Summary
हम मानव आंखों में रेटिना से रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) को कुशलतापूर्वक अलग करने और आरपीई के हिस्टोलॉजिकल और मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पूरे आरपीई / कोरॉयड फ्लैटमाउंट उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) और रेटिना कार्यात्मक और संरचनात्मक रूप से जुड़े ऊतक हैं जो प्रकाश धारणा और दृष्टि को विनियमित करने के लिए एक साथ काम करते हैं। आरपीई एपिकल सतह पर प्रोटीन फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड की सतह पर प्रोटीन के साथ कसकर जुड़े होते हैं, जिससे आरपीई को फोटोरिसेप्टर / रेटिना से लगातार अलग करना मुश्किल हो जाता है। हमने फोटोरिसेप्टर और आरपीई कोशिकाओं के अलग-अलग सेलुलर विश्लेषण के लिए पूर्ण आरपीई / कोरॉयड और रेटिना फ्लैटमाउंट उत्पन्न करने के लिए मानव आंखों के आरपीई से रेटिना को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए एक विधि विकसित की। डी-मैनिटोल के उच्च-परासरण समाधान के एक इंट्राविट्रल इंजेक्शन, आरपीई द्वारा परिवहन नहीं की गई चीनी, ने आरपीई सेल जंक्शनों को नुकसान पहुंचाए बिना पूरे पीछे के कक्ष में आरपीई और रेटिना के पृथक्करण को प्रेरित किया। रेटिना से जुड़ा कोई आरपीई पैच नहीं देखा गया। एक्टिन के फेलोइडिन लेबलिंग ने आरपीई आकार संरक्षण दिखाया और पूरे उपकला के मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति दी। आरपीई सेल सीमाओं को सटीक रूप से पहचानने और विभाजित करने और 30 विभिन्न आकार मैट्रिक्स को निर्धारित करने के लिए एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) आधारित सॉफ्टवेयर विकसित किया गया था। यह विच्छेदन विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इसे आसानी से अन्य पशु मॉडल तक बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) और तंत्रिका रेटिना आरपीई पर फोटोरिसेप्टर की मजबूत शारीरिक निर्भरता के कारण एक दूसरे के साथ दृढ़ता से जुड़े हुए हैं। विच्छेदन के दौरान, आरपीई से तंत्रिका रेटिना का यांत्रिक पृथक्करण आरपीई कोशिकाओं के फटने का कारण बनता है, जिसमें आरपीई के एपिकल भाग रेटिना फोटोरिसेप्टर के बाहरी खंडों से जुड़े रहते हैं। आरपीई-रेटिना आसंजन की सीमा इतनी अधिक है कि अलगाव के बाद रेटिना पर शेष वर्णक की मात्रा का उपयोग रेटिना आसंजन1 की ताकत को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। विशेष रूप से, आरपीई तंग जंक्शन और एक्टिन संरचना जो उन्हें जोड़ती है, जो एपिकल साइड पर स्थित हैं, यांत्रिक पृथक्करण के दौरान टूट जाती हैं। इसलिए, सेल सीमाओं के लिए आरपीई फ्लैटमाउंट को धुंधला करने से एक पैची मोनोलेयर होता है जिसमें कई कोशिकाओं की सीमाएं गायब होती हैं। यह प्रभाव तब बढ़ जाता है जब ऊतक को विच्छेदन से पहले पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय किया जाता है, क्योंकि प्रोटीन क्रॉसलिंक हो जाते हैं।
इंट्राविट्रल दवा वितरण पर अध्ययन से पता चला है कि पीछे के कक्ष में हाइपरोस्मोटिक समाधान के इंजेक्शन रेटिना डिटेचमेंट 2,3 को प्रेरित करते हैं। इन प्रयोगों में, 1,000 mOsm से 2,400 mOsm तक के विभिन्न समाधानों के 50 μL, को मध्य-विट्रस में इंजेक्ट किया गया, जिससे मिनटों के भीतर रेटिना डिटेचमेंट हुआ। विशेष रूप से, उच्च-परासरण समाधानों के लंबे एक्सपोजर के बाद भी, आरपीई तंग जंक्शन खरगोश औरबंदर दोनों आंखों के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक छवियों में बरकरार दिखाई दिए। इसी तरह की रणनीति के बाद, हमने आरपीई विच्छेदन करने से पहले एक कुशल रेटिना डिटेचमेंट को प्रेरित करने के लिए डी-मैनिटोल के एक हाइपरोस्मोटिक समाधान को मध्य-विट्रियस में इंजेक्ट किया। चूंकि डी-मैनिटोल को आरपीई4 द्वारा नहीं ले जाया जाता है, इसलिए एक उच्च इंट्राविट्रल एकाग्रता बनाए रखी जाती है, जिससे आसमाटिक ढाल उत्पन्न होती है। पूरे पश्चवर्ती कक्ष में आरपीई और रेटिना का कुशल पृथक्करण आरपीई सेलुलर जंक्शनों के संरक्षण की गारंटी देता है और पूरे फ्लैटमाउंट पर आरपीई मॉर्फोमेट्री के अध्ययन की अनुमति देता है। इसके अलावा, हमने एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) -आधारित सॉफ्टवेयर विकसित किया है जो फ्लोरोसेंटली लेबल आरपीई सेल सीमाओं को पहचानता है और सेगमेंट करता है, 30 अलग-अलग आकार मैट्रिक्स को निर्धारित करता है, और विज़ुअलाइज़ेशन 5,6 के लिए प्रत्येक मीट्रिक के हीटमैप का उत्पादन करता है।
Protocol
कैडेवर मानव ग्लोब उन्नत दृष्टि नेटवर्क (बर्मिंघम, एएल) से प्राप्त किए गए थे। शव ऊतक पर किए गए काम को एनआईएच संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुसंधान नैतिकता समिति से छूट दी गई है।
1. आई ग्लोब शिपमेंट
- न्यूक्लियेशन के बाद, सीए2 + और एमजी2 + के साथ बर्फ-ठंडे डीपीबीएस 1 एक्स से भरे कंटेनर में ताजा आंख ग्लोब शिप करें।
नोट: न्यूक्लियेशन के बाद 24 घंटे के भीतर आंख को विच्छेदित करना बेहतर होता है। इस समय विंडो के दौरान आरपीई आकृति विज्ञान में बदलाव नहीं किया जाता है।
2. सिलिकॉन मोल्ड की तैयारी
- 25 मिमी व्यास गोल-तल ट्यूब के निचले 20 मिमी काट लें। इसे एक वर्ग वजन वाली नाव (81 मिमी x 81 मिमी x 25 मिमी) के आधार पर रखें।
- सिलिकॉन इलास्टोमेर किट के दो घटकों को 10: 1 अनुपात में मिलाएं, हवा को फंसाने पर ध्यान न दें। मिश्रण को वजन वाली नाव में डालें जिसमें गोल-तल ट्यूब का गोलाकार टुकड़ा होता है।
- रात भर कमरे के तापमान पर सिलिकॉन का इलाज करें। ठीक सिलिकॉन मोल्ड से वजन नाव और गोल-तल ट्यूब को हटा दें।
3. आरपीई विच्छेदन
- मांसपेशियों और संयोजी ऊतक के ताजा आंख ग्लोब के श्वेतपटल को साफ करें। श्वेतपटल के माध्यम से पिरोए गए 27 जी सुइयों का उपयोग करके सिलिकॉन मोल्ड के लिए आंख को सुरक्षित करें। मोल्ड की गुहा को डीपीबीएस 1 एक्स के साथ सीए2 + और एमजी 2 + के साथभरें।
नोट: ध्यान दें कि आंख कक्ष का उल्लंघन न करें। सुइयों को केवल श्वेतपटल से गुजरना चाहिए। - विट्रस में 1,700 mOsm D-mannitol घोल के ~ 400 μL इंजेक्ट करने के लिए 1 mL सिरिंज और 21 G सुई का उपयोग करें। आंख के पूर्ववर्ती कक्ष को छिद्रित करने से बचने के लिए पार्स प्लाना के माध्यम से सुई डालें। ~ 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आंख छोड़ दें।
- बारीक कैंची और बल की एक जोड़ी का उपयोग करके पार्स प्लाना के स्तर पर पूर्ववर्ती कक्ष को खोलें। सीए2 + और एमजी 2 + के साथ डीपीबीएस 1 एक्स के साथ पीछे की आंख कक्षभरें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, मैक्युला (रेटिना पर पीला स्थान) को स्थानीयकृत करें।
- यदि एक सर्जिकल विट्रियस कटर उपलब्ध है, तो विट्रियस को हटा दें और इसे डीपीबीएस 1 एक्स के साथ सीए2 + और एमजी2 + के साथ बदलें। वैकल्पिक रूप से, विट्रियस को बल के साथ उठाने की कोशिश करें और इसे ठीक कैंची से काटें।
- मैकुलर क्षेत्र को संरक्षित करने पर ध्यान देते हुए, आंख को क्वाड्रेंट्स में काट लें: नाक, अस्थायी, बेहतर और हीन। सुइयों को हटा दें यदि वे रास्ते में हैं।
- आंख के तितलियों वाले पीछे के कक्ष को 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें सीए2 + और एमजी 2 + के साथ डीपीबीएस 1 एक्सहोता है। रेटिना को हटाने से पहले, सिलिअरी मार्जिन में थोड़ा सा कट (वी-आकार) बनाकर उस पंखुड़ी को चिह्नित करें जिसमें मैक्युला होता है। रेटिना पर पड़े सभी विट्रियस को उठाएं और काट लें।
- धीरे से रेटिना को घुमावदार स्पैटुला या बल की एक जोड़ी के साथ कई तरफ से उठाएं ताकि यह जांचा जा सके कि रेटिना आरपीई से अलग हो गया है या नहीं और दो परतों के बीच कुछ तरल पदार्थ प्रसारित हो सके।
नोट: रेटिना अभी भी बहुत परिधि (सिलियरी मार्जिन) और ऑप्टिक तंत्रिका पर जुड़ा होगा। - रेटिना को सभी पंखुड़ियों में सिलियरी मार्जिन से काटें, यह सुनिश्चित करें कि आरपीई को खरोंच न करें। ऊतक को 4% पीएफए में रखें और ~ 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। डीपीबीएस 1x के साथ Ca 2+और Mg 2+ के साथ 3x धोएं। ऊतक को सीए 2 +और एमजी 2 + के साथ डीपीबीएस 1 एक्स से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: इस बिंदु पर, रेटिना केवल ऑप्टिक तंत्रिका पर जुड़ा हुआ है। यह इस प्रयोग में एक विराम बिंदु है। - नमूने को 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें सीए 2 + और एमजी2 + के साथ डीपीबीएस 1 एक्सहोता है। ऑप्टिक तंत्रिका सिर को 1.5 मिमी बायोप्सी पंच के साथ बाहर निकालें और रेटिना को इकट्ठा करें। न्यूरल रेटिना को डीपीबीएस 1एक्स में सीए2 + और एमजी2 + के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: ऑप्टिक तंत्रिका सिर को बाहर निकालने से पहले, ऑप्टिक तंत्रिका को स्क्लरल साइड पर जितना संभव हो उतना काटना सुनिश्चित करें। इससे पंच की सटीकता बढ़ेगी। फ्लैटमाउंट को 4% पीएफए में तय करने के बाद ऑप्टिक तंत्रिका को बाहर निकालने से ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास स्थित आरपीई कोशिकाओं को नुकसान कम हो जाता है। - कोरॉयड परत को परिधि से धीरे-धीरे उठाकर और कोरॉइडल वाहिकाओं और संयोजी ऊतक को काटकर आरपीई / कोरॉइड से श्वेतपटल को हटा दें जो स्क्लेरा और आरपीई के बीच हैं। एक बार जब आरपीई / कोरॉयड स्क्लेरा से पूरी तरह से अलग हो जाता है, तो आरपीई / कोरॉयड परत एकत्र करें। ऊतक को Ca 2+और Mg 2+ के साथ DPBS 1x से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें और इसे 4 ° C पर स्टोर करें।
नोट: इस समय, प्रयोग को रोका जा सकता है।
4. धुंधलापन
- कोरॉयड को 6-वेल प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 0.5% ट्वीन20 , और 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के साथ सीए 2 + और एमजी 2+ के साथ डीपीबीएस 1 एक्स में नमूने को ब्लॉक और परमेबिलाइज करें।
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए डीपीबीएस 1 एक्स में 1: 250 कमजोर पड़ने पर 647 फ्लोरोफोरे के साथ संयुग्मित फेलोइडिनके साथ नमूने को इनक्यूबेट करें और 1% बीएसए के साथ एमजी 2+ के साथ 1% बीएसए, 0.5% ट्वीन 20, और 0.5% ट्राइटन एक्स -100। डीपीबीएस 1 एक्स में सीए2 + और एमजी2 + के साथ 3x धोएं।
- कोरॉयड नमूने को 50 मिमी x 75 मिमी ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें और इसे चपटा करें। नमूना चापलूसी बनाने के लिए प्रत्येक "पंखुड़ी" को दो में काटें। मैक्युला पर ध्यान दें। हाइड्रोफोबिक पेन के साथ फ्लैटमाउंट का एक समोच्च बनाएं।
- लिपोफसिन ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाने के लिए, 70% इथेनॉल में 1:20 तक पतला ऑटोफ्लोरेसेंस बुझाने वाले घोल के 500 μL जोड़ें और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
- डीपीबीएस 1 एक्स में सीए2 + और एमजी2 + के साथ अच्छी तरह से (कम से कम 3x) धो लें। DPBS निकालें और माउंटिंग माध्यम जोड़ें। फ्लैटमाउंट पर एक कवरग्लास रखें और नेल पॉलिश के साथ सील करें।
- फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ फ्लैटमाउंट की छवि बनाएं (अधिमानतः 10x या 20x उद्देश्य का उपयोग करके)।
5. RESHAPE विश्लेषण
नोट: जैसा कि RESHAPE AI-आधारित एल्गोरिथ्म को 10x और 20x छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था, इसलिए, इमेजिंग करते समय 10x या 20x उद्देश्य का उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यदि नहीं, तो छवियों को तदनुसार फिर से तैयार करने की आवश्यकता होगी।
- यदि छवियों को एक से अधिक फ्लोरोसेंट चैनल के साथ अधिग्रहित किया जाता है, तो सेल सीमाओं को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल को अलग करें। छवियों को 16-बिट ग्रेस्केल टीआईएफ फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें।
नोट: फ़ाइल एक्सटेंशन .czi के साथ प्राप्त छवियों को TIF फ़ाइलों के रूप में निर्यात करने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन सेल सीमाओं वाले चैनल को अभी भी अलग करने की आवश्यकता है। - Windows x64 या Linux (Centos 7) प्लेटफार्मों पर सॉफ़्टवेयर स्थापित करें।
नोट: सॉफ्टवेयर और स्थापना के निर्देश https://github.com/nih-nei/REShAPE पर पाए जा सकते हैं। - सॉफ़्टवेयर खोलें (चित्रा 1)।
- निर्देशिका टैब में, इनपुट और आउटपुट फ़ोल्डरका चयन करें। इनपुट निर्देशिका में, उस फ़ोल्डर का चयन करें जिसमें छवियाँ हैं. आउटपुट निर्देशिका में, सॉफ़्टवेयर को स्वचालित रूप से पथ को "इनपुट निर्देशिका / संसाधित" में बदलने दें। वैकल्पिक रूप से, आउटपुट निर्देशिका मैन्युअल रूप से बदलें।
नोट: सॉफ्टवेयर इनपुट फ़ोल्डर में निहित सभी छवियों के माध्यम से पुनरावृत्ति करेगा। - NN विभाजन विकल्प टैब में, छवि विभाजन के लिए निम्न सेटिंग्स चुनें:
- बैच आकार: टेक्स्ट बॉक्स में 20 का मान एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु के रूप में टाइप करें, लेकिन यदि सिस्टम ग्राफिक्स प्रोसेसिंग यूनिट (जीपीयू) से बाहर चला जाता है तो इसे कम करें।
नोट: मूल छवि प्रसंस्करण के लिए छोटी टाइलों में विभाजित है। बैच आकार निर्दिष्ट करता है कि एक बार में कितनी टाइलें संसाधित की जा सकती हैं। - GPU का उपयोग करें?: यदि सिस्टम के पास पर्याप्त GPU संसाधन नहीं हैं, तो बॉक्स संख्या (11) चेक करें।
- आंतरिक स्केल: ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके, उन मामलों में आंतरिक स्केलिंग को कोई नहीं से बदलें जहां छवियों को 10x या 20x उद्देश्य के साथ प्राप्त नहीं किया गया था। उदाहरण के लिए, 1/2 बटन का उपयोग करके 40x छवियों को आधे आकार में डाउनस्केल करें। ड्रॉपडाउन मेनू में उपलब्ध रीस्केलिंग विकल्प निम्नानुसार हैं: 5x, 2x, कोई नहीं, 1/2, 1/5।
नोट: मशीन लर्निंग को 10x और 20x छवियों के साथ प्रशिक्षित किया गया था। यह अन्य आवर्धन पर ली गई छवियों से सेल सीमाओं को नहीं पहचान सकता है। इस मामले में, बाइनरी छवियां पूरी तरह से काली दिखाई देंगी। - आरती फ़िल्टर: बहुत उज्ज्वल कणों (मलबे या रेटिना के छोटे हिस्से या ऑप्टिक तंत्रिका के चारों ओर संयोजी ऊतक) को हटाने के लिए आर्टिफैक्ट फ़िल्टर टैब का उपयोग करें जो छवि में मौजूद हो सकते हैं और सेल सीमा विभाजन में हस्तक्षेप कर सकते हैं। डिफ़ॉल्ट रूप से कोई फ़िल्टर उपयोग नहीं किया जाता है. ड्रॉपडाउन मेनू में कृत्रिम फ़िल्टर विकल्प निम्नानुसार हैं: नियमित, मजबूत और कमजोर।
- बैच आकार: टेक्स्ट बॉक्स में 20 का मान एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु के रूप में टाइप करें, लेकिन यदि सिस्टम ग्राफिक्स प्रोसेसिंग यूनिट (जीपीयू) से बाहर चला जाता है तो इसे कम करें।
- टाइल्ड छवि विकल्प टैब में, पैड टाइल्स बाय पैरामीटर समायोजित करके छवि टाइल्स के बीच ओवरलैप की मात्रा निर्दिष्ट करने के लिए पाठ बॉक्स में एक मान डालें। 100 पिक्सेल का ओवरलैप आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है।
- आउटपुट ग्राफ़िक विकल्प टैब में, हीटमैप पीढ़ी के लिए सेटिंग्स ट्यून करें:
- टाइल्ड छवियों का पुनर्निर्माण?: यदि सिस्टम के पास बड़ी छवियों के विश्लेषण के लिए पर्याप्त संसाधन नहीं हैं, तो सॉफ़्टवेयर को पूरी छवि का पुनर्निर्माण किए बिना अलग-अलग टाइल्स को सहेजकर विश्लेषण पूरा करने की अनुमति देने के लिए बॉक्स नंबर चेक करें।
- रंग छवियाँ बनाएँ: हीटमैप उत्पन्न करने के लिए, ड्रॉपडाउन मेनू से सभी का चयन करें.
- कलरिंग के लिए, ड्रॉपडाउन मेनू में उपलब्ध विभिन्न रंग पैलेट में से कोई भी चुनें: थर्मल, ग्रीन, एमपीएल-मैग्मा, फेज, फायर, जेट, सियान हॉट।
- छवि स्वरूप के लिए, टैब में विकल्पों में से किसी एक का चयन करके छवियों को TIF या PNG के रूप में सहेजें.
- मैन्युअल सीमाओं का उपयोग करें सुविधा के संबंध में, सॉफ़्टवेयर को प्रत्येक छवि में पाए गए न्यूनतम और अधिकतम मानों का उपयोग करने देने के लिए बॉक्स नहीं चेक करें। प्रत्येक आकृति मीट्रिक हीटमैप के लिए मानों की श्रेणी को मैन्युअल रूप से समायोजित करने के लिए बॉक्स हाँ चेक करें, और पाठ बक्से में मान सम्मिलित करके अलग-अलग पैरामीटर के लिए श्रेणियाँ चुनने के लिए सीमाएँ सेट करें बटन पर क्लिक करें. रुचि के मूल्यों को बदलने के बाद, सहेजें पर क्लिक करें। सभी सीमाओं को रीसेट करने के लिए लोड डिफ़ॉल्ट पर क्लिक करें।
नोट: मैन्युअल सीमाओं का उपयोग करें यदि कई छवियों से हीटमैप की तुलना करने की आवश्यकता है, जैसे कि सेल आकार पर विभिन्न यौगिकों के प्रभावों की तुलना करते समय। इस तरह, मूल्यों की एक ही श्रेणी का उपयोग किया जाता है। मैन्युअल रूप से दर्ज किए जाने वाले मानों का सेट नमूने के प्रकार के आधार पर भिन्न होता है। इष्टतम सीमा चुनने के लिए कुछ पुनरावृत्तियों को चलाने की सिफारिश की जाती है।
- विश्लेषण के लिए कक्ष आकार प्रतिबंध टैब में, विश्लेषण के लिए कक्ष आकार सीमा का चयन करें:
- लोअर सेल आकार में, विश्लेषण में शामिल किए जाने वाले सबसे छोटे सेल का आकार टेक्स्ट बॉक्स में डालें।
- ऊपरी कक्ष आकार में, पाठ बॉक्स में विश्लेषण में शामिल किए जाने वाले सबसे बड़े कक्ष का आकार सम्मिलित करें.
नोट: स्वचालित इकाई रूपांतरण टैब में चुने गए विकल्प के आधार पर सेल आकार की इकाई पिक्सेल से माइक्रोमीटर वर्ग में बदल जाती है।
- स्वचालित इकाई रूपांतरण टैब में, विश्लेषण के लिए पसंदीदा इकाई चुनें:
- पिक्सेल को वास्तविक इकाइयों में कनवर्ट करें?, पिक्सेल इकाइयों में विश्लेषण चलाने के लिए कोई बॉक्स चेक करें। माइक्रोमीटर में विश्लेषण चलाने के लिए हाँ बॉक्स की जाँच करें।
- स्केल पट्टी (पिक्सेल) की लंबाई में, पाठ बॉक्स में पिक्सेल मान दर्ज करें.
- स्केल बार (माइक्रोन) की लंबाई में, टेक्स्ट बॉक्स में माइक्रोमीटर में संबंधित दूरी दर्ज करें।
- विश्लेषण शुरू करने के लिए, इसके लिए जाएं दबाएँ।
नोट: सॉफ्टवेयर सेल व्यवहार्यता को भी माप सकता है जब कोशिकाओं को 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) और प्रोपिडियम आयोडाइड (सीजेडआई विकल्प टैब) के साथ दाग दिया जाता है, लेकिन यह आरपीई फ्लैटमाउंट पर लागू नहीं होता है।
चित्रा 1: RESHAPE ग्राफिकल यूजर इंटरफेस। जीयूआई में कार्यशील निर्देशिकाओं (निर्देशिका टैब) का चयन करने, विभाजन विकल्पों (एनएन विभाजन विकल्प और टाइल्ड छवि विकल्प टैब) को संशोधित करने, विश्लेषण के लिए पैरामीटर निर्दिष्ट करने (विश्लेषण और स्वचालित इकाई रूपांतरण टैब के लिए सेल आकार प्रतिबंध), और हीटमैप पीढ़ी (आउटपुट ग्राफिक्स विकल्प टैब) के लिए अलग-अलग टैब हैं। संक्षिप्त नाम: जीयूआई = ग्राफिकल यूजर इंटरफेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Representative Results
इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एक फ्लैटमाउंट की एकल-विमान छवि होती है, जहां सेल स्थान और 30 आकार मैट्रिक्स को हर सही ढंग से पहचाने गए आरपीई सेल (चित्रा 2) के लिए मापा जाता है। इनपुट निर्देशिका के अंदर "संसाधित" नामक एक फ़ोल्डर स्वचालित रूप से उत्पन्न होता है। इस फ़ोल्डर में चार उप-निदेशक हैं, जिनका नाम "विश्लेषण," "रंग कोडित," "संयुक्त फ़ाइलें" और "खंडित छवियां" और विश्लेषण के दौरान उत्पन्न कुछ अस्थायी फ़ाइलें हैं। "संयुक्त फ़ाइलें" फ़ोल्डर में सभी आकार मापों के साथ एक स्प्रेडशीट और सभी फ़ाइलों की सेल पड़ोसी गणना की आवृत्तियों के साथ एक स्प्रेडशीट होती है। "विश्लेषण" फ़ोल्डर में सभी आकार मापों के साथ एक स्प्रेडशीट और प्रत्येक छवि के लिए अलग-अलग सेल पड़ोसी की आवृत्तियों के साथ एक स्प्रेडशीट होती है। "खंडित छवियां" निर्देशिका में आरपीई सेल सीमाओं के अंतिम बाइनरी मास्क शामिल हैं; इसका उपयोग विभाजन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। "रंग कोडित" निर्देशिका में प्रत्येक छवि में आकार पैटर्न की कल्पना करने के लिए प्रत्येक आकार माप के लिए हीटमैप होते हैं। आकृति मीट्रिक परिभाषाएँ और संक्षिप्तीकरण तालिका 1 में पाए जा सकते हैं।
कभी-कभी आरपीई फ्लैटमाउंट में रेटिना के अवशिष्ट टुकड़े हो सकते हैं जिन्हें साफ रूप से हटाया नहीं गया था, खासकर ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास। नमूने के फेलोइडिन धुंधला होने के परिणामस्वरूप रेटिना से एक मजबूत संकेत आता है, और इससे आरपीई सेल सीमा विभाजन के लिए समस्याएं हो सकती हैं। कुछ टाइलें पूरी तरह से काली दिखाई देंगी, जबकि आसपास की टाइलें सामान्य विभाजन दिखाएंगी। अन्य उज्ज्वल वस्तुएं जो छवि में मौजूद हो सकती हैं, वे भी काली टाइलों की पीढ़ी का कारण बनेंगी (चित्रा 3)। इन मामलों में, आरती फ़िल्टर ड्रॉपडाउन मेनू में उपलब्ध फ़िल्टरिंग विकल्पों (कमजोर, नियमित, मजबूत) में से एक चुनने से काली टाइलों के गठन को रोका जा सकेगा।
RESHAPE इनपुट के रूप में 8-बिट या 16-बिट ग्रेस्केल छवियों को लेता है लेकिन RGB छवियों को नहीं। RESHAPE विश्लेषण के लिए RGB छवियों का उपयोग पूरी तरह से काले बाइनरी छवियों का उत्पादन करेगा। यदि ऐसा होता है, तो आरजीबी छवियों को ग्रेस्केल में परिवर्तित करने से सही ढंग से खंडित द्विआधारी छवियां उत्पन्न होंगी (चित्रा 4)। कुछ अवसरों पर जहां आरपीई सीमाओं को सही ढंग से पहचाना नहीं जाता है, उदाहरण के लिए, यदि धुंधलापन इष्टतम नहीं है या यदि नमूना खरोंच (चित्रा 5 ए) से क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो कोशिकाओं के बड़े झुरमुट को एकल बहुत बड़े सेल (चित्रा 5 बी) के रूप में पहचाना जा सकता है। इस मामले में, बड़ी वस्तुओं को सेल आकार सीमा (चित्रा 5 सी) को कम करके विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। यह ऊपरी सेल आकार पाठ बॉक्स में निम्न मान सम्मिलित करके प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, इसके परिणामस्वरूप हीटमैप की सीमा में बदलाव होगा। यदि कोई शोधकर्ता ऐसा करना चुनता है, तो उपयोग मैनुअल सीमा सुविधा में बॉक्स हां की जांच करके मूल हीटमैप रेंज (चित्रा 5 डी) को बनाए रखना भी संभव है। इसके बाद, शोधकर्ता को सीमा सेट बटन पर बाएं-क्लिक करना होगा और मैन्युअल सीमाओं को निर्दिष्ट करने के लिए टेक्स्ट बॉक्स में वांछित मान सम्मिलित करना होगा।
चित्र 2: एक संपूर्ण मानव आरपीई मोनोलेयर का पूर्ण मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण। (ए) एक संपूर्ण मानव आरपीई / कोरॉयड फ्लैटमाउंट (मैजेंटा: फेलोइडिन) का एक कम आवर्धन दृश्य। (बी) फेलोइडिन-दाग वाले आरपीई कोशिकाओं के दृश्य में एक ज़ूम-इन। (ग) संपूर्ण मानव आरपीई/कोरॉयड फ्लैटमाउंट के लिए आरपीई सेल सीमाओं का आरईएसएचएपीई-जनित विभाजन और (डी) तदनुरूपी ज़ूम-इन दृश्य। (ई) एक सॉफ्टवेयर-जनित हीटमैप जो पूरे मानव फ्लैटमाउंट में व्यक्तिगत आरपीई कोशिकाओं के सेल क्षेत्र को दर्शाता है। ऊपरी-बाएं कोने पर थर्मल स्केल उपयोग किए गए मूल्यों की सीमा को दर्शाता है। (एफ) संबंधित ज़ूम-इन दृश्य क्षेत्र द्वारा रंगीन अलग-अलग आरपीई कोशिकाओं को दर्शाता है। स्केल बार = (बी, डी, एफ) 50 μm, (A, C, E) 5 मिमी। संक्षिप्त नाम: आरपीई = रेटिना वर्णक उपकला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: उज्ज्वल कलाकृतियों की फ़िल्टरिंग। (A) सेल सीमाओं (Magenta: fhalloidin) के लिए सना हुआ एक मानव RPE फ्लैटमाउंट उज्ज्वल क्षेत्रों (हरे आयताकार) को प्रस्तुत कर सकता है जो विभाजन में हस्तक्षेप करते हैं। (बी) पूरे फ्लैटमाउंट के आरपीई सेल सीमा विभाजन में प्रतिदीप्ति के उज्ज्वल क्षेत्रों के अनुरूप तीन पूरी तरह से काली टाइलें (हरे तीर) होती हैं। (C, E) काली टाइलों में से दो उज्ज्वल बिंदुओं वाले क्षेत्रों के अनुरूप हैं, जो संभवतः कुछ मलबे हैं। (डी) काली टाइलों में से एक ऑप्टिक तंत्रिका के चारों ओर तंत्रिका रेटिना के एक टुकड़े द्वारा उत्पन्न किया गया था जिसे सही ढंग से नहीं हटाया गया था। तंत्रिका रेटिना के टुकड़े आरपीई परत की तुलना में काफी उज्जवल होते हैं और सेल विभाजन में बाधा डालते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: इनपुट छवि आवश्यकता। सेल सीमाओं के लिए दागदार आरपीई कोशिकाओं को (ए) आरजीबी या (बी) ग्रेस्केल 16-बिट छवियों के रूप में RESHAPE विश्लेषण के लिए सहेजा गया था। (सी) आरबीजी छवि विश्लेषण का आउटपुट एक काली द्विआधारी छवि है, (डी) जबकि ग्रेस्केल छवि का विश्लेषण सेल सीमाओं के सही ढंग से खंडित बाइनरी का उत्पादन करता है। RESHAPE केवल 8-बिट या 16-बिट ग्रेस्केल छवियों का विश्लेषण कर सकता है। स्केल पट्टियाँ = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 5: उप-मानक परिणाम. (A) RPE मोनोलेयर के एक हिस्से की एक छवि जहां फेलोइडिन से दागी कोशिकाओं को गलती से खरोंच दिया गया था. (बी) सेल क्षेत्र के आयाम द्वारा रंगीन आरपीई कोशिकाओं का एक हीटमैप। एक बड़े ऊपरी सेल आकार की सीमा में विश्लेषण में बड़ी वस्तुएं शामिल हैं। (सी) एक सेल क्षेत्र हीटमैप जिसमें विश्लेषण से बड़ी वस्तुओं को बाहर करने के लिए एक छोटी ऊपरी सेल आकार सीमा चुनी गई थी। (डी) एक सेल क्षेत्र हीटमैप जिसमें एक छोटी ऊपरी सेल आकार सीमा चुनी गई थी और मूल रूप से उपयोग किए जाने वाले हीटमैप रेंज को बनाए रखने के लिए मैनुअल सीमा निर्धारित की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: RESHAPE पैरामीटर। तालिका प्रत्येक पैरामीटर की परिभाषा और कच्चे स्प्रेडशीट ("_Data.csv" फ़ाइलों) और हीटमैप्स के लिए उपयोग किए जाने वाले संक्षिप्तीकरण की रिपोर्ट करती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानव आरपीई और रेटिना के सुसंगत और कुशल पृथक्करण को प्राप्त किया जा सकता है। यह विधि पूरे मानव रेटिना 5 में आरपीई आकार में क्षेत्रीय अंतरके अध्ययन की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम आरपीई और रेटिना का भौतिक पृथक्करण है। यदि कुछ क्षेत्रों में दो ऊतक पूरी तरह से अलग नहीं हैं, तो किसी को धीरे से रेटिना को उठाना चाहिए, यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ऊतकों को तोड़ा न जाए। बड़े फ्लैटमाउंट के RESHAPE विश्लेषण को काफी रैम संसाधनों वाले सिस्टम के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। इस मामले में, प्रसंस्करण संसाधनों की कमी के बावजूद सॉफ्टवेयर को सफलतापूर्वक विश्लेषण पूरा करने की अनुमति देने के लिए पूरी छवि के पुनर्संयोजन को अक्षम किया जा सकता है।
मानव आरपीई फ्लैटमाउंट को विभाजित करने के लिए आरईएसएचएपीई का उपयोग करने की मुख्य सीमा यह है कि एआई एल्गोरिदम को ज्यादातर प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई की छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था। नतीजतन, मानव आरपीई फ्लैटमाउंट का विभाजन कम सटीक है। वृद्ध दाताओं से आरपीई कोशिकाओं में बड़ी मात्रा में लिपोफसिन7 होता है, और इसके ऑटोफ्लोरेसेंस का व्यापक स्पेक्ट्रम सेल सीमा विभाजन में हस्तक्षेप करता है। भविष्य में, इस तरह के नमूने में सेल सीमा विभाजन को बेहतर बनाने के लिए आरपीई फ्लैटमाउंट की अधिक छवियों का उपयोग किया जाएगा। इस सीमा के बावजूद, RESHAPE को विशेष रूप से आरपीई सेल सीमाओं को पहचानने और विभाजित करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था और अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करता है, जैसे कि वोरोनोई8 और सेलप्रोफाइलर9 आरपीई कोशिकाओं का विभाजन।
इसके अलावा, मैनुअल विभाजन10 की तुलना में, RESHAPE बड़ी छवियों का जल्दी से विश्लेषण करने का लाभ प्रदान करता है (~ 130,000 पिक्सेल x 130,000 पिक्सेल का परीक्षण किया गया था)। अंत में, यह विच्छेदन विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इसे आसानी से अन्य पशु मॉडल तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, सॉफ्टवेयर का उपयोग आंखों के फ्लैटमाउंट में आरपीई आकार का अध्ययन करने या कुछ उपचारों के प्रभाव की जांच करने के लिए सेल कल्चर मॉडल में किया जा सकता है। अंत में, RESHAPE की बहुमुखी प्रतिभा इसे अन्य प्रकार के उपकला कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए व्यापक रूप से लागू करती है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम ज़ीस एक्सियो स्कैन.जेड 1 के उपयोग के लिए नेशनल आई इंस्टीट्यूट (एनईआई) हिस्टोलॉजी कोर को धन्यवाद देते हैं। हम दानदाताओं, उनके परिवारों, एडवांसिंग साइट नेटवर्क और लायंस आई इंस्टीट्यूट को उनकी उदारता के लिए भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनईआई आईआरपी फंड (अनुदान संख्या ज़िया ईवाई000533-04) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
| Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
| Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
| Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
| Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
| Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
| Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
| Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
| Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
| Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
| Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
| Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
| Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
| Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
| Vannas Spring Scissors - 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |
References
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- Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).
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