Summary
Den aktuella studien visar en mycket reproducerbar djurmodell av akut regional myokardischemi och reperfusionsskada hos kaniner med hjälp av en vänster mini-torakotomi för överlevnadsfall eller en sternotomi i mittlinjen för icke-överlevnadsfall.
Abstract
Protokollet här ger en enkel, mycket replikerbar metod för att inducera akut regional myokardiell ischemi in situ hos kanin för icke-överlevnads- och överlevnadsexperiment. Nya Zeeland Vit vuxen kanin är sederad med atropin, acepromazin, butorfanol och isofluran. Djuret intuberas och placeras i respirator. En intravenös kateter förs in i den marginella öronvenen för infusion av läkemedel. Djuret är premedicinerat med heparin, lidokain och lakterad Ringer-lösning. En halspulsåderskärning utförs för att få tillgång till artärslangen för blodtrycksövervakning. Utvalda fysiologiska och mekaniska parametrar övervakas och registreras genom kontinuerlig realtidsanalys.
Med djuret sövt och helt bedövat utförs antingen en fjärde interkostal rumsliten vänster torakotomi (överlevnad) eller sternotomi mittlinje (icke-överlevnad). Hjärtsäcken öppnas och den vänstra främre nedåtgående artären (LAD) lokaliseras.
En polypropensutur förs runt den andra eller tredje diagonala grenen av LAD-artären, och polypropenfilamentet träs genom ett litet vinylrör och bildar en snara. Djuret utsätts för 30 minuters regional ischemi, vilket uppnås genom att täppa till LAD genom att dra åt snaran. Myokardischemi bekräftas visuellt genom regional cyanos i epikardiet. Efter regional ischemi lossnar ligaturen och hjärtat får perfusion igen.
För både överlevnads- och icke-överlevnadsexperiment kan myokardfunktionen bedömas via en ekokardiografi (ECHO) mätning av den fraktionerade förkortningen. För icke-överlevnadsstudier kan data från sonomikrometri som samlats in med hjälp av tre digitala piezoelektriska ultraljudssonder implanterade i det ischemiska området och vänster kammares utvecklade tryck (LVDP) med hjälp av en apikalt insatt vänster kammare (LV) kateter kontinuerligt inhämtas för att utvärdera den regionala respektive globala myokardfunktionen.
För överlevnadsstudier sluts snittet, en thoracentes med vänster nål utförs för pleuraluftevakuering och postoperativ smärtkontroll uppnås.
Introduction
Hjärt- och kärlsjukdomar är den vanligaste dödsorsaken i världen och bidrar till över 18 miljoner dödsfall varje år 1,2,3. Akut hjärtinfarkt (MI) är en vanlig medicinsk nödsituation som utvecklas när en blodpropp eller en bit ateromatös plack blockerar blodflödet i ett kranskärl. Detta orsakar regional myokardischemi i det område där artären perfuseras.
Den aktuella studien beskriver ett protokoll som använder en enkel och tillförlitlig metodik för att skapa in situ akut regional myokardischemi i en kaninmodell för icke-överlevnads- och överlevnadsexperiment. Det initiala målet med denna metod var att utvärdera effekterna av mitokondriell transplantation på modulering av myokardnekros och ökning av den postischemiska hjärtfunktionen efter en ischemisk händelse. Tidigare forskning har visat förekomsten av mitokondriella förändringar och en snabb minskning av högenergifosfatnivåer efter ischemi och en minskning av syretillförseln, vilket resulterar i en drastisk minskning av hjärtats energidepåer4. Utredare har försökt förbättra postischemisk funktion och minska myokardvävnadsnekros med hjälp av farmakologiska interventioner och/eller procedurtekniker, men dessa tekniker ger begränsat hjärtskydd och har minimal inverkan på mitokondriell skada och dysfunktion 5,6,7. Vårt team och andra har tidigare visat att mitokondriell skada främst uppstår vid ischemi och att kontraktil återhämtning kan förbättras och hjärtinfarktstorleken minska med bevarande av mitokondriell andningsfunktion under reperfusion 8,9,10. Således antog vi att mitokondriell transplantation från vävnader som inte påverkats av ischemi till området för ischemi före reperfusion skulle ge ett alternativt tillvägagångssätt för att minska myokardnekros och förbättra myokardfunktionen. Här beskriver vi det protokoll som användes för att testa denna teori och de representativa resultaten från vår första studieanalys.
Dessutom har flera forskare fokuserat på andra ämnen som är viktiga för att definiera effekten av myokardiell ischemi-reperfusionsskada och etablera lämpliga terapeutiska interventioner. Ett sådant forskningsområde är prekonditionering. Myokardischemisk förkonditionering är en kardioprotektiv mekanism som aktiveras av kortvarig ischemisk stress som resulterar i en minskning av hjärtcellsnekros under efterföljande episoder av långvarig ischemi. Dessa mekanismer kan aktiveras av antingen hypoxi eller koronar ocklusion. Mandel et al. visade att hypoxisk-hyperoxisk förkonditionering hjälpte till att upprätthålla balansen mellan kväveoxidmetaboliter, minskade hyperproduktion av endotelin-1 och stödde organskydd11. Dessutom har begreppet ischemisk förkonditionering på distans, ett fenomen där förkonditionering av ett organ ger systemiskt skydd, undersökts. Ali et al. fann att hos patienter som genomgick elektiv reparation av öppen bukaortaaneurysm, minskade förkonditionering på distans, utförd genom intermittent korsklämning av den gemensamma höftartären för att fungera som en stimulans, förekomsten av postoperativ myokardskada, hjärtinfarkt och nedsatt njurfunktion12.
Kaninmodeller erbjuder potentiella fördelar jämfört med modeller med andra arter och har använts i flera olika scenarier i årtionden, inklusive induktion av arytmier, globala och regionala ischemiska modeller och hjärtkontraktionsforskning, bland annat13,14,15. Även om kaninhjärtat är mindre än hos en hund eller gris, är det tillräckligt stort för att enkelt kunna utföra kirurgiska ingrepp till en mycket lägre kostnad. Kaninhjärtat används ofta eftersom det är en nära parallell till det mänskliga hjärtat; Faktum är att den har en liknande ämnesomsättning, uttrycker β-myosin tung kedja och saknar betydande myokardiellt xantinoxidas16. Tekniken som beskrivs här för att inducera regional myokardiell ischemi är enkel, repeterbar och kostnadseffektiv. Denna metod möjliggör både icke-överlevnads- och överlevnadsfall, eftersom endast regional ischemi induceras snarare än global ischemi, och de material som behövs är icke-specialiserade. Två olika kirurgiska metoder (dvs. sternotomi och mini-torakotomi) kan användas, vilket ger operatören och experimentella protokoll mer frihet när det gäller studiedesignen. Dessutom kräver ingreppet inte användning av en kardiopulmonell bypass. I detta sammanhang har minimalinvasiva metoder för kranskärls-bypasstransplantation blivit värdefulla alternativ för patienter i behov av revaskularizaiton med flera kärl17,18. Denna modell kan användas för att studera skillnaderna mellan dessa tillvägagångssätt och tillhandahålla ett djurbaserat inlärningsverktyg för kirurgiska praktikanter. Dessutom kan det vara användbart för fysiologisk forskning och/eller kirurgisk träning att utföra hjärtkateterisering med hjälp av denna modell.
Vår modell ger en metodik för tillämpningar där inducering av regional myokardischemi och därefter mätning av infarktstorlek, myokardfunktion och cellulära förändringar är av betydelse. Med detta protokoll har vi kunnat utvärdera flera markörer för cellulär funktion och anpassning till ischemi och den föreslagna terapeutiska interventionen (dvs. mitokondriell transplantation) genom att undersöka internaliseringen av organeller, syreförbrukning, högenergifosfatsyntes och induktion av cytokinmediatorer och proteomiska vägar. Dessa resultat är viktiga för att bevara myokardiell energi, cellviabilitet och hjärtfunktion och möjliggör objektiv utvärdering av kardioprotektiva tekniker efter ischemi-reperfusionsskada. Denna modell kan användas för att studera liknande biologiska vägar och alternativ inom postischemisk myokardpatologi och återhämtning.
Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en mycket reproducerbar metod för att inducera akut regional myokardischemi in situ hos kanin för icke-överlevnads- och överlevnadsexperiment. Denna modell ger en metodik med hög överlevnad, låg intraoperativ mortalitet och minimal morbiditet19. Andra modeller för akut regional myokardiell ischemi har beskrivits med hjälp av radioaktivt märkta material, kontrastmedel, magnetisk resonanstomografi eller datorsimuleringar20,21,22. Vårt protokoll tillhandahåller en tillförlitlig och enkel metodik som är kostnadseffektiv, konsekvent reproducerbar och har ett lågt tekniskt krav och därmed kan utföras av utredare utan kirurgisk expertis. Detta protokoll rymmer antingen ett överlevnadsprojekt med hjälp av en vänster mini-torakotomi eller en icke-överlevnadsmodell med hjälp av en sternotomi i mittlinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna undersökning genomfördes i enlighet med National Institutes of Healths riktlinjer för djurvård och användning och godkändes av Boston Children's Hospital's Animal Care and Use Committee (protokoll 20-08-4247R). Alla djur fick human vård i enlighet med Guiden för skötsel och användning av försöksdjur.
1. Djurarter, bedövningsmedel och smärtstillande medel
- Djurart: Använd Nya Zeelands vita kaniner (vildtypsstam; honkön; könsmogen 15-20 veckors ålder; 3-4 kg kroppsvikt) för experimentella studier.
- Bedövningsmedel och smärtstillande medel:
- Använd atropin i en dos på 0,01 mg/kg intramuskulärt (IM)
- Använd acepromazin i en dos på 0,5 mg/kg intramuskulärt för initial sedering och 0,5 mg/kg intravenöst (IV) för full anestesi.
- Använd butorfanol i en dos på 0,5 mg/kg intramuskulärt protein.
- Använd isofluran via en ansiktsmask med precisionsförångat system vid 3 % för induktion, följt av intubation vid 1%-2%, syrgas (O2) vid 100 % vid 2 L/min och generell anestesi vid 1 % för underhåll.
- Använd medetomidin i en dos på 0,25 mg/kg intramuskulärt ämne.
- Använd ketamin i en dos på 10 mg/kg IV.
- Använd ett bupivakaininterkostalt blockad på torakotomistället i en dos som inte överstiger 3 mg/kg intramuskulärt protein.
- Använd 1 % lidokain i en dos på 1-1,5 ml/kg intravenöst.
- Använd ett 1-4 μg/kg fentanyldepotplåster i 72 timmar.
2. Etapper i förfarandet (figur 1)
- Lugna Nya Zeeland Vita vuxna kaniner med en enda kombinerad intramuskulär injektion av atropin, acepromazin och butorfanol. Inducera djuret med 3 % isofluran via en ansiktsmask med precisionsförångat system.
- Förberedelse före blindad endotrakeal intubation (dvs. utan visualisering av glottis)
- Spraya struphuvudet med 1 % lidokain för att förhindra laryngospasm.
- Mät endotrakealtubens (ETT) längd på utsidan av kaninen från tänderna till den förutspådda carinan och placera kaninen i en akteral liggande position med halsen utsträckt.
- Intubera djuret med en manschettförsedd pediatrisk storlek (3-0 eller 3-5 innerdiameter) ETT under kontinuerlig inhalationsbedövning vid 1%-2% och O 2 vid 100% vid2 L/min.
- För in ETT i munnen och rikta den förbi torus in i svalget.
- För fram ETT tills antingen spetsen på röret kommer i kontakt med glottis eller andningsljuden försvinner, vilket indikerar att rörspetsen har passerat genom den glottiska öppningen.
- Dra ut slangen något tills andningsljuden återfås och för sedan fram igen och fäst slangen på plats.
- Ventilera djuret med mekaniskt stöd (tidalvolym: 10 ml/kg, fraktion av inandadO2: 40 %, andningsfrekvens: 30-40 andetag/min, positivt slutexpiratoriskt tryck: 5-10 cmH2O).
- Justera FiO2 som tolereras för att uppnå en O2-mättnad större än92 % mätt med pulsoximetri för att förhindra hyperoxi, vilket kan framkalla ett systemiskt inflammatoriskt svar.
- Verifiera korrekt placering av ETT genom en fysisk undersökning (dvs. auskultation), kliniska tecken (dvs. observation av kondens i slutet av endotrakealtuben) och med objektiva mått (dvs. endtidal koldioxid).
- Efter cirka 10 minuter ges en intramuskulär injektion av medetomidin till kaninen för att ge samtidig bedövnings- och smärtstillande effekt.
- Bibehåll narkosen med 1 % isofluran under hela det kirurgiska ingreppet.
- För in en 22 G IV-kateter i den marginella öronvenen och fäst den med tejp för att få perifer IV-åtkomst.
OBS: Lårbensvenen kan användas som ett alternativt ställe för venös åtkomst.- Bedöva djuret helt med acepromazin IV och ketamin IV.
- Före snittet injiceras 1 000 E/ml heparin i en dos på 3 mg/kg IV.
- Administrera 1 000 E/ml heparin i en dos på 3 mg/kg initialt och ge en ny dos varje timme fram till slutet av experimentet för att bibehålla en aktiverad koagulationstid på > 400 s, i enlighet med det nuvarande kirurgiska protokollet.
- Administrera 1 % lidokain IV och/eller epikardiell asynkron defibrillering efter behov om ventrikelflimmer uppstår under operationen. Kammarflimmer upphör vanligtvis med en eller två doser lidokain.
- Perfuse laktat Ringers lösning kontinuerligt vid 10 ml/kg/h.
OBS: Med tanke på den lilla volymen vätska som administrerades och de korta operationstiderna behövde djuren i överlevnadsstudier i detta arbete inte diures före extubation eller under återhämtningsperioden. Om djuret utvecklar en försämrad lungstatus (dvs. ökad respiratorinställning, tecken på lungödem vid auskultation etc.), rekommenderas diures.
- Utför en halspulsåderskärning och placera en 4 eller 5 fransk artärslang för att underlätta den intraoperativa övervakningen av det arteriella blodtrycket (BP).
OBS: Lårbensartären kan användas som en alternativ plats för arteriell åtkomst. - Övervaka och registrera alla fysiologiska och mekaniska variabler genom kontinuerlig realtidsanalys.
- Övervaka arteriellt blodtryck med halspulsådern och registrera O 2-mättnaden med hjälp av pulsoximetri via en sensor placerad på en rakad tass.
- Övervaka med ett elektrokardiogram (EKG) med tre extremitetsavledningar: I, II och III, och tre beräknade förstärkta avledningar: aVL, aVR och aVF.
- Registrera EKG-spårningarna vid den pre-ischemiska baslinjen, under ischemi, under reperfusion och seriellt under dag 7-28 av återhämtningen (om en överlevnadsstudie utförs).
- Övervaka sederingsnivån genom kontinuerlig övervakning av blodtrycket och hjärtfrekvensen (HR).
- Övervaka temperaturen med en rektal sond.
- Använd 2D ECHO från vänster, parasternal och apikal vy för att bedöma myokardfunktionen vid önskade tidpunkter i både överlevnads- och icke-överlevnadsfallen.
- Bedöm myokardfunktionen med hjälp av fraktionerad förkortning (FS) genom att mäta vänster kammares slutdiastoliska avstånd (LVEDD) och vänster kammares slutsystoliska avstånd (LVESD) och med hjälp av följande formel:
FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
- Bedöm myokardfunktionen med hjälp av fraktionerad förkortning (FS) genom att mäta vänster kammares slutdiastoliska avstånd (LVEDD) och vänster kammares slutsystoliska avstånd (LVESD) och med hjälp av följande formel:
- Under operationen, placera djuret på en cirkulerande varmvattenfilt för att upprätthålla en stabil kroppstemperatur.
- Förbered och drapera djuret på ett sterilt sätt:
- Raka operationsstället och förbered med betadin och 70 % isopropylalkohol, var och en applicerad i tre exemplar. Klappa området torrt med sterila gasbindor och drapera hela djuret med sterila handdukar.
- Vänster mini-torakotomi (överlevnadsstudier)
- Utför en interkostal blockad på det förutbestämda torakotomistället med bupivakain IM.
- Administrera 1 % lidokain intravenöst via öronvenen före snittet.
- Utför en vänster mini-torakotomi genom det fjärde interkostala utrymmet längs den övre delen av det femte revbenet för att undvika det neuromuskulära knippet, som ligger parallellt med underytan av varje revben.
- Utför en anterolateral torakotomi för bästa visualisering av hjärtats anterolaterala yta (dvs. den anatomiska placeringen av de diagonala LAD-grenarna).
- Placera kaninen med vänster sida upphöjd cirka 30° med hjälp av en kudde eller saccosäck.
- Fäst kaninens ipsilaterala ben ovanför huvudet för att skapa utrymme för både operationsfältet och mellan revbenen.
- Palpera och konturera de beniga landmärkena, inklusive revbenen, bröstbenet och skulderbladet, med en märkpenna med filtspets. Snitta huden över det femte revbenet med ett #10-blad. Se till att snittet förblir parallellt med revbenet.
- Använd diatermi för att dela pectoralis major-muskeln och serratus anterior-muskeln. Dela upp de interkustiska musklerna precis ovanför det femte revbenet med diatermi för att bevara det neurovaskulära knippet.
- Gå försiktigt in i pleurarummet genom det fjärde interkostala rummet med skarp eller trubbig dissektion. Förläng det initiala pleurasnittet parallellt med revbenet i båda riktningarna med skarp eller trubbig dissektion tills en revbensspridare eller sternal retraktor kan sättas in.
- Placera en revbensspridare eller sternal retraktor i revbensutrymmet och vidga för att ge tillräcklig visualisering av hjärtat och hjärtsäcken. Lyft hjärtsäcken med DeBakey-pincetten och öppna hjärtsäcken med Metzenbaum-saxen.
- Isolering av LAD-artären
- Omslut den andra eller tredje diagonala grenen av LAD-artären med en polypropensutur (3-0) på en avsmalnande nål. Ta bort nålen och trä båda ändarna av polypropenfilamentet genom ett litet vinylrör för att bilda en snara.
- Placera en pledgeget mellan snaran och kranskärlet för att undvika att skada kranskärlet och/eller orsaka vasospasm med ligering.
- Använd en DeBakey-pincett och plocka upp en rektangulär PTFE-filtplädget (cirka 7 mm x 3 mm). Placera panten mellan de två polypropenfilamenten så att den är inklämd mellan den isolerade LAD-artären och vinylröret när virveltrumman dras åt.
- Sternotomi mittlinje (icke-överlevnadsstudier)
OBS: Mittlinjesternotomimetoden är idealisk för icke-överlevnadsfall, för vilka mer invasiv övervakning med LVDP och sonomikrometri kan användas.- Utför en sternotomi i mittlinjen med en böjd Mayo-sax. Placera en sternal retraktor och bredda den för att ge tillräcklig visualisering av hjärtat och hjärtsäcken.
- Lyft hjärtsäcken med DeBakey-pincetten och öppna hjärtsäcken med Metzenbaum-saxen.
- Placering av de tre piezoelektriska sonomikrometrikristallerna:
- Gör tre små snitt på 1 mm på LV:s epikardiet och bilda hörnen i en triangel. Placera de piezoelektriska sonomikrometrikristallerna inuti epikardiumsnitten.
- Fäst trådarna på hjärtats yta med en 5-0 U-söm av polypropen. När du spelar in med sonomikrometri, pausa den mekaniska ventilationen för att möjliggöra en korrekt inspelning över två till tre hjärtslag.
OBS: Om hjärtat fibrillalerar, 1 % lidokain är inte effektivt och epikardiell defibrillering behövs, stäng av sonomikrometern och koppla bort den från datainsamlingssystemet för att skydda båda från elektrisk inmatning.
- Isolering av LAD-artärer:
- Omslut den andra eller tredje diagonala grenen av LAD-artären med en polypropensutur (3-0) på en avsmalnande nål.
- Ta bort nålen och trä båda ändarna av polypropenfilamentet genom ett litet vinylrör för att bilda en snara.
- Placera en plädda mellan snaran och kranskärlet för att undvika att skada kranskärlet och/eller orsaka vasospasm med ligering.
- Använd en DeBakey-pincett och plocka upp en rektangulär PTFE-filtplädget (cirka 7 mm x 3 mm). Placera panten mellan de två polypropenfilamenten så att den är inklämd mellan den isolerade LAD-artären och vinylröret när virveltrumman dras åt.
- Mätning av LVDP:
- Placera en 5-0 polypropen U-söm i toppen av LV. Gör ett litet 1 mm snitt med ett 11 blad i LV-spetsen.
- För in en 3 fransk ballongkateter i LV-lumen. Fäst katetern på LV genom att knyta den till 5-0 polypropen U-stitch-suturen.
- Anslut katetern till givaren som är ansluten till monitorn för att spela in LVDP. Spela in LVDP med hjälp av datainsamlingssystemet (beskrivs nedan). Nollställ katetern för att registrera de hemodynamiska variablerna genom att öppna trevägskranen i luften och nollställa monitorn.
- System för datainsamling
- Starta datainsamlingssystemet (se materialtabellen) på den dator/bärbara dator som används. Anslut kabeln från bildskärmen till datorn/laptopen.
- Välj kanal 1 i datainsamlingssystemet och ge den namnet LVDP. Nollställ givaren med hjälp av monitorn.
OBS: Om du ansluter BP och HR till datainsamlingssystemet, följ samma process: anslut kabeln till den bärbara datorn, välj Kanal och noll om du mäter BP.
- Täpp till kranskärlet genom att dra åt virveltrumman genom att trycka ner vinylröret samtidigt som du drar upp polypropensuturfilamenten. Behåll önskad täthet med en myggklämma genom att direkt klämma fast röret och fixera det på plats.
- Bekräfta myokardiell ischemi visuellt genom epikardiets regionala cyanos. Regional ischemi kan också bekräftas på EKG med närvaro av ett ST-segment och T-vågsförändringar.
- Efter visuell bekräftelse, inducera regional ischemi i 30 minuter under anestesi.
- Vid 0 min, 10 min, 20 min och 30 min under regional ischemi, bedöm FS med 2D ECHO för både överlevnads- och icke-överlevnadsfall.
- Bedöm LVDP och sonomikrometri kontinuerligt under tiden före ischemi, myokardiell ischemi och postischemisk tid för icke-överlevnadsfallen.
- Om det behövs, avgränsa riskområdet genom att ligera artären igen med polypropensutursömmen kvar på plats. Kläm fast aortan och injicera Monastral Blue-pigment 98 % (utspätt 1:5 i PBS) genom aortan med hjälp av en kardioplegi nål. De perfunderade områdena i myokardium kommer att färgas blått, och det riskområde som är i riskzonen kommer att förbli ofärgat.
- Övervaka och registrera HR-, BP- ochO2-mättnaden kontinuerligt.
- Låt djuret återhämta sig i 2 timmar (icke-överlevnad) eller 28 dagar (överlevnad).
OBS: EKG kan användas för att bekräfta reperfusion. Även om det inte sågs i experimentet som utfördes i denna studie, kan hypokalemi ofta uppstå under reperfusion och kan korrigeras med kaliumkontroll eller en lämplig infusion.
- Avslutande av förfarandet
- Överlevnad fall
- I överlevnadsfall, klipp av 3-0 polypropentråden som används för virveltrumman, knyt ihop ändarna löst och låt den sitta kvar. Identifiera riskområdet och infarktzonen med 3-0 polypropentråden.
- När proceduren är klar, stäng snittet i tre lager.
- Stäng det första lagret genom att knyta två 2-0 polyglactin 910 åttastygn runt resåren.
- Stäng de muskulära och subkutana lagren med en 3-0 polydioxanonsutur på ett löpande sätt.
- Stäng huden på ett subkutikulärt sätt med en 5-0 monofilamentsutur. Använd en nedgrävd löpande sutur för att minimera irritationen som djuret känner.
- Evakuera pleuraluften genom att utföra en nåltorakocentes.
- Applicera ett fentanylplåster i 72 timmar för att underlätta den postoperativa smärtlindringen.
- Utför transthorax ekokardiografi vid 1 vecka och 2 veckor postoperativt för att bedöma trenderna i FS.
- Efter den förutbestämda återhämtningsperioden lugnas, intuberas och bedövas djuret enligt ovan. Utför en mediansternotomi. Exponera och öppna hjärtsäcken. Avliva kaninen under djup bedövning genom att ta bort hjärtat i klump, så att djuret dör genom blodförgiftning.
- Fall som inte överlever
- Efter experimentet och efter att ha säkerställt djup anestesi, exponera hjärtat helt och hållet och ta bort det i klump för biokemisk analys och vävnadsanalys. Djuret dör genom blodförgiftning.
- Överlevnad fall
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt protokollet (figur 1) bekräftades myokardischemi omedelbart genom direkt visualisering av cyanos i epikardiet.
Standard-EKG (tre avledningar i extremiteterna: I, II och III, och tre beräknade förstärkta avledningar: aVL, aVR och aVF) registrerades kontinuerligt före ischemi, under ischemi och vid reperfusion (Figur 2). EKG visar takykardi, arytmier (dvs. ventrikelflimmer), ledningssystemdefekter (dvs. grenblock), utveckling av infarktrelaterade Q-vågor och ST-segmentavvikelse23.
Under regional ischemi observerades regional hypokinesi direkt med blotta ögat i mitten av den främre väggen i alla hjärtan, vilket överensstämde med LAD-artärens perfusionsområde som gjordes ischemiskt genom flödesbegränsningen med den tillfälliga snarningen av LAD. I både överlevnads- och icke-överlevnadsfallen erhölls 2D ECHO-avläsningar under pre-ischemi, strax före inducering av regional ischemi, och vid olika tidpunkter under experimentet: 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min och 120 min. De vänsterkammar-end-diastoliska (LVEDD) och vänsterkammar-end-systoliska dimensionerna (LVESD) mättes med en 2D-styrd M-mode ECHO vid maximal respektive minimal LV-omkrets. Den regionala LV-väggkontraktiliteten i den myokardiella ischemiska zonen bedömdes från kortaxliga vyer av LV med hjälp av M-mode, med curserlinjen som ligger över riskområdet. Fraktionsförkortningen (FS) beräknades med följande formel: FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 10024. Resultaten visade att den fraktionerade förkortningen minskade under den ischemiska tiden och den postischemiska tiden jämfört med den pre-ischemiska tiden (Figur 3)
För att kvantifiera omfattningen av hjärtmuskelskada kan infarktstorleken mätas biokemiskt med trifenyltetrazoliumklorid (TTC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) färgning. I detta arbete avgränsades riskområdet genom att den involverade artären återligerades genom att knyta Prolenesömmen som lämnats på plats. Aortan korsklämdes och Monastral Blue-pigment (utspätt 1:5 i PBS) tillfördes genom aortan med hjälp av en kardioplegi nål. Områdena med perfunderat myokardium färgades blå, och riskområdet förblev ofärgat på grund av artärens ligering.
Hjärtat skars tvärs över vänster kammares långa axel, från spets till bas, i 1 cm tjocka tvärsnitt, placerades mellan glasplattor och pressades ihop med bulldoggklämmor. Riskområdet för varje sida av varje sektion ritades upp på ett genomskinligt acetatark. Hjärtsnitten inkuberades i en mörk behållare med 1 % TTC i fosfatbuffert (pH 7,4) vid 38 °C i 20 minuter. Hjärtsnitten förvarades sedan i en 10-procentig formaldehydlösning i 24 timmar innan de slutliga mätningarna för att förbättra visualiseringen av infarktzonen. Sektionerna placerades mellan glasskivor och komprimerades med bulldoggklämmor. Myokardnekros visade sig genom ett vitt område på myokardvävnaden, och de tegelröda områdena visade den livskraftiga vävnaden. (Figur 4) De infarktdrabbade områdena (vita) inom riskområdena för varje sida av varje sektion spårades på det genomskinliga acetatarket. Planimetri användes för att mäta riskområdet och infarktzonen. Volymerna för riskområdet och den infarktdrabbade zonen beräknades genom att multiplicera de planimeterade ytorna med skivtjockleken. Infarktvolymen uttrycktes i procent av den totala LV-volymen för varje hjärta25. Förhållandet mellan riskområdet och LV-vikten beräknades och infarktstorleken uttrycktes i procent av riskområdet. Vårt tidigare arbete visade att efter 2 timmar och 28 dagars återhämtning var riskområdena (dvs. i procent av LV-massan) cirka 29 % respektive 27 % för både mitokondrie- och kontrollgruppen Men efter 2 timmar och 28 dagars återhämtning var infarktstorleken (dvs. infarktstorleken/riskområdet) i mitokondriehjärtana 9,8 % och 7,9 % jämfört med 37 % respektive 34 % i kontrollhjärtan26. Dessutom, i våra tidigare experiment, minskade fraktionerad förkortning och LVDP i kontrollgruppen till 50%-60% respektive 70%-80%, jämfört med baslinjen.
Figur 1: Protokolldiagram. Protokollet kan justeras baserat på experimentets behov, antingen för överlevnad eller icke-överlevnad. Icke-överlevnadsfall kan utföras med en mer invasiv kirurgisk metod med hjälp av en sternotomi i mittlinjen, vilket möjliggör användning av sonomikrometrikristaller, epikardiell ekokardiografi (ECHO) och en LV-kateter för mätning av fraktionerad förkortning och LVDP. För överlevnadsfall, för vilka snittläkning och smärtlindring måste övervägas, kan en vänster mini-torakotomi utföras, och hjärtmuskelfunktionen kan bedömas vid olika tidpunkter under en längre studieperiod med hjälp av 2D ECHO. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativt elektrokardiogram (extremitet II och beräknat förstärkt bly aVL) före den regionala ischemiinduktionen, under den ischemiska tiden och under reperfusionen. Millivolt- och millisekundskalor visas till vänster. Tidpunkterna och ögonblicket för den vänstra främre nedåtgående artären visas längst ner. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ekokardiografisk bedömning av hjärtat genom mätning av fraktionerad förkortning (FS). Den fraktionerade förkortningen mättes genom att erhålla det vänsterkammar-end-diastoliska avståndet och det vänstra kammar-slutsystoliska avståndet med 2D-styrt M-mode vid maximal respektive minimal LV-omkrets. Den fraktionerade förkortningen bedömdes vid (A) baslinje/pre-ischemi, (B) under den tillfälliga snarningen av den vänstra främre nedåtgående artären (LAD) med markörlinjen som ligger över riskområdet, och (C) under reperfusion efter att virveltrumman släppts på LAD. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa bilder av infarktstorleken för ett hjärta färgat med 1 % trifenyltetrazoliumklorid efter 30 minuters inducerad myokardregional ischemi. Den livsdugliga vävnaden ses som röd, medan infarkten ses som vita områden. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt protokoll visar en tillförlitlig metod för att utföra akut regional myokardischemi hos kaninen. Den vänstra mini-torakotomimetoden är idealisk för överlevnadsfall, där snittet och tillhörande smärta måste minimeras. Det är viktigt att notera att diuretikabehandling inte var nödvändig före extubation, och det förekom ingen mortalitet intraoperativt i icke-överlevnadsgruppen eller 4 veckor postoperativt i överlevnadsgruppen. När utformningen av protokollet kräver ett fall av icke-överlevnad, eller när mer detaljerad övervakning av den globala och regionala hjärtmuskelfunktionen behövs, kan en mittlinjesternotomi användas (Figur 1).
De mest kritiska stegen i protokollet är att noggrant omringa LAD med en avsmalnande nål utan att skada artären eller skapa venös blödning och att täppa till LAD för att skapa ett konsekvent riskområde.
Några komplikationer som kan upplevas vid utförande av den beskrivna operationen är lungöverdistension under mekanisk ventilation på grund av hög tidalvolym, blödning från skada på LAD, blödning sekundärt till interkostal kärlskada, som vanligtvis uppstår vid inträde eller från retraktormanipulation, och/eller hjärtarytmi (intraoperativt ventrikelflimmer) med LAD-ligering. Andra postoperativa komplikationer kan också förekomma, såsom infektion i operationsområdet, dålig mobilisering av djur på grund av smärta och/eller kvarvarande myokardregional hypokinesi. Trots att förekomsten av dessa komplikationer är mycket låg bör utredaren enkelt och effektivt kunna ta itu med dem.
Kaniner är en utmärkt djurmodell för hjärtmuskelstudier. Deras hjärtfrekvens liknar den mänskliga hjärtfrekvensen, och deras storlek är tillräckligt liten men möjliggör histologisk analys under ett optiskt mikroskop.
En begränsning i denna studie bör erkännas; Kaninhjärtat är mindre och kliniskt mindre relevant för jämförelser med det mänskliga hjärtat än hjärtan hos andra stora djurmodeller som grisen.
På grund av förekomsten och prevalensen av hjärt-kärlsjukdomar är det av största vikt att ha en djurmodell som simulerar regional myokardiell ischemi. Denna metod kan ha flera tillämpningar och har visat sig vara användbar i modeller av kärlskada, kronisk myokardiell ischemi och korta perioder av myokardbedövning 27,28,29,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter, ekonomiska eller andra, deklareras av författarna.
Acknowledgments
Den ursprungliga studien där detta protokoll användes stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL-103642 och HL-088206
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
- Selvin, E., Erlinger, T. P. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 110 (6), 738-743 (2004).
- Bolli, R., et al. Myocardial protection at a crossroads: The need for translation into clinical therapy. Circulation Research. 95 (2), 125-134 (2004).
- Cohn, J. N., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Special Emphasis Panel on Heart Failure Research. Circulation. 95 (4), 766-770 (1997).
- Rousou, A. J., Ericsson, M., Federman, M., Levitsky, S., McCully, J. D. Opening of mitochondrial KATP channels enhances cardioprotection through the modulation of mitochondrial matrix volume, calcium accumulation, and respiration. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (5), H1967-H1976 (2004).
- Rao, V., et al. Insulin cardioplegia for elective coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 119 (6), 1176-1184 (2000).
- Vinten-Johansen, J., Zhao, Z. Q., Jiang, R., Zatta, A. J. Myocardial protection in reperfusion with postconditioning. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 3 (6), 1035-1045 (2005).
- Wakiyama, H., et al. Selective opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during surgically induced myocardial ischemia decreases necrosis and apoptosis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 21 (3), 424-433 (2002).
- Chen, Q., Moghaddas, S., Hoppel, C. L., Lesnefsky, E. J. Reversible blockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial injury following reperfusion. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 319 (3), 1405-1412 (2006).
- Lesnefsky, E. J., et al. rather than reperfusion, inhibits respiration through cytochrome oxidase in the isolated, perfused rabbit heart: Role of cardiolipin. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), H258-H267 (2004).
- McCully, J. D., Rousou, A. J., Parker, R. A., Levitsky, S. Age- and gender-related differences in mitochondrial oxygen consumption and calcium with cardioplegia and diazoxide. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (3), 1102-1109 (2007).
- Mandel, I. A., et al. Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial is-chemia-reperfusion injury with cardiopulmonary bypass (Experimental study). International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5336 (2020).
- Ali, Z. A., et al. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: A randomized controlled trial. Circulation. 116, 98-105 (2007).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M.
- Tanaka, K., Hearse, D. J. Reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rabbit heart: characterization of the influence of the duration of regional ischemia and the extracellular potassium concentration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 20 (3), 201-211 (1988).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Gupta, M. P. Factors controlling cardiac myosin-isoform shift during hypertrophy and heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (4), 388-403 (2007).
- Lapierre, H., Chan, V., Sohmer, B., Mesana, T. G., Ruel, M. Minimally invasive coronary artery bypass grafting via a small thoracotomy versus off-pump: A case-matched study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 804-810 (2011).
- Aubin, H., Akhyari, P., Lichtenberg, A., Albert, A. Additional right-sided upper "half-mini-thoracotomy" for aortocoronary bypass grafting during minimally invasive multivessel revascularization. Journal of Cardiothoracic Surgery. 10, 130 (2015).
- Hu, N., et al. Ligation of the left circumflex coronary artery with subsequent MRI and histopathology in rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (6), 838-844 (2010).
- Sievers, R. E., et al. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat. Magnetic Resonance in Medicine. 10 (2), 172-181 (1989).
- Rodríguez, B., Trayanova, N., Noble, D.
- Sinusas, A. J., et al. Quantification of area at risk during coronary occlusion and degree of myocardial salvage after reperfusion with technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile. Circulation. 82 (4), 1424-1437 (1990).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Pombo, J. F., Troy, B. L., Russell, R. O. J. Left ventricular volumes and ejection fraction by echocardiography. Circulation. 43 (4), 480-490 (1971).
- McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M., Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), H1923-H1935 (2004).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), 966-982 (2013).
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. Journal of Surgical Research. 162 (2), 239-249 (2010).
- Pirat, B., et al. A novel feature-tracking echocardiographic method for the quantitation of regional myocardial function: Validation in an animal model of ischemia-reperfusion. Journal of the American College of Cardiology. 51 (6), 651-659 (2008).
- Verdouw, P. D., vanden Doel, M. A., de Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
- Bolukoglu, H., et al. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. The American Journal of Physiology. 263, H20-H29 (1992).
- Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F. Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. Journal of Clinical Investigation. 56 (4), 978-985 (1975).
