Summary
Här presenteras ett protokoll för att initiera, underhålla och analysera hematopoetiska stamcellskulturer hos möss med användning av ex vivo polyvinylalkoholbaserad expansion, samt metoder för att genetiskt manipulera dem genom lentiviral transduktion och elektroporering.
Abstract
Självförnyande multipotenta hematopoetiska stamceller (HSC) är en viktig celltyp på grund av deras förmåga att stödja hematopoes under hela livet och rekonstituera hela blodsystemet efter transplantation. HSC används kliniskt i stamcellstransplantationsterapier, som representerar botande behandling för en rad blodsjukdomar. Det finns ett stort intresse för att både förstå mekanismerna som reglerar HSC-aktivitet och hematopoes och utveckla nya HSC-baserade terapier. Den stabila odlingen och expansionen av HSCs ex vivo har dock varit ett stort hinder för att studera dessa stamceller i ett lätthanterligt ex vivo-system. Vi utvecklade nyligen ett polyvinylalkoholbaserat odlingssystem som kan stödja långsiktig och storskalig expansion av transplanterbara mus-HSC och metoder för att genetiskt redigera dem. Detta protokoll beskriver metoder för att odla och genetiskt manipulera HSC hos möss via elektroporering och lentiviral transduktion. Detta protokoll förväntas vara användbart för ett brett spektrum av experimentella hematologer intresserade av HSC-biologi och hematopoies.
Introduction
Det hematopoietiska systemet stöder en rad viktiga processer hos däggdjur, från syretillförsel till bekämpning av patogener, genom specialiserade blod- och immuncelltyper. Kontinuerlig blodproduktion (hematopoies) krävs för att stödja blodsystemets homeostas, som upprätthålls av hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC)1. Den mest primitiva hematopoetiska cellen är den hematopoetiska stamcellen (HSC), som har unik kapacitet för självförnyelse och multilineagedifferentiering 2,3. Detta är en sällsynt cellpopulation, som främst finns i den vuxna benmärgen4, där de förekommer med en frekvens av bara ungefär en var 30 000 celler. HSC tros stödja livslång hematopoes och hjälpa till att återupprätta hematopoies efter hematologisk stress. Dessa kapaciteter gör det också möjligt för HSC att stabilt rekonstituera hela det hematopoetiska systemet efter transplantation till en bestrålad mottagare5. Detta representerar den funktionella definitionen av en HSC och utgör också den vetenskapliga grunden för HSC-transplantationsterapi, en botande behandling för en rad blod- och immunsjukdomar6. Av dessa skäl är HSC ett stort fokus för experimentell hematologi.
Trots ett stort forskningsfokus har det varit utmanande att stabilt utöka HSC ex vivo7. Vi utvecklade nyligen det första långsiktiga ex vivo-expansionsodlingssystemet för mus HSC8. Tillvägagångssättet kan expandera transplanterbara HSC med 234-899 gånger över en 4 veckors kultur. I jämförelse med alternativa tillvägagångssätt var den största förändringen i protokollet avlägsnandet av serumalbumin och dess ersättning med en syntetisk polymer. Polyvinylalkohol (PVA) identifierades som en optimal polymer för mössens HSC-kulturer8, som nu också har använts för att odla andra hematopoetiska celltyper9. Emellertid har en annan polymer som heter Soluplus (en polyvinylkaprolaktamacetat-polyetylenglykolgraftsampolymer) också nyligen identifierats, vilket verkar förbättra klonal HSC-expansion10. Före användning av polymerer användes serumalbumin i form av fetalt bovint serum, bovint serumalbuminfraktion V eller rekombinant serumalbumin, men dessa hade begränsat stöd för HSC-expansion och stödde endast kortvarig (~ 1 vecka) ex vivo-kultur 7. Det bör dock noteras att HSC-odlingsprotokoll som håller HSC i vilande tillstånd kan stödja en längre ex vivo-odlingstid 11,12.
I jämförelse med andra odlingsmetoder är en stor fördel med PVA-baserade kulturer antalet celler som kan genereras och hur lång tid protokollet kan användas för att spåra HSC ex vivo. Detta övervinner flera hinder inom experimentell hematologi, såsom det låga antalet HSC som kan isoleras per mus (bara några tusen) och svårigheten att spåra HSC över tid in vivo. Det är dock viktigt att komma ihåg att dessa kulturer stimulerar HSC-proliferation, medan in vivo HSC-poolen huvudsakligen är vilande vid ett stabilt tillstånd13. Dessutom, även om kulturerna är selektiva för HSC, ackumuleras ytterligare celltyper med kulturerna över tiden, och transplanterbara HSC representerar endast ungefär en av 34 celler efter 1 månad. Myeloida hematopoetiska stamceller verkar vara den huvudsakliga förorenande celltypen i dessa HSC-kulturer8. Ändå kan vi använda dessa kulturer för att berika HSC från heterogena cellpopulationer (t.ex. c-Kit + benmärgs HSPC14). Det stöder också transduktion eller elektroporering av HSC för genetisk manipulation14,15,16. För att hjälpa till att identifiera HSC från den heterogena odlade HSPC-populationen har CD201 (EPCR) nyligen identifierats som en användbar ex vivo HSC-markör 10,17,18, med transplanterbara HSC begränsade till CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-fraktionen.
Detta protokoll beskriver metoder för att initiera, underhålla och utvärdera PVA-baserade mus HSC-expansionskulturer, samt protokoll för genetisk manipulation inom dessa kulturer med hjälp av elektroporering eller lentiviral vektortransduktion. Dessa metoder förväntas vara användbara för en rad experimentella hematologer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök, inklusive avel och avlivning, måste utföras inom institutionella och nationella riktlinjer. Experimenten som beskrivs nedan godkändes av det brittiska inrikesdepartementet. Se materialförteckningen för en lista över alla material, reagenser och utrustning som används i detta protokoll.
1. Förbereda stamlösningar
- PVA-stamlösning
- Ta 50 ml vävnadsodlingskvalitetsvatten i en liten glasflaska (lämplig för autoklavering). Värm vattnet till nästan kokande i en mikrovågsugn.
- Väg ut 5 g PVA-pulver och tillsätt i vattnet.
OBS: Det rekommenderas att endast lösa upp 1-5 g PVA. Upplösning av större mängder kan resultera i ofullständig beredning. - Stäng locket ordentligt och skaka för att blanda. Lossa sedan locket.
OBS: Var försiktig när du öppnar igen, eftersom trycket kan förändras på grund av den förändrade vattentemperaturen. - Autoklav och låt svalna. Stäng locket ordentligt och skaka för att blanda. Gör alikvoter i sterila rör och förvara i upp till 3 månader vid 4 °C.
- Lös frystorkade cytokiner i F-12-medium innehållande 1 mg/ml PVA. Bered stamcellsfaktorn till 10 μg/ml och trombopoietin till 100 μg/ml för att generera 1:1 000 stamberedningar. Gör alikvoter i sterila rör och förvara länge vid -80 °C. Alternativt kan alikvoterna förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka.
OBS: Undvik rekonstituering av cytokiner i bovint serumalbumin på grund av den negativa påverkan på mus HSC-expansion.
2. HSC benmärgsextraktion och c-Kit + anrikning
- Dissekera lårbenen, skenbenet, bäckenen och ryggraden från nyligen avlivade 8-12 veckor gamla C57BL / 6-möss (via CO 2-kvävning och / eller cervikal dislokation) och placera benen i PBS på is.
OBS: Se till att ytor och verktyg steriliseras med 70% etanol. - Rengör benen med luddfria känsliga arbetsservetter, ta bort muskler och ryggmärg och lägg till en murbruk med ~ 3 ml PBS.
OBS: Se till att mortelstöten och morteln steriliseras med 70% etanol och tvättas sedan ut en gång med PBS. - Krossa benen med stöten utan att slipa för att minimera skjuvkrafterna. Bryt upp stora benmärgsfragment som släpps ut i PBS med en 19 G nål fäst vid en 5 ml spruta. Överför cellsuspensionen genom ett 70 μm filter till ett 50 ml koniskt rör.
- När suspensionen har överförts, upprepa med ny PBS tills benen är blekta och ingen märg syns. Sikta på en ändvolym på ~ 30 ml per mus och ~ 50 ml för två möss.
- Blanda benmärgscellerna, samla 10 μL celler och räkna med Türks lösning vid en utspädning av 1:10-1:20 med en hemocytometer.
OBS: En mus förväntas ge 2-5 × 108 hela benmärgsceller. - Snurra vid 450 × g i 5 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i kallt PBS (350 μl för en mus eller 500 μl för två möss).
- Tillsätt 0,2 μl allophycocyanin (APC) anti-c-Kit-antikropp per 10 miljoner celler och inkubera i 30 minuter i mörker vid 4 °C.
- Tillsätt 5 ml kall PBS till de inkuberade cellerna för att tvätta bort överskott av antikroppar och filtrera genom ett 50 μm filter till ett nytt 15 ml koniskt rör.
- Tvätta originalröret med 7 ml kall PBS och överför genom filtret. Om filtret täpps till, repa filterytan med en P1000-spets.
- Snurra vid 450 × g i 5 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten och suspendera pelleten på nytt i kallt PBS (350 μl för en mus eller 500 μl för två möss).
- Tillsätt 0,2 μl anti-APC-mikrokulor per 10 miljoner celler och inkubera i 15 minuter i mörker vid 4 °C. Tillsätt 12 ml steril PBS för att tvätta bort överflödiga mikrokulor.
- Snurra ner cellerna vid 450 × g i 5 minuter vid 4 °C och suspendera igen i 2 ml kall PBS. Medan cellerna snurrar i det här steget fortsätter du till steg 2.13.
- Förbered dig för kolonnanrikning genom att placera en magnetisk filtreringskolonn i magneten på en magnetisk kolonnseparator, med ett 50 μm filter ovanpå och ett 15 ml koniskt rör under.
- Kör 3 ml steril PBS genom 50 μm filter och filtreringskolonn. När PBS har gått igenom, passera cellsuspensionen genom kolonnen, följt av tre tvättar av 3 ml kall PBS varje gång. För varje tvätt, vänta tills kolonnen slutar droppa innan du lägger till nästa tvätt.
- Ta bort kolonnen från magneten och placera den ovanpå ett nytt 15 ml rör. Tillsätt 5 ml kall PBS, montera kolonnkolven på kolonnen och eluera cellerna genom att trycka på kolven.
- Blanda de c-Kit-anrikade cellerna, samla 10 μL celler och räkna med Türks lösning vid en utspädning av 1:2 med en hemocytometer. Det typiska utbytet från en mus är 2-5 × 106 c-Kit + -celler.
OBS: Vid denna tidpunkt kan cellerna ympas direkt i HSC-media eller förberedas för HSC-fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) rening.
3. Initiera cellkulturer med c-Kit-berikade HSPCs
- Förbered färskt medium (tabell 1) för det antal celler/brunnar som krävs. Frö 0,5-1 miljon celler per ml för c-Kit-berikade HSPC.
- Snurra ner de c-Kit-anrikade cellerna och resuspendera i HSC-medium vid önskad celldensitet.
- Överför cellerna till fibronektinbelagda eller negativa ytladdade plattor, vid 200 μL per 96-brunnsplatta eller 1 ml per 24-brunnsplatta.
- Placera cellerna i en vävnadsodlingsinkubator inställd på 37 °C och 5%CO2.
4. Initiera cellkulturer med FACS-renade HSC
- Bered en lämplig volym av den biotinylerade härstamningsantikroppsfläcken: 3 μl mastermix (tabell 2) per 10 miljoner celler, utspädd 1:100 i PBS.
- Snurra ner de c-Kit-berikade cellerna och resuspendera i härstamningsantikroppsfläcken i 30 minuter vid 4 °C.
- Tvätta med 10 ml steril PBS och snurra nedåt vid 450 × g i 5 min vid 4 °C.
- Bered en lämplig volym av den färska HSC-antikroppsfläcken (tabell 3): 300 μl per 10 miljoner celler. Vid sidan av denna provfärgning, förbered lämpliga färgkontrollprover för kompensation och grind.
OBS: Arbeta i en vävnadsodlingshuva med ljuset släckt när du använder färgkonjugerade antikroppar. - Resuspendera cellerna i HSC-antikroppsfläcken och inkubera vid 4 °C i 90 minuter. Blanda cellerna var 20-30 minut genom att knacka för att förhindra cellpelletering.
- Tvätta med 10 ml steril PBS och centrifugera ned vid 450 × g i 5 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten, snärta med pelleten för att störa och resuspendera i steril PBS med 0,5 μg/ml propidiumjodid (PI).
- Förbered färskt medium (tabell 1) för det antal brunnar som krävs och platta i fibronektin eller negativa ytladdade plattor (200 μL per 96-brunnsplatta eller 1 ml per 24-brunnsplatta).
- Förbered FACS-maskinen för sortering och sortera CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage-HSC direkt i mediainnehållande brunnar (se figur 1 för den standard FACS-grindstrategin som används här). Sortera upp till 200 celler per 96-brunnsplatta eller upp till 1 000 celler per 24-brunnsplattbrunn.
FACS-maskiner bör drivas av en utbildad forskare. Det rekommenderas att användare kontaktar sin lokala FACS-anläggning för att diskutera denna sorteringsstrategi om de inte har erfarenhet av FACS-isolering av HSC:er hos möss.
5. Utföra medieändringar
- För cellkulturer initierade från c-Kit-anrikade celler, börja medieförändringar efter 2 dagar. För cellkulturer initierade från FACS-isolerade HSC, börja medieförändringar efter 5 dagar.
- Förbered tillräckligt med färskt förvärmt (~ 37 °C) HSC-medium (tabell 1) för alla brunnar.
- Ta försiktigt bort plattan från vävnadsodlingsinkubatorn.
OBS: Eftersom HSPC: er på negativa ytladdade plattor lättare störs än de på fibronektin, bör extra försiktighet iakttas vid byte av medium på negativa ytladdade plattor för att undvika att störa cellkulturerna. - Använd en pipett eller vakuumpump och ta långsamt bort ~ 90% -95% av mediet från brunnmenisken.
OBS: Undvik att dra upp mediet från brunnens botten, annars kommer många celler att tas bort. - Tillsätt 200 μL (för plattor med 96 brunnar; 1 ml för plattor med 24 brunnar) färskt medium till brunnen.
- Sätt tillbaka plattan till vävnadsodlingsinkubatorn.
- Upprepa steg 5.1-5.6 var 2-3:e dag tills experimentets slutpunkt.
- För cellkulturer initierade med c-Kit-berikade HSPC (avsnitt 3), dela kulturerna i förhållandet 1:2-1:3 efter ~3 veckor. För cellkulturer initierade med FACS-renade HSC (avsnitt 4), dela kulturerna i förhållandet 1:2-1:3 efter ~3 veckor och när kulturerna är >90% sammanflytande.
OBS: Den exakta tidslinjen beror på de experimentella intressena. Dessa kulturer har karakteriserats i 4-8 veckor8, men ytterligare kulturlängder kan vara möjliga.
6. Elektroporering av odlade HSPC: er
OBS: Detta protokoll är för elektroporering av Cas9 / sgRNA-ribonukleoprotein (RNP), men kan anpassas för elektroporering av mRNA eller andra rekombinanta proteiner. Initiera kulturer med tillräckligt antal celler för att utföra detta vid önskad experimentell tidpunkt.
- Utför ett mediumbyte 1 dag före elektroporering enligt beskrivningen i avsnitt 5.
OBS: Minst en övernattningskultur före elektroporering rekommenderas. Celler odlas emellertid vanligtvis i 1-3 veckor före transduktion. - På dagen för elektroporering, sätt upp nukleofektorn. Slå på maskinen. På pekskärmen väljer du X-modulen och sedan den kyvettstorlek som används.
- Bered tillräckligt med P3-lösning (enligt tillverkarens anvisningar) för elektroporeringens skala (100 μL per kyvett eller 20 μL per mikrokyvett) och låt den balansera till rumstemperatur.
- Bered tillräckligt med färskt medium (tabell 1) för antalet brunnar som pläteras och tillsätt 500 μL medium för en 24-brunns plattbrunn eller 100 μL media till en 96-brunns plattbrunn.
- Tina upp sgRNA (förspätt till 2 μg/ml i RNasfritt vatten) på is och blanda 16 μg sgRNA med 30 μg Cas9-enzym (vid 10 μg/ml) i ett sterilt PCR-rör. Inkludera ett extra PCR-rör som endast innehåller Cas9-protein som kontroll. Blanda genom att knäppa röret och snurra sedan kort nedåt. Inkubera vid 25 °C i 10 minuter i en termocykler för att komplexa RNP och håll sedan rören på is.
OBS: Detta kan minskas femfaldigt om man utför elektroporering i mikrokyvetter. - Blanda och överför HSPC: erna för elektroporering till ett rör; samla upp 10 μl av cellerna och räkna med Türks lösning i spädningen 1:2 med en hemocytometer.
OBS: Det rekommenderas att elektroporera 1-5 miljoner celler per 100 μL kyvett (nedskalad femfaldigt för mikrokyvetten). - Snurra ner cellerna med lämpligt antal i ett 1,5 ml rör vid 450 × g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera så mycket av supernatanten som möjligt och suspendera igen med 100 μl nukleofektionsbuffert.
- Överför cellsuspensionen omedelbart till PCR-röret som innehåller den komplexbildade RNP och pipettera långsamt upp och ner för att försiktigt blanda och överföra till en 100 μL elektroporeringskyvett. Mata ut blandningen i kyvetten långsamt och i en flytande rörelse för att undvika att luftbubblor bildas i kyvetten.
- På elektroporatorn väljer du positionen för brunnarna som elektroporeras. Använd pekskärmen och välj celltypsprogrammet CD34+, människa eller skriv in pulskoden EO100. Tryck på OK .
- Överför kyvetter till elektroporatorn. Tryck på Start-knappen på pekskärmen för att starta elektroporering. Direkt efter elektroporering tillsätts 500 μL av odlingsmediet till kyvetten (100 μL om en mikrokyvett används).
- Överför försiktigt cellerna till den förberedda plattan och återgå till vävnadsodlingsinkubatorn.
- För procedurer som använder en AAV6-donatormall, lägg till vektorn omedelbart efter att cellerna har överförts till en fibronektinbelagd platta i en koncentration av 5 000 vektorer / cell.
- Efter 6-18 timmar bereds färskt medium och utför ett mediumbyte enligt beskrivningen i avsnitt 5. För denna medieförändring, ta bort endast 80% -90% av mediet.
OBS: Undvik att dra upp mediet från brunnens botten. - Analysera cellerna med flödescytometri efter 2 eller fler dagar (se avsnitt 8 för detaljer).
- Fortsätt att utföra medelförändringar varannan dag, enligt beskrivningen i avsnitt 5, tills experimentets slutpunkt har nåtts.
OBS: Redigeringshastigheter för CRISPR / Cas9 med denna metod är mycket beroende av inriktningseffektiviteten hos det designade sgRNA. Redigeringshastigheter på upp till 95% har observerats med en effektiv guide15. Riktlinjer för sgRNA-design har tidigare beskrivits någon annanstans19,20.
7. Transducera odlade HSPC med lentiviral vektor
OBS: Initiera kulturer med tillräckligt antal celler för att utföra detta vid önskad experimentell tidpunkt.
- Generera och titer lentiviral vektor (beroende på experimentella mål). Tina lentiviral vektor på is.
- Utför en medeländring (som i avsnitt 5); Blanda sedan och överför HSPC: erna för transduktion till ett rör. Samla upp 10 μl av cellerna och räkna med Türks lösning i spädning 1:2 med en hemocytometer.
OBS: Celler kan transduceras omedelbart efter plätering. Celler odlas emellertid vanligtvis i 1-3 veckor före transduktion. - Platta om den dos celler som krävs för transduktion (vanligtvis 100 000 celler per 96-brunnsplatta). Separat, platta otransducerade negativa kontrollceller.
OBS: Om du använder negativa ytladdade plattor, överför cellerna till fibronektinbelagda plattor för lentiviral vektortransduktion. - Lägg till lentiviral vektor till varje cellbrunn: lägg till 20 transduktionsenheter per cell för att uppnå ~ 30% transduktionseffektivitet. Bestäm emellertid den lentivirala vektordosen empiriskt, beroende på experimentkraven.
OBS: Se till att lentiviral vektor kasseras enligt institutionella riktlinjer. - Återför cellerna till vävnadsodlingsinkubatorn i 6 timmar. Utför sedan en mediumändring enligt beskrivningen i avsnitt 5.
Supernatanten innehåller levande virus. Kassera enligt institutionella riktlinjer. - Analysera cellerna med flödescytometri (t.ex. för GFP-uttryck) efter 2 dagar eller mer. Se avsnitt 8 för mer information.
- Fortsätt att utföra medelförändringar varannan dag, enligt beskrivningen i avsnitt 5, tills experimentets slutpunkt har nåtts.
8. Flödescytometrisk analys av HSPC-kulturer
- Bered en koncentrerad odlad ex vivo HSC-antikroppsblandning i PBS innehållande 2% FBS (tabell 4). Förvara blandningen vid 4 °C i mörker i upp till 1 månad.
OBS: Arbeta i en vävnadsodlingshuva med lamporna släckta när du använder färgkonjugerade antikroppar. - Tillsätt 2 μl koncentrerad antikroppsblandning till 50 μl celler. Inkubera i 30 minuter vid 4 °C i mörker. Vid sidan av denna provfärgning, förbered lämpliga färgkontrollprover för kompensation och grind.
- Tillsätt 200–1 000 μl PBS innehållande 2 % FBS och centrifugera vid 450 × g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort så mycket supernatant som möjligt och suspendera igen i 100-500 μL PBS innehållande 2 % FBS och 0,5 μg/ml PI.
- Ställ in flödescytometern och registrera minst 10 000 levande celler per prov.
OBS: Flödescytometrar bör drivas av en utbildad forskare. Användare måste kontakta sin lokala FACS-anläggning för att diskutera denna analys om de inte har erfarenhet av flödescytometri. - Exportera data i FCS-format och analysera data med hjälp av lämplig programvara för flödescytometrianalys. Se figur 2 för den standardgrindstrategi som används här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För FACS-rening av HSC förväntar vi oss att inom den c-Kit-anrikade benmärgen är ~ 0,2% av cellerna CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- population för unga (8-12 veckor gamla) C57BL / 6-möss (figur 1). Det är dock troligt att transgena möss eller möss i olika åldrar uppvisar olika HSC-frekvenser. Efter 4 veckors kultur förväntar vi oss att CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage- fraktionen är ~ 10% (figur 2). Dessa resultat är likartade för cellkulturer initierade från c-Kit-anrikad benmärg eller FACS-renade HSC. Efter transduktion med en GFP-uttryckande lentiviral vektor (vid 20 transduktionsenheter/cell) förväntar vi oss ~30% GFP+-celler (figur 3).
När de är sammanflytande förväntar vi oss att kulturerna ligger på ~ 2 miljoner celler / ml. Inom kulturen förväntar vi oss att se huvudsakligen små runda celler, även om det är normalt att se en liten frekvens av större runda (megakaryocytliknande) celler. Inom de cellkulturer som initieras från c-Kit-anrikad benmärg förväntas viss initial celldöd14. Cirka 50% celldöd förväntas inom de första 24-48 timmarna, innan de första medieförändringarna utförs. Initialt dödcellsskräp i dessa kulturer kommer sannolikt från celldöd inom kulturerna snarare än benskräp (från de krossade benen), eftersom c-Kit-anrikningssteget bör tömma sådant benskräp. Cellnummer återgår dock till 80% -100% av antalet seedade celler efter 1 vecka (se tabell 5 för förväntade celldensitetsvärden). Om dåliga resultat visas rekommenderar vi felsökning av protokollet (tabell 6). I detta fall kan det vara enklast att batchtesta reagens med hjälp av c-Kit-anrikad benmärgsprotokoll (avsnitt 3), eftersom detta undviker komplikationer i samband med FACS-sortering. Observera att de representativa resultaten är baserade på användningen av reagens och utrustning som beskrivs i materialförteckningen. Liknande resultat kan uppnås med hjälp av reagenser från olika leverantörer, men validering (och titrering) av nya reagenser är sannolikt nödvändig.
Figur 1: Gating-strategi för FACS-rening av HSC från c-Kit-anrikad benmärg. Sekventiell grind som används för att identifiera CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage-celler från c-Kit-berikad benmärg. Förkortningar: FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; HSC = hematopoetiska stamceller; SSC-A = sidospridningstoppare; FSC-A = spridningstoppområde framåt, FSC-W = spridningstoppbredd framåt FSC-H = spridning-topphöjd framåt, SSC-H = sidospridning-topphöjd; PI = propidiumjodid; PE = fykoerytrin; APC = allofykocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Gating-strategi för flödescytometrisk analys av odlade HSPC. Sekventiell grind som används för att identifiera CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-celler från HSPC-kulturer. Förkortningar: HSPC = hematopoetiska stam- och stamceller; SSC-A = sidospridningstoppare; FSC-A = spridningstoppområde framåt, FSC-W = spridningstoppbredd framåt FSC-H = spridning-topphöjd framåt, SSC-H = sidospridning-topphöjd; PI = propidiumjodid; PE = fykoerytrin; APC = allofykocyanin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa resultat från lentiviral vektortransduktion. Representativt GFP-uttryck efter odlad HSPC-transduktion med en GFP-uttryckande lentiviral vektor (20 transduktionsenheter/cell) vid 48 timmar efter transduktion. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; HSPC = hematopoetiska stam- och stamceller; FSC-H = spridning-topphöjd framåt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagens | Slutlig koncentration i F-12 | Volym (μL) |
| Hams F-12 medium | Ej tillämpligt | 958 |
| 100x penicillin-streptomycin-glutamin | 1x | 10 |
| 1 M HEPES | 10 mM | 10 |
| 100 mg/ml PVA-lager | 1 mg/ml | 10 |
| 100x ITSX | 1x | 10 |
| 100 μg/ml TPO-lager | 100 ng/ml | 1 |
| Buljong för 10 μg/ml SCF | 10 ng/ml | 1 |
Tabell 1: HSC-mediesammansättning. Mediereagensvolymer för 1 ml komplett medium. Förkortningar: PVA = polyvinylalkohol; SCF = stamcellsfaktor; TPO = trombopoietin; ITSX = insulin-transferrin-selen-etanolamin.
| Antikropp | Koncentration (μg/ml) | Volym (μL) |
| Ly6G/Ly6C – biotin | 0.5 | 100 |
| Ter119 – biotin | 0.5 | 100 |
| CD4 – biotin | 0.5 | 25 |
| CD8a – biotin | 0.5 | 25 |
| CD45R – biotin | 0.5 | 50 |
| CD127 – biotin | 0.5 | 50 |
| Steril PBS | Ej tillämpligt | 350 |
Tabell 2: Biotinylerad antikroppscocktail. Antikroppsvolymer för beståndet av biotinantikroppscocktailen.
| Antikropp | Koncentration (mg/ml) | Volym (μL) |
| CD34 FITC | 0.5 | 4 |
| c-Kit APC | 0.2 | 1 |
| Sca1 PE | 0.2 | 1 |
| Streptavidin APC/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 1 |
| CD48 BV421 | 0.2 | 1 |
| Steril PBS | Ej tillämpligt | 291 |
Tabell 3: Färsk HSC-antikroppscocktail. Antikroppsvolymer för den färska HSC-antikroppscocktailen. Förkortningar: PE = phycoerythrin; APC = allofykocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat.
| Antikropp | Koncentration (mg/ml) | Volym (μL) |
| c-Kit BV421 | 0.2 | 12.5 |
| Sca1 PE | 0.2 | 12.5 |
| CD150 PE/Cy7 | 0.2 | 12.5 |
| CD4 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD8 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ter119 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD127 APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD45R APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| Ly6C/Ly6G APC/Cy7 | 0.2 | 5 |
| CD201 APC | 0.2 | 5 |
| Steril PBS | Ej tillämpligt | 27.5 |
Tabell 4: Odlad HSC-antikroppscocktail (100x). Antikroppsvolymer för 100x lager av den odlade HSC-antikroppscocktailen. Förkortningar: PE = phycoerythrin; APC = allofykocyanin; FITC = fluoresceinisotiocyanat.
| Kultur | Celldensitet vid 24-48 h | % KSL vid 24-48 h | Celldensitet vid 1 vecka | % KSL vid 1 vecka |
| Färsk c-Kit+ benmärgsplätering | 0,5x106 ml-1 | 25-35% | 1-2x106 ml-1 | 50-60% |
| HSPC-elektroporering | 0,5x106 ml-1 | 25-35% | 0,5-1,5x106 ml-1 | 25-35% |
| HSPC lentivirus | 1,5x106 ml-1 | 20-25% | 1-2x106 ml-1 | 45-55% |
Tabell 5: Förväntade resultat. Förväntade celldensiteter och frekvenser av c-Kit+Sca1+Lineage-celler efter (1) sådd av c-Kit+ benmärg, (2) elektroporering och (3) lentiviral vektortransduktion baserad på sådd vid 1 × 106 celler ml-1. Förkortningar: KSL = c-Kit+Sca1+Härstamning-; HSPC = hematopoetisk stam- och stamcell.
| Utfärda | Trolig orsak/er | Lösning/ar | |||
| Flödeshastigheten för LS-kolonnen är ovanligt långsam. | LS-kolumnen är igensatt. | Ta bort kolonnen från magneten. Eluera cellsuspensionen med kolven och upprepa med ytterligare 5 ml PBS. Upprepa kolumnberikningen med en ny kolumn och ett nytt filter. | |||
| Stor mängd celldöd inom de första 7 dagarna av odlingen | Använda utgångna reagens eller reagens i felaktiga förhållanden. | Se till att regenter är i rätt koncentration och lagras korrekt. | |||
| Felaktig inkubatortemperatur. | Regelbunden service av inkubatorer och se till att inkubatorn hålls stängd så mycket som möjligt. | ||||
| Kulturkollaps efter 7 dagars kultur | Fel celltyp sorterad | Sök råd från HSC FACS-experter om sorteringsprotokoll. Validera reagenser med c-Kit-berikad benmärg. | |||
| Ofullständiga medieändringar utförs | Utför mer fullständiga medieändringar. | ||||
| Överdriven (t.ex. >50%) total celldöd efter transduktion | Lentiviral vektortoxicitet. | Minska mängden viruspartiklar som används. | |||
| Förkorta inkubationstiderna till 5 timmar. | |||||
| Överdriven (t.ex. >50%) total celldöd efter transfektion | Celler kvar i P3-lösning för länge | Återställ celler i media så snart som möjligt, elektroporera endast 2 prover åt gången och var försiktig vid pipettering (och använd pipettspetsar med bred borrning). | |||
| Pipettering för kraftigt dödar celler | |||||
| Låg transfektionseffektivitet | Nedbrytning av RNP och/eller Cas9-enzym. | Felaktig förvaring, förvara Cas9 vid -20 °C och RNA vid -80 °C (rekonstituerat med RNasfritt vatten). | |||
| Låg transduktionseffektivitet | Låg lentiviral vektoraktivitet | Titrera lentiviral vektor för specifik cellpopulation, undvik frysning/upptining av lentiviral vektor | |||
Tabell 6: Vanliga felsökningsproblem. Sammanfattning av vanliga problem och föreslagen felsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi hoppas att detta protokoll ger ett användbart tillvägagångssätt för att undersöka HSC-biologi, hematopoes och hematologi mer allmänt. Sedan den initiala utvecklingen av den PVA-baserade odlingsmetoden för FACS-renade HSCs8 har metoden utvidgats. Till exempel har metoden visat sig fungera med c-Kit berikad med benmärg och med negativa ytladdade plattor14. Dess kompatibilitet med transduktion och elektroporering har också visats14,15. In vivo-valideringen av dessa HSC- och c-Kit+ HSPC-kulturer finns i dessa publikationer, medan läsare kan hänvisa till andra publicerade protokoll för in vivo-transplantationsprotokoll21. Vi ser inga större skillnader i härstamningschimärism mellan färska och odlade HSPC efter transplantation, men rekonstitueringsstyrkan hos enskilda HSC efter ex vivo-expansion är ännu inte bestämd i detalj. Det stora antalet HSC som genereras av detta tillvägagångssätt öppnar nya sätt att förhöra HSC med hjälp av molekylära eller biokemiska analyser som kräver stora cellnummer. Dessutom, att kunna generera genetiskt modifierade HSC inom dessa odlingssystem bör göra det möjligt för oss att ytterligare undersöka mekanismerna som reglerar HSC-aktivitet och det hematopoetiska systemet. Till exempel är dessa system mottagliga för att utföra genetiska skärmar16.
Mekanistiskt förstår vi ännu inte helt varför PVA och andra polymerer kan ersätta serumalbumin och stödja effektiv HSC-expansion; vi tror att PVA åtminstone delvis ersätter serumalbumin genom stabiliserande cytokiner i media9. Dessutom verkar bristen på dåligt definierade bioaktiva föroreningar som finns i serumalbuminprodukter minska HSC-differentieringen. Användningen av syntetiska polymerer bör också bidra till att minska variabiliteten från sats till sats och störeffekterna i samband med dessa bioaktiva föroreningar när HSC ex vivo22 studeras. Det finns också mer att lära sig om varför vissa polymerer ger bättre stöd för HSC ex vivo.
Även om det redan är kraftfullt bör ytterligare optimering och karakterisering av dessa kulturprotokoll vara möjlig. I synnerhet skulle det vara lämpligt att förbättra renheten hos HSC inom dessa kulturer. Ytterligare markörer som skiljer det långsiktiga HSC-facket från dessa kulturer skulle också hjälpa till att spåra och isolera dessa celltyper. Det är också av intresse att se om detta system så småningom kan användas för att kvantifiera HSC-aktivitet ex vivo, utan behov av in vivo-transplantationsanalyser. Vi förstår ännu inte hur länge HSC kan utökas ex vivo, även om det säkert är längre än 6-8 veckor om det underhålls ordentligt8. Slutligen, medan dessa kulturer ger en användbar modell för att studera HSC hos möss, är det också viktigt att utveckla likvärdiga odlingssystem för humana HSC för att ge ett mer lätthanterligt system för att studera human HSC-biologi och hematopoies, och så småningom för att generera HSC för kliniska stamcellstransplantationsterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar WIMM Flow Cytometry Core för åtkomst till flödescytometri och WIMM Virus Screening Core för lentiviral vektorgenerering. Detta arbete finansierades av Kay Kendall Leukaemia Fund och UK Medical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
