Summary
Dette er en enkel protokoll for en byggbladskjedeanalyse ved bruk av minimale reagenser og vanlig laboratorieutstyr (inkludert en grunnleggende smarttelefon). Hensikten er å visualisere den tidlige infeksjonsprosessen av blastsykdom i laboratorier uten tilgang til avansert mikroskopiutstyr.
Abstract
Å forstå hvordan planter og patogener samhandler, og om samspillet kulminerer i forsvar eller sykdom, er nødvendig for å utvikle sterkere og mer bærekraftige strategier for plantes helse. Fremskritt i metoder som mer effektivt avbilder plantepatogenprøver under infeksjon og kolonisering, har gitt verktøy som risbladskjedeanalysen, som har vært nyttig for å overvåke infeksjon og tidlige koloniseringshendelser mellom ris og sopppatogenet, Magnaporthe oryzae. Dette hemi-biotrofiske patogenet forårsaker alvorlig sykdomstap i ris og relaterte monocoter, inkludert hirse, rug, bygg og mer nylig, hvete. Bladkappeanalysen, når den utføres riktig, gir en optisk klar planteseksjon, flere lag tykk, noe som gjør det mulig for forskere å utføre levende celleavbildning under patogenangrep eller generere faste prøver farget for spesifikke funksjoner. Detaljerte cellulære undersøkelser av bygg-M. oryzae-interaksjonen har ligget bak risvertens, til tross for den økende betydningen av dette kornet som matkilde for dyr og mennesker og som gjærede drikker. Rapportert her er utviklingen av en byggbladskjedeanalyse for intrikate studier av M. oryzae-interaksjoner i løpet av de første 48 timene etter inokulering. Bladkappeanalysen, uavhengig av hvilken art som studeres, er delikat; Forutsatt er en protokoll som dekker alt, fra byggvekstforhold og oppnåelse av en bladkappe, til inokulering, inkubasjon og avbildning av patogenet på planteblader. Denne protokollen kan optimaliseres for screening med høy gjennomstrømning ved hjelp av noe så enkelt som en smarttelefon for bildebehandling.
Introduction
Magnaporthe oryzae, risblåsoppen, infiserer et utvalg kornavlinger, inkludert bygg, hvete og ris1. Dette patogenet forårsaker ødeleggende sykdommer og utgjør en verdensomspennende trussel mot disse verdifulle avlingene, og forårsaker fullstendig avlingstap hvis det ikke kontrolleres. Mange laboratorier rundt om i verden fokuserer på risblastsykdom på grunn av sin globale trussel og dens egenskaper som en utmerket modell for plante-sopp-interaksjoner2. Det har blitt fullstendig sekvensert, og genetikken til dens infeksjonssyklus, spesielt de tidlige hendelsene, er etablert 3,4. Livssyklusen begynner med en spore som spirer på en bladoverflate, og danner den spesialiserte penetrasjonsstrukturen kalt appressorium. Appressorium trenger inn i bladvevet, og infeksjonen fortsetter med utviklingen av lesjoner som starter prosessen med sporulering og spredning av sykdom4. Forhindre noen av disse tidlige hendelsene ville drastisk hemme denne ødeleggende sykdommen. Følgelig har den nyeste forskningen på blastsykdom vært fokusert på de tidlige infeksjonstrinnene, fra de spirede konidiene som danner et appressorium til utviklingen av invasive hyfer og det biotrofiske grenseflatekomplekset (BIC)5.
Den enorme mengden forskning på blastsykdom har blitt utført i ris, selv om M. oryzae er et betydelig patogen for en rekke avlinger, og nyutviklede stammer dukker opp som en global trussel mot hvete6. Mens ris er en av de tre viktigste stiftavlingene som brukes til å mate befolkningen, sammen med hvete og mais, er bygg det fjerde kornkornet når det gjelder husdyrfoder og ølproduksjon7. Etter hvert som håndverksølindustrien vokser, øker også den økonomiske verdien av bygg. Det er klare fordeler ved å bruke M. oryzae og bygg som et patosystem for å studere blastsykdom. For det første er det stammer av M. oryzae som bare smitter bygg, samt stammer som kan infisere flere gressarter. For eksempel smitter 4091-5-8 primært bare bygg, mens Guy11 og 70-15 kan infisere både bygg og ris8. Disse stammene er genetisk like, og infeksjonsprosessen er sammenlignbar9. For det andre, under standard laboratorie- og drivhusforhold, er bygg lettere å dyrke, da det ikke har de kompliserte kravene til ris (kortfattet temperaturkontroll, høy luftfuktighet, spesifikke lysspektra). Det er også bildemessige utfordringer med ris på grunn av hydrofobisiteten til bladoverflaten, som bygg ikke viser10.
Denne protokollen presenterer en enkel metode for å isolere og effektivt utnytte byggbladskjede for mikroskopisk analyse av flere infeksjonsstadier, ved hjelp av vanlige laboratorieforsyninger og en smarttelefon for datainnsamling. Denne metoden for byggbladskjedeanalysen er tilpasningsdyktig for laboratorier over hele verden, da det krever minimale forsyninger, og gir likevel et klart bilde av den mikroskopiske interaksjonen mellom patogenet og de første cellene det infiserer. Mens patogenisitetsanalyser, for eksempel en spray eller dråpeinokulering, kan gi et makrosyn på patogenets evne til å danne lesjoner, tillater denne analysen forskeren å visualisere spesifikke trinn med tidlig infeksjon, fra pre-penetrasjonshendelser til kolonisering av epidermale celler. Videre kan forskere enkelt sammenligne infeksjon med villtype sopp til infeksjon med en mutant redusert i virulens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av eksperimentelle materialer
- Forbered havregrynagar (OMA) ved å blande havregryn til det er et fint pulver. Tilsett 25 g havregrynpulver og 15 g agar til 500 ml ddH2O, og autoklav på mediesyklus (alternativt kokes det i 20 minutter). Hell mediet i sterile 60 mm petriskåler.
MERK: Andre medietyper som induserer sporulering, for eksempel V8-agar, er akseptable for denne protokollen. - Plate M. oryzae filtrerer skjefter direkte på OMA-platene ved hjelp av steril tang, og lar dem dekke hele tallerkenen (9-12 dager). Plasser platene i en vekstinkubator ved 25 °C med 12:12 timer dag:natt-sykluser for å bidra til å indusere sporulering.
MERK: Noen mutanter vokser saktere og krever ekstra forsiktighet (f.eks. komplette medier først, deretter en overføring til OMA), og kan ta en ekstra uke for å produsere nok konidier. - Plant bygg direkte (Hordeum vulgare Lacey) frø i et fuktig vekstmedium (f.eks. jordløse pottemedier) med 10-15 frø per 6 tommers potte. Sett pottene i brett med 1-2 i vann.
- Sett byggvekstkammerforholdene til 22 °C i 12 timer (dagslys) og 19 °C i 12 timer (mørkt) ved 60 % relativ fuktighet. Fortsett å vanne fra bunnen for ikke å forstyrre frøene.
- Voks byg til det andre bladstadiet, omtrent i 14 dager. Bruk steril saks til å klippe byggplanten rett over jordlinjen. Bruk tang og barberhøvel / skalpell, kutt forsiktig bladkappen på det første bladet som er åpent i lengderetningen, og bruk tangen, fjern den fra bunnen av det andre bladet.
MERK: Rengjør verktøyene (tang, skalpell, etc.) før bruk med 75% -80% etanol. Skjeden er det tynne overhudslaget som gir feste fra første til andre blad (andre til tredje blad, etc.; se figur 1). - Legg det første bladet flatt i en steril 60 mm petriskål, som inneholder et vått papirhåndkle for å opprettholde fuktigheten inne i platen. Bruk skalpellen, kutt mesteparten av det første bladet bort fra skjeden, og la bare 0,5 i bladvevet for montering.
- Teip bladvevet til bunnen av petriskålen.
MERK: Sliren krøller seg, men dette er akseptabelt da en krøllet kappe holder conidial-dråpen lettere. - Samle 9-12 dager gamle M. oryzae-plater , og tilsett 0,5-2 ml sterilt vann til platene. Bruk en steril inokulasjonssløyfe, skrap forsiktig mycelien for å frigjøre de vedlagte konidierene. Forsiktig pipette conidial suspensjonen inn i et mikrosentrifugerør som inneholder et lite stykke osteklær for å filtrere ut store biter av mycel fra conidial suspensjonen.
MERK: Sporer kan samles så tidlig som 7 dager, hvis vekst og sporulering er tilstrekkelig til å nå ønsket sporekonsentrasjon. Innsamling kan forsinkes ikke mer enn 14 dager hvis du arbeider med en sakte voksende genetisk mutant - Ønsket sporekonsentrasjon er 5 x 10 4 sporer per ml, men et område (1 x 10 4-1 x 10 5) er akseptabelt. For høy konsentrasjon gjør det utfordrende å avbilde enkelte infeksjonssteder; Fortynn sporekonsentrasjonen med sterilt vann om nødvendig.
- Forsiktig pipette conidial suspensjonen inne i den valsede bladkappen. Start med 25 μL (dråpestørrelsen kan økes avhengig av størrelsen på skjeden, opptil 50 μL).
MERK: Det anbefales å utføre tre til fem replikater av hver mutantstamme eller bygglinje. Det er vanlig at det oppstår skade under fargeprosessen, derfor anbefales ytterligere kappreplikater. - Fyll fire eller fem 500 ml beger med ddH2O, og varm opp til damping (med mikrobølgeovn eller kokeplate). Vær forsiktig når du flytter varmtvannsbegerne. Hold lokket på petriskålen over et av de dampende begerglassene for å fange fuktighet inne i tallerkenen.
- Stable de infiserte bladkappeplatene og omgi dem med de resterende varme begerglassene. Dette skaper et fuktig, fuktig miljø, som kreves for at sporene skal spire.
MERK: Vær forsiktig når du damper lokkene for å sikre at varmt vann eller damp ikke berører mantene. - Beskytt bladkappene mot lys, dekk til med en ensfarget (svart foretrukket) gummi- eller plastboks, og la den sitte i 48 timer eller ønsket tidspunkt for avbildning.
MERK: En pappeske er ikke egnet fordi den ikke låser inn fuktighet og absorberer dampen fra varmtvannsbegerne. Et låsende plastkar fungerer godt for å inneholde fuktigheten, og det kan dekkes med svart stoff eller en større mørk beholder for å blokkere lyset.
2. Fargeprosess
- Forbered flekken som følger: Forbered en ny fortynning av 45% eddiksyre og tilsett 0,1% v / v trypanblå. Aliquot 1 ml av fargestoffoppløsningen i mikrosentrifugerør. Sett en varmeblokk eller et vannbad på 40 °C.
- Forsiktig, ved hjelp av en barberhøvel eller skalpell, kutt bladskjeden bort fra båndet. Bruk tang, plasser skjeden i mikrosentrifugerøret og sørg for at den er helt nedsenket i fargestoffløsningen. Tillat 2 timer for fargestoffet å trenge inn i bladet. Varm prøvene ved 40 °C under fargeprosessen i en varmeblokk eller et vannbad for å øke gjennomtrengningen av fargestoffet.
MERK: Kappene prøver å flyte i mikrosentrifugerøret; For å forhindre ufargede lommer av bladvev, fyll rørene, senk kappene og lukk røret. Ikke legg flere mantler i samme mikrosentrifugerør. - Skyll bladkappene forsiktig i 60% glyserol for å fjerne det ekstra fargestoffet. Tre skyll (hver i fersk glyserol) er vanligvis tilstrekkelig. Hold skjeden i glyserol til den er klar til å monteres på lysbilder.
3. Monterings- og avbildningsprosess
- Plasser skjeden på et rent glassglass og tilsett noen dråper 60% glyserol. Bruk et dissekerende mikroskop og to par tang, rull forsiktig ut skjeden, og la det inokulerte senteret vende opp. Hold sliren åpen med tangen, og legg dekselet på toppen for å forhindre at sliren krøller seg og blokkerer infeksjonsstedet.
MERK: Bladkappen er svært skjør, og disse trinnene må gjøres med forsiktighet for å forhindre skade på skjeden. - Forsegle dekselet med neglelakk for langtidsoppbevaring, eller tape for kortvarig lagring. Observer lysbildene under et sammensatt lysmikroskop.
- Ta grunnleggende bilder ved hjelp av et mikroskop og en mobiltelefon. Her ble det tatt bilder med et adapterfeste for mobiltelefoner og en smarttelefon. For Android-enheter, juster kameraprogrammet til følgende innstillinger: blits av, deaktiver Top Shot, deaktiver automatisk justering av lysstyrke og skygger, og sett bildeoppløsningen til full.
MERK: Bruk av kameraprogrammet på telefonen reduserer batterilevetiden raskere enn vanlig, så det anbefales å ha ekstern strøm. - Når mobiltelefonen er montert på mikroskopet, ta et bilde av en skala mikrometer med målet som skal brukes til å skaffe dataene. Dataene i denne studien ble samlet inn på et 40x 0.65 NA luftmål, og telefonadapteren ble montert på et 10x okulært stoff. Juster zoomen på telefonen til 2,5x, og hold den konsekvent for å opprettholde en konstant pikselstørrelse.
- Midten av skjeden huser den største konsentrasjonen av sporer og infiserer appressoria; Sikt derfor på 9-12 bilder av hver kappe for å få signifikante tall for statistisk analyse. Antall sporer og appressoria varierer basert på konsentrasjonen av påførte sporer.
4. Bildevurdering og telling ved hjelp av ImageJ (FIJI)
- Overfør bildene til en datamaskin som kjører ImageJ (FIJI). For å åpne bildene, dra og slipp filene på ImageJ-linjen.
- Still inn skalaen til bildene ved å laste inn scenemikrometerbildet og tegne en rett linje mellom to markeringer for skalaen. Åpne Angi skala, skriv inn Kjent avstand for linjen som måles, og skriv inn enheten for skalaen. På mikrometeret, i dette eksemplet, var den minste linjen 10 μm. Merk av for Sett global og trykk OK. Alle påfølgende bilder lastet vil ha samme skala.
- Hvis du vil telle appressoria, sporer eller andre objekter, velger du punktverktøyet . Deretter åpner du ROI Manager. Klikk T-tasten på tastaturet for å legge til punkter i listen. Disse interesseområdene kan lagres om nødvendig og lastes inn på nytt på det samme bildet.
- Avhengig av eksperimentelle mål, gjør ytterligere målinger, for eksempel sporelengde, appressoria størrelse og kimrørlengde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skildring av den opprinnelige arbeidsflyten for denne teknikken er vist i figur 1. Slirene ble høstet fra 14 dager gamle mottakelige "Lacey" byggplanter (H. vulgare). Conidiene ble høstet fra 10 dager gamle sporulerende M. oryzae OMA-plater, med en conidial suspensjon fremstilt ved bruk av steril ddH2O for en endelig konsentrasjon på 5 x 104 sporer per ml. Inokulumsuspensjonen ble direkte påført bladkappene, som ble festet til sterile petrisklater. Platene ble oppbevart i et varmt, fuktig kammer i 48 timer uten lys. Etter inkubasjonsperioden ble bladkappene farget med trypanblå og klargjort for avbildning.
Infeksjonssteder ble avbildet ved hjelp av en smarttelefon og smarttelefonmikroskopadapter. Minst 10 bilder ble registrert for hver av de testede stammene av M. oryzae. Forsøket ble gjentatt tre ganger for minimum 30 bilder for hver soppstamme. Figur 2A viser de representative resultatene av en vellykket kappeanalyse, sammen med ufargede og feilfargede bilder for referanse.
Avhengig av hypotesen kan disse bildene kvantifiseres og analyseres på en mengde måter. For dette eksperimentet, ved 48 timer etter inokulering, ble det totale antall levende sporer (spiresporer) talt, sammen med antall appressoria og antall vellykkede infiserte celler. En samling av 2000 tilfeldig mutageniserte M. oryzae-stammer i en bygginfiserende bakgrunn ble generert i laboratoriet. Patogenisitetsanalyser med spray- og dråpeinokulasjoner viste mange mutanter med redusert lesjonsstørrelse sammenlignet med villtype (en vanlig fenotype for M. oryzae-mutanter )11. For å skille fra hverandre disse fenotypene ble det antatt at den reduserte lesjonsstørrelsen var forårsaket av hemming av et av de tidlige infeksjonstrinnene (sporespiring, appressorial dannelse, penetrasjonspinnedannelse, initial epidermal cellekolonisering), som lettest testes via bladkappeanalysen. En lovende kandidat fra mutageneseprosjektet ble identifisert ved hjelp av en fremadrettet genetisk kalt J99A12. Denne mutanten viste ikke følsomhet for verken nitrogen-sultne eller reaktive oksygenforhold under skjermen. Under oppfølgingsforsøk produserte J99A et betydelig antall appressoria på en hydrofob overflate, men viste redusert lesjonsstørrelse på levende bygg. Ved testing ved bruk av kappeanalysen utviklet J99A vellykket appressoria og penetrasjonspinner, som trengte inn i bladkappen, men ikke produserte invasive hyfer en gang inne, noe som tyder på at infeksjonen stoppet ved penetrasjonspinnen (figur 2B). Vellykket infiserte celler ble identifisert ved tilstedeværelse av infeksiøse hyfer inne i vevet i bladskjeden. Sammenligning av antall appressoria til antall infiserte celler ga en prosentandel av vellykket infisering av appressoria. For villtype 4091-5-8 invaderte og koloniserte 87% av appressoria cellen, mens i mutanten J99A hadde bare 36% av appressoria hyfer inne i cellen12.
Figur 1: Bladskjede høstet fra 10 dager gammelt bygg og forsiktig fjernet med verktøy rengjort i etanol. Conidia oppsamles, og konsentrasjonen justeres til 0,5-1,0 x 105 per milliliter med sterilt vann. De isolerte kappene er tapet inne i en 60 cm petriskåle, og conidial-suspensjonen lastes inn i skjeden. De inokulerte prøvene holdes ved romtemperatur, i mørket, med beger av varmt vann for fuktighet. Prøvene farges i 45% eddiksyre + 0,1% trypanblå i 1-2 timer ved 40 °C, skylles deretter i 60% glyserol tre ganger i 48 timer etter inokulering. Fargede prøver monteres og avbildes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater fra fargeprotokollen. (A) Avvik fra fargeprotokollen kan gi suboptimale resultater. Varmen og eddiksyren tjener til å forsiktig myke bladvevet. Etterfargingsskyllene i 60% glyserol fjerner ikke bare overflødig flekk, men bidrar til å redusere lysspredningen forårsaket av bladet og forbedre bildekvaliteten. Skalastenger = 50 μm. (B) Representative bilder som viser robustheten i denne analysen for å se mislykket penetrasjon og påfølgende infeksjonsforsøk av J99A (pilspisser), sammenlignet med vellykkede forsøk på 4091WT som resulterte i produksjon av invasive hyfer til bladvevet (piler). Skalastenger = 50 μm. Alle bildene ble tatt 48 timer etter infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er mange ofte brukte analyser tilgjengelig for å teste M. oryzae-stammer som gir et makroskopisk nivå visuelt av en kompatibel eller inkompatibel infeksjonsrespons, for eksempel spray- eller dråpeinokulasjoner, og bruk av vurderingssystemer for å kvantifisere lesjonsstørrelser13,14. En annen vanlig analyse for M. oryzae er å teste patogenes evne til å danne sin spesialiserte penetrasjonsstruktur, apppressorium15. Beskrevet her er en enkel metode for å observere endringer i tidlige infeksjonsprosesser raskt og effektivt på cellenivå, i det mer lettvinte bygganlegget. Denne metoden er unik ved at den bruker generelt laboratorieutstyr og en smarttelefon for datafangst. Denne metoden negerer behovet for kamerautstyrte og datastyrte mikroskoper, noe som gjør denne protokollen rimelig for ethvert laboratorium. Ved hjelp av denne metoden var vi i stand til å identifisere på hvilket trinn mutert J99A-infeksjon ble stoppet, et spørsmål tidligere eksperimenter ikke har vært i stand til å avklare.
Infeksjonsprosessen av M. oryzae i ris, spesielt kolonisering av de første epidermale cellene, har blitt godt avbildet ved hjelp av fluorescerende proteiner, markører, fargestoffer, konfokal avbildning og avansert mikroskopi16. Disse typer bildebehandlingseksperimenter er dyre, tidkrevende og krever spesifikk kompetanse. Mange laboratorier, ved hjelp av homolog rekombinasjon, er i stand til å skape genetiske mutanter av M. oryzae for å analysere individuelle gens roller i infeksjonssyklusen, men har kanskje ikke tilgang til det avanserte utstyret og kompetansen som kreves for å utforske den underliggende cellebiologien. Denne protokollen er ment å bidra til å bygge bro over dette gapet, ved å bruke bare et sammensatt lysmikroskop og en smarttelefon for å ta digitale bilder og generere z-stack-type videoer av faste bladkappevev. Denne metoden gjør det mulig å avbilde noen få cellelag i vevet, og fange de invasive sopphyfene i opptil 48 timer. Bladskjeden av ris og bygg har lignende egenskaper; De er bare noen få cellelag tykke og har mindre kloroplaster, noe som gjør dem lettere å avbilde. Som nevnt ovenfor er bygg mindre hydrofob og lettere å dyrke enn ris, og mange stammer av M. oryzae kan forårsake infeksjon på ris og bygg, noe som gjør dette eksperimentet til et enkelt bytte for de mer kompliserte risanalysene.
Noen få begrensninger ved denne metoden inkluderer bruk av videofunksjonen til smarttelefonen for å samle inn z-feltdata, da z-trinnet for bildefrekvensen er ukjent. En annen begrensning er at det krever fast vev (ikke levende celler). På grunn av hastigheten og enkelheten til protokollen, kan denne begrensningen imidlertid overvinnes ved å undersøke ulike tidspunkter etter infeksjon.
Et av de mest avgjørende trinnene i protokollen er riktig farging. Feil skylling forårsaker overflødig fargestoff i lysbildepreparatet, forårsaker fargestoffmetning, og gjør patogenvevet umulig å skille fra bladvevet. I mellomtiden forhindrer underfarging patogenvevet i å kontrastere mot bladvevet.
Den nevnte metoden er tilpasningsdyktig til mange vitenskapelige spørsmål, og kan brukes til å vurdere soppmutanter, vurdere ulike grader av genetisk resistens i byggplanter, og teste effektiviteten av tidligere anvendte soppkontrollmetoder. Det er også mulig å utvide denne metoden til andre plantepatogeninteraksjoner, spesielt andre monocotbladskjeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner finansiering fra USDA-NIFA-prisen 2016-67013-24816.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , Springer. Cham. 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , Doctoral dissertation (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
