Summary
I denne protokol blev metoden til oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT) optimeret til parret forhør af det cellespecifikke ovarietranskriptom og epigenom ved hjælp af NuTRAP-musemodellen krydset til en Cyp17a1-Cre-muselinje.
Abstract
Vurdering af celletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske ændringer er nøglen til forståelse af æggestokkenes aldring. Til dette formål blev optimeringen af metoden til oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT) metode udført til den efterfølgende parrede forhør af det cellespecifikke ovarietranskriptom og epigenom ved anvendelse af en ny transgen NuTRAP-musemodel. Ekspressionen af NuTRAP-allelen er under kontrol af en floxed STOP-kassette og kan målrettes mod specifikke ovariecelletyper ved hjælp af promotorspecifikke Cre-linjer. Da nylige undersøgelser har impliceret stromale celler i æggestokkene i kørsel af for tidlige aldringsfænotyper, blev NuTRAP-ekspressionssystemet målrettet mod stromale celler ved hjælp af en Cyp17a1-Cre-driver. Induktionen af NuTRAP-konstruktionen var specifik for ovariestromale fibroblaster, og tilstrækkeligt DNA og RNA til sekventeringsundersøgelser blev opnået fra en enkelt æggestok. NuTRAP-modellen og metoderne, der præsenteres her, kan bruges til at studere enhver ovariecelletype med en tilgængelig Cre-linje.
Introduction
Æggestokkene er vigtige aktører i somatisk aldring1, med forskellige bidrag fra specifikke cellepopulationer. Den cellulære heterogenitet af æggestokken gør det vanskeligt at fortolke molekylære resultater fra bulk, hel-ovarie assays. Forståelse af specifikke cellepopulationers rolle i æggestokkenes aldring er nøglen til at identificere de molekylære drivere, der er ansvarlige for fertilitet og sundhedsnedgang hos ældre kvinder. Traditionelt blev multi-omics-vurderingen af specifikke ovariecelletyper opnået ved teknikker som lasermikrodissektion2, enkeltcellemetoder3 eller cellesortering4. Imidlertid kan mikrodissektion være dyrt og vanskeligt at udføre, og cellesortering kan ændre cellulære fænotypiske profiler5.
En ny tilgang til vurdering af ovariecelletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske profiler bruger den nukleare mærkning og oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (NuTRAP) musemodel. NuTRAP-modellen tillader isolering af celletypespecifikke nukleinsyrer uden behov for cellesortering ved hjælp af affinitetsrensningsmetoderne: oversættelse af ribosomaffinitetsoprensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT)6. Ekspressionen af NuTRAP-allelen er under kontrol af en floxed STOP-kassette og kan målrettes mod specifikke ovariecelletyper ved hjælp af promotorspecifikke Cre-linjer. Ved at krydse NuTRAP-musen med en celletypespecifik Cre-linje forårsager fjernelsen af STOP-kassetten eGFP-mærkning af det ribosomale kompleks og biotin/mCherry-tagging af kernen på en Cre-afhængig måde6. TRAP- og INTACT-teknikkerne kan derefter bruges til at isolere mRNA og nukleært DNA fra den pågældende celletype og gå videre til transkriptomiske og epigenomiske analyser.
NuTRAP-modellen er blevet brugt i forskellige væv, såsom fedtvæv6, hjernevæv 7,8,9 og nethinden 10, til at afsløre celletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske ændringer, der muligvis ikke påvises i helvævshomogenat. Fordelene ved NuTRAP-tilgangen i forhold til traditionelle cellesorteringsteknikker inkluderer følgende: 1) forebyggelse af ex vivo-aktiveringsartefakter 8, 2) det minimerede behov for specialudstyr (dvs. cellesorterere) og 3) den øgede gennemstrømning og reducerede omkostninger ved celletypespecifikke analyser. Derudover giver evnen til at isolere celletypespecifikt DNA og RNA fra en enkelt mus mulighed for parrede analyser, der øger den statistiske styrke. Da nylige undersøgelser har impliceret stromale celler i æggestokkene i at køre for tidlige aldringsfænotyper 11,12,13, målrettede vi NuTRAP-ekspressionssystemet til stromale og theca-celler ved hjælp af en Cyp17a1-Cre-driver. Her demonstrerer vi, at induktionen af NuTRAP-konstruktionen er specifik for ovariestromale og thecaceller, og tilstrækkeligt DNA og RNA til sekventeringsundersøgelser opnås fra en enkelt æggestok. NuTRAP-modellen og metoderne, der præsenteres her, kan bruges til at studere enhver ovariecelletype med enhver tilgængelig Cre-linje.
Til generering af en celletypespecifik NuTRAP-muselinje i æggestokkene har NuTRAP-allelen til nuklear mærkning og oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (NuTRAP) et floxed STOP-kodon, der styrer ekspressionen af BirA, biotinligasegenkendelsespeptid (BLRP)-mærket mCherry/mRANGAP1 og eGFP/L10a. Når NuTRAP-kassetten krydses med en celletypespecifik Cre-linje, mærker ekspressionen af NuTRAP-kassetten det nukleare protein mRANGAP1 med biotin/mCherry og ribosomalt protein L10a med eGFP på en Cre-afhængig måde. Dette muliggør isolering af kerner og mRNA fra specifikke celletyper uden behov for cellesortering. NuTRAP flox/flox kan parres med en celletypespecifik Cre, der er relevant for ovariecelletyper for at vurdere dette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Forældremus blev købt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og opdrættet og opstaldet under SPF-forhold i et HEPA-barrieremiljø på en 14 timer / 10 timers lys / mørk cyklus (lys tændt kl. 6:00) på OMRF.
BEMÆRK: I denne demonstration bruger vi en Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) han parret med en NuTRAP hun (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). Det ønskede Cyp17-NuTRAP afkom (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) vil udtrykke NuTRAP-allelen under kontrol af Cyp17a1-promotoren i stromale celler i æggestokkene. Til denne manuskriptforberedelse brugte vi 4 måneder gamle hunmus Cyp17-NuTRAP (n = 4). DNA blev ekstraheret fra museørestansprøver til genotypebestemmelse for at bekræfte arven af Cyp17iCre- og NuTRAP-transgenerne og til PCR-påvisning af 1) generisk Cre, 2) Cyp17iCre og 3) NuTRAP floxed ved hjælp af primerne, der er anført i materialetabellen, som tidligere beskrevet 7,8.
1. Dissektion af æggestokkene på mus
- Udfør musedødshjælp i henhold til retningslinjerne for dyrepleje og godkendelse af institutionen, efterfulgt af indsamling af æggestokke.
- Disseker æggestokkene for at fjerne fedtvæv eller dele af ovidukterne, der kan være fastgjort til æggestokkene, inden æggestokkene placeres i rør med buffer. Fortsæt straks til TRAP eller INTACT teknikker.
BEMÆRK: Denne protokol er ikke optimeret til brug med frosset væv. Brug af en æggestok fra den samme mus til hver teknik anbefales til fremtidig statistisk analyse.
2. Isolering af kerner fra specifikke ovariecelletyper
- Forberedelse af buffer
- Nuklear rensningsbuffer (NPB): For at forberede 100 ml NPB kombineres 2 ml 1 M HEPES (slutkoncentration: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), og 92,2 ml nukleasefrit vand. Suppler med 1x proteasehæmmer på dagen for kerneisolering.
BEMÆRK: NPB kan fremstilles uden proteasehæmmeren på forhånd og varer i op til 3 uger ved 4 °C. - Nuclei lysis buffer (komplet): Supplement nuclei lysis buffer med 1x proteasehæmmer på dagen for kerneisolering.
- Nuklear rensningsbuffer (NPB): For at forberede 100 ml NPB kombineres 2 ml 1 M HEPES (slutkoncentration: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), og 92,2 ml nukleasefrit vand. Suppler med 1x proteasehæmmer på dagen for kerneisolering.
- Oprettelse af kernesuspensionen
BEMÆRK: Prøverne skal altid opbevares på is, medmindre andet er angivet.- Der indsamles én æggestok fra en Cyp17-NuTRAP-mus (eller anden relevant Cre-NuTRAP) i 500 μL kernelysebuffer (komplet). Hak æggestokken i otte dele i bufferen ved hjælp af selvåbnende mikrosaks.
- Brug pipetter med bred boring til at overføre hakket æggestok og 500 μL lysisbuffer til en glas Dounce-homogenisator på is. Homogeniser æggestokken 10x-20x med den løse støder A. Tilsæt 400 μL lysisbuffer til Dounce-homogenisatoren, vask støderen A.
- Homogeniser æggestokken med den stramme støder B 10x-20x. Tilsæt 1.000 μL lysisbuffer, vask støderen B. Overfør homogenatet (1,9 ml) til et 2 ml rundbundet rør.
- Der centrifugeres ved 200 x g i 1,5 min ved 4 °C for at fjerne ikke-dissocieret væv og blodkar14. Supernatanten indeholder kernerne; Kassér pellet af ikke-dissocieret væv.
- Efter forvædning af en 30 μm cellesi med 100 μL lysisbuffer og filtreres supernatanten gennem cellesien i et 15 ml konisk rør. Overfør derefter den kerneholdige blanding til et 2 ml rundbundet rør.
- Prøven centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Pelleten indeholder kerner.
- Den nukleare pellet resuspenderes i 250 μL iskold lysisbuffer ved hvirvelstrøm kortvarigt ved moderat til høj hastighed. Bring lydstyrken op til 1,75 ml ved at tilføje 1,5 ml lysisbuffer. Bland forsigtigt, og lad den nukleare suspension hvile på is i 5 min.
- Pellet kernerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres forsigtigt uden at forstyrre kernepelletsen. Resuspender pellet i 200 μL iskold opbevaringsbuffer og hvirvel kortvarigt for fuldstændigt at resuspendere den nukleare pellet.
- Der reserveres 10 % af den resuspenderede pellet (20 μL) som inputkerneprøve til downstream-analyser.
- Tag den resuspenderede kernepellet, og fyld volumenet op til 2,0 ml med iskold NPB. Fortsæt med at isolere de mærkede kerner ved hjælp af den INTACT-affinitetsbaserede oprensningsmetode.
- Isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT)
- Vortex streptavidinperlerne i hætteglasset i 30 s ved medium hastighed for at sikre, at de er helt opslæmmede. Tilsæt 30 μL resuspenderede perler til hver prøve i et 2 ml rundbundet rør (perler til op til 10 prøver kan vaskes i et enkelt rør), tilsæt 1 ml NPB, og resuspender godt ved pipettering.
- Placer røret på magnetstativet i 1 min for at adskille perlerne. Supernatanten kasseres, og tuben tages ud af magneten. Resuspender de vaskede magnetiske perler i 1 ml NPB.
- Gentag vasketrinnet i i alt tre vaske. Efter den endelige vask resuspenderes perlerne i det oprindelige volumen NPB (30 μL pr. prøve).
- Der tilsættes 30 μL af de vaskede perler til 2 ml nuklear suspension fra trin 2.2.10. Resuspender perle-kerneblandingen godt ved pipettering og forsigtigt invertering af røret.
- Placer rørene på en roterende mixer i et koldt rum eller køleskab i 30 minutter ved lav hastighed. Inkuber inputprøverne uden perler under de samme betingelser.
- Placer rørene med den nukleare suspension og perler på magneten, og adskil de biotinylerede kerner bundet til streptavidinperler (positiv fraktion) fra den negative fraktion af kerner. Lad perlerne skille sig ad på magneten i 3 min.
- Supernatanten fjernes, den negative fraktion hældes til et frisk 2,0 ml rør, og der reserveres på is. For hvert positivt fraktionsrør fjernes røret fra magneten, og indholdet resuspenderes i 1 ml NPB.
- Anbring tuben på magneten i 1 min, og kassér supernatanten. Fjern røret fra magneten, og resuspender den vaskede perle-kerneblanding i 1 ml NPB.
- Gentag trin 2.3.8 for i alt tre vaske. Efter afslutningen af tre vaske resuspenderes den positive fraktion perle-kerneblanding i 30 μL NPB.
- For hvert negativt fraktionsglas centrifugeres den nukleare suspension fra trin 2.3.7 ved 500 x g i 7 minutter ved 4 °C. Supernatanten suges forsigtigt og kasseres. Resuspender den negative fraktionskernepellet i 30 μL NPB.
- Kernerne opbevares fra input (trin 2.2.9), den negative fraktion (trin 2.3.10) og den positive fraktion (trin 2.3.9) i en -80 °C fryser, indtil de er klar til nuklear DNA- eller RNA-isolering.
BEMÆRK: Kernerne bør ikke fryses for protokoller, der kræver intakte kerner som input (dvs. assay for transposase-tilgængeligt kromatin, kromatinimmunudfældning).
3. Isolering af mRNA fra specifikke ovariecelletyper
- Forberedelse af bufferne
- TRAP-bufferbase: Forbered 100 ml TRAP-bufferbase ved at kombinere 78,8 ml RNasefrit vand, 5 ml 1 M Tris-HCl (slutkoncentration: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 ml 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 ml 1 M MgCl2 (12 mM MgCl2) og 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40). Opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
- Høj saltbufferbase: Forbered 100 ml høj saltbufferbase ved at kombinere 68,8 ml RNasefrit vand, 5 ml 1 M Tris-HCl (slutkoncentration: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 ml 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 ml 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) og 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40). Opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
- TRAP homogeniseringsbuffer (komplet): Forbered 1,5 ml pr. prøve på dagen for vævsopsamling. Der fremstilles 10 ml TRAP-homogeniseringsbuffer ved at kombinere 10 ml TRAP-bufferbase (fra trin 3.1.1) med 10 μL 100 mg/ml cycloheximid (slutkoncentration: 100 μg/ml cycloheximid), 10 mg natriumheparin (1 mg/ml natriumheparin), 20 μL 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μL 40 E/μL RNase-hæmmer (200 E/ml RNase-hæmmer), 200 μL 0,1 M spermidin (2 mM spermidin) og en EDTA-fri proteasehæmmertablet (1x).
- Lav saltvaskebuffer (komplet): Lav 1,5 ml pr. prøve på dagen for vævsopsamling. For at fremstille 10 ml buffer med lavt saltindhold kombineres 10 ml TRAP-bufferbase (fra trin 3.1.1) med 10 μL 100 mg/ml cycloheximid (100 μg/ml cycloheximid) og 20 μL 0,5 M DTT (1 mM DTT).
- Høj saltvaskebuffer (komplet): Lav 1,5 ml pr. prøve på den anden dag af TRAP-isolering. For at fremstille 10 ml buffer med højt saltindhold kombineres 10 ml højsaltbufferbase (fra trin 3.1.2) med 10 μL 100 mg/ml cycloheximid og 20 μL 0,5 M DTT.
- Udførelse af oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (TRAP)
- Den anden æggestok opsamles fra en Cyp17-NuTRAP-mus (eller anden relevant Cre-NuTRAP) og anbringes i et 1,5 ml RNasefrit rør indeholdende 100 μL iskold TRAP-homogeniseringsbuffer (fra trin 3.1.3). Hak æggestokken i otte dele i bufferen ved hjælp af selvåbnende mikrosaks.
- Brug spidser med bred boring til at overføre æggestokken og 100 μL homogeniseringsbuffer til en glas Dounce-homogenisator. Homogeniser 10x-20x med den løse støder, A. Tilsæt 400 μL TRAP homogeniseringsbuffer, vask støder, A.
- Homogenatet overføres til et 2 ml rundbundet rør. Vask Dounce-homogenisatoren med yderligere 1 ml TRAP-homogeniseringsbuffer, og overfør det vaskede volumen til det 2 ml rundbundede rør.
- Homogenatet centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Den rensede supernatant overføres til et friskt 2 ml rundbundet rør. Kassér pelleten.
- 100 μL af det rensede homogenat overføres til et friskt 2 ml rundbundet rør, og reserver som tilførsel til is.
- Resten af det rensede homogenat (fra trin 3.2.4) inkuberes med et anti-GFP-antistof (5 μg/ml) i 1 time ved 4 °C, mens ende-over-enden roteres. Inkuber inputprøven under de samme betingelser.
- I de sidste 15 minutter af inkubationen vaskes proteinet G magnetiske perler i bufferen med lavt saltindhold ved hjælp af følgende trin (3.2.8-3.2.11).
- Vortex hætteglasset med protein G magnetiske perler i 30 s for helt at resuspendere. Overfør 50 μL af protein G magnetiske perler til hver prøve (op til 10 prøver kan vaskes i et rør) til et 2 ml rundbundet rør.
- Tilsæt 500 μL buffer med lavt saltindhold til perlerne, og pipette forsigtigt for at blande. Placer røret i et magnetisk stativ i 1 min for at samle perlerne mod siden af røret. Supernatanten fjernes og kasseres.
- Fjern røret fra magnetstativet, og tilsæt 1 ml buffer med lavt saltindhold til røret. Pipette forsigtigt for at blande. Placer røret i et magnetisk stativ i 1 min for at samle perlerne mod siden af røret. Supernatanten fjernes og kasseres.
- Gentag trin 3.2.10 for i alt tre vaske. Efter den sidste vask fjernes røret fra magnetstativet, og perlerne resuspenderes i det oprindelige volumen af buffer med lavt saltindhold (50 μL pr. prøve).
- De resuspenderede vaskede perler (50 μL) overføres til antigenprøven/antistofblandingen, og de inkuberes ved 4 °C natten over, mens de roteres i en ende-over-ende-blander. Inputprøverne inkuberes ved 4 °C ved 4 °C natten over for at opretholde tilsvarende betingelser.
- Efter nattens inkubation fjernes rørene fra rotatoren, og de magnetiske perler adskilles med målribosomerne/RNA'et (positiv fraktion) fra supernatanten (negativ fraktion) ved hjælp af magnetstativet i 2,5-3 minutter. Opsug den negative fraktion, læg den i et frisk 2 ml rundbundet rør, og læg den til side på is, mens du behandler den positive fraktion.
- Der tilsættes 500 μL buffer med højt saltindhold (fra trin 3.1.5) til glasset med den positive fraktion, og der afpipetteres forsigtigt for at blandes. Placer røret på et magnetisk stativ, der holdes på is i 1 min for at adskille perlerne. Supernatanten kasseres, og tuben tages ud af magneten.
- Gentag trin 3.2.14 for i alt tre vaske. Efter den endelige vask resuspenderes perlerne i 350 μL RNA-lysebuffer suppleret med 3,5 μL 2-mercaptoethanol (BME). Inkuber glassene ved stuetemperatur, mens de blandes i 10 minutter ved 900 rpm i en digital ryster.
- Adskil perlerne fra opløsningen, der nu indeholder målribosomerne/RNA'et med et magnetisk stativ i 1 min ved stuetemperatur. Den eluerede positive fraktion (supernatant) opsamles i et frisk 1,5 ml glas, og der tilsættes 350 μL 100% ethanol. Inverter for at blande. Fortsæt til RNA-isolationen.
- Valgfrit: For at isolere RNA fra inputprøven (trin 3.2.5) og den negative fraktion (trin 3.2.13) overføres 100 μL af inputfraktionerne og de negative fraktioner til friske 1,5 ml rør. Der tilsættes 350 μL RNA-lysebuffer suppleret med 3,5 μL BME til hver prøve. Inverter for at blande. Tilsæt 250 μL 100% ethanol til hvert rør, og inverter for at blande. Fortsæt til RNA-isolationen.
- RNA-isolering
- Overfør 700 μL af den positive fraktion og eventuelt den tilførte og/eller negative fraktion til en RNA-spinsøjle. Følg producentens anvisninger for at isolere RNA fra spinsøjlen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skema over protokollerne TRAP og INTACT er vist i figur 1. Her demonstreres Cyp17-NuTRAP-musemodellens specificitet over for stromale / theca-celler i æggestokkene ved immunfluorescerende billeddannelse og RNA-Seq fra TRAP-isoleret RNA. Først blev immunofluorescensbilleddannelse af eGFP-signalet i æggestokken og lokalisering af eGFP-signalet til theca- og stromale celler udført. Kort fortalt blev 5 μm sektioner afparaffineret med en xylen- og ethanolgradient. For bedre eGFP-signalering blev eGFP-proteinet farvet ved hjælp af gedeanti-GFP primært antistof og Alexa 488 æselanti-ged sekundært antistof, og kernerne blev farvet med DAPI15. Billeder blev taget på et fluorescensmikroskop ved 20x forstørrelse (figur 2A). Dernæst blev TRAP udført på æggestokke fra 4 måneder gamle Cyp17-NuTRAP-mus for at isolere ribosombundet RNA specifikt fra theca/stromale celler. Det TRAP-isolerede RNA (positiv fraktion) og helvævs-RNA (input) blev brugt til at konstruere strengede RNA-sekventeringsbiblioteker til sekvensering på en næste generations sequencer. RNA-Seq trimning, justering og normalisering (DESeq2) blev udført, som tidligere beskrevet 7,8. Hovedkomponentanalysen (PCA) viste stærk adskillelse af input og positiv fraktion i den første komponent, hvilket tyder på forskellige transkriptomiske profiler (figur 2B). Der var 2.009 differentielt udtrykte gener mellem input og positive fraktioner, som det ses i vulkanplottet (parret t-test, Benjamini-Hochberg multipel testkorrektion FDR < 0,05, foldændring >2; Figur 2C). Af de differentielt udtrykte gener kunne berigelsen af stromale og theca-cellemarkører (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) og udtømningen af oocyt (Gdf9, Oosp1, Ooep), granulosa (Amhr2, Serpine2, Eml5), immuncelle (C1qa, C1qb, Fcerg1) og glatte muskelcellegener (Mfap5)16 observeres (figur 2D).
Figur 1: Isolering af celletypespecifikke kerner og mRNA fra Cyp17-NuTRAP-modellen ved hjælp af INTACT- og TRAP-metoderne. (A) Genereringen af Cyp17-NuTRAP-linjen opnås ved at krydse en NuTRAP-floks/flox-hun med en Cyp17iCre+/+ -han. (B) Skematisk oversigt over metoderne TRAP og INTACT til isolering af kerner og polysomer fra stromale/theca-cellerne i Cyp17-NuTRAP-musen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Validering af Cyp17-NuTRAP musemodel. (A) Immunofluorescens blev udført på paraffiniserede ovarier hos Cyp17-Cre+/−NuTRAP flox/WT og Cyp17-Cre−/−NuTRAPflox/WT-mus. eGFP-protein blev farvet ved hjælp af gedeanti-GFP primært antistof og Alexa 488 æselanti-ged sekundært antistof, og kernerne blev farvet med DAPI. Billeder blev taget på et fluorescensmikroskop ved 20x forstørrelse. (B-D) Input- og TRAP-positivt fraktions-RNA blev isoleret fra Cyp17-Cre+/−NuTRAPflox/WT-museæggestokke (n = 4), brugt til at forberede strengede RNA-Seq-biblioteker, som tidligere gjort7, og sekventeret på en parret måde. RNA-Seq trimning, justering og normalisering (DESeq2) blev udført, som tidligere gjort 7,8. (B) Hovedkomponentanalysen (PCA) af alle de udtrykte gener viste en adskillelse af TRAP-input og positive fraktioner i den første komponent (51,4% forklaret varians). (C) Vulkanplot af differentielt udtrykte gener mellem input og positive fraktioner (parret t-test, Benjamini-Hochberg multipel testkorrektion FDR < 0,05, foldændring >2). (D) Sammenligningen af den TRAP-positive fraktion med input (log2[foldændring ([ositiv fraktion/input)]) viste en samlet berigelse af stromal/theca-cellemarkørgenerne og nedbrydningen af oocyt-, granulosa-, immun- og glatmuskelcellemarkørgenerne i den TRAP-positive fraktion (ratio paired t-test, Benjamini-Hochberg multiple testing correction FDR < 0,10, n = 4). Søjlerne repræsenterer den gennemsnitlige log2[foldændring (positiv brøkdel/input)] ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NuTRAP-musemodel6 er en kraftfuld transgen mærkningsmetode til parret forhør af transkriptomet og epigenomet fra specifikke celletyper, der kan tilpasses enhver celletype med en tilgængelig Cre-driver. Her demonstrerer vi specificiteten af Cyp17-NuTRAP-musemodellen til målretning af ovarie-theca- og stromale celler. Cyp17-NuTRAP-modellen kan bruges til yderligere at belyse de theca- og stromale cellespecifikke epigenetiske mekanismer, der er involveret i æggestokkenes aldring, kræft og sygdom.
Når du vælger en Cre-driver, anbefales det at validere cellespecificiteten af det Cre-medierede NuTRAP-udtryk ved hjælp af flere ortogonale tilgange. Cyp17a1-Cre udtrykkes konstitutivt. NuTRAP-modellen kan også krydses med inducerbare Cre-linjer for at undgå forbigående ekspression af gener i ikke-målceller under udvikling. Da de fleste ovarieceller er meget følsomme over for hormonelle udsving, bør østruscyklus iscenesættelse også overvejes17.
NuTRAP-tilgangen har mange fordele sammenlignet med traditionelle cellesorteringsteknikker. For det første er cellesorteringsteknikker afhængige af oprettelsen af enkeltcellesuspensioner, hvilket kan forårsage induktion af ex vivo-aktiveringsartefakter 8. Derudover er cellesortering afhængig af celleoverflademarkører, som kan ændre sig med alder eller sygdomstilstande, hvilket sætter spørgsmålstegn ved, om populationerne af celler, der sammenlignes mellem to eksperimentelle grupper, faktisk er ækvivalente. Mærkning af celleoverflademarkører er også afhængig af identifikation af pålidelige antistoffer til immunfarvning18.
I løbet af det sidste årti har der været en udvidelse i enkeltcelle / kerner transkriptomiske 19,20,21,22,23 og epigenomiske24,25,26 teknikker til at udforske heterogeniteten af cellepopulationer. Mens disse tilgange har ført til en større forståelse af cellulær heterogenitet, lider de ofte af manglende følsomhed og genomisk dækning, hvilket kan begrænse dybden af analyser. For eksempel detekterer enkeltcelle transkriptomiske (scRNA) teknikker kun ~ 1.000-5.000 gener pr.Celle 27, mens NuTRAP-teknikken, der blev brugt i denne undersøgelse, detekterede 14.980 gener. Derudover er flere scRNA-teknikker afhængige af 3' eller 5' tagging 20,21,22,28,29,30, hvilket ikke tillader analyse af specifikke RNA-isoformer, der er tilgængelige ved hjælp af TRAP-seq-metoden.
Mens enkeltcelletranskriptomik er blevet almindelig i molekylærbiologi (gennemgået i Aldridge og Teichmann31), har det epigenetiske felt haltet bagud. De fleste enkeltcelle epigenomiske teknikker er afhængige af FACS-aflejring af celler eller mikrofluidiske teknikker efterfulgt af biblioteksforberedelse fra enkeltceller. Som sådan er gennemstrømningen for enkeltcelle epigenomiske teknikker generelt lavere end for dråbeindkapslingsmetoderne, der almindeligvis anvendes til enkeltcelle RNA-Seq32. Den nylige tilføjelse af et enkeltcelle (sc) eller enkeltkerner (sn) assay til transponerbart tilgængeligt kromatin (ATAC-Seq) til 10x genomikfamilien af enkeltcelleopløsninger repræsenterer den første dråbebaserede metode, der muliggør forhør af et epigenomisk endepunkt (kromatintilgængelighed) ved enkeltcelleopløsning. Multiplexing-teknikker, såsom CoBATCH-Seq24 til histonmodifikationer, har øget gennemstrømningen dramatisk, men ikke til niveauet for dråbebaserede tilgange. Enkeltkerner methylsekventering (snmC-Seq) er blevet udført ved hjælp af fluorescensaktiverede kerner sortering i individuelle brønde og BS-Seq bibliotek forberedelse25,26. Den hårde bisulfatkonvertering fører imidlertid til sparsom genomdækning, hvilket nødvendiggør stor genomisk binning under dataanalyse (~ 100 kb) og får den genomiske kontekst, der er nødvendig for at drage robuste videnskabelige konklusioner, til at gå tabt. NuTRAP-musemodellen muliggør følsom analyse af epigenomet og transkriptomet af specifikke celletyper.
Med hensyn til TRAP-proceduren er der nogle overvejelser for at sikre en vellykket isolering. For det første skal æggestokken skæres inden homogenisering for at sprænge den ydre membran og muliggøre fuldstændig dissociation. Æggestokken er et fibrøst væv, især hos ældre mus, hvilket gør det vanskeligt at homogenisere fuldt ud. Under optimeringen af denne protokol resulterede aggressiv homogenisering under TRAP-protokollen imidlertid i forurening af RNA-isolaterne med synlige DNA-bånd vist ved kapillærelektroforese. For at løse dette problem blev 2 mM spermidin inkluderet i TRAP-homogeniseringsbufferen for at stabilisere kernemembranen33. Derudover homogeniserede vi kun TRAP-prøverne med den løse støder A for at forhindre forstyrrelse af kernemembranen. Det er vigtigt at kontrollere RNA-prøverne på en bioanalysator eller TapeStation efter isolering for at sikre et RNA-integritetstal >7, før du fortsætter til sekventeringsapplikationer.
Til INTACT-proceduren skal æggestokken også skæres inden homogenisering. Derudover har vi fundet ud af, at et kort, lavt hastighedsspin (200 x g i 1,5 min) efter homogenisering er effektivt til fjernelse af ikke-dissocieret væv og blodkar, som det tidligere blev gjort 7,14. Hvis nukleært RNA er et ønsket endepunkt, skal en RNase-hæmmer inkluderes i INTACT-bufferne. Nuklear RNA-Seq eller RT-qPCR kan bruges til at teste cellespecificiteten af INTACT-isolationerne. Streptavidinperler har en utrolig høj affinitet for biotin, hvilket gør det vanskeligt at adskille perlerne fra biotin + kerner efter INTACT-protokollen, og dette bør overvejes, når man planlægger downstream-applikationer. Ud over at isolere celletypespecifikke kerner fra NuTRAP-modeller ved hjælp af INTACT kan kerner også sorteres baseret på eGFP-ekspression til downstream-applikationer. INTACT-proceduren til isolering af kerner kan bruges til at vurdere flere endepunkter, herunder nuklear transkriptomik, epigenomik og proteomics.
De førnævnte teknikker er gode værktøjer til vurderinger af æggestokkenes aldring. Ovarie aldring er en bekymring ikke kun fra et reproduktivt perspektiv, men også fra et sundhedsspænd perspektiv. Overgangsalderen, som er ophør af ovariefunktionen, er forbundet med accelerationen af biologiske ure34, og tidlig overgangsalder er forbundet med en kortere levetid og øget risiko for sygdomme hos kvinder35,36. Oocyt aldring er kendt for at være direkte relateret til et fald i æggestokkene fitness. Men, andre celletyper menes også at spille roller i nedgangen i æggestokkene sundhed span og en stigning i ovarie ældning og inflammation37. En bedre forståelse af, hvilke celler der er involveret i denne proces, og hvordan man bremser den, er nøglen. Selvom der er ubestridelige forskelle mellem menneskelig og murin ovariedynamik, forbliver musemodeller vigtige værktøjer til at undersøge æggestokkenes biologi. I denne sammenhæng kan Cre-NuTRAP-modellerne være nyttige værktøjer til at identificere de mest effektive celletypemål for forsøg på at bremse æggestokkenes aldring og overgangsalderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) og Presbyterian Health Foundation. Dette arbejde blev også delvist støttet af MERIT-prisen I01BX003906 og en Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) -pris ISIBX004797 fra USA (USA) Institut for Veterananliggender, Biomedicinsk Laboratorium Forskning og Udvikling Service. Forfatterne vil også gerne takke Clinical Genomics Center (OMRF) og Imaging Core Facility (OMRF) for hjælp og instrumentbrug.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al.
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
