Summary
土壤密度分馏将土壤有机质分离到具有不同稳定机制、化学成分和周转时间的不同池中。具有特定密度的聚钨酸钠溶液允许分离游离颗粒有机物和矿物相关有机物，从而产生适合描述土壤对管理和气候变化响应的有机物部分。
Abstract
土壤有机质（SOM）是不同化合物的复杂混合物，其范围从游离的，部分降解的植物成分到土壤聚集体中保存的更多微生物改变的化合物，再到与活性土壤矿物质密切相关的高度加工的微生物副产品。土壤科学家一直在努力寻找将土壤分离成易于测量且可用于土壤碳（C）建模的部分的方法。基于密度的分馏土壤越来越多地被使用，并且易于执行，并根据SOM与不同矿物之间的关联程度产生C池;因此，土壤密度分级有助于表征SOM并确定SOM稳定机制。然而，报告的土壤密度分馏方案差异很大，使得不同研究和生态系统的结果难以比较。在这里，我们描述了一种强大的密度分馏程序，该程序可以分离颗粒和与矿物质相关的有机物，并解释将土壤分离成两个，三个或更多密度部分的优缺点。这些馏分通常在其化学和矿物组成、周转时间和微生物加工程度以及矿物稳定程度方面有所不同。
Introduction
土壤是最大的陆地碳（C）储存量，在顶部1米处含有超过1，500 Pg的C，在全球更深的层次中几乎是该量的两倍，因此这意味着土壤含有比植物生物量和大气加起来更多的C1。土壤有机质（SOM）保留水和土壤养分，对植物生产力和陆地生态系统的功能至关重要。尽管全球都认识到充足的SOM储量对土壤健康和农业生产力的重要性，但由于不可持续的森林和农业管理、景观变化和气候变暖，土壤碳储量已大量枯竭2，3。对恢复土壤健康和利用土壤碳保留作为自然气候解决方案的关键参与者的兴趣日益浓厚，导致人们努力了解在不同环境中控制土壤碳固存和稳定的因素4，5。
土壤有机质（SOM）是不同化合物的复杂混合物，其范围从游离的，部分降解的植物成分到土壤聚集体中保存的更多微生物改变的化合物（此处定义为由单独的单元或项目组合形成的材料）到高度加工的微生物副产品，与活性土壤矿物质有很强的关联6.在无法识别SOM中全套单个化合物的情况下，研究人员通常专注于识别少量的C功能库，这些C作为物理现实存在，并且因周转率，一般化学成分和土壤矿物成分的稳定程度而异1，7.为了批判性地解释和建模水池，分离的矿池数量必须少，可直接测量而不仅仅是理论上的，并且在组成和反应性方面表现出明显的差异8。
已经采用了许多不同的技术，包括化学和物理技术，以分离有意义的土壤C池，von Lützow等人9和 Poeplau等人10很好地总结了这些技术。化学萃取技术旨在分离特定的池，例如与低结晶或结晶Fe和Al11相关的C。有机溶剂已被用于提取特定化合物，例如脂质12，并且SOM的水解或氧化已被用作C13，14不稳定池的量度。然而，这些提取方法都没有将所有C池分类为可测量或可建模的分数。土壤的物理分馏根据大小将所有土壤C分类为池，并假设植物残骸的分解导致碎裂和颗粒越来越小。虽然仅靠大小无法将游离植物碎片与矿物相关的SOM15分开，但由于形成和周转中常见的空间，物理和生物地球化学差异，量化这两个池对于理解土壤C稳定性至关重要16。
基于密度的土壤C分馏越来越多地被使用，并且易于执行，并根据与不同矿物的关联程度识别不同的C池17，18，19;因此，土壤密度分级有助于阐明不同的土壤C稳定机制。分馏土壤的主要要求是能够完全分散有机和矿物颗粒。一旦分散，相对不含矿物质的降解有机物漂浮在轻于~1.85 g/cm 3的溶液中，而矿物质通常在2-4.5 g/cm 3的范围内，尽管氧化铁的密度可能高达5.3 g/cm 3。轻颗粒或游离颗粒部分往往具有较短的周转时间（除非木炭有重大污染），并且已被证明对栽培和其他干扰高度敏感。重质（>1.85 g/cm3）或矿物相关部分通常具有较长的周转时间，因为当有机分子与反应性矿物表面结合时获得对微生物介导的分解的抵抗力。然而，重馏分可能会饱和（即达到矿物络合能力的上限），而轻馏分理论上几乎可以无限期地积累。因此，了解有机物在矿物相关与颗粒有机物池中的物理分布有助于阐明哪些生态系统可以管理以实现有效的碳封存，以及不同系统将如何应对气候变化和人为干扰模式的变化20。
虽然在过去十年中，使用不同密度的聚钨酸钠溶液进行密度分馏的使用大大增加，但技术和方案差异很大，使得不同研究和不同生态系统的结果难以比较。尽管 1.85 g/cm 3 的密度已被证明可以回收最大量的自由光部分，而矿物质相关有机物 （MAOM） 的含量极少17，但许多研究使用的密度范围为 1.65-2.0 g/cm3。虽然大多数研究将土壤分馏为两个池（轻部分和重部分，以下简称LF和HF），但其他研究使用多种密度将重部分进一步细化为池，这些池因与其相关的矿物质，矿物质与有机涂层的相对比例或聚集程度（例如， Sollins et al.17， Sollins et al.18， Hatton et al.21， Lajtha et al.22， Yeasmin et al.23， Wagai et al.24， Volk et al.25）。此外，有人建议采用更复杂的分馏程序，将尺寸和密度分离结合起来，导致更多的池（例如，Yonekura 等人 26、Virto 等人 27、Moni 等人 15、Poeplau 等人 10），但在方法和与池大小相关的方面也存在更大的错误空间。此外，作者还使用了不同强度和时间的超声处理，以努力从矿物表面分散聚集体和MAOM28，29，30。
在这里，我们描述了一个强大的密度分馏程序，首先识别两个独特的土壤碳库（LF和HF，或POM和MAOM），我们提供了技术和论据，以进一步将HF池分离成其他部分，这些部分根据其矿物学，有机涂层程度或聚集度而有所不同。这里确定的馏分已被证明在其化学成分、周转时间、微生物加工程度和矿物质稳定程度方面有所不同18，19。
以下程序通过在具有特定密度的溶液中混合已知数量的土壤，将块状土壤分离为颗粒有机物（POM）和矿物相关有机物（MAOM）。该程序的有效性是通过土壤质量和碳相对于初始土壤样品质量和C含量的综合回收来衡量的。通过将聚钨酸钠（SPT）溶解在去离子水中来实现致密溶液。土壤最初与致密的SPT溶液混合并搅拌以彻底混合和分散土壤骨料。然后使用离心法分离漂浮在溶液中（轻质部分）或下沉（重部分）的土壤材料。混合、分离、回收和洗涤步骤重复多次，以确保轻质和重质馏分的分离，同时从材料中去除SPT。最后，对土壤组分进行干燥、称重并分析其 C 含量。分馏材料可用于后续程序和分析。
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Protocol
1. 制备聚钨酸钠储备溶液
注意：SPT是一种刺激物，吞咽或吸入有害。对水生生物有毒;避免将其释放到环境中。
- 要制备密度为 1.85 g/cm3 的 1 L SPT 溶液，请将 1，051 g 结晶 SPT 溶解在约 600 mL 去离子蒸馏 （DDI） 水中。搅拌溶液直到SPT完全溶解，约15分钟，然后用DDI使溶液体积达到1L。
注意：使用溶液密度 <1.85 g/cm3 的碳回收可能会不足地募集来自颗粒有机物17，18 的轻组分碳，从而错误地表示样品中的碳量。因此，建议SPT溶液密度为1.85 g/cm3 8，17，以便更好地包含与典型土壤样品（即大多数沙子，淤泥和粘壤土）相关的碳，C含量<10%）。 - 要制备密度为 2.40 g/cm3 的 1 L SPT 溶液，请将 1，803 g 固体 SPT 溶解在约 500 mL DDI 水中。搅拌溶液直到SPT完全溶解，然后用DDI使溶液体积达到1L。
注意：除了土壤分馏的潜在用途外，通常需要密度大于1.85 g/cm 3的溶液来调整协议中后续步骤中的SPT溶液（参见步骤3.2）。如果剩余额外的2.40 g / cm 3溶液，则可以用去离子水将溶液稀释至1.85 g / cm3并用于土壤分馏。 - 在用于分馏之前，分析SPT的C和N含量。使用固体或液体元素分析仪执行此分析（示例方法：ISO 10694：1995、ISO 20236：2018）。
- 对液体元素分析仪执行步骤1.1中的溶液的1：100稀释，以减少元素洗涤器和催化剂的劣化。SPT溶液中对C和N污染的耐受性将取决于样品和土壤组分的后续用途。通常，C和N含量分别为<1 ppm和<0.1 ppm的SPT溶液被认为适合使用，因为诸如此类的解决方案具有改变更大的土壤C和N池的最小容量。
2. SPT中土壤的溶解
- 将 50 g 风干并筛分至 2 mm 的土壤加入 250 mL 锥形聚丙烯离心管中。将质量记录为至少四个有效数字。不要使用烘箱干燥的土壤，因为这可能会由于热诱导的细胞裂解而增加可溶性碳31。
注意：可以使用田间潮湿的土壤31，但在后面的步骤中需要进一步调整以保持SPT溶液的目标密度。建议将土壤材料筛分至2毫米，以去除可能扭曲分馏结果的大材料，例如岩石和木质碎屑。- 调整土壤质量以确保回收每个馏分的足够质量，以避免定量中的明显误差。质量调整的最常见原因是POM含量低（例如，占土壤总质量的<2%）。对于此类土壤，提供额外的土壤质量以准确量化POM回收率。总体而言，调整每个单独样品的土壤质量是可以接受的，因为改变样品质量不会改变POM与MAOM的比例。然而，使用一致的质量来帮助平衡离心机通常是有用的。
- 在分馏之前处理富含碳酸盐的土壤以去除无机碳酸盐32.
- 向离心管中加入 50 mL 的 1.85 g/cm3 密度 SPT，并盖紧盖子。与土壤量一样，根据需要调整 SPT 体积。在富含POM的表层土壤（例如，许多温带森林土壤）中，使用较大的土壤与SPT的比例（例如，30 g土壤与60 mL SPT）以实现轻质和重质部分材料的充分分离。
- 用手用力摇动试管~60秒以分解非水稳定的骨料。需要土壤骨料与离心管侧壁的强力碰撞，这意味着仅仅涡旋溶液可能是不够的。
- 将管子固定在平台振动器上。通常，将管子侧放在一边有助于通过增加溶液的晃动力和降低土层的站立高度来分散土壤。注意管子密封紧密，并以40-120rpm摇动2小时。定期从摇床上取下管子并用手剧烈摇晃，以增加密度较大的聚集材料的搅拌。
3. 进行粗土分馏
- 从摇床上取下试管。通过小心地添加额外的SPT溶液来平衡离心管质量，以在要离心的管组中达到一致的质量，确保在加入SPT溶液后用手剧烈摇动30秒。在水平桶离心机中以3，000× g 离心10分钟。
- 在吸出样品之前，通过用移液管抽出5 mL溶液并在天平上检查质量数来测试上清液的密度。根据需要调整 SPT 密度以达到所需的密度。如果进行了溶液密度调整，则再次摇动并离心。
- 将1L侧臂烧瓶连接到真空泵上。将 110 mm 玻璃纤维过滤器（0.7 μm 孔径）放入 12 cm 内径 （ID） 瓷布赫纳漏斗中。使用锥形橡胶垫圈将漏斗小心地密封在侧臂烧瓶上。
注意：玻璃纤维过滤器应在150°C的干燥箱中预清洗，并在使用前用DDI冲洗。 - 设置一个连接到真空的附加 1 L 侧臂烧瓶。将橡胶塞放在烧瓶的顶部，并附有~0.5m突出长度的管子以进行抽吸。
注意：将塑料吸头（例如 5 mL 一次性移液器吸头，末端以一定角度夹住）连接到吸液管的末端可能会有所帮助，以改善抽吸过程中的吸力控制（见 图 1）。 - 沿着离心管的侧面轻轻吸出沉淀在溶液顶层的上清液和悬浮材料，注意不要将吸管的尖端接触到下面的颗粒土壤表面。
注意：如果任何土壤颗粒材料（重部分）与悬浮（轻部分）材料一起被错误地吸出，则应重复分馏程序。如果不注意，这种误差将导致轻分数质量比预期的重，碳含量低于预期，这可以通过对具有相似土壤性质的样品的数据分析来证明。- 要在样品之间清洁吸液管，请将吸管尖端快速浸入 DDI 水中（例如，浸没 0.1 秒），并在真空泵打开的情况下通过管路吸入 ~5 mL DDI 水。重复直到所有材料从真空管中冲洗干净。
- 从侧臂烧瓶中取出橡胶塞和吸液管附件，并在真空泵打开的情况下将内容物倒入 Buchner 漏斗的顶部。
- 用DDI水冲洗烧瓶，旋转，然后将烧瓶内容物倒入Buchner漏斗中。重复直到去除粘附在烧瓶侧面的所有残留物。
- 向离心管中加入 50 mL SPT，用手剧烈摇晃 60 秒（如果土壤不能快速分散，则使用摇床），确保分解管底部的硬颗粒，以便重新悬浮所有残留物。以3，000× g离心10分钟。
- 重复步骤 3.5。将烧瓶内容物倒入步骤3.5.2中使用的相同布赫纳漏斗中。
- 向离心管中加入 50 mL SPT，用手剧烈摇晃，确保将管底部的硬颗粒分解。以3，000× g离心10分钟。
- 重复步骤 3.5。将烧瓶内容物倒入步骤3.5.2中使用的相同布赫纳漏斗中。
4. 使用更高密度的SPT进行额外的密度分离
注意：如果执行多个额外的密度分级，则必须按照密度增加的顺序进行后续分馏。这里显示了使用1.85-2.4 g/cm 3和>2.4 g/cm3密度SPT进行分离的步骤。
- 将 50 mL 的 2.4 g/cm 3 SPT 加入含有步骤 3 中 >1.85 g/cm 3 土壤材料的离心管中。用手剧烈摇晃（>60秒），确保打破管底部的硬颗粒。以3，000×g离心10分钟。
- 在吸出样品之前，通过用移液管抽出5 mL溶液并在天平上检查质量数来测试上清液的密度。根据需要调整 SPT 密度以达到所需的密度。如果进行了溶液密度调整，则再次摇动并离心。
- 使用2.4 g/cm 3 SPT溶液代替之前使用的1.85 g/cm 3 SPT溶液重复步骤3。在步骤3结束时，在Buchner漏斗中分离的材料将具有1.85-2.4 g / cm 3之间的密度，而剩余在离心管中的材料将具有>2.4 g / cm3之间的密度。
5. 从重质和轻质馏分样品中清洗 SPT
注意：必须对所有分馏材料执行以下清洗步骤。如果SPT溶液没有从材料上完全冲洗干净，则相应的馏分重量将不准确。
- 将 50 mL DDI 水加入装有重馏分材料的离心管中，用手剧烈摇晃（60 秒），确保将管底部的硬颗粒打碎。以3，000× g离心10分钟。
- 如步骤3.5所示吸出。此时，应该已经去除了所有轻质部分材料。将清澈的吸气物丢弃在废物桶中，而不是将其添加到过滤漏斗中。
- 重复步骤 5.1-5.2 两次。在最终吸出管中的溶液之前，使用移液管抽出 25 mL 的上清液，并通过将溶液重量除以体积来检查密度，以确保 SPT 已从样品中充分去除。如果密度为 <1.01 g/mL，请继续下一步。如果密度为 1.01 g/mL 或更高，请按上述方式进行额外的水洗，直到密度小于 1.01 g/mL。
- 为确保从轻质部分完全去除 SPT，请用 DDI 水填充每个 Buchner 漏斗，并通过玻璃纤维过滤器过滤内容物。一旦水完全过滤，再重复两次。如果土壤有机物含量高，过滤可能需要长达48小时。
6. 重馏分材料的收集
- 小心地将离心管中的土壤刮入干净的贴有标签的玻璃烧杯或罐子中。将足够的DDI水倒入管中以松动剩余的土壤;盖上盖子摇晃，然后将浆液加入玻璃容器中。冲洗离心管中所有剩余的土壤，并使用去离子水转移到玻璃容器中。
- 将玻璃容器放入设置在40-60°C之间的干燥炉中。 干燥直至达到恒定干重，通常持续24-72小时。
7. 轻组分材料的收集
- 关闭真空泵，然后从侧臂烧瓶中取出漏斗。将漏斗水平放在贴有标签的玻璃烧杯或罐子上，使用 DDI 水洗瓶轻轻冲洗过滤器中的颗粒。
注意：可能需要使用刮刀轻轻刮擦过滤器，并冲洗过滤器的两侧以去除所有残留物。 - 将玻璃容器放入40-60°C之间的干燥箱中。 干燥直至达到恒定干重，通常持续24-72小时。
8. 称量分馏物料的干质量
- 轻轻地将每个容器中的所有干燥材料刮入塑料称重船中。记录质量直到小数点后第四位。将样品放入带标签的储存瓶或袋子中。
- 对所有干燥的样品重复上述步骤。
9. 总有机碳的数据收集和分析
- 按照用于分析元素C含量的仪器（例如ISO 10694：1995）遵循分析程序。
注意：在元素分析之前，将干燥的馏分材料研磨成细粉是一种常见的做法，以确保分馏样品的均匀性。 - 确保所有馏分的累积质量至少等于原始土壤样品质量的~90%。如果材料损失为>10%，则建议进行额外的重复分馏。
- 量化馏分中土壤有机碳（SOC）的累积恢复率。由于馏分材料的不成比例的损失和溶解有机碳的损失，SOC的损失可能与质量损失不完全相关。然而，土壤样本中SOC的损失也应为初始SOC的<10%。
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Representative Results
土壤密度分馏非常适合研究土壤颗粒和矿物质相关有机物含量的差异。将SOC分离到这两个不同的池中，为阐明土壤C含量和稳定动态的变化提供了一条途径，否则在观察土壤C含量的趋势时可能不清楚。重物的进一步分离（密度>1.85 g/cm3）提供了对土壤C稳定性变化和趋势的更多见解，但增加了程序和相关解释的复杂性，并带来了额外的成本。尽管如此，将土壤分馏成三个或三个以上密度池可以阐明土壤C池的复杂趋势和化学差异。与任何土壤分馏程序一样，这些土壤C库的分离是不完美的，在报告结果时应认识到这些误差和方法假设的潜在影响。最后，从业人员应了解存在的土壤分馏方法的多样性及其独特的优缺点（见von Lützow等人9和Poeplau等人10提供的综述和比较）。这些土壤分馏方法中的许多并不相互排斥，可以适当地组合以改进或验证土壤C动态的分析。
选择要使用的密度级分数量是开始分馏程序之前关键的第一步。虽然始终可以在数学上组合多个池以产生单个轻质和单个重质馏分以将结果与其他研究进行比较，但将重质馏分组分为多个池会增加大量的时间和费用。Pierson等人33在长期碎屑操作研究后量化了三个密度池中SOC的变化。当合并两个较重的池（图2）时，碎屑处理的效果在轻（<1.85 g/cm 3）和重（>1.85 g/cm 3）部分之间是不同的，特别是相对于从块SOC含量观察到的效果。通过以2.40 g/cm 3（图3）进行额外的密度分馏，可以进一步确定对MAOM的处理效果主要局限于高密度材料（>2.4 g/cm3）。最后，报告的散装土壤相对于密度分馏池的C：N含量（图4）清楚地证明了密度分馏方法从C：N含量相对较低的矿物中分离植物颗粒材料的有效性。
经过 50 年的碎屑操作，Lajtha 等人 22 使用六次连续密度分馏来仔细研究碎屑对 SOC 稳定和不稳定的影响（图 5）。通过分离七个SOC池，作者能够观察到在垫料添加和清除处理后的POM和MAOM响应中存在更大的细微差别。密度<2.20 g/cm3 的池对处理的反应更灵敏，这与凋落物输入与SOC积累之间存在正相关关系的长期预期一致。然而，密度>2.20 g/cm3 的SOC库的响应不太明显，特别是对于凋落物清除处理，输入与SOC之间存在相反的负相关关系（即输入减少，但馏分的SOC含量增加）。通过对 14C进行后续分析，确定了每个池的最新碳输入的贡献和损失，为MAOM的形成和不稳定途径的碎屑控制提供了机理见解。
将同位素分析与顺序密度分馏相结合，为研究SOM动力学的复杂性提供了额外的途径。然而，研究人员应注意考虑矿物学对密度分馏结果的影响。独特的矿物结构和反应性导致矿物之间颗粒密度分布的固有差异。例如，Sollins 等人 18 检查了四种具有不同母体材料和形态的森林土壤中多个密度库的同位素和化学特性（图 6）。四种土壤之间的矿物学对比对观察到的每个密度分数的13 C，14C和15N差异做出了重大贡献。如果不考虑矿物学，这些结果可能会在SOC形成和稳定动力学方面被误解。最后，回到执行额外密度分离的实用性，Sollins 等人 18 从对六个密度池的分析中获得的额外信息很少，而不是只有三个（图 6）。
Helbling等人31 确定了季节性对森林土壤轻组分含量的影响，以及土壤干燥处理对可溶池中C流失的影响（图7）。这项工作产生了两个重要结果。首先，虽然烘箱干燥土壤对SPT溶液的溶解有机碳损失明显更大，但C损失量微不足道。其次，轻组分C库似乎没有任何季节性，这意味着土壤样品收集时间不会影响分馏结果。然而，鉴于POM储量和分解速率的差异，预计结果可能会因土壤和环境而异。
图1：光分数抽吸装置。 抽吸光级分的真空装置示意图。*封口膜可用于固定和密封移液器吸头和真空管之间的连接处。**以一定角度切割移液器吸头可能有助于增加吸头开口的尺寸，以及将紧密的吸力施加到离心管的侧壁上。 请点击此处查看此图的大图。
图2：块状、轻质和重质土壤的碳含量比较。 经过20年的处理（n = 3），从H.J.安德鲁斯实验林的碎屑输入和清除处理（DIRT）地块收集土壤。根系去除处理（NR，NI）的矿物质相关C显着增加，与观察到的对体积C含量的影响形成鲜明对比。此外，分馏结果表明，双木（DW）处理的体积C的增加源于轻组分C的增加。误差线表示标准误差。这个数字是从Pierson等人33修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图3：中间和重馏分池的比较。 经过20年的处理（n = 3），从H.J.安德鲁斯实验林的碎屑输入和清除处理（DIRT）地块收集土壤。结果表明，分离中间馏分（1.85-2.40 g/cm 3）和较重馏分（>2.40 g/cm3）的结果。中间馏分C含量变异性较大，处理效果不显著。误差线表示标准误差。这个数字是从Pierson等人33修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：块状、轻质和重质土壤的碳氮比。 经过20年的处理（n = 3），从H.J.安德鲁斯实验林的碎屑输入和清除处理（DIRT）地块收集土壤。鉴于植物组织相对于土壤矿物质的高C：N含量，观察到的轻质和重质组分之间的C：N含量差异清楚地表明了土壤密度分馏从大块土壤中分离颗粒有机物的能力。误差线表示标准误差。这个数字是从Pierson等人33修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图5：50年碎屑操作后土壤的顺序密度分馏（n = 4）。 将土壤分成七个密度部分可以深入了解土壤矿物质上碳负荷的性质。双凋落物处理增加了土壤C，导致2.00-2.40 g/cm 3 馏分的矿物物质C负荷量，从馏分C浓度相对于对照的变化可以看出。无凋落物处理土壤碳损失在密度在1.85—2.20 g/cm之间的土壤组分中最大3。误差线表示标准误差。这个数字是从Lajtha等人22修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图6：矿物学对土壤密度库的影响。 从四个森林地点收集了具有独特形态的土壤。同位素分析表明土壤矿物学如何影响土壤密度库的生物地球化学特性。此外，在这种情况下，对三个密度库的分析，而不是六个或更多，在很大程度上捕捉了不同同位素特征内部和之间的趋势。这个数字是从Sollins等人18修改的。原始数据和图表显示在具有六个以上池的列中;重新计算并显示数据以仅演示三个池的结果。 请点击此处查看此图的大图。
图7：样品收集和制备对土壤密度分馏的影响。 Helbling等人31 发现，相对于风干，田间潮湿和浸出的土壤，烘箱干燥的土壤通常产生更多的溶解有机碳。在整个样品采集季节，轻质与重质分数的比例没有显著差异。这个数字是从Helbling等人31修改而来的。误差线表示标准误差。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在整个土壤密度分馏方案中，必须密切监测一些特定的程序，以帮助减少土壤组分分离和分析中的误差。土壤密度分馏程序的一个关键步骤是反复验证SPT溶液的密度。土壤样品中的水分通常会稀释SPT溶液，从而降低SPT的密度。因此，研究人员必须始终确保在离心后实现轻溶液和重溶液的完全分离。如果馏分不能充分分离，则应添加更多的SPT溶液，或者减少土壤的质量。沙质土壤迅速分离，而质地细腻的土壤，特别是Oxisols，由于细颗粒的高悬浮负荷，在离心过程中可能会长时间保持浑浊。当溶液在离心后出现浑浊时，应增加离心时间或速度。作为替代方案，可以通过分析吸入溶液的C含量来确定悬浮沉积物中C损失的估计值。
确定要购买的聚钨酸钠（SPT）的质量取决于分馏后将执行的分析。Kramer等人34发现，商业SPT可能富含高15 N铵，因此可能显着改变土壤组分的15N特征。因此，应使用高纯度等级的SPT（例如SPT-0）来确保在测量土壤同位素特征的研究中将C和N污染降至最低。然而，纯度等级低一级的SPT（例如SPT-1）通常具有最小的N和C富集，并且更便宜，因此在不测量同位素时提供了更经济的选择。
为避免出现重大误差，必须注意从溶液中去除所有轻质部分，这些部分在抽吸过程中经常粘在离心管的侧壁上，在随后的过滤步骤中粘在漏斗上。重馏分材料中残留的过量轻馏分将导致轻馏分C的估计值较低，同时高估重馏分的C含量。仔细检查最终数据可能有助于在分馏一系列具有相似土壤特性的样品时识别此类误差。
溶解性有机碳（DOC）对溶液的损失通常很小，通常占土壤总C的<5%，并且无法避免（图7）31。然而，当分馏具有高可溶性C池的土壤时，DOC的损失可能要大得多，例如在一些沙漠环境中发现的土壤35。在这种情况下，还应量化可抽水的DOC池。通常，土壤质量损失引起的误差，特别是轻质部分的误差，远远大于DOC损失引起的误差。
聚钨酸盐吸附到土壤样品中是一种化学可能性，这种化学交换发生的程度目前尚不清楚。此外，预计聚钨酸酯的结合亲和力在不同化学性质的土壤中会有所不同。目前，程序结束时土壤质量损失与SOC损失之间的相关性提供了一种直接且逻辑上可行的保证形式，即聚钨酸盐交换的任何质量增益对于分馏材料中SOC的定量都可以忽略不计。如果土壤部分的累积质量大于初始样品质量，或者质量损失明显小于SOC损失，则样品可以吸收聚钨酸盐。应首先执行其他清洗步骤以尝试解决此类问题。如果分馏材料中聚钨酸盐的吸收持续存在，则可能需要进行额外的元素分析来验证和纠正分馏材料中钨含量的增加。值得注意的是，这种涉及无法从土壤材料中冲洗出多钨酸盐的问题并不常见。
尽管密度分馏可以理想地将游离颗粒物（POM）与矿物相关有机物（MAOM）分离出来，但水稳定聚集体的存在使密度分馏结果的解释变得复杂。淤泥和粘土可能形成强烈的关联并与有机物结合，土壤生物群、根和真菌菌丝可以形成大聚集体，有助于保护有机化合物免受微生物分解。这种受聚集体保护的有机物，通常被称为封闭的有机物，不是MAOM，而是将以重质部分（即>1.85 g/cm3）回收。包含闭塞的POM可能对中等密度部分的结果和解释影响最大。虽然密度超过 ~2.40 g/cm 3 的馏分可能含有不含闭塞有机物质的贫有机矿物质，而密度小于 1.85 g/cm 3 的材料被认为是无矿物质的有机物，但中间馏分可以是富含有机物的重矿物质、聚集体和贫有机轻矿物质的混合物。迄今为止，还没有达成共识或普遍的方法来解释中间部分材料中发现的C差异。在报告此类信息时，我们建议承认闭塞有机物和矿物学对结果的潜在影响。
已经采用了各种化学和物理技术来分散聚集体以促进闭塞POM的释放，超声波能量是最常用的方法。不幸的是，没有一个超声能级可以导致所有聚集体的完全分散，因为聚集体强度和结合机制在土壤类型和骨料尺寸等级上差异很大36。Amelung和Zech36 发现微聚集体（20-250μm）比较大的大聚集体需要更多的超声波能量来分散，但也发现颗粒有机物在这些较高能量下被破坏。此外，随着强度的增加，顺序超声处理继续产生游离的闭塞有机物37，再次表明没有单一的闭塞有机物池，并且在较高的超声水平下，大部分分离的轻质部分材料可能是胶体伪影。Kaiser和Guggenberger30 还证明了超声处理改变轻组分有机物与不同矿物质混合物的密度分布的潜力。虽然在土壤密度分馏期间或之后结合超声分散技术为分散和分离SOM池提供了独特的机会，但这些研究值得考虑分散功效以及POM和矿物结构的破坏。
将土壤C分离到易于测量的池中最普遍的替代方法是尺寸分馏。相对于密度分馏，尺寸分馏快速且成本低，并且考虑到粘土含量与MAOM之间的相关性，可以提供类似的SOM动力学见解。事实上，Poeplau等人10 发现，在三种不同土壤中，通过大小和密度分馏分离的C池的SOM周转率没有显着差异。然而，尺寸等于或小于粘土的颗粒有机物（POM）很常见，这意味着仅靠尺寸分馏方法无法从MAOM中准确分离POM。因此，在细粒径馏分中掺入POM会导致某些含有大量细颗粒物质的土壤中的元素和有机化学分析出错15。如果需要量化特定粒径（例如，沙子、淤泥、粘土）下矿物材料的C含量，则可以通过执行单一密度分馏，然后对重分馏材料进行尺寸分馏来组合这两种方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
对于这项工作，国家科学基金会向K.L.拨款DEB-1257032和向H.J.安德鲁斯长期生态研究计划提供DEB-1440409的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator/vacuum tubing 1/4 x 1/2" | Kimble | 10847-216 | |
| Conical polypropylene centrifuge tube, 250mL | Thermo Scientific | 376814 | |
| Conical rubber gasket for filtering flasks | DWK Life Sciences | 292020001 | |
| Double flat ended stainless steel spatula/scraper | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Glass fiber filter, grade GF/F, 110 mm | Whatman | WHA1825110 | |
| Glass mason jar, 16 oz | Ball Corporation | 500 ml beaker or glass weigh dish are also suitable | |
| Polypropylene conical bottle adapter, 250mL | Beckman Coulter | 369385 | |
| Porcelain buchner funnel, 90mm | FisherBrand | FB966F | |
| Reciprocating shaker, 2-speed | Eberbach | E6000.00 | |
| Sidearm flask, 1000mL | VWR | 89000-386 | |
| Sodium Polytungstate, crystalline | Sometu | SPT-0 or SPT-1, see Discussion for SPT choice | Shipping via FedEx from Germany |
| Swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 3362020 |
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