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Utilizando o Fracionamento da Densidade do Solo para Separar Pools de Carbono do Solo Distintos

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64759
Automatic Translation
*1,2, *1, *1, *1
1Department of Crop and Soil Sciences, Oregon State University, 2USDA Forest Service
* These authors contributed equally

Summary

O fracionamento da densidade do solo separa a matéria orgânica do solo em pools distintos com diferentes mecanismos de estabilização, química e tempos de rotação. Soluções de politungstato de sódio com densidades específicas permitem a separação da matéria orgânica particulada livre e da matéria orgânica associada ao mineral, resultando em frações de matéria orgânica adequadas para descrever a resposta do solo ao manejo e às mudanças climáticas.

Abstract

A matéria orgânica do solo (MOS) é uma mistura complicada de diferentes compostos que abrangem desde componentes vegetais livres e parcialmente degradados até compostos mais alterados microbialmente mantidos nos agregados do solo até subprodutos microbianos altamente processados com fortes associações com minerais reativos do solo. Os cientistas do solo têm lutado para encontrar maneiras de separar o solo em frações que sejam facilmente mensuráveis e úteis para a modelagem de carbono (C) do solo. O fracionamento do solo com base na densidade está sendo cada vez mais utilizado, sendo de fácil execução e produzindo pools de C com base no grau de associação entre a MOS e diferentes minerais; assim, o fracionamento da densidade do solo pode auxiliar na caracterização da MOS e na identificação de mecanismos de estabilização da MOS. No entanto, os protocolos de fracionamento da densidade do solo relatados variam significativamente, tornando os resultados de diferentes estudos e ecossistemas difíceis de comparar. Aqui, descrevemos um procedimento robusto de fracionamento por densidade que separa partículas e matéria orgânica associada a minerais e explicamos os benefícios e desvantagens de separar o solo em duas, três ou mais frações de densidade. Tais frações frequentemente diferem em sua composição química e mineral, tempo de rotatividade e grau de processamento microbiano, bem como o grau de estabilização mineral.

Introduction

O solo é o maior estoque de carbono terrestre (C), contendo mais de 1.500 Pg de C no 1 m superior e quase o dobro dessa quantidade em níveis mais profundos globalmente, o que significa que o solo contém mais C do que a biomassa vegetal e a atmosfera combinadas1. A matéria orgânica do solo (MOS) retém água e nutrientes do solo e é essencial para a produtividade das plantas e para a função do ecossistema terrestre. Apesar do reconhecimento global da importância de estoques adequados de MOS para a saúde do solo e a produtividade agrícola, os estoques de C no solo têm sido substancialmente esgotados devido ao manejo florestal e agrícola insustentável, às mudanças na paisagem e ao aquecimento climático 2,3. O aumento do interesse em restaurar a saúde do solo e em usar a retenção de C do solo como um ator chave em soluções climáticas naturais tem levado a esforços para entender os fatores que controlam o sequestro e a estabilização do C no solo em diversos ambientes 4,5.

A matéria orgânica do solo (MOS) é uma mistura complicada de diferentes compostos que abrangem desde componentes vegetais livres e parcialmente degradados até compostos mais microbialmente alterados contidos nos agregados do solo (definidos aqui como um material formado pela combinação de unidades ou itens separados) até subprodutos microbianos altamente processados com fortes associações com minerais reativos do solo6 . Nos casos em que é impraticável identificar o conjunto completo de compostos individuais na MOS, os pesquisadores geralmente se concentram em identificar um número menor de pools funcionais de C que existem como realidades físicas e que variam de acordo com as taxas de rotatividade, a composição química geral e o grau de estabilização com os componentes minerais do solo1, 7º. Para que os pools sejam criticamente interpretados e modelados, é essencial que os pools separados sejam pequenos em número, sejam diretamente mensuráveis em vez de apenas teóricos e exibam diferenças claras na composição e reatividade8.

Muitas técnicas diferentes, tanto químicas quanto físicas, têm sido empregadas para isolar pools significativos de C no solo, e estas são bem resumidas por von Lützow et al.9 e Poeplau et al.10. Técnicas de extração química visam isolar pools específicos, tais como C associado a Fe e Al11 pouco cristalinos ou cristalinos. Solventes orgânicos têm sido usados para extrair compostos específicos, como lipídios12, e tanto a hidrólise quanto a oxidação da MOS têm sido usadas como medida de um pool lábil de C13,14. No entanto, nenhum desses métodos de extração categoriza todos os pools de C em frações mensuráveis ou modeláveis. O fracionamento físico do solo categoriza todo o C do solo em pools com base no tamanho e assume que a decomposição dos restos vegetais resulta em fragmentação e partículas cada vez menores. Embora o tamanho isoladamente não possa separar os detritos vegetais livres da MOS15 associada ao mineral, a quantificação desses dois pools é crítica para a compreensão da estabilização do C no solo devido às diferenças espaciais, físicas e biogeoquímicas comuns na formação e no turnover16.

O fracionamento do C do solo com base na densidade vem sendo cada vez mais utilizado, sendo de fácil execução e identificando diferentes pools de C com base no grau de associação com diferentes minerais17,18,19; assim, o fracionamento da densidade do solo pode ajudar a elucidar diferentes mecanismos de estabilização do C no solo. O principal requisito para que o solo seja fracionado é a capacidade de dispersar totalmente as partículas orgânicas e minerais. Uma vez dispersa, a matéria orgânica degradada que é relativamente livre de minerais flutua em soluções mais leves do que ~1,85 g/cm 3, enquanto os minerais tipicamente caem na faixa de 2-4,5 g/cm 3, embora os óxidos de ferro possam ter densidades de até 5,3 g/cm3. A fração de partículas leves ou livres tende a ter um tempo de rotação mais curto (a menos que haja contaminação significativa por carvão vegetal) e tem se mostrado altamente responsiva ao cultivo e outras perturbações. A fração pesada (>1,85 g/cm3) ou associada a minerais geralmente tem um tempo de turnover maior devido à resistência à decomposição mediada microbialmente adquirida quando moléculas orgânicas se ligam a superfícies minerais reativas. No entanto, a fração pesada pode saturar (isto é, atingir um limite superior para a capacidade de complexação mineral), enquanto a fração leve pode teoricamente acumular-se quase indefinidamente. Assim, compreender a distribuição física da matéria orgânica em pools de matéria orgânica associada a minerais versus particulados ajuda a elucidar quais ecossistemas podem ser manejados para o sequestro eficiente de carbono e como diferentes sistemas responderão às mudanças climáticas e mudanças nos padrões de perturbação antrópica20.

Embora o uso do fracionamento por densidade utilizando soluções de politungstato de sódio em diferentes densidades tenha aumentado muito na última década, as técnicas e protocolos variam significativamente, tornando os resultados de diferentes estudos e diferentes ecossistemas difíceis de comparar. Embora tenha sido demonstrado que uma densidade de 1,85 g/cm3 recupera a maior quantidade de fração leve livre com mínima inclusão de matéria orgânica associada ao mineral (MAOM)17, muitos estudos têm utilizado densidades que variam de 1,65-2,0 g/cm3. Enquanto a maioria dos estudos fracionou os solos em apenas dois pools (uma fração leve e uma fração pesada, doravante LF e HF), outros estudos usaram densidades múltiplas para refinar ainda mais a fração pesada em pools que diferem pelos minerais aos quais estão associados, a proporção relativa de minerais para revestimento orgânico ou o grau de agregação (por exemplo, Sollins et al.17, Sollins et al.18, Hatton et al.21, Lajtha et al.22, Yeasmin et al.23, Wagai et al.24, Volk et al.25). Além disso, procedimentos de fracionamento mais complexos têm sido sugeridos que combinam separação de tamanho e densidade, resultando em um maior número de pools (por exemplo, Yonekura et al.26, Virto et al.27, Moni et al.15, Poeplau et al.10), mas também mais espaço para erros, tanto na metodologia quanto em relação ao tamanho do pool. Além disso, os autores também utilizaram a sonicação em intensidades e tempos variados em um esforço para dispersar agregados e MAOM de superfícies minerais28,29,30.

Aqui, descrevemos um procedimento robusto de fracionamento de densidade que identifica, primeiro, dois pools únicos de carbono do solo (LF e HF, ou POM e MAOM), e oferecemos as técnicas e os argumentos para separar ainda mais o pool de HF em frações adicionais que diferem com base em sua mineralogia, grau de revestimento orgânico ou agregação. As frações identificadas diferem quanto à composição química, tempo de rotação, grau de processamento microbiano e grau de estabilização mineral18,19.

O procedimento a seguir separa o solo em matéria orgânica particulada (POM) e matéria orgânica associada a minerais (MAOM) misturando uma quantidade conhecida de solo em uma solução com uma densidade específica. A eficácia do procedimento é medida pela recuperação combinada da massa do solo e do carbono em relação à massa da amostra inicial e ao teor de C. Uma solução densa é obtida pela dissolução do politungstato de sódio (TCP) em água deionizada. O solo é inicialmente misturado com a solução densa de SPT e agitado para misturar e dispersar completamente os agregados do solo. A centrifugação é então usada para separar os materiais do solo que flutuam (fração leve) ou afundam (fração pesada) na solução. As etapas de mistura, isolamento, recuperação e lavagem são repetidas várias vezes para garantir a separação das frações leve e pesada, juntamente com a remoção de SPT do material. Finalmente, as frações do solo são secas, pesadas e analisadas quanto ao teor de C. O material fracionado pode ser utilizado para procedimentos e análises subsequentes.

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Protocol

1. Fabricação de soluções-mãe de politungstato de sódio (SPT)

CUIDADO: O TSP é irritante e prejudicial se ingerido ou inalado. É tóxico para organismos aquáticos; evitar sua liberação no meio ambiente.

  1. Para fazer 1 L de solução de TCP com densidade de 1,85 g/cm3, dissolver 1.051 g de TSC cristalizado em aproximadamente 600 mL de água destilada deionizada (DDI). Mexa a solução até que o TSC esteja totalmente dissolvido, aproximadamente durante 15 minutos, e, em seguida, leve o volume da solução a 1 L com DDI.
    NOTA: A recuperação de carbono utilizando uma densidade de solução <1,85 g/cm3 pode subrecrutar a fração leve de carbono derivada da matéria orgânica particulada17,18, deturpando assim a quantidade de carbono na amostra. Assim, sugere-se uma densidade de solução de TCP de 1,85 g/cm3 8,17 para incluir mais o carbono associado à matéria orgânica particulada para uma amostra típica de solo (ou seja, a maioria dos francos de areia, silte e argila com teor de C <10 %).
  2. Para fazer 1 L de solução de TCP com densidade de 2,40 g/cm3, dissolver 1.803 g de TSC sólido em aproximadamente 500 mL de água DDI. Agite a solução até que o TSC esteja totalmente dissolvido e, em seguida, leve o volume da solução a 1 L com DDI.
    NOTA: Para além da utilização potencial para fracionamento do solo, é frequentemente necessária uma solução com uma densidade superior a 1,85 g/cm 3 para o ajuste da solução de TSC em fases posteriores do protocolo (ver passo3.2). Se sobrar uma solução extra de 2,40 g/cm 3, a solução pode ser diluída a 1,85 g/cm3 com água deionizada e utilizada para fracionamento do solo.
  3. Antes do uso no fracionamento, analise o TCP para os teores de C e N. Realize essa análise usando um analisador elementar sólido ou líquido (métodos de exemplo: ISO 10694:1995, ISO 20236:2018).
    1. Efectuar uma diluição de 1:100 da solução a partir do passo 1.1 para os analisadores elementares líquidos para reduzir a deterioração dos lavadores elementares e catalisadores. A tolerância à contaminação por C e N na solução de TSC dependerá da amostra e dos usos subsequentes das frações do solo. Tipicamente, uma solução SPT com teor de C e N <1 ppm e <0,1 ppm, respectivamente, é considerada adequada para uso, pois soluções como essa apresentam capacidade mínima de alterar os reservatórios de C e N do solo muito maiores.

2. Dissolução do solo em TSC

  1. Adicionar 50 g de terra seca ao ar e peneirada a 2 mm a um tubo centrífugo cônico de polipropileno de 250 mL. Registre a massa em pelo menos quatro números significativos. Não utilizar solo seco em estufa, pois isso pode aumentar o carbono solúvel devido à lise celular induzida pelo calor31.
    NOTA: O solo úmido de campo pode ser usado31, mas ajustes adicionais são necessários nas etapas posteriores para manter a densidade alvo da solução de SPT. Recomenda-se peneirar o material do solo a 2 mm para remover material grande que possa distorcer os resultados do fracionamento, como rochas e detritos lenhosos.
    1. Ajustar a massa do solo para garantir que uma massa adequada de cada fração seja recuperada para evitar erros significativos na quantificação. A razão mais comum para o ajuste de massa é o baixo teor de POM (por exemplo, <2% da massa total do solo). Para tais solos, fornecer massa de solo adicional para quantificar com precisão a recuperação de POM. De modo geral, é aceitável ajustar a massa de solo para cada amostra individual, uma vez que a alteração da massa da amostra não alterará a proporção de MOM para MAOM. No entanto, muitas vezes é útil usar uma massa consistente para ajudar no balanceamento da centrífuga.
    2. Tratar solos ricos em carbonatos para remover carbonatos inorgânicos antes do fracionamento32.
  2. Adicione 50 mL de 1,85 g/cm 3 de densidade de TSC ao tubo da centrífuga e substitua bem a tampa. Tal como acontece com as quantidades de solo, ajuste o volume de TSC conforme necessário. Em solos superficiais ricos em POM (por exemplo, muitos solos de florestas temperadas), use uma proporção maior de solo para SPT (por exemplo, 30 g de solo para 60 mL de SPT) para obter uma separação adequada dos materiais fracionados leves e pesados.
  3. Agite o tubo vigorosamente com a mão por ~60 s para quebrar agregados não estáveis à água. A colisão forçada dos agregados do solo com as paredes laterais do tubo da centrífuga é desejada, o que significa que simplesmente o vórtice da solução pode ser insuficiente.
  4. Fixe o tubo a um agitador de plataforma. Muitas vezes, colocar o tubo de lado ajuda na dispersão do solo, aumentando a força de inclinação da solução e reduzindo a altura de pé da camada de solo. Tome cuidado para que o tubo esteja bem fechado e agite por 2 h a 40-120 rpm. Retire periodicamente o tubo do agitador e agite vigorosamente à mão para aumentar a agitação do material agregado mais denso.

3. Realização de fracionamento grosseiro do solo

  1. Retire o tubo do agitador. Equalize as massas dos tubos da centrífuga adicionando cuidadosamente uma solução SPT adicional para alcançar uma massa consistente em todo o conjunto de tubos a serem centrifugados, garantindo que agite vigorosamente manualmente por 30 s após a adição da solução SPT. Centrifugar por 10 min a 3.000 x g em uma centrífuga de balde oscilante.
  2. Antes de aspirar a amostra, testar a densidade do sobrenadante retirando 5 ml da solução com uma pipeta e verificando a massa numa balança. Ajuste a densidade do TCP conforme necessário para atingir a densidade desejada. Agitar e centrifugar novamente se for efectuado um ajuste da densidade da solução.
  3. Ligue um balão lateral de 1 L a uma bomba de vácuo. Coloque um filtro de fibra de vidro de 110 mm (tamanho de poro de 0,7 μm) em um funil de porcelana Buchner de 12 cm de diâmetro interno (ID). Sele cuidadosamente o funil usando uma junta de borracha cônica no balão lateral.
    NOTA: Os filtros de fibra de vidro devem ser pré-lavados em estufa de secagem a 150 °C e enxaguados com DDI antes do uso.
  4. Instalar um balão lateral adicional de 1 L ligado ao vácuo. Coloque uma rolha de borracha na parte superior do balão com um comprimento saliente de ~0,5 m de tubo acoplado para aspiração.
    NOTA: Pode ser útil fixar uma ponta de plástico (como uma ponta de pipeta descartável de 5 mL, com a extremidade cortada em um ângulo) à extremidade da tubulação de aspiração para melhorar o controle da sucção durante a aspiração (ver Figura 1).
  5. Aspirar suavemente o sobrenadante e o material em suspensão que se depositou na camada superior da solução ao longo das laterais do tubo centrífugo, tomando cuidado para não encostar a ponta do tubo de aspiração à superfície do solo peletizado abaixo.
    OBS: Se algum material de pellet de solo (fração pesada) for aspirado por engano junto com o material em suspensão (fração leve), o procedimento de fracionamento deve ser repetido. Se não for notado, tal erro resultará em uma massa de fração leve mais pesada do que o esperado com um teor de C menor do que o esperado, o que pode ser evidente através da análise de dados de amostras com propriedades de solo semelhantes.
    1. Para limpar o tubo de aspiração entre as amostras, mergulhe a ponta do tubo rapidamente (por exemplo, submerja por 0,1 s) em água DDI e retire ~5 mL de água DDI através da linha com a bomba de vácuo ligada. Repita até que todo o material tenha sido liberado do tubo de vácuo.
    2. Retire a rolha de borracha e o acessório do tubo de aspiração do balão lateral e despeje o conteúdo na parte superior do funil de Buchner com a bomba de vácuo ligada.
    3. Enxaguar o balão com água DDI, agitar e despejar o conteúdo do frasco no funil de Buchner. Repetir até retirar todo o resíduo aderido às laterais do frasco.
  6. Adicionar 50 mL de TSC ao tubo de centrífuga e agitar vigorosamente manualmente por 60 s (ou usar uma mesa de agitação se o solo não se dispersar rapidamente), certificando-se de quebrar o pellet duro no fundo do tubo para que todo o resíduo seja ressuspenso. Centrifugar por 10 min a 3.000 x g.
  7. Repita a etapa 3.5. Deite o conteúdo do balão no mesmo funil de Buchner utilizado no ponto 3.5.2.
  8. Adicione 50 mL de SPT ao tubo de centrífuga e agite vigorosamente com a mão, certificando-se de quebrar o pellet duro no fundo do tubo. Centrifugar por 10 min a 3.000 x g.
  9. Repita a etapa 3.5. Deite o conteúdo do balão no mesmo funil de Buchner utilizado no ponto 3.5.2.

4. Separação(ões) de densidade adicional utilizando TSC de maior densidade

NOTA: Se executar mais de uma fração de densidade adicional, os fracionamentos subsequentes devem ser realizados em ordem crescente de densidade. Aqui, são mostradas as etapas para o isolamento usando TCP de densidade de 1,85-2,4 g/cm3 e >2,4 g/cm3 .

  1. Adicionar 50 mL de 2,4 g/cm 3 de TSC ao tubo de centrífuga contendo o material de solo de >1,85 g/cm 3 da etapa3. Agite vigorosamente com a mão (>60 s), certificando-se de quebrar a pelota dura no fundo do tubo. Centrifugar por 10 min a 3.000 x g.
  2. Antes de aspirar a amostra, testar a densidade do sobrenadante retirando 5 ml da solução com uma pipeta e verificando a massa numa balança. Ajuste a densidade do TCP conforme necessário para atingir a densidade desejada. Agitar e centrifugar novamente se for efectuado um ajuste da densidade da solução.
  3. Repita o passo 3 utilizando uma solução de 2,4 g/cm 3 SPT em vez da solução de 1,85 g/cm3 SPT utilizada anteriormente. Ao final da etapa 3, o material isolado no funil de Buchner terá densidade entre 1,85-2,4 g/cm3, enquanto o material remanescente no tubo centrífugo terá densidade >2,4 g/cm3.

5. Lavagem do TSC das amostras de fracções pesadas e leves

OBS: As seguintes etapas de lavagem devem ser realizadas para todo o material fracionado. Se a solução de TSC não for completamente enxaguada do material, os pesos das frações correspondentes serão imprecisos.

  1. Adicionar 50 mL de água DDI ao tubo da centrífuga com o material de fração pesada e agitar vigorosamente manualmente (60 s), certificando-se de quebrar o pellet duro no fundo do tubo. Centrifugar por 10 min a 3.000 x g.
  2. Aspirar como no passo 3.5. Neste ponto, todo o material da fração leve deveria ter sido removido. Descarte o aspirado transparente em um balde de resíduos em vez de adicioná-lo ao funil do filtro.
  3. Repita as etapas 5.1-5.2 duas vezes. Antes de finalmente aspirar a solução no tubo, utilizar uma pipeta de transferência para retirar 25 ml do sobrenadante e verificar a densidade dividindo o peso da solução pelo volume para garantir que o TCP foi adequadamente removido da amostra. Se a densidade for <1,01 g/mL, prossiga para a próxima etapa. Se a densidade for igual ou superior a 1,01 g/mL, realizar lavagens adicionais com água como acima até que a densidade seja inferior a 1,01 g/mL.
  4. Para garantir a remoção completa do SPT da fração leve, encha cada funil de Buchner com água DDI e filtre o conteúdo através de filtros de fibra de vidro. Depois que a água tiver filtrado completamente, repita isso mais duas vezes. Se o solo for rico em matéria orgânica, a filtração pode levar até 48 h.

6. Recolha do material da fracção pesada

  1. Raspe cuidadosamente o solo do tubo de centrífuga em um copo ou frasco de vidro limpo e rotulado. Despeje água DDI suficiente no tubo para soltar o solo restante; Substitua a tampa e agite e, em seguida, adicione a pasta ao recipiente de vidro. Enxágue todo o restante do solo do tubo de centrífuga e transfira para o recipiente de vidro usando água deionizada.
  2. Coloque o recipiente de vidro num forno de secagem regulado entre 40-60 °C. Secar até atingir um peso seco constante, normalmente por 24-72 h.

7. Recolha do material da fracção leve

  1. Desligue a bomba de vácuo e retire o funil do balão lateral. Segurando o funil horizontalmente sobre um copo ou frasco de vidro rotulado, enxágue suavemente as partículas do filtro usando uma garrafa de lavagem de água DDI.
    NOTA: Pode ser necessário raspar suavemente o filtro usando uma espátula e enxaguar ambos os lados do filtro para remover todo o resíduo.
  2. Coloque o recipiente de vidro no forno de secagem regulado entre 40-60 °C. Secar até atingir um peso seco constante, normalmente por 24-72 h.

8. Pesagem da massa seca do material fracionado

  1. Raspe suavemente todo o material seco de cada recipiente em um barco de pesagem de plástico. Registre a massa até a quarta casa decimal. Coloque a amostra num frasco ou saco para injetáveis de arrumação rotulado.
  2. Repita para todas as amostras secas.

9. Coleta e análise de dados para carbono orgânico total

  1. Seguir os procedimentos de análise de acordo com o instrumento a ser utilizado para a análise do conteúdo elementar C (por exemplo, ISO 10694:1995).
    NOTA: Moer o material da fração seca em um pó fino é uma prática comum para garantir a homogeneidade da amostra fracionada antes da análise elementar.
  2. Certifique-se de que a massa acumulada de todas as frações seja igual a, pelo menos, ~90% da massa original da amostra de solo. Se as perdas de material forem de >10%, recomenda-se fracionamentos replicados adicionais.
  3. Quantificar a recuperação cumulativa de carbono orgânico do solo (COS) nas frações. As perdas de SOC podem não se correlacionar perfeitamente com a perda de massa devido à perda desproporcional de material fracionado e à perda de carbono orgânico dissolvido. No entanto, as perdas de COS também devem ser de <10 % do COS inicial na amostra de solo.

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Representative Results

O fracionamento da densidade do solo é ideal para investigar como os solos diferem em seu teor de partículas e matéria orgânica associada a minerais. A separação do COS nesses dois pools distintos fornece um caminho para elucidar as mudanças no teor de C do solo e na dinâmica de estabilização que, de outra forma, podem não ser claras ao observar tendências no teor de C no solo. A separação adicional do material pesado (densidade >1,85 g/cm3) fornece informações adicionais sobre as mudanças e tendências na estabilização do C no solo, mas aumenta a complexidade do procedimento e a interpretação associada e está associada a custos adicionais. No entanto, o fracionamento do solo em três ou mais pools de densidade pode elucidar tendências complexas e diferenças químicas nos pools de C do solo. Como em qualquer procedimento de fracionamento do solo, a separação desses estoques de C do solo é imperfeita, e a influência potencial de tais erros e os pressupostos do método devem ser reconhecidos ao relatar os resultados. Finalmente, os profissionais devem estar cientes da variedade de métodos de fracionamento do solo que existem e seus pontos fortes e fracos únicos (ver revisões e comparações fornecidas por von Lützow et al.9 e Poeplau et al.10). Muitos desses métodos de fracionamento do solo não são mutuamente exclusivos e podem ser adequadamente combinados para melhorar ou validar análises da dinâmica do C do solo.

A escolha do número de frações de densidade a serem utilizadas é o primeiro passo crítico antes de iniciar o procedimento de fracionamento. Embora vários pools sempre possam ser matematicamente combinados para produzir uma única fração leve e uma única fração pesada para comparar os resultados com outros estudos, fracionar a fração pesada em mais de um pool adiciona tempo e despesa significativos. Pierson et al.33 quantificaram a mudança no SOC em três pools de densidade após um estudo de manipulação de detrital de longo prazo. Ao combinar os dois pools mais pesados (Figura 2), os efeitos dos tratamentos detritais foram distintos entre as frações leve (<1,85 g/cm 3) e pesada (>1,85 g/cm3), especialmente em relação aos efeitos observados a partir do teor de SOC no volume. Realizando-se o fracionamento de densidade adicional a 2,40 g/cm3 (Figura 3), pôde-se determinar ainda que os efeitos do tratamento no MAOM estavam predominantemente confinados ao material de maior densidade (>2,4 g/cm3). Finalmente, o teor relatado de C:N do solo em relação aos pools fracionados de densidade (Figura 4) apresenta uma demonstração clara da eficácia do método de fracionamento por densidade para separar material particulado de origem vegetal de matéria mineral com teor relativamente baixo de C:N.

Após 50 anos de manipulações detritais Lajtha et al.22 utilizaram seis fracionamentos sequenciais de densidade para examinar de perto as influências detritais na estabilização e desestabilização do SOC (Figura 5). Ao isolar sete pools de CO, os autores puderam observar uma maior nuance na resposta de MOP e MAOM após os tratamentos de adição e remoção de serapilheira. Pools com densidades <2,20 g/cm3 foram mais responsivos ao tratamento, concordando com a expectativa de longa data de uma relação positiva entre entrada de serapilheira e acúmulo de COS. No entanto, a resposta dos pools de CO com densidades >2,20 g/cm3 foi menos pronunciada e, especificamente para o tratamento de remoção de serapilheira, identificou-se uma relação negativa oposta entre os inputs e o SOC (i.e., os inputs foram reduzidos, mas o teor de SOC da fração aumentou). Realizando análises subsequentes de 14C, as contribuições e perdas de entradas de C mais recentes para cada pool foram verificadas, fornecendo uma visão mecanicista sobre o controle detrital das vias de formação e desestabilização para MAOM.

A combinação da análise isotópica com o fracionamento sequencial da densidade fornece caminhos adicionais para investigar os meandros da dinâmica da MOS. No entanto, os investigadores devem ter o cuidado de considerar a influência da mineralogia nos resultados do fracionamento da densidade. A estrutura e a reatividade minerais únicas causam diferenças inerentes na distribuição de densidade de partículas entre os minerais. Como exemplo, Sollins et al.18 examinaram as características isotópicas e químicas de pools de densidade múltipla em quatro solos florestais com materiais parentais e morfologias diferentes (Figura 6). A mineralogia contrastante entre os quatro solos contribuiu fortemente para as diferenças observadas em 13C, 14C e 15N para cada fração densa. Sem a consideração da mineralogia, tais resultados podem ser mal interpretados com relação à formação de SOC e dinâmica de estabilização. Finalmente, voltando à praticidade de realizar separações de densidade adicionais, poucas informações adicionais foram obtidas por Sollins et al.18 a partir da análise de seis pools de densidade em oposição a apenas três (Figura 6).

Helbling et al.31 determinaram o efeito da sazonalidade sobre o teor de frações leves de solos florestados, bem como o efeito do tratamento de secagem do solo sobre a perda de C para o pool solúvel (Figura 7). Dois resultados significativos emergiram deste trabalho. Primeiro, enquanto a secagem em estufa do solo produziu perdas significativamente maiores de C orgânico dissolvido para a solução de SPT, a quantidade de C perdida foi insignificante. Em segundo lugar, não parece haver sazonalidade no pool da fração C leve, o que significa que a época de coleta das amostras de solo não influenciou os resultados do fracionamento. No entanto, pode-se esperar que os resultados difiram entre solos e ambientes, dadas as diferenças nos estoques de POM e nas taxas de decomposição.

Figure 1
Figura 1: Aparelho de aspiração com fração leve. Esquema do aparelho de vácuo para aspiração da fração leve. *Parafilme pode ser usado para fixar e selar a junção entre a ponta da pipeta e o tubo de vácuo. **Cortar a ponta da pipeta em um ângulo pode ser útil para aumentar o tamanho da abertura da ponta, bem como para aplicar sucção próxima nas paredes laterais do tubo da centrífuga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparação do teor de carbono para solos a granel, leves e pesados. O solo foi coletado nas parcelas de Tratamento de Entrada e Remoção de Detrito (DIRT) na Floresta Experimental H.J. Andrews após 20 anos de tratamento (n = 3). O C associado ao mineral para os tratamentos de remoção radicular (NR, NI) aumentou significativamente, contrastando com os efeitos observados sobre o teor de C no volume de plantas. Além disso, os resultados fracionados mostram que o aumento do C a partir do tratamento com madeira dupla (PM) foi derivado de um aumento na fração C leve. As barras de erro representam o erro padrão. Esse valor foi modificado a partir de Pierson et al.33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparação dos pools de frações intermediárias e pesadas. O solo foi coletado nas parcelas de Tratamento de Entrada e Remoção de Detrito (DIRT) na Floresta Experimental H.J. Andrews após 20 anos de tratamento (n = 3). Os resultados demonstram os achados a partir do isolamento de uma fração intermediária (1,85-2,40 g/cm3) e uma fração mais pesada (>2,40 g/cm3). O teor da fração C intermediária apresentou maior variabilidade, e nenhum efeito dos tratamentos foi significativo. As barras de erro representam o erro padrão. Esse valor foi modificado a partir de Pierson et al.33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Relação carbono/nitrogênio para solos a granel, leves e pesados. O solo foi coletado nas parcelas de Tratamento de Entrada e Remoção de Detrito (DIRT) na Floresta Experimental H.J. Andrews após 20 anos de tratamento (n = 3). Dado o alto teor de C:N do tecido vegetal em relação aos minerais do solo, a diferença observada no teor de C:N entre as frações leve e pesada demonstra claramente a capacidade do fracionamento da densidade do solo em separar a matéria orgânica particulada do solo do solo. As barras de erro representam o erro padrão. Esse valor foi modificado a partir de Pierson et al.33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Fracionamento sequencial da densidade do solo após 50 anos de manipulações detritais (n = 4). A separação do solo em sete frações de densidade forneceu informações sobre a natureza da carga de C sobre os minerais do solo. O tratamento com cama dupla, que aumentou o C do solo, levou ao carregamento de C do material mineral na fração 2,00-2,40 g/cm3 , como mostra a mudança nas concentrações da fração C em relação ao controle. As perdas de C do solo com o tratamento sem serapilheira foram maiores nas frações do solo com densidades entre 1,85-2,20 g/cm3. As barras de erro representam o erro padrão. Esse valor foi modificado a partir de Lajtha et al.22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Efeitos da mineralogia sobre a densidade do solo. Solos com morfologia única foram coletados em quatro áreas florestais. A análise isotópica demonstra como a mineralogia do solo pode influenciar as propriedades biogeoquímicas em pools de densidade do solo. Além disso, neste caso, a análise de três pools de densidade, em oposição a seis ou mais, capturou amplamente as tendências dentro e entre as diferentes assinaturas isotópicas. Esse valor foi modificado a partir de Sollins et al.18. Os dados e gráficos originais são mostrados na coluna com mais de seis pools; Os dados foram recalculados e exibidos para demonstrar os resultados para apenas três pools. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Efeitos da coleta e preparo das amostras no fracionamento da densidade do solo. Helbling et al.31 verificaram que o solo seco em estufa frequentemente produz maior carbono orgânico dissolvido em relação ao solo seco ao ar, úmido no campo e lixiviado. Ao longo das estações de coleta de amostras, a proporção de massa da fração leve para pesada não foi significativamente diferente. Esse valor foi modificado de Helbling et al.31. As barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Ao longo do protocolo de fracionamento da densidade do solo, existem alguns procedimentos específicos que devem ser monitorados de perto para ajudar a reduzir erros na separação e análise das frações do solo. Uma etapa crítica no procedimento de fracionamento da densidade do solo é verificar repetidamente a densidade da solução de TCP. A umidade na amostra de solo muitas vezes dilui a solução de SPT, diminuindo assim a densidade do SPT. Portanto, o pesquisador deve sempre garantir que a separação completa das soluções leves e pesadas tenha sido alcançada após a centrifugação. Se as fracções não se separarem adequadamente, deve ser adicionada mais solução de TSC ou a massa do solo deve ser reduzida. Solos arenosos se separam rapidamente, enquanto solos de textura fina, como Latossolos em particular, podem permanecer turvos por um longo tempo durante a centrifugação devido a uma alta carga suspensa de partículas finas. Quando as soluções parecem turvas após a centrifugação, o tempo ou a velocidade de centrifugação devem ser aumentados. Como alternativa, uma estimativa da perda de C do sedimento em suspensão pode ser determinada pela análise do teor de C da solução aspirada.

A determinação da qualidade do politungstato de sódio (TCP) a ser adquirido depende das análises que serão realizadas após o fracionamento. Kramer et al.34 verificaram que o TCP comercial pode ser enriquecido com alto teor de 15 N de amônio e, assim, pode alterar significativamente a assinatura de 15N das frações do solo. Assim, um SPT de alto grau de pureza (por exemplo, SPT-0) deve ser usado para garantir mínima contaminação por C e N para estudos nos quais as assinaturas isotópicas dos solos serão medidas. No entanto, o SPT com um grau de pureza um degrau mais baixo (por exemplo, SPT-1) geralmente tem um enriquecimento mínimo de N e C e é mais barato, fornecendo assim uma opção mais econômica quando os isótopos não serão medidos.

Para evitar erros significativos, deve-se tomar cuidado para remover toda a fração de luz da solução, que muitas vezes adere às paredes laterais dos tubos de centrífuga durante a aspiração e ao funil durante as etapas subsequentes de filtração. O excesso de fração leve remanescente no material da fração pesada resultará em uma baixa estimativa da fração leve C e, ao mesmo tempo, superestimará o teor de C da fração pesada. Um exame minucioso dos dados finais pode ajudar a identificar tais erros ao fracionar uma série de amostras com propriedades de solo semelhantes.

A perda de carbono orgânico dissolvido (COD) para solução é tipicamente pequena, geralmente <5% do C total do solo, e não pode ser evitada (Figura 7)31. No entanto, as perdas de COD podem ser muito maiores quando se fracionam solos com reservatórios de C altamente solúveis, como os encontrados em alguns ambientes desérticos35. Nesses casos, o pool de DOC extraível em água também deve ser quantificado. Normalmente, os erros decorrentes da perda de massa do solo, especialmente da fração leve, são muito maiores do que os erros causados pela perda de COD.

A adsorção de politungstato à amostra de solo é uma possibilidade química, e a extensão em que tais trocas químicas ocorrem é atualmente desconhecida. Além disso, espera-se que a afinidade de ligação do politungstato varie entre solos com diferentes propriedades químicas. Atualmente, a correlação entre a perda de massa do solo e a perda de COS ao final do procedimento fornece uma forma simples e logisticamente viável de garantir que quaisquer ganhos de massa decorrentes da troca de politungstato sejam desprezíveis para a quantificação do COS no material fracionado. Se a massa acumulada da fracção do solo for superior à massa da amostra inicial, ou se as perdas de massa forem nitidamente inferiores às perdas de SOC, as amostras podem absorver o politungstato. Etapas adicionais de lavagem devem primeiro ser executadas para tentar resolver esse problema. Se a absorção de politungstato no material fracionado persistir, pode ser necessária uma análise elementar adicional para verificar e corrigir um aumento no teor de tungsténio do material fracionado. Notavelmente, tais questões envolvendo a incapacidade de enxaguar o politungstato do material do solo são incomuns.

Embora o fracionamento por densidade separe idealmente o material particulado livre (POM) da matéria orgânica associada ao mineral (MAOM), a presença de agregados estáveis em água complica a interpretação dos resultados do fracionamento por densidade. Silte e argila podem formar fortes associações e se ligar à matéria orgânica, e a biota do solo, raízes e hifas fúngicas podem formar macroagregados que ajudam a proteger compostos orgânicos da decomposição microbiana. Esta matéria orgânica protegida por agregados, muitas vezes referida como matéria orgânica ocluída, não é MAOM, mas será recuperada na fração pesada (ou seja, >1,85 g/cm3). A inclusão de MOP ocluído provavelmente será mais impactante nos resultados e na interpretação das frações de densidade intermediária. Enquanto frações a uma densidade acima de ~2,40 g/cm 3 provavelmente contêm minerais pobres em matéria orgânica desprovidos de material orgânico ocluído e material com densidade inferior a 1,85 g/cm3 é assumido como matéria orgânica livre de minerais, frações intermediárias podem ser misturas de minerais pesados ricos em orgânicos, agregados e minerais leves pobres em orgânicos. Até o momento, não surgiu um consenso ou método comum para a interpretação das diferenças de C encontradas no material da fração intermediária. Ao relatar tais informações, sugerimos reconhecer a influência potencial da matéria orgânica ocluída e da mineralogia nos resultados.

Várias técnicas químicas e físicas têm sido empregadas para dispersar agregados para facilitar a liberação de POM ocluída, com energia ultra-sônica representando o método mais comumente utilizado. Infelizmente, não há um nível de energia de sonicação que possa causar dispersão completa em todos os agregados, pois a resistência dos agregados e os mecanismos de ligação variam amplamente entre os tipos de solo e as classes de tamanho de agregados36. Amelung e Zech36 descobriram que os microagregados (20-250 μm) necessitavam de mais energia ultrassônica para se dispersar do que os macroagregados maiores, mas também descobriram que a matéria orgânica particulada era interrompida nessas energias mais altas. Além disso, a sonicação sequencial com intensidade crescente continua a produzir matéria orgânica livre ocluída37, sugerindo novamente que não há um único pool de matéria orgânica ocluída e que, em níveis mais altos de sonicação, grande parte do material da fração leve separado poderia ser um artefato coloidal. Kaiser e Guggenberger30 também demonstraram o potencial da sonicação para alterar a distribuição de densidade das misturas da matéria orgânica da fração leve com diferentes minerais. Embora a incorporação de técnicas de dispersão ultra-sônica durante ou após o fracionamento da densidade do solo proporcione oportunidades únicas para dispersar e isolar pools de MOS, esses estudos justificam a consideração da eficácia da dispersão e da destruição do POM e das estruturas minerais.

O método alternativo mais prevalente para separar o C do solo em pools facilmente mensuráveis é o fracionamento de tamanho. O fracionamento granulométrico é rápido e de baixo custo em relação ao fracionamento por densidade e pode fornecer informações semelhantes sobre a dinâmica da MOS, dada a correlação entre o teor de argila e o MAOM. De fato, Poeplau et al.10 não encontraram diferença significativa nas taxas de rotação da MOS para pools de C separados por tamanho e fracionamento de densidade em três diferentes solos. No entanto, matéria orgânica particulada (POM) com um tamanho equivalente ou menor que a argila é comum, o que significa que os métodos de fracionamento de tamanho sozinhos não são capazes de separar com precisão o POM do MAOM. A incorporação de MOP em frações de tamanho fino pode, portanto, levar a erros nas análises químicas elementares e orgânicas em determinados solos com quantidade significativa de material particulado fino15. Se houver necessidade de quantificar o teor de C do material mineral em um tamanho de partícula específico (por exemplo, areia, silte, argila), os dois métodos podem ser combinados realizando um único fracionamento de densidade seguido pelo fracionamento de tamanho do material de fração pesada.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Para este trabalho, o apoio foi fornecido pela National Science Foundation Grants DEB-1257032 para K.L. e DEB-1440409 para o programa de Pesquisa Ecológica de Longo Prazo de H. J. Andrews.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator/vacuum tubing 1/4 x 1/2" Kimble 10847-216
Conical polypropylene centrifuge tube, 250mL Thermo Scientific 376814
Conical rubber gasket for filtering flasks DWK Life Sciences 292020001
Double flat ended stainless steel spatula/scraper Fisher Scientific 14-373-25A
Glass fiber filter, grade GF/F, 110 mm Whatman WHA1825110
Glass mason jar, 16 oz Ball Corporation 500 ml beaker or glass weigh dish are also suitable 
Polypropylene conical bottle adapter, 250mL Beckman Coulter 369385
Porcelain buchner funnel, 90mm FisherBrand FB966F
Reciprocating shaker, 2-speed Eberbach E6000.00
Sidearm flask, 1000mL VWR 89000-386
Sodium Polytungstate, crystalline Sometu SPT-0 or SPT-1, see Discussion for SPT choice Shipping via FedEx from Germany
Swinging bucket centrifuge  Beckman Coulter 3362020

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Pierson, D., Lajtha, K., Peter-Contesse, H., Mayedo, A. Utilizing Soil Density Fractionation to Separate Distinct Soil Carbon Pools. J. Vis. Exp. (190), e64759, doi:10.3791/64759 (2022).

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