle wurde von McStay et al.20 übernommen; Shalini et al.3; und van Opdenbosch und Lamkanfi4.
Ergänzungstabelle 1: kinetische DEVD-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Bei dieser Methode wird ein fluorogenes Substrat in einem populationsbasierten Assay oder einer Einzelzellanalyse verwendet, um die Caspase-3/Caspase-7-Aktivität zu messen. Beide Methoden messen die Caspase-Aktivität quantitativ anhand der Spaltung eines Substrats. Ein Vorteil ist die Möglichkeit, diese Methoden für eine Vielzahl von Proben zu verwenden. Mit diesen Methoden wird die Caspase-3/Caspase-7-Aktivität in primären Makrophagen nachgewiesen, die mit Smac-Mimetika behandelt wurden.
Ein kritischer Aspekt des populationsbasierten fluorometrischen Assays ist die Zeit von der Lyse bis zum Ablesen der Fluoreszenz. Die Proben müssen während des gesamten Verfahrens auf Eis gehalten werden, insbesondere vor dem "Ablesen" des Assays. Dies verhindert eine vorzeitige Spaltung und Fluoreszenz des Substrats. Bei Verwendung des populationsbasierten Assays ist möglicherweise weniger Optimierung erforderlich. Die Menge an Protein, die im Assay verwendet wird, wird normalisiert, so dass die Proben direkt verglichen werden können. Ein Nachteil ist, dass in einem späten Stadium des apoptotischen Zelltods die Gesamtproteinmenge reduziert wird; Daher ist der Nachweis der Caspase-Aktivität möglicherweise nicht möglich. Um dieses Problem zu umgehen, werden unterschiedliche Kinetik oder unterschiedliche Behandlungsdosen empfohlen. Darüber hinaus kann neben der in dieser Methode beschriebenen Software auch andere Software verwendet werden, um die Rate der Caspase-Aktivität genau zu bewerten.
Für den durchflusszytometrischen Assay sind genügend Ereignisse oder Zellen erforderlich, um die Populationen sicher zu steuern. Darüber hinaus kann eine weitere Optimierung des flussbasierten Assays erforderlich sein, um das optimale Verhältnis von Substrat zu Zellzahl zu erreichen. Mit der Durchflusszytometrie bietet sich diese Methode jedoch an, um zusätzliche Parameter zu messen, wie z.B. Zelloberflächenmarker zur Zelltypidentifikation.
Sowohl die Populations- als auch die Einzelzellmethode könnten für andere Caspasen verwendet werden. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Erkennungssequenz für andere Caspasen weniger diskriminiert wird. Daher müssen andere Methoden für die Caspase-Aktivität verwendet werden. Dazu gehören die Hemmung der Caspase-Aktivität, CRISPR oder Knock-down bestimmter Caspasen und Western Blotting, um die Spaltung bekannter Substrate zu erkennen.
Eine alternative Methode zur Detektion der Caspase-Aktivität ist die Zeitrafferaufnahme. Das gleiche permeable Caspase-Substrat könnte zusammen mit anderen Lebensfähigkeitsmarkern wie Annexin V verwendet werden, um Informationen über die Kinetik des Zelltods zu liefern. Die Bildgebung würde auch die Caspase-Aktivität und das Zellüberleben trennen, was den Nachweis subletaler Mengen an Caspase-Aktivität in einer Zellpopulation ermöglicht. Die nicht-letalen Funktionen von Caspase-3/Caspase-7 sind mit der antiviralen Regulation in angeborenen Immunzellen29 verbunden, insbesondere mit der Aktivierung von Typ-I-IFN über die mitochondriale DNA-Freisetzung15,16. Daher sind diese Assays zur Messung der Caspase-Aktivität entscheidend für die Identifizierung verschiedener Arten des Zelltods und können bei der Beurteilung von Nicht-Zelltodfunktionen nützlich sein.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
W.W.W. wird durch das Clöetta Medical Research Fellow Stipendium unterstützt, S.R. wird vom CanDoc UZH Forschungskredit unterstützt und J.T. wird vom Chinese Scholarship Council unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| 15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
| 37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
| 6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
| 96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
| 96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
| Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
| BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
| b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
| caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
| CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
| DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
| EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
| Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
| FBS | Thermoscientific | 26140 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
| Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
| M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
| M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | |
| PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
| protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
| Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
| sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
| sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
| Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
| sucrose | Sigma | 1.07687 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |
References
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