Summary
Detta protokoll beskriver två metoder för att mäta kaspasaktivitet genom ett fluorogent substrat med hjälp av flödescytometri eller en spektrofluorometer.
Abstract
Aktiveringen av cysteinproteaser, kända som kaspaser, är fortfarande en viktig process i flera former av celldöd. Caspases är kritiska initiatorer och bödlar av apoptos, den mest studerade formen av programmerad celldöd. Apoptos uppträder under utvecklingsprocesser och är en nödvändig händelse i vävnadshomeostas. Pyroptos är en annan form av celldöd som använder kaspaser och är en kritisk process för att aktivera immunsystemet genom aktivering av inflammasomen, vilket resulterar i frisättning av medlemmar av interleukin-1 (IL-1) familjen. För att bedöma kaspasaktivitet kan målsubstrat bedömas. Känslighet kan dock vara ett problem när man undersöker enskilda celler eller låg nivåaktivitet. Vi demonstrerar hur ett fluorogent substrat kan användas med en populationsbaserad analys eller encellsanalys genom flödescytometri. Med rätt kontroller kan olika aminosyrasekvenser användas för att identifiera vilka kaspaser som är aktiva. Med hjälp av dessa analyser har samtidig förlust av hämmare av apoptosproteiner vid stimulering av tumörnekrosfaktor (TNF) identifierats, vilket främst inducerar apoptos i makrofager snarare än andra former av celldöd.
Introduction
Caspaser är involverade i flera former av programmerad celldöd. Apoptos är den mest studerade formen av programmerad celldöd och är associerad med kaspasaktivitet1. Alla kaspaser har en stor och liten katalytisk underenhet. Caspase-1, caspase-4, caspase-5, caspase-9 och caspase-11 har en kaspasaktiverings- och rekryteringsdomän (CARD), och caspase-8 och caspase-10 innehåller dödseffektordomäner (DED)2,3,4,5 (tabell 1). Apoptos kan initieras av två huvudvägar: den yttre vägen och den inre vägen. Den yttre apoptotiska vägen utlöses av dödsreceptorer, som ingår i tumörnekrosfaktorsuperfamiljen (TNFSF). Dödsreceptorer har DED-domäner, vilket underlättar kaspas-8-aktivitet6. Den inneboende apoptotiska vägen innefattar aktivering av kaspas-9 efter bildandet av apoptosomen, vilket kräver frisättning av cytokrom c och Apaf-17. Aktiveringen av antingen initiator caspase, caspase-8 eller caspase-9, leder till klyvning och efterföljande aktivering av bödelkaspaser, vilka är caspase-3, caspase-6 och caspase-7. Att identifiera att bödelns kaspaser är aktiva indikerar att cellerna genomgår apoptos, och denna aktivering anses vara en viktig faktor för att definiera celldödssättet.
Kaspasaktivering är också en kritisk tidpunkt för reglering av inflammation och induktion av alternativa former av programmerad celldöd. Exempelvis leder kaspas-1-aktivering till mognad av proinflammatoriska cytokiner i interleukin-1-familjen8. Frisättning och aktivering av cytokiner från denna familj, särskilt IL-1β och IL-18, beror på gasdermin D-klyvning och porbildning vid plasmamembranet 9,10. Otillräcklig membranreparation av gasdermin D-porer kan resultera i en typ av celldöd som kallas pyroptos11. Dessutom resulterar kaspas-8-aktivitet i hämning av en kaspasoberoende celldöd som kallas nekropotos12. Receptorinteragerande serin/treoninproteinkinas 1 (RIPK1) är en av de kritiska faktorerna i nekropotos och för att driva inflammation reglerad av NF-kB. Modeller har visat att RIPK1 klyvs av kaspas-8, vilket resulterar i att begränsa NF-kB signalering, apoptos och nekropotos13,14. Därför kan identifiering av aktiviteten hos olika kaspaser hjälpa till att förstå den resulterande inflammations- och celldödsmodaliteten.
Oberoende av kaspasernas funktion vid reglering av celldödsmodaliteter kan kaspasaktivitet också reglera andra cytokinfamiljer, såsom interferon (IFN), som svar på infektion15,16. Dessutom är kaspaser involverade i icke-celldödsfunktioner, inklusive cellödesbeslut, vävnadsreparation och regenerering, tumörgenes genom DNA-reparation och neuronal synapsfunktion. Aktiviteten hos kaspaser i dessa icke-dödliga roller tros begränsas av cellulär lokalisering och mängden kaspaser. Därför kan kvantifiering av nivån av kaspasaktivitet mycket väl definiera om en cell genomgår celldöd eller om kaspasen spelar en roll i en icke-celldödsfunktion 4,17,18.
Caspase aktivitet kan bedömas med flera metoder. Western blotting för klyvda kaspaser och deras substrat har använts som en indikator på aktivitet, men dessa analyser är i bästa fall kvalitativa. För att avgöra om kaspasaktivitet är associerad med celldöd är en kvantitativ mätning idealisk. Eftersom kaspaser klyver substrat på ett igenkänningsställe bestående av fyra aminosyror har kolorimetriska, luminiscens- eller fluorometriska metoder utvecklats. Kaspaser verkar dock ha plasticitet i sin substratigenkänning19,20. Igenkänningssekvensen är inte associerad med proteindomänerna (tabell 1). Tetrapeptidsekvensen DEVD kan emellertid användas för att detektera kaspas-3 och kaspas-7-aktivitet20,21.
Smac mimetika är föreningar som riktar sig mot hämmare av apoptosproteiner (IAP). Användningen av Smac-mimetika i en delmängd av cancerceller gör att cellerna blir känsliga för TNF-inducerad celldöd22. I primära makrofager orsakar Smac-mimetik celldöd utan exogen tillsats av TNF23,24. Förlusten av cIAP1 genom Smac mimetisk-inducerad nedbrytning resulterar i produktion av TNF. Om kaspasaktivitet detekteras betyder det att cellerna inte dog av nekrotos utan på ett apoptotiskt sätt. I denna metod används detektion av klyvt DEVD substrat för att identifiera kaspas-3 / kaspas-7 aktivitet. Ytterligare experiment för att bekräfta apoptotisk celldöd har publicerats tidigare24.
Protocol
Den aktuella studien har genomförts med godkännande och i enlighet med riktlinjerna från den djuretiska kommittén vid universitetet i Zürich (#ZH149/19). Manliga C57Bl / 6J-möss i åldern 8-16 veckor, uppfödda och inrymda i specifika patogenfria (SPF) förhållanden, användes för den aktuella studien. De intakta benen kan hållas på is i steril Hanks buffrade saltlösning (HBSS) med 2% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS). Benmärg samlades in från lårbenet och skenbenet hos musen25 på differentieringsdagen. Båda metoderna för att bedöma kaspasaktivitet kan användas för andra celltyper, inklusive både primära och transformerade.
1. Differentierande benmärgshärledda makrofager (BMDM)
OBS: Utför alla steg i en laminär flödeshuv för vävnadskultur och använd sterila aseptiska tekniker.
- Förbered en 1 ml spruta med en 21 G nål.
- Tillsätt 5 ml HBSS + 2% FBS till ett 15 ml rör.
- Använd sterila pincett, ta ett utskuret lårben och sätt in nålen i lårbenets öppning. Håll lårbenet i HBSS + 2% FBS, spola benmärgen ut tills benet är vitt. Spola skenbenet på samma sätt. Fortsätt att spola lösningen för att erhålla en encellssuspension.
- Centrifugera encellssuspensionen vid 200 x g i 4 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort supernatanten med en vakuumsugare. Knacka på röret för att försiktigt återsuspendera pelleten. Tillsätt 1 ml rödcellslysbuffert (se materialförteckning) och blanda försiktigt med en P1 000-pipett. Inkubera vid rumstemperatur i 1 min.
- Tillsätt 10 ml HBSS + 2% FBS och centrifugera vid 200 x g i 4 minuter vid RT.
- Ta bort supernatanten och suspendera igen i 10 ml benmärgshärledd makrofag (BMDM) odlingsmedium.
OBS: BMDM-odlingsmediet består av DMEM med låg glukos med tillsats av 10% FBS, 20 ng / ml M-CSF, penicillin (50 U / ml) och streptomycin (50 μg / ml) (se materialtabell). Alternativt kan 20% L929 konditionerat medium ersättas med M-CSF. - Tillsätt 15 ml BMDM-odlingsmedium i två 15 cm petriskålar. Tillsätt 5 ml encellslösning till varje platta.
OBS: Använd inte vävnadskulturbehandlade plattor. Vävnadskulturbehandlade plattor begränsar differentieringen. - Placera disken vid 37 °C, 5%CO2, i 6 dagar.
OBS: BMDM kan skördas efter 5-7 dagar. Längre inkubationstider för differentiering leder till ökat anti-apoptotiskt proteinuttryck26.
2. Skörd, sådd och behandling av celler
OBS: Utför alla steg i en laminär flödeshuv för vävnadskultur och använd sterila aseptiska tekniker. Helt differentierade makrofager fäster vid plattan, vilket möjliggör enkel separation, medan flytande celler kan kasseras. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan användas med eller utan Ca 2+ och Mg2+.
- Efter 6 dagars inkubation, ta bort de flytande cellerna och mediet från plattan med en aspirator.
- Tillsätt 5 ml PBS till varje 15 cm platta. Ta bort PBS från plattan med en aspirerare.
- Tillsätt 2 ml trypsin (se materialtabell) till varje platta. Inkubera plattan tills försiktig tappning av plattan lossnar cellerna. Ta 5 ml BMDM-odlingsmedium och skörda cellerna från plattan.
- Överför till den andra 15 cm plattan och skörda cellerna från plattan. Ta bort cellsuspensionen från plattan till ett 50 ml rör. Ta ytterligare 5 ml BMDM-odlingsmedium och tvätta båda plattorna för att säkerställa att alla celler har samlats in. Placera cellsuspensionen i samma 50 ml rör.
- Ta 10 μL av cellsuspensionen och räkna med en hemacytometer med en 1:1 spädning med trypanblått.
OBS: Automatiska cellräknare kan också användas när de kalibreras för makrofagernas storlek. - Frö makrofagerna med en densitet av 1 x 106 celler / ml. BMDM sådd vid 2 x 106 celler/brunn i en 6-brunnsplatta ger cirka 2 mg/ml totalt protein. Låt cellerna fästa vid plattan i minst 6 timmar före behandling.
OBS: För andra celltyper måste den optimala koncentrationen bestämmas. - Behandla makrofagerna med Smac mimetic (förening A, se Table of Materials)22 vid 250 nM och 500 nM i 16 timmar.
OBS: Inkludera en positiv kontroll för att inducera apoptos och kaspas-3-klyvning för att säkerställa att analysen fungerar. Vanliga apoptosinducerare inkluderar staurosporin och etoposid. För att många cellinjer ska genomgå apoptos är 0,1-10 μM för 16 timmars stimulering tillräcklig.
3. Beredning av celllysat från behandlade celler
OBS: Detta steg måste göras på is, och reagenserna och materialen måste förkylas.
- Överför plattorna som innehåller de behandlade cellerna till isen. Samla upp mediet från cellkulturen till ett 1,5 ml rör, centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C, aspirera mediet och lägg röret på is. Detta möjliggör insamling av cellerna som har lossnat från plattan.
- Tillsätt 1 ml kall PBS till cellodlingsplattan för att tvätta cellerna och aspirera alla PBS. Tillsätt 100 μL trypsin till cellerna (om du arbetar med en 6-brunnskål). Låt trypsinet lyfta cellerna från plattan och samla dem i 1,5 ml röret. Använd 1 ml kall PBS för att säkerställa att alla celler har samlats in.
OBS: Om du arbetar med suspensionsceller, överför försiktigt mediet och cellerna till ett 1,5 ml rör. - Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten och återsuspendera i 100 μL DISC-lysbuffert (150 mM natriumklorid, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 20 mM Tris, pH 7,5, se materialtabell).
- Inkubera proverna på is i 20 minuter.
- Centrifugera lysaten vid ~12 000 x g i 10 minuter vid 4 °C för att pelletera den olösliga fraktionen.
- Överför 25 μl lysat till en vit, flatbottnad 96-brunnsplatta för aktivitetstestet caspase-3/caspase-7 (steg 5).
OBS: Stör inte pelletsen. Detta är den olösliga fraktionen av celllysatet. - Överför 10 μl av det återstående lysatet till en genomskinlig flatbottnad 96-brunnsplatta för bicinchoninsyratestet (BCA) (steg 4). Detta kommer att användas för normalisering av proverna.
- Håll båda plattorna på is för vidare bearbetning.
OBS: I detta skede kan plattorna förseglas med ett självhäftande lock och förvaras vid -20 ° C i cirka 4 veckor.
4. Proteinkvantifiering med BCA-analysen
OBS: Andra reagens eller analyser kan användas för att kvantifiera mängden protein i varje prov. I den populationsbaserade analysen kan proverna jämföras genom att normalisera mängden protein som används i analysen.
- Bered standardproteinkoncentrationer mellan 0 μg/ml och 2 000 μg/ml (0 μg/ml, 25 μg/ml, 125 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml, 100 μg/ml, 1 500 μg/ml, 2 000 μg/ml) med bovint serumalbumin (BSA). Förbered endast ämnen med lysbuffert.
- Tillsätt 10 μl av varje standard i den platta platta med 96 brunnar med flatbottnad som innehåller proverna, som nämns i steg 3.7.
- Blanda BCA-reagens 1 med BCA-reagens 2 i förhållandet 50:1 (se Materialförteckning). Tillsätt 200 μl blandat BCA-reagens till varje prov och standard.
- Inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
- Mät absorbansen vid 562 nm på ett fluorometrisk instrument och kvantifiera proteinkoncentrationen med standardkurvan.
5. Populationsbaserad analys för kaspas-3/kaspas-7-aktivitet
OBS: Låt inte celllysaterna i plattan sitta på is i mer än 3 timmar. Om kaspasaktivitet är närvarande ökar detta med tiden trots att provet ligger på is. Om proverna var frysta, tina dem på is och fortsätt omedelbart när lysaterna har tinat.
- Starta det fluorometriska instrumentet (se Materialförteckning) och värm maskinen till 37 °C. Förbered skriptet enligt ovan:
- Utför individuella avläsningar varje minut i 40 minuter för att bestämma reaktionens kinetik.
- Ställ in excitationen på 360 nm och emissionen på 465 nm. Tio blinkningar per brunn räcker.
- Bered den positiva kontrollen av rekombinant kaspas-3 (se materialförteckning). Blanda 1 U av det rekombinanta kaspas-3-enzymet i 50 μl lysbuffert (rör 1). Tillsätt 25 μl lysbuffert till ytterligare tre rör. Överför 25 μl från rör 1 till rör 2. Blanda genom pipettering.
- Upprepa för rör 3 och rör 4. Rör 5 innehåller endast 50 μl lysbuffert. Tillsätt 25 μL av varje standard i den vita flatbottnade 96-brunnsplattan för caspase-3-aktivitetsanalysen, som nämns i steg 3.6.
- Förbered en masterreaktionsblandning för analys av kaspasaktivitet på is. För en reaktion, blanda 50 μL 2x kaspasklyvningsbuffert (0,2M HEPES pH 7,5; 20% sackaros eller PEG; 0,2% CHAPS), 5 μL 1 mM DEVD-AMC (kaspas-3-tetrapeptidsubstrat), 2 μL 500 mM DTT och 18 μL avjoniserat vatten (se materialtabell).
- Tillsätt 75 μl av reaktionsblandningen till varje prov och standard för att erhålla en total reaktionsvolym på 100 μl.
- Mät omedelbart fluorescensen med det fluorometriska instrument som ställts in i steg 5.1.
- För varje fluorescerande mätning subtraheras fluorescensavläsningen för blindprovet (endast lysbuffert) från provets fluorescens. Normalisera avläsningen genom att dividera med proteinkoncentrationen i provet (beräknat i steg 4.5)27:
- Beräkna hastigheten för kaspasaktivitet genom att bestämma lutningen för den normaliserade fluorescensen på y-axeln och tiden på x-axeln.
6. Encellsanalys (flödescytometrianalys) för kaspas-3 / kaspas-7-aktivitet
- Ympa cellerna enligt beskrivningen i avsnitt 2.
- Skörda cellerna i ett 5 ml polystyrenrör. Om du arbetar med vidhäftande celler, samla mediet i 5 ml röret. Tillsätt 1 ml kall PBS till cellodlingsplattan och samla PBS i 5 ml röret. Tillsätt trypsin till cellerna (100 μL om du arbetar med 6-brunnsrätter). Låt trypsinet lyfta cellerna från plattan och samlas in i 5 ml röret. Använd 1 ml kall PBS för att säkerställa att alla celler har samlats in.
OBS: Om du arbetar med suspensionsceller, överför försiktigt mediet och cellerna till ett 5 ml rör. - Centrifugera proverna vid 300 x g i 5 min, 4 °C. Ta bort supernatanten med en vakuumsugare.
- Förbered färgblandningen. Den optimala färgningskoncentrationen är 1 x 10 6-2 x 106 celler i 50 μL. Späd det fluorogena substratet enligt tillverkarens instruktioner (se Materialförteckning, flödescytometri). Ta 1 μl av stamsubstratet och späd i 150 μl PBS. Tillsätt 50 uL per prov.
- Inkubera proverna vid 37 °C i 30 minuter skyddade från ljus, med blandning var 15:e minut.
- Med flödescytometern som används i denna studie, använd den röda lasern vid 640 nm och detektera med 675/25 nm. Kör det ofärgade kontrollprovet först och hämta minst 10 000 händelser av den önskade populationen. Uteslut skräpet med hjälp av en grind (P1) på ett FSC-A- och SSC-A-punktdiagram.
- Använd ett histogram som visar händelserna i P1-grinden och detektering för kaspassubstratet (y-axeln) för att bestämma medianfluorescensintensiteten (MFI).
OBS: Kaspassubstratet som beskrivs i denna metod kräver en excitation vid 590 nm och avger vid 628 nm.
- Använd ett histogram som visar händelserna i P1-grinden och detektering för kaspassubstratet (y-axeln) för att bestämma medianfluorescensintensiteten (MFI).
Representative Results
Primära musmakrofager differentierades i 6 dagar. Efter 6 dagar skördades, räknades och såddes cellerna. Följande behandlingar användes: ingen behandling och Smac mimetisk (förening A)22 vid 250 nM och 500 nM under 16 timmar (figur 1). Experimentet utfördes i två exemplar för att möjliggöra kaspas-3 / kaspas-7-aktivering som kan bedömas antingen genom en populationsbaserad analys eller encellsanalys med flödescytometri.
Proteinkoncentrationen hos celllysaterna kvantifierades med hjälp av BCA-analysen (kompletterande tabell 1). Detta är nödvändigt för att säkerställa att mängden protein som används i analysen av kaspas-3/kaspas-7-aktivitet är densamma mellan proverna. I denna populationsbaserade analys kan data presenteras på två sätt. Den första är att visa kinetiken genom att plotta den justerade fluorescensen (y-axeln) mot tiden (x-axeln) (figur 2A). Alternativt kan lutningen beräknas för att direkt jämföra proverna (figur 2B). Ökningen av lutningen vid 500 nM mimetisk behandling med Smac var inte signifikant baserat på en vanlig enkelriktad ANOVA med flera jämförelser (Dunnetts multipeljämförelsetest28).
För analys av kaspas-3/kaspas-7-aktivitet med flödescytometri skördades cellerna och supernatanten. Ofärgade celler eller fluorescens minus en användes som en negativ kontroll, liksom de obehandlade cellerna. Ett histogram av cellerna som samlats in med flödescytometri visade en förändring i fluorescens för cellerna behandlade med Smac-mimetik jämfört med de obehandlade cellerna (figur 2C). Data kan visas antingen som medianfluorescensintensitet (figur 2D) eller som en veckförändring över de obehandlade cellerna (figur 2E).
Figur 1: Flödesschema för studien . (A) Lårben och skenben skars ut från möss med C57Bl/6. Benen spolades och differentierades i 20 ng / ml m-csf i 6 dagar. (B) På dag 6 skördades makrofager och återfördes för behandling. En uppsättning celler skördades för lysat och bedömdes genom fluorogen aktivitet, medan den andra uppsättningen skördades, inkuberades med det fluorogena substratet och bedömdes med flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kinetisk analys för kaspas-3/kaspas-7-aktivitet och substratklyvning genom flödescytometri. (A,B) Representativa data för kinetisk bestämning för kaspas-3/kaspas-7-aktivitet (C-E) och substratklyvning genom flödescytometri. Makrofagerna behandlades med två koncentrationer av Smac mimetic (förening A; 250 nM och 500 nM) i 16 h. (A) Detektion av det klyvda DEVD AFC-substratet över tid. Data normaliserades till proteinkoncentrationen i provet. (B) Klyvningshastigheten (lutningen) av DEVD AFC för varje prov normaliserades till den obehandlade lutningen och presenterades som veckförändringen över de obehandlade cellerna. (C) Flödescytometriska histogram av cellerna som inkuberats med kaspas-3-substratet. (D,E) MFI-jämförelse och vikningsförändring i MFI jämfört med det obehandlade provet. Varje datapunkt representerar ett oberoende prov. medelvärdet ± medelfelet visas, *p < 0,05 med hjälp av en enkelriktad ANOVA och flera jämförelsetester (Dunnetts multipeljämförelsetest). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Caspase | Art | Substrat sekvens | Protein domäner | ||
| Caspase-1 | Hs, Mm | (W/L) EHD | CARD, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-2 | Hs, Mm | DEXD | CARD, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-4 | Hs | (W/L) EHD | CARD, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-5 | Hs | (W/L) EHD | CARD, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-9 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | CARD, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-11 | Mm | (W/L) EHD | CARD, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-12 | Mm | ATAD | CARD, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-8 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | DED, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-10 | Hs | (I/V/L) E(H/T)D | DED, stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-3 | Hs, Mm | DEXD | stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-6 | Hs, Mm | (I/V/L) E(H/T)D | stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Caspase-7 | Hs, Mm | DEXD | stor domän, liten katalytisk domän | ||
| Kaspas-14 | hs, mm | (W/L) EHD | stor domän, liten katalytisk domän | ||
| KORT | Domänen för aktivering och rekrytering av Caspase | ||||
| DED | Dödseffektor domän | ||||
| Hs | homo sapien | ||||
| Mm | mus musculus | ||||
Tabell 1: Substratspecificitet och proteindomänerna hos kasperna. Tabellen är anpassad från McStay et al.20; Shalini et al.3; och van Opdenbosch och Lamkanfi4.
Kompletterande tabell 1: DEVD kinetisk analys. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
I denna metod används ett fluorogent substrat i en populationsbaserad analys eller encellsanalys för att mäta kaspas-3 / kaspas-7-aktivitet. Båda metoderna mäter kaspasaktiviteten på ett kvantitativt sätt baserat på klyvning av ett substrat. En fördel är möjligheten att utnyttja dessa metoder för många prover. Med dessa metoder detekteras kaspas-3/kaspas-7-aktivitet i primära makrofager behandlade med Smac-mimetika.
En kritisk aspekt av den populationsbaserade fluorometriska analysen är tiden från lys till avläsning av fluorescensen. Proverna skall ligga på is under hela förfarandet, särskilt innan testet "avläsas". Detta förhindrar för tidig klyvning och fluorescens av substratet. Med hjälp av den populationsbaserade analysen kan mindre optimering krävas. Mängden protein som används i analysen normaliseras, vilket gör att proverna kan jämföras direkt. En varning är att i ett sent skede av apoptotisk celldöd reduceras den totala proteinmängden; Därför kan detektering av kaspasaktivitet inte vara möjlig. Olika kinetik eller olika behandlingsdoser rekommenderas för att kringgå detta problem. Dessutom kan annan programvara användas för att exakt bedöma graden av kaspasaktivitet förutom den programvara som beskrivs i denna metod.
För flödescytometrisk analys krävs tillräckligt med händelser eller celler för att grinda populationerna säkert. Dessutom kan mer optimering i den flödesbaserade analysen krävas för att uppnå det optimala förhållandet mellan substrat och cellantal. Men med flödescytometri lämpar sig denna metod för att mäta ytterligare parametrar, såsom cellytmarkörer för celltypidentifiering.
Både populations- och encellsmetoden skulle kunna användas för andra kaspaser. Det är dock viktigt att komma ihåg att igenkänningssekvensen är mindre diskriminerad för andra caspaser. Som sådan måste andra metoder för kaspasaktivitet användas. Detta inkluderar hämning av kaspasaktivitet, CRISPR eller knock-down av specifika kaspaser och västerländsk blotting för att detektera klyvning av kända substrat.
En alternativ metod för att detektera kaspasaktivitet är time-lapse imaging. Samma permeabla kaspassubstrat kan användas tillsammans med andra markörer för livskraft, såsom annexin V, för att ge information om kinetiken för celldöd. Avbildning skulle också separera kaspasaktiviteten och cellöverlevnaden, vilket möjliggör detektion av subletala mängder kaspasaktivitet i en cellpopulation. De icke-dödliga funktionerna hos kaspas-3/kaspas-7 är kopplade till antiviral reglering i medfödda immunceller29, särskilt aktivering av typ I IFN via mitokondriell DNA-frisättning15,16. Således är dessa analyser för att mäta kaspasaktivitet avgörande för att identifiera olika former av celldöd och kan vara användbara vid bedömning av icke-celldödsfunktioner.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
W.W.W. stöds av Clöetta Medical Research Fellow-bidrag, SR stöds av CanDoc UZH Forschungskredit och JT stöds av det kinesiska stipendierådet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| 15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
| 37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
| 6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
| 96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
| 96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
| Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
| BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
| b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
| caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
| CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
| DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
| EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
| Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
| FBS | Thermoscientific | 26140 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
| Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
| M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
| M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | |
| PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
| protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
| Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
| sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
| sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
| Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
| sucrose | Sigma | 1.07687 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |
References
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Nicholson, D. W., Thornberry, N. A.
- Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Jiang, X., Wang, X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).
- Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -D. Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation. Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
- Rühl, S., et al. ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation. Science. 362 (6417), 956-960 (2018).
- Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis. Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).
- Newton, K., et al. Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis. Nature. 574, 428-431 (2019).
- Fritsch, M., et al. Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis. Nature. 575, 683-687 (2019).
- White, M. J., et al. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production. Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).
- Rongvaux, A., et al. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Kuranaga, E.
- Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. The role of caspases as executioners of apoptosis. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).
- Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis. FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Vince, J. E., et al. IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis. Cell. 131 (4), 682-693 (2007).
- McComb, S., et al. cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation. Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).
- Wong, W. W. -L., et al. cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner. Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-Protocol. 5 (20), e1631 (2015).
- Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells. Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).
- Mackridge, A., Rowe, P. One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests. Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 93-103 (2018).
- Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. Caspases control antiviral innate immunity. Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).
