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Biochemistry

फ्लोरोमेट्रिक परख या फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके कैस्पेज़ गतिविधि को मापना

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64745
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Experimental Immunology, University of Zürich

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री या स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग करके फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के माध्यम से कैसपेज़ गतिविधि को मापने के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

सिस्टीन प्रोटीज की सक्रियता, जिसे कैसपेस के रूप में जाना जाता है, कोशिका मृत्यु के कई रूपों में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया बनी हुई है। कैसपेस एपोप्टोसिस के महत्वपूर्ण सर्जक और निष्पादनकर्ता हैं, जो क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का सबसे अधिक अध्ययन किया गया रूप है। एपोप्टोसिस विकास प्रक्रियाओं के दौरान होता है और ऊतक होमियोस्टैसिस में एक आवश्यक घटना है। पाइरोप्टोसिस कोशिका मृत्यु का एक और रूप है जो कैसपेस का उपयोग करता है और सूजन के सक्रियण के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, जिसके परिणामस्वरूप इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) परिवार के सदस्यों की रिहाई होती है। कैसपेस गतिविधि का आकलन करने के लिए, लक्ष्य सब्सट्रेट्स का आकलन किया जा सकता है। हालांकि, एकल कोशिकाओं या निम्न-स्तरीय गतिविधि की जांच करते समय संवेदनशीलता एक मुद्दा हो सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि फ्लो साइटोमेट्री द्वारा जनसंख्या-आधारित परख या एकल-सेल परख के साथ एक फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग कैसे किया जा सकता है। उचित नियंत्रण के साथ, विभिन्न अमीनो एसिड अनुक्रमों का उपयोग यह पहचानने के लिए किया जा सकता है कि कौन से कैसपेस सक्रिय हैं। इन परखों का उपयोग करके, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) उत्तेजना पर एपोप्टोसिस प्रोटीन के अवरोधकों के एक साथ नुकसान की पहचान की गई है, जो मुख्य रूप से कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों के बजाय मैक्रोफेज में एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है।

Introduction

कैसपेस प्रोग्राम्ड सेल डेथ के कई रूपों में शामिल हैं। एपोप्टोसिस प्रोग्राम्ड सेल डेथ का सबसे अधिक अध्ययन किया गया रूप है और कैसपेज़ गतिविधि1 से जुड़ा हुआ है। सभी कैसपेस में एक बड़ा और छोटा उत्प्रेरक सबयूनिट होता है। कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -4, कैसपेज़ -5, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -11 में एक कैसपेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन (CARD) होता है, और कैसपेज़ -8 और कैस्पेज़ -10 में डेथ एफेक्टर डोमेन (DED)2,3,4,5 (तालिका 1) होते हैं। एपोप्टोसिस को दो प्रमुख मार्गों द्वारा शुरू किया जा सकता है: बाह्य मार्ग और आंतरिक मार्ग। बाह्य एपोप्टोटिक मार्ग मृत्यु रिसेप्टर्स द्वारा ट्रिगर किया जाता है, जो ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर सुपरफैमिली (टीएनएफएसएफ) का हिस्सा हैं। डेथ रिसेप्टर्स में डीईडी डोमेन होते हैं, जो कैसपेज़ -8 गतिविधि 6 की सुविधा प्रदान करतेहैं। आंतरिक एपोप्टोटिक मार्ग में एपोप्टोसोम के गठन के बाद कैसपेज़ -9 की सक्रियता शामिल है, जिसमें साइटोक्रोम सी और एपफ -1 7 की रिहाई की आवश्यकता होतीहै। या तो आरंभकर्ता कैस्पेज़, कैस्पेज़ -8 या कैसपेज़ -9 की सक्रियता, निष्पादनकर्ता कैसपेज़ के दरार और बाद में सक्रियण की ओर ले जाती है, जो कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6 और कैसपेज़ -7 हैं। यह पहचानना कि निष्पादक कैसपेस सक्रिय हैं, इंगित करता है कि कोशिकाएं एपोप्टोसिस से गुजर रही हैं, और इस सक्रियण को कोशिका मृत्यु के मोड को परिभाषित करने में एक महत्वपूर्ण कारक माना जाता है।

कैस्पेज़ सक्रियण सूजन को विनियमित करने और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु के वैकल्पिक रूपों के प्रेरण के लिए एक महत्वपूर्ण मोड़ भी है। उदाहरण के लिए, कैसपेज़ -1 सक्रियण इंटरल्यूकिन -1 परिवार 8 के प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की परिपक्वता की ओर जाताहै। इस परिवार से साइटोकिन्स की रिहाई और सक्रियण, विशेष रूप से आईएल -1 और आईएल -18, प्लाज्मा झिल्ली 9,10 पर गैसडर्मिन डी दरार और छिद्र गठन के परिणामस्वरूप होता है। गैसडर्मिन डी छिद्रों की अपर्याप्त झिल्ली की मरम्मत के परिणामस्वरूप एक प्रकार की कोशिका मृत्यु हो सकती है जिसेपाइरोप्टोसिस 11 के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, कैसपेज़ -8 गतिविधि के परिणामस्वरूप एक कैसपेज़-स्वतंत्र कोशिका मृत्यु का निषेध होता है जिसे नेक्रोप्टोसिस12 के रूप में जाना जाता है। रिसेप्टर-इंटरैक्टिंग सेरीन /थ्रेओनिन प्रोटीन काइनेज 1 (RIPK1) नेक्रोप्टोसिस में महत्वपूर्ण कारकों में से एक है और NF-kB द्वारा विनियमित सूजन को चलाने में है। मॉडल से पता चला है कि RIPK1 को कैसपेज़ -8 द्वारा छोड़ दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप NF-kB सिग्नलिंग, एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस13,14 सीमित होते हैं। इसलिए, विभिन्न कैसपेस की गतिविधि की पहचान करने से परिणामस्वरूप सूजन और कोशिका मृत्यु पद्धति को समझने में सहायता मिल सकती है।

कोशिका मृत्यु के तौर-तरीकों को विनियमित करने में कैसपेस के कार्य से स्वतंत्र, कैसपेज़ गतिविधि संक्रमण15,16 के जवाब में इंटरफेरॉन (आईएफएन) जैसे अन्य साइटोकिन परिवारों को भी विनियमित कर सकती है। इसके अतिरिक्त, कैसपेस गैर-कोशिका मृत्यु कार्यों में शामिल हैं, जिसमें सेल भाग्य निर्णय, ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन, डीएनए मरम्मत के माध्यम से ट्यूमरजेनिसिस और न्यूरोनल सिनैप्स फ़ंक्शन शामिल हैं। इन गैर-घातक भूमिकाओं में कैसपेस की गतिविधि को सेलुलर स्थानीयकरण और कैसपेस की मात्रा से सीमित माना जाता है। इसलिए, कैसपेज़ गतिविधि के स्तर को निर्धारित करना अच्छी तरह से परिभाषित कर सकता है कि क्या एक कोशिका कोशिका मृत्यु से गुजरती है या क्या कैसपेज़ गैर-कोशिका मृत्यु समारोह 4,17,18 में भूमिका निभाता है।

कैसपेस गतिविधि का मूल्यांकन कई तरीकों से किया जा सकता है। क्लीवर कैसपेस और उनके सब्सट्रेट्स के लिए पश्चिमी सोख्ता का उपयोग गतिविधि के संकेतक के रूप में किया गया है, लेकिन ये परख सबसे अच्छा गुणात्मक हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कैसपेस गतिविधि कोशिका मृत्यु से जुड़ी है, एक मात्रात्मक माप आदर्श है। चूंकि कैस्पेस चार अमीनो एसिड, कलरमेट्रिक, ल्यूमिनेसेंस या फ्लोरोमेट्रिक विधियों से युक्त एक मान्यता स्थल पर सब्सट्रेट्स को छोड़ देते हैं। हालांकि, कैसपेस में उनके सब्सट्रेट मान्यता19,20 में प्लास्टिसिटी दिखाई देती है। मान्यता अनुक्रम प्रोटीन डोमेन (तालिका 1) से जुड़ा नहीं है। टेट्रापेप्टाइड अनुक्रम डीईवीडी, हालांकि, कैसपेज़ -3 और कैसपेज़ -7 गतिविधि20,21 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

स्मैक मिमेटिक्स एपोप्टोसिस प्रोटीन (आईएपी) के अवरोधकों को लक्षित करने वाले यौगिक हैं। कैंसर कोशिकाओं के उप-समूह में स्मैक मिमेटिक्स का उपयोग कोशिकाओं को टीएनएफ-प्रेरित कोशिका मृत्यु के प्रति संवेदनशील होने का कारण बनताहै। प्राथमिक मैक्रोफेज में, स्मैक मिमेटिक्स टीएनएफ23,24 के बहिर्जात जोड़ के बिना कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। स्मैक मिमेटिक-प्रेरित गिरावट द्वारा सीआईएपी 1 के नुकसान के परिणामस्वरूप टीएनएफ का उत्पादन होता है। यदि कैसपेस गतिविधि का पता लगाया जाता है, तो इसका मतलब है कि कोशिकाएं नेक्रोप्टोसिस से नहीं बल्कि एपोप्टोटिक तरीके से मर गईं। इस विधि में, कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि की पहचान करने के लिए क्लीवर डीईवीडी सब्सट्रेट का पता लगाने का उपयोग किया जाता है। एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु की पुष्टि करने के लिए आगे के प्रयोगपहले 24 प्रकाशित किए गए हैं।

Protocol

वर्तमान अध्ययन अनुमोदन के साथ और ज्यूरिख विश्वविद्यालय की पशु नैतिक समिति के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए किया गया था (#ZH149/19)। वर्तमान अध्ययन के लिए 8-16 सप्ताह की आयु के नर सी 57 बीएल / 6 जे चूहों का उपयोग किया गया था, जिन्हें विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) स्थितियों में पाला और रखा गया था। बरकरार हड्डियों को बाँझ हैंक के बफर्ड खारा समाधान (एचबीएसएस) में 2% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ बर्फ पर रखा जा सकता है। अस्थि मज्जा भेदभाव के दिन माउस25 के फीमर और टिबिया से एकत्र किया गया था। कैसपेज़ गतिविधि का आकलन करने के लिए दोनों तरीकों का उपयोग अन्य सेल प्रकारों के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्राथमिक और रूपांतरित दोनों शामिल हैं।

1. अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDM) को अलग करना

नोट: एक ऊतक संस्कृति लैमिनार प्रवाह हुड में सभी चरणों का प्रदर्शन करें, और बाँझ सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करें।

  1. 21 ग्राम सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज तैयार करें।
  2. 15 एमएल ट्यूब में 5 एमएल एचबीएसएस + 2% एफबीएस जोड़ें।
  3. बाँझ बल का उपयोग करके, एक उत्पादित फीमर लें, और सुई को फीमर के उद्घाटन में डालें। एचबीएसएस + 2% एफबीएस में फीमर को पकड़ते हुए, अस्थि मज्जा को तब तक बाहर निकालें जब तक कि हड्डी सफेद न हो जाए। टिबिया को उसी तरह से फ्लश करें। एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए समाधान को फ्लश करना जारी रखें।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 मिनट के लिए 200 x g पर एकल-सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को हटा दें। गोली को धीरे से पुन: निलंबित करने के लिए ट्यूब टैप करें। लाल सेल लाइसिस बफर का 1 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और पी 1,000 पिपेट के साथ धीरे से मिलाएं। 1 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  6. 10 एमएल एचबीएसएस + 2% एफबीएस जोड़ें, और आरटी में 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  7. सुपरनैटेंट को हटा दें, और अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) संस्कृति माध्यम के 10 एमएल में पुन: निलंबित करें।
    नोट: बीएमडीएम संस्कृति माध्यम में 10% एफबीएस, 20 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ, पेनिसिलिन (50 यू / एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 μg / mL) के अतिरिक्त कम ग्लूकोज डीएमईएम शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। वैकल्पिक रूप से, एम-सीएसएफ के लिए 20% एल 929 वातानुकूलित माध्यम को प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  8. दो 15 सेमी पेट्री व्यंजनों में 15 एमएल बीएमडीएम संस्कृति माध्यम जोड़ें। प्रत्येक प्लेट में एकल-सेल समाधान के 5 एमएल जोड़ें।
    नोट: ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों का उपयोग न करें। ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटें भेदभाव को सीमित करती हैं।
  9. व्यंजन को 6 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रखें।
    नोट: बीएमडीएम को 5-7 दिनों के बाद काटा जा सकता है। भेदभाव के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय एंटी-एपोप्टोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति में वृद्धि होतीहै।

2. कोशिकाओं की कटाई, बीजारोपण और उपचार

नोट: एक ऊतक संस्कृति लैमिनार प्रवाह हुड में सभी चरणों का प्रदर्शन करें, और बाँझ सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करें। पूरी तरह से विभेदित मैक्रोफेज प्लेट का पालन करते हैं, जिससे आसान पृथक्करण की अनुमति मिलती है, जबकि फ्लोटिंग कोशिकाओं को छोड़ दिया जा सकता है। फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) का उपयोग सीए2 + और एमजी 2 + के साथ या उसके बिना किया जा सकताहै।

  1. इनक्यूबेशन के 6 दिनों के बाद, एक श्वासयंत्र का उपयोग करके प्लेट से फ्लोटिंग कोशिकाओं और माध्यम को हटा दें।
  2. प्रत्येक 15 सेमी प्लेट में 5 एमएल पीबीएस जोड़ें। एक एस्पिरेटर का उपयोग करके प्लेट से पीबीएस को हटा दें।
  3. प्रत्येक प्लेट में 2 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्लेट को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि प्लेट का कोमल टैपिंग कोशिकाओं को हटा न दे। बीएमडीएम संस्कृति माध्यम के 5 एमएल लें, और प्लेट से कोशिकाओं की कटाई करें।
    1. दूसरी 15 सेमी प्लेट में स्थानांतरित करें, और प्लेट से कोशिकाओं को काटें। प्लेट से सेल निलंबन को 50 एमएल ट्यूब में निकालें। बीएमडीएम संस्कृति माध्यम का एक अतिरिक्त 5 एमएल लें, और यह सुनिश्चित करने के लिए दोनों प्लेटों को धो लें कि सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है। सेल निलंबन को उसी 50 एमएल ट्यूब में रखें।
  4. सेल सस्पेंशन का 10 μL लें, और ट्रिपैन ब्लू के साथ 1: 1 कमजोर पड़ने का उपयोग करके हेमसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती करें।
    नोट: मैक्रोफेज के आकार के लिए कैलिब्रेट किए जाने पर स्वचालित सेल काउंटरों का भी उपयोग किया जा सकता है।
  5. मैक्रोफेज को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर बीज दें। 6-वेल प्लेट में 2 x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से बीजित बीएमडीएम लगभग 2 मिलीग्राम / एमएल कुल प्रोटीन प्रदान करते हैं। उपचार से पहले कोशिकाओं को कम से कम 6 घंटे के लिए प्लेट का पालन करने दें।
    नोट: अन्य सेल प्रकारों के लिए, इष्टतम एकाग्रता निर्धारित की जानी चाहिए।
  6. मैक्रोफेज को स्मैक मिमेटिक (यौगिक ए, सामग्री की तालिका देखें) 22 के साथ 250 एनएम और 500 एनएम के साथ 16 घंटे के लिए इलाज करें।
    नोट: परख काम कर रही है यह सुनिश्चित करने के लिए एपोप्टोसिस और कैसपेज़ -3 दरार को प्रेरित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करें। सामान्य एपोप्टोसिस इंड्यूसर में स्टौरोस्पोरिन और एटोपोसाइड शामिल हैं। एपोप्टोसिस से गुजरने के लिए कई सेल लाइनों के लिए, उत्तेजना के 16 घंटे के लिए 0.1-10 μM पर्याप्त है।

3. उपचारित कोशिकाओं से सेल लाइसेट तैयार करना

नोट: यह कदम बर्फ पर किया जाना चाहिए, और अभिकर्मकों और सामग्रियों को पूर्व-ठंडा किया जाना चाहिए।

  1. उपचारित कोशिकाओं वाली प्लेटों को बर्फ पर स्थानांतरित करें। सेल कल्चर से माध्यम को 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, माध्यम को एस्पिरेट करें, और ट्यूब को बर्फ पर रखें। यह उन कोशिकाओं के संग्रह की अनुमति देता है जो प्लेट से अलग हो गए हैं।
  2. कोशिकाओं को धोने के लिए सेल कल्चर प्लेट में 1 एमएल ठंडा पीबीएस जोड़ें, और सभी पीबीएस को एस्पिरेट करें। कोशिकाओं में ट्रिप्सिन के 100 μL जोड़ें (यदि 6-वेल डिश के साथ काम कर रहे हैं)। ट्रिप्सिन को प्लेट से कोशिकाओं को उठाने की अनुमति दें, और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है, 1 एमएल ठंडे पीबीएस का उपयोग करें।
    नोट: निलंबन कोशिकाओं के साथ काम करते समय, धीरे से माध्यम और कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. कोशिकाओं को 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को हटा दें, और 100 μL DISC लिसिस बफर (150 mM सोडियम क्लोराइड, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% ग्लिसरॉल, 20 mM Tris, pH 7.5, सामग्री की तालिका देखें) में पुन: निलंबित करें।
  4. 20 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने इनक्यूबेट करें।
  5. अघुलनशील अंश को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ~ 12,000 x g पर लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि परख (चरण 5) के लिए एक सफेद फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में लाइसेट के 25 μL को स्थानांतरित करें।
    नोट: गोली को परेशान न करें। यह सेल लाइसेट का अघुलनशील अंश है।
  7. बिसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) परख (चरण 4) के लिए शेष लाइसेट के 10 μL को एक पारदर्शी फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। इसका उपयोग नमूनों के सामान्यीकरण के लिए किया जाएगा।
  8. आगे की प्रक्रिया के लिए दोनों प्लेटों को बर्फ पर रखें।
    नोट: इस स्तर पर, प्लेटों को चिपकने वाले कवर के साथ सील किया जा सकता है और लगभग 4 सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. बीसीए परख का उपयोग करके प्रोटीन परिमाणीकरण

नोट: प्रत्येक नमूने में प्रोटीन की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए अन्य अभिकर्मकों या परखों का उपयोग किया जा सकता है। जनसंख्या आधारित परख में, परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा को सामान्य करके नमूनों की तुलना की जा सकती है।

  1. बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ 0 μg/mL और 2,000 μg/mL (0 μg/mL, 25 μg/mL, 2,000μg/mL, 2,000μg/mL, 100 μg/mL, 1,500 μg/mL, 2,000μg/mL, 2,000μg/mL, 2,000μg/mL) के बीच मानक प्रोटीन सांद्रता तैयार करें। केवल लाइसिस बफर के साथ रिक्त स्थान तैयार करें।
  2. चरण 3.7 में उल्लिखित नमूनों वाले फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में प्रत्येक मानक के 10 μL जोड़ें।
  3. बीसीए अभिकर्मक 1 को बीसीए अभिकर्मक 2 के साथ 50: 1 अनुपात में मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक नमूने और मानक में मिश्रित बीसीए अभिकर्मक के 200 μL जोड़ें।
  4. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. फ्लोरोमेट्रिक उपकरण पर 562 एनएम पर अवशोषण को मापें, और मानक वक्र के साथ प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।

5. कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि के लिए जनसंख्या-आधारित परख

नोट: प्लेट में सेल लाइसेट को 3 घंटे से अधिक समय तक बर्फ पर बैठने की अनुमति न दें। यदि कैसपेस गतिविधि मौजूद है, तो नमूना बर्फ पर होने के बावजूद समय के साथ यह बढ़ जाता है। यदि नमूने जमे हुए थे, तो उन्हें बर्फ पर पिघलाएं, और लाइसेट पिघलने के तुरंत बाद आगे बढ़ें।

  1. फ्लोरोमेट्रिक उपकरण शुरू करें ( सामग्री की तालिका देखें) और मशीन को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। उल्लिखित स्क्रिप्ट तैयार करें:
    1. प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स को निर्धारित करने के लिए 40 मिनट के लिए हर मिनट अलग-अलग रीडिंग करें।
    2. उत्तेजना को 360 एनएम और उत्सर्जन को 465 एनएम पर सेट करें। प्रति कुएं दस चमक पर्याप्त हैं।
  2. पुनः संयोजक कैसपेज़ -3 का सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। पुनः संयोजक कैसपेज़ -3 एंजाइम के 1 यू को लाइसिस बफर (ट्यूब 1) के 50 μL में मिलाएं। एक अतिरिक्त तीन ट्यूबों में 25 μL लाइसिस बफर जोड़ें। ट्यूब 1 से ट्यूब 2 में 25 μL स्थानांतरित करें। पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
    1. ट्यूब 3 और ट्यूब 4 के लिए दोहराएं। ट्यूब 5 में केवल 50 μL लाइसिस बफर होगा। चरण 3.6 में उल्लिखित कैसपेज़ -3 गतिविधि परख के लिए सफेद फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में प्रत्येक मानक का 25 μL जोड़ें।
  3. बर्फ पर कैस्पेस गतिविधि परख के लिए एक मास्टर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। एक प्रतिक्रिया के लिए, 2x कैसपेस क्लीवेज बफर (0.2M HEPES pH 7.5; 20% सुक्रोज या PEG; 0.2% CHAPS), 1 mM DEVD-AMC (कैस्पेज़-3 टेट्रापेप्टाइड सब्सट्रेट) के 5 μL, 500 mM DTT के 2 μL और 18 μL विआयनीकृत पानी ( सामग्री की तालिका देखें) मिलाएं।
  4. 100 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने और मानक में प्रतिक्रिया मिश्रण का 75 μL जोड़ें।
  5. चरण 5.1 में स्थापित फ्लोरोमेट्रिक उपकरण का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को तुरंत मापें।
  6. प्रत्येक फ्लोरोसेंट माप के लिए, नमूने के प्रतिदीप्ति से रिक्त (केवल लाइसिस बफर) के लिए प्रतिदीप्ति रीडिंग को घटाएं। नमूने की प्रोटीन एकाग्रता से विभाजित करके रीडिंग को सामान्य करें (चरण 4.5)27 में गणना की गई:
    Equation 1
  7. वाई-अक्ष पर सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति की ढलान और एक्स-अक्ष पर समय निर्धारित करके कैस्पेस गतिविधि की दर की गणना करें।

6. कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि के लिए एकल-सेल परख (प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण)

  1. खंड 2 में वर्णित कोशिकाओं को बीज दें।
  2. कोशिकाओं को 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में काट लें। यदि अनुयायी कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, तो माध्यम को 5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। सेल कल्चर प्लेट में 1 एमएल ठंडा पीबीएस जोड़ें, और पीबीएस को 5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। कोशिकाओं में ट्रिप्सिन जोड़ें (6-अच्छी तरह से व्यंजनों के साथ काम करते समय 100 μL)। ट्रिप्सिन को प्लेट से कोशिकाओं को उठाने की अनुमति दें, और 5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है, 1 एमएल ठंडे पीबीएस का उपयोग करें।
    नोट: निलंबन कोशिकाओं के साथ काम करते समय, धीरे से माध्यम और कोशिकाओं को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. नमूने को 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  4. धुंधला मिश्रण तैयार करें। इष्टतम धुंधला एकाग्रता50 μL में 1 x 106-2 x 10 6 कोशिकाएं हैं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट को पतला करें ( सामग्री की तालिका, प्रवाह साइटोमेट्री देखें)। स्टॉक सब्सट्रेट का 1 μL लें, और PBS के 150 μL में पतला करें। प्रति नमूना 50 uL जोड़ें।
  5. हर 15 मिनट में मिश्रण के साथ, प्रकाश से संरक्षित 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें।
  6. इस अध्ययन में उपयोग किए गए प्रवाह साइटोमीटर के साथ, 640 एनएम पर लाल लेजर का उपयोग करें, और 675/25 एनएम का उपयोग करके पता लगाएं। पहले बिना दाग वाले नियंत्रण नमूने को चलाएं, और वांछित आबादी की न्यूनतम 10,000 घटनाओं को प्राप्त करें। एफएससी-ए और एसएससी-ए डॉट प्लॉट पर गेट (पी 1) का उपयोग करके मलबे को बाहर रखें।
    1. औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) निर्धारित करने के लिए पी 1 गेट में घटनाओं को प्रदर्शित करने वाले हिस्टोग्राम का उपयोग करें और कैसपेज़ सब्सट्रेट (वाई-अक्ष) का पता लगाएं।
      नोट: इस विधि में वर्णित कैसपेज़ सब्सट्रेट को 590 एनएम पर उत्तेजना की आवश्यकता होती है और 628 एनएम पर उत्सर्जित होता है।

Representative Results

प्राथमिक माउस मैक्रोफेज को 6 दिनों के लिए विभेदित किया गया था। 6 दिनों के बाद, कोशिकाओं को काटा गया, गिना गया और बीज दिया गया। निम्नलिखित उपचारों का उपयोग किया गया था: कोई उपचार नहीं और 250 एनएम पर स्मैक मिमेटिक (कंपाउंड ए) 22 और 16 घंटे के लिए 500 एनएम (चित्रा 1)। कैस्पेज़ -3 / कैसपेज़ -7 सक्रियण को जनसंख्या-आधारित परख या प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके एकल-कोशिका विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन करने की अनुमति देने के लिए डुप्लिकेट में प्रयोग किया गया था।

सेल लाइसेट की प्रोटीन एकाग्रता को बीसीए परख (पूरक तालिका 1) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा नमूनों के बीच समान है, यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। इस जनसंख्या-आधारित परख में, डेटा को दो तरीकों से प्रस्तुत किया जा सकता है। पहला समायोजित प्रतिदीप्ति (वाई-अक्ष) बनाम समय (एक्स-अक्ष) (चित्रा 2 ए) को प्लॉट करके कैनेटीक्स दिखाना है। वैकल्पिक रूप से, ढलान की गणना सीधे नमूनों की तुलना करने के लिए की जा सकती है (चित्रा 2 बी)। 500 एनएम एसएमएसी मिमेटिक उपचार पर ढलान में वृद्धि कई तुलनाओं के साथ एक साधारण एक-तरफ़ा एनोवा के आधार पर महत्वपूर्ण नहीं थी (डनेट का कई तुलना परीक्षण28)।

फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि के विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं और सुपरनैटेंट की कटाई की गई थी। बिना दाग वाली कोशिकाओं या प्रतिदीप्ति माइनस एक को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, साथ ही अनुपचारित कोशिकाएं भी। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकत्रित कोशिकाओं के एक हिस्टोग्राम ने अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में स्मैक मिमेटिक्स के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के लिए प्रतिदीप्ति में बदलाव दिखाया (चित्रा 2 सी)। डेटा को या तो औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 2 डी) या अनुपचारित कोशिकाओं (चित्रा 2 ई) पर गुना परिवर्तन के रूप में दिखाया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: अध्ययन का प्रवाह चार्ट। (A) फीमर और टिबिया को C57Bl/6 चूहों से निकाला गया था। हड्डियों को 6 दिनों के लिए 20 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ में फ्लश और विभेदित किया गया था। (बी) दिन 6 पर, मैक्रोफेज को काटा गया और उपचार के लिए फिर से सीड किया गया। कोशिकाओं के एक सेट को लाइसेट के लिए काटा गया था और फ्लोरोजेनिक गतिविधि द्वारा मूल्यांकन किया गया था, जबकि दूसरे सेट को काटा गया था, फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कैस्पेस -3/कैसपेज़ -7 गतिविधि के लिए काइनेटिक परख और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सब्सट्रेट क्लीवेज। (ए, बी) कैस्पेज़ -3/ कैसपेज़ -7 गतिविधि (सी-ई) और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सब्सट्रेट क्लीवेज के लिए गतिज परख का प्रतिनिधि डेटा। मैक्रोफेज को 16 घंटे के लिए स्मैक मिमेटिक (यौगिक ए; 250 एनएम और 500 एनएम) की दो सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। डेटा को नमूने में प्रोटीन एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था। (ख) प्रत्येक नमूने के लिए डीईवीडी एएफसी की दरार (ढलान) की दर को अनुपचारित ढलान पर सामान्यीकृत किया गया था और अनुपचारित कोशिकाओं पर गुना परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत किया गया था। (सी) कैस्पेज़ -3 सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं के फ्लो साइटोमेट्रिक हिस्टोग्राम। (D, E) अनुपचारित नमूने की तुलना में एमएफआई की तुलना और गुना परिवर्तन। प्रत्येक डेटा बिंदु एक स्वतंत्र नमूने का प्रतिनिधित्व करता है; माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि दिखाई गई है; * पी < 0.05 एक तरफ़ा एनोवा और कई तुलना परीक्षणों (डंनेट के कई तुलना परीक्षण) का उपयोग करके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Caspase प्रजातियां सब्सट्रेट अनुक्रम प्रोटीन डोमेन
Caspase-1 एचएस, एमएम (W/L) ईएचडी CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
Caspase-2 एचएस, एमएम DEXD CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कैसपेस -4 एच एस (W/L) ईएचडी CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कैसपेस -5 एच एस (W/L) ईएचडी CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कैसपेज़ -9 एचएस, एमएम (I/V/L) E(H/T)D CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कैसपेज़ -11 मिलीमीटर (W/L) ईएचडी CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कैसपेस -12 मिलीमीटर ATAD CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
Caspase-8 एचएस, एमएम (I/V/L) E(H/T)D DED, बड़ा डोमेन, छोटे उत्प्रेरक डोमेन
Caspase-10 एच एस (I/V/L) E(H/T)D DED, बड़ा डोमेन, छोटे उत्प्रेरक डोमेन
Caspase-3 एचएस, एमएम DEXD बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कैसपेज़ -6 एचएस, एमएम (I/V/L) E(H/T)D बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कैसपेज़ -7 एचएस, एमएम DEXD बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कैसपेज़ -14 hs, mm (W/L) ईएचडी बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन
कार्ड कैसपेस सक्रियण और भर्ती डोमेन
DED मृत्यु प्रभावक डोमेन
एच एस homo sapien
मिलीमीटर मस्कुलस

तालिका 1: सब्सट्रेट विशिष्टता और कैसपेस के प्रोटीन डोमेन। तालिका मैकस्टे एट अल.20 से अनुकूलित है; शालिनी और अन्य 3; और वैन ऑपडेनबोश और लैमकान्फी4.

पूरक तालिका 1: डीईवीडी गतिज विश्लेषण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस विधि में, कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि को मापने के लिए जनसंख्या-आधारित परख या एकल-सेल विश्लेषण में एक फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है। दोनों विधियां एक सब्सट्रेट के दरार के आधार पर मात्रात्मक तरीके से कैसपेज़ गतिविधि को मापती हैं। एक लाभ कई नमूनों के लिए इन तरीकों का उपयोग करने की क्षमता है। इन विधियों के साथ, कैस्पेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि का पता प्राथमिक मैक्रोफेज में लगाया जाता है जो स्मैक मिमेटिक्स के साथ इलाज किया जाता है।

जनसंख्या-आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख का एक महत्वपूर्ण पहलू लाइसिस से प्रतिदीप्ति को पढ़ने का समय है। नमूने को पूरी प्रक्रिया में बर्फ पर रखा जाना चाहिए, खासकर परख को "पढ़ने" से पहले। यह सब्सट्रेट के समय से पहले दरार और प्रतिदीप्ति को रोकता है। जनसंख्या-आधारित परख का उपयोग करके, कम अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा सामान्यीकृत है, जिससे नमूनों की सीधे तुलना की जा सकती है। एक चेतावनी यह है कि एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु के अंतिम चरण में, कुल प्रोटीन की मात्रा कम हो जाती है; इसलिए, कैसपेज़ गतिविधि का पता लगाना संभव नहीं हो सकता है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए विभिन्न कैनेटीक्स या विभिन्न उपचार खुराक की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, इस विधि में वर्णित सॉफ़्टवेयर के अलावा कैस्पेस गतिविधि की दर का सही आकलन करने के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है।

प्रवाह साइटोमेट्रिक परख के लिए, आबादी को आत्मविश्वास से गेट करने के लिए पर्याप्त घटनाओं या कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सब्सट्रेट से सेल नंबर के इष्टतम अनुपात को प्राप्त करने के लिए प्रवाह-आधारित परख में अधिक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, फ्लो साइटोमेट्री के साथ, यह विधि अतिरिक्त मापदंडों को मापने के लिए खुद को उधार देती है, जैसे कि सेल प्रकार की पहचान के लिए सेल सतह मार्कर।

जनसंख्या और एकल-कोशिका विधियों दोनों का उपयोग अन्य कैसपेस के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि मान्यता अनुक्रम अन्य कैसपेस के लिए कम भेदभाव किया जाता है। जैसे, कैस्पेस गतिविधि के लिए अन्य तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। इसमें कैस्पेस गतिविधि का निषेध, सीआरआईएसपीआर या विशिष्ट कैसपेस का नॉक-डाउन, और ज्ञात सब्सट्रेट्स की दरार का पता लगाने के लिए पश्चिमी सोख्ता शामिल हैं।

कैसपेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक विधि टाइम-लैप्स इमेजिंग है। सेल मृत्यु के कैनेटीक्स पर जानकारी प्रदान करने के लिए एनेक्सिन वी जैसे व्यवहार्यता के अन्य मार्करों के साथ एक ही पारगम्य कैसपेस सब्सट्रेट का उपयोग किया जा सकता है। इमेजिंग कैस्पेस गतिविधि और सेल अस्तित्व को भी अलग करेगी, जिससे सेल आबादी में कैसपेस गतिविधि की उप-घातक मात्रा का पता लगाने की अनुमति मिलेगी। कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 के गैर-घातक कार्य जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं29 में एंटीवायरल विनियमन से जुड़े हुए हैं, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए रिलीज15,16 के माध्यम से टाइप आई आईएफएन की सक्रियता। इस प्रकार, कैस्पेज़ गतिविधि को मापने के लिए ये परख कोशिका मृत्यु के विभिन्न तरीकों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और गैर-कोशिका मृत्यु कार्यों का आकलन करने में उपयोगी हो सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

W.W.W. को क्लोएटा मेडिकल रिसर्च फेलो अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है, एसआर को CanDoc UZH Forschungskredit द्वारा समर्थित किया जाता है, और J.T. को चीनी छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microfuge tubes Sarstedt 72.706.400
15 cm Petri plates Sarstedt 82.1184.500
37 degree incubator shaker IKA shaker KS 4000i 97014-816 distributed by VWR
6-well cell culture dish Sarstedt 83.392
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile Sigma CLS3600
96 well flat plate Sarstedt 82.1581
Ac-DEVD-AFC Enzo Life Sciences ALX-260-032-M005 Caspase-3 substrate
BD Fortessa BD any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work
b-glycerolphosphate Sigma G9422-10G
caspase-3 recombinant  Enzo Life Sciences ALX-201-059-U025
CHAPS Sigma 1.11662
DMEM, low glucose, pyruvate Thermoscientific 31885023
DMSO Sigma D8418-250ML
EDTA Sigma 03685-1KG
EGTA Sigma 324626-25GM
Etoposide MedChem Express HY-13629
FBS Thermoscientific 26140
Flow cytometry tubes Falcon 352008
Flowjo Flowjo A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice
Glycerol Sigma G5516-500ML
HEPES Sigma H4034
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging Immunochemistry Technologies 935
M-CSF ebioscience 14-8983-80 now a subsidiary of Thermoscientific
M-Plex Tecan any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors
NaCl Roth 3957.1
PBS pH 7.4 Thermoscientific 10010023
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Thermoscientific 10378016
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 protein concentration assay
protease inhibitors Biomol P9070.100
Smac mimetic, Compound A Tetralogics also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007
Sodium Fluoride Sigma S7920-100G
sodium orthovanadate Sigma S6508-10G
sodium pyrophosphate Sigma P8010-500G
Staurosporine MedChem Express HY-15141
sucrose Sigma 1.07687
Tris Base Sigma T1503-1KG
Triton X100 Sigma T8787-50ML
TrypLE Thermoscientific A1285901 In the protocol, it is listed as Trypsin

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References

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जैव रसायन अंक 193
फ्लोरोमेट्रिक परख या फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके कैस्पेज़ गतिविधि को मापना
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Tong, J., Rufli, S., Wong, W. W. L.… More

Tong, J., Rufli, S., Wong, W. W. L. Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e64745, doi:10.3791/64745 (2023).

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