Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Разработка модели хронической травмы вращательной манжеты плеча у кролика для изучения фиброза и мышечно-жировой дегенерации

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64828
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5
1School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Institute for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 3Center for Neuromusculoskeletal Restorative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 5Department of Orthopaedics and Traumatology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

Summary

В этом исследовании подробно описаны процедуры установления хронической травмы вращательной манжеты плеча (RC) кролика. В частности, повреждение создается в подлопаточной мышце/миотендозном отделе, чтобы имитировать анатомию и патофизиологию РК человека, включая тяжелую мышечно-жировую дегенерацию (ФД). Этот протокол может быть применен для изучения травм РК и оценки регенеративной терапии.

Abstract

Патофизиология вращательной манжеты плеча кролика (RC) может привести к прогрессирующим и высокодегенеративным изменениям в связанной с ней мускулатуре и сухожилиях, что отрицательно влияет на клинически значимые параметры, такие как прочность и втягивание мышечно-сухожильного/миотендинного блока, что в конечном итоге приводит к потере функции плеча и отрицательно влияет на результаты восстановления RC. Животные модели, которые имитируют аспекты анатомии и патофизиологии РК человека, имеют решающее значение для продвижения концептуального понимания прогрессирования травмы и разработки эффективных терапевтических средств на основе тканевой инженерии и регенеративной медицины.

В этом контексте модель подлопаточной мышцы кролика (SSC) подходит из-за (i) ее анатомического сходства с костно-сухожильно-мышечной единицей человека (SSP), которая является наиболее часто повреждаемым участком RC; (ii) его патофизиологическое сходство с человеком с точки зрения фиброза и мышечно-жировой дистрофии (ФД); и (iii) его пригодность к хирургическим процедурам. Таким образом, целью данного исследования является описание хирургических техник индуцирования повреждения ССК RC. Вкратце, процедура включает в себя изоляцию SSC путем идентификации коракобрахиальной мышцы с последующим рассечением по всей толщине в месте соединения мышцы и сухожилия и обертыванием свободного конца мышечно-сухожильного соединения трубкой Пенроуза на силиконовой основе для предотвращения спонтанного повторного прикрепления. Гистологические оценки проводятся для мониторинга прогрессирования мышечной ФД через 4 недели после операции с использованием гематоксилина и эозина (H&E), а также трихромного окрашивания по Массону.

Потеря мышечной массы и ФД были очевидны через 4 недели после рассечения мышечно-сухожильного соединения SSC, как и при патофизиологических состояниях РК человека. Этот протокол демонстрирует шаги для успешного создания хронической модели травмы РК у кроликов, которая может служить мощным инструментом для изучения изменений скелетных мышц, связанных с патофизиологией РК, и помочь в разработке новых терапевтических стратегий при хроноподобных разрывах РК.

Introduction

Хронические разрывы вращательной манжеты плеча характеризуются дегенеративными изменениями в мускулатуре и сухожилиях, включая атрофию мышц, накопление жировой ткани и фиброз, которые могут поставить под угрозу исход восстановления РК и, в конечном итоге, вызвать боль и дисфункцию плеча 1,2,3,4,5 . Чтобы лучше понять патогенез RC-разрыва и улучшить результаты хирургического вмешательства, крайне важно разработать соответствующие модели животных, которые могут имитировать аспекты анатомии и патофизиологии RC человека. В частности, модели RC-травм должны соответствовать следующим критериям: (i) отсутствие спонтанного заживления после травмы; (ii) содержат значительное присутствие фиброза, мышечной атрофии и накопления жировой ткани; и (iii) иметь достаточный размер, позволяющий приблизиться к хирургическим методам, используемым у людей6.

В этом контексте подлопаточная мышца кролика (SSC) может быть использована в качестве точной и надежной животной модели для изучения патофизиологии RC, учитывая ее уникальную анатомию, патофизиологический ответ и биомеханические свойства7. Действительно, анатомия SSC RC кролика похожа на человеческую надостную мышцу (SSP) RC, которая является мышечно-сухожильной единицей, наиболее часто связанной с травмами, возникающими в результате чрезмерной нагрузки 8,9. В частности, сухожильный комплекс SSC кролика проходит через костный туннель и под коракобрахиальной мышцей, что аналогично ситуации у человека, когда сухожильный комплекс SSP проходит через субакромиальный костный туннель и под коракоакромиальной связкой7. Это анатомическое сходство приводит к тому, что у кролика ССК происходят те же движения опорно-двигательного аппарата, что и у человека, при котором сухожилие проходит под акромионом во время подъема и отведения плечевой кости 7,10.

Кроме того, патогистологические изменения, сходные с человеческими RCtears 11, наблюдались у кроликов после разрыва SSC. В частности, мышечный живот подвергается тяжелой ФД со значительной потерей мышечной массы, уменьшением площади поперечного сечения мышечных волокон и повышенным ожирением. Кроме того, Otarodifard et al. оценили биомеханические характеристики ССК кроликов после (1) однорядной, (2) двухрядной и (3) чрескостно-эквивалентной РК-репарации и обнаружили, что первоначальные биомеханические характеристики этих репараций были аналогичны РК-репарациям ТКП человека, выполненной на трупных образцах12. Таким образом, анатомическое, физиологическое и биомеханическое сходство КСК кролика с человеческим ТКП делает его полезным для моделирования травм РК.

Несмотря на то, что многие виды животных, включая крыс, мышей, собак и овец, были использованы для изучения РЦ-заболевания и восстановления 6,13,14,15, степень хронизации травмы является ключевым фактором. Это связано с тем, что разрывы RC могут протекать бессимптомно и часто могут быть диагностированы гораздо позже, когда разрыв увеличился и стал хроническим по своей природе, при этом как сухожилие, так и мышца демонстрируют тяжелую дегенерацию16,17,18. Тем не менее, в большинстве моделей восстановления RC используются модели острой травмы, при которых здоровое сухожилие пересекается, а затем немедленно восстанавливается 19,20,21,22. Это происходит в основном из соображений логистической целесообразности и технической простоты, что приводит к небольшому количеству исследований, которые изучают патофизиологию РК в хронических условиях. Более того, некоторые животные модели могут обладать свойствами, которые препятствуют их использованию в исследованиях хронического РК.

Например, несмотря на то, что крыса широко использовалась для моделирования разрыва РЦ и вмешательства, отсутствие значительного накопления жира после травмы контрастирует с состоянием человека, а ее небольшой размерзатрудняет повторные хирургические процедуры. Кроме того, несмотря на то, что Gerber et al. использовали подостную мышцу овец для изучения мышечной атрофии и ФД после хронического разрыва RC24, существует некоторое анатомическое сходство между подостной мышцей овец и человеческим SSP, а также многочисленные логистические проблемы для изучения и размещения такой крупной модели животного. Кроме того, Gerber et al. разработали модель отсроченной RC-травмы у овец, освободив поверхностную головку подостной мышцы и сухожилия, чтобы имитировать особенности хронического RC-разрыва, а затем оценили эффективность различных методов восстановления сухожилия через 4-6 недель. К сожалению, эта хроническая модель овцы обладала ограничением, заключающимся в том, что конец высвобожденного сухожилия стал неотличим от рубцовой ткани во время второй хирургическойпроцедуры.

Coleman et al. также разработали модель хронического разрыва RC у овец, покрыв пересеченный конец сухожилия синтетической мембраной во время первоначальной операции, что позволило диффузировать питательные вещества и эффективно свести к минимуму образование рубцовой ткани вокруг поврежденной ткани, одновременно улучшая различение между сухожилием и рубцовой тканью26. Между тем, Turner et al. предположили, что отсроченное восстановление должно быть проведено в течение 4 недель, поскольку прямое повторное прикрепление редко происходит при массивнойретракции сухожилия. В совокупности эти исследования способствовали созданию воспроизводимых и надежных протоколов для успешного создания хронической модели травмы ССК у кроликов.

В этом протоколе установлена хроническая модель RC-травмы кроликов на 4-й неделе, при которой патологические изменения, связанные с фиброзом и FD-опосредованной атрофией мышц, могут быть изучены с помощью гистологических оценок. В частности, обертывание свободного конца мышечно-сухожильного соединения с помощью трубки Пенроуза на силиконовой основе во время первичной операции позволяет четко идентифицировать ткани РК во время второй хирургической процедуры и, следовательно, способствует безопасному восстановлению для изучения заживления РК с аугментацией каркаса и без нее. В целом, хроническая модель SSC кролика может лучше имитировать патофизиологию РК и предъявлять минимальные технические и логистические требования.

Protocol

Все процедуры должны проводиться с использованием стерильной хирургической техники в соответствующим образом оборудованном помещении, предназначенном для операций на животных, в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по этике экспериментов на животных института. В настоящем исследовании операции на кроликах проводились в соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по этике экспериментов на животных Китайского университета Гонконга.

1. Хирургическое вмешательство

  1. Для подготовки операционного поля предварительно разогрейте грелку и наложите на нее стерильные хирургические простыни, чтобы поддерживать температуру тела кролика. Затем разложите стерилизованные хирургические инструменты и расходные материалы (как указано в таблице материалов) и организуйте их в соответствии с предпочтениями хирурга.
  2. Индуцировать анестезию путем внутримышечного введения 35 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина новозеландским белым кроликам (массой от 3,5 до 4,5 кг, возраст около 5-6,5 месяцев; в этом исследовании использовались два самца и одна самка). Затем подтвердите анестезию с помощью теста на сжатие лапы и/или хвоста.
  3. Если требуется дополнительная анестезия для поддержания хирургической плоскости, вводят внутривенно 10 мг/кг кетамина и 3 мг/кг ксилазина через краевую ушную вену28 и контролируют частоту дыхания животного через регулярные промежутки времени в 5-10 мин.
  4. Чтобы подготовить операционное окно, побрейте предполагаемое место разреза (участок кожи, поверхностный от мышечно-сухожильного блока SSC) и очистите его тремя чередующимися аппликациями бетадина и 70% спирта. С помощью ватного тампона нанесите бетадин и 70% спирт круговыми движениями (изнутри наружу). Используйте глазную мазь, чтобы глаза кролика оставались влажными и смазанными. Вводят 20 мг/кг цефалексина внутримышечно в качестве противоинфекционного средства.
  5. Сделайте разрез кожи на 3-4 см ниже ключицы, разделите дельтопекторальный интервал с помощью хирургического скальпеля No 11 и втяните, чтобы получить доступ к плечу (рис. 1А,Б).
  6. Чтобы найти мышечно-сухожильный блок SSC, сначала определите коракобрахиальную мышцу (как ткань, покрывающую прикрепление сухожилия SSC) и разделите ее. После этого определите сухожилие SSC и вставьте зажим под прямым углом, чтобы обнажить все сухожилие SSC в месте его установки на меньшую бугристость плечевой кости (рис. 1C).
  7. Перед нанесением травмы изолируют мышцу-сухожилие SSC (рис. 1D) и вводят интраоперационный анестетик (0,2 мг/кг 0,5% бупивакаина) локально вблизи места рассечения. Оберните мышечно-сухожильный блок SSC в трубку Пенроуза на основе силикона (Рисунок 1E), чтобы предотвратить нежелательное прикрепление к окружающим тканям и облегчить последующее извлечение тканей.
  8. Чтобы вызвать травму, создайте рассечение на всю толщину в месте соединения мышцы и сухожилия с помощью хирургического скальпеля No 11 (рис. 1F). При необходимости остановите кровотечение, надавливая куском марли, и используйте физиологический раствор для орошения раны по мере необходимости.
  9. Чтобы закрыть рану, используйте шов из полигликолевой кислоты (PGA) 4-0, чтобы приблизить мышечную ткань дельтовидной мышцы (Рисунок 1G), и нейлоновый шовный материал 4-0, чтобы закрыть рану кожи (Рисунок 1H).
  10. Послеоперационный уход путем подкожного введения 0,03 мг/кг бупренорфина в качестве анальгетика (один раз сразу после операции и два раза в день в течение следующих 48 ч29).
  11. Дайте кроликам прийти в себя на закрытой грелке и наложите мягкий ошейник, чтобы предотвратить нежелательное поведение, включая членовредительство, облизывание хирургических участков и снятие швов (рисунок 1I).
  12. Следите за изменениями в весе и поведении животных. Сообщайте ветеринарному врачу о любом снижении массы тела более чем на 10% и сильной боли, которую невозможно контролировать (оценивается на основе пяти поведенческих действий: стягивание орбиты, уплощение щек, изменение формы ноздрей, изменение положения усов, а также изменение формы и положения ушей), чтобы определить, требуется ли вмешательство, такое как ранняя эвтаназия.

2. Сбор образцов

  1. Усыпляют кроликов в 4 недели с момента травмы. Обезболивают кроликов и дают смертельную дозу пентобарбитала натрия (более 60 мг/кг). Подтвердите смерть с помощью торакотомии.
  2. Определите головку плечевой кости и хирургически иссеките ее, сохранив при этом большой и малый бугорки и все прикрепления мягких тканей. Зафиксировать 4% параформальдегидом (PFA) в течение 72 ч при 4 °C, прежде чем перенести в раствор 10% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 1 месяца при комнатной температуре (со сменой среды каждые 72 ч) для декальцинации кости.
  3. После декальцинации образцы подвергают стандартной гистологической обработке с использованием дифференцированного обезвоживания этанола, введения парафина, гистологического среза (срезы по 8 мкм) и окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и трихромными растворами Массона30,31,32.
  4. Получение изображений с помощью вертикального микроскопа с 10-кратным увеличением.
  5. Выполните полуколичественную оценку трихромных изображений H&E и Masson, измерив площадь и процентное содержание мышц, фиброзной ткани и жира в мышцах, как описано ранее33,34 с помощью программного обеспечения для графического дизайна по выбору. В этом примере используется программное обеспечение Adobe Photoshop (https://www.adobe.com).
    1. Выделите область определенного цвета, представляющую определенный тип ткани, с помощью инструмента «Волшебная палочка » (красный — мышечная ткань, синий — фиброз, белый — жир).
    2. Щелкните пункты меню Выбрать | Инверсия | Сохранить выделенную область | Назовите раздел.
    3. Подсчитайте количество пикселей в отмеченной области, щелкнув пункты меню Окно | Журнал измерений | Record Measurement (Измерение записи ), чтобы записать эти значения пикселей и вручную рассчитать процентное соотношение выбранных типов тканей.

3. Статистический анализ

  1. Для получения гистологических данных выполните статистический анализ с помощью выбранного аналитического программного обеспечения. Выполните t-критерий Стьюдента для сравнения двух независимых образцов между контрольной и пострадавшей группами.
  2. Выразите данные в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения. Значение p , равное <0,05, считать статистически значимым.

Representative Results

Для оценки хронизации патологии РК после рассечения мышечно-сухожильных единиц ССК была охарактеризована общая морфология тканей и клеточные изменения с помощью общей оценки и гистологического анализа (H&E и трихромное окрашивание по Массону, соответственно) через 4 недели после травмы (рис. 2, рис. 3 и рис. 4 ). Репрезентативные изображения грубой морфологии тканей показали появление белой жировой ткани в поврежденных мышцах SSC, которая отсутствовала в контрольной группе (рис. 2). Окрашивание H&E подтвердило потерю мышечной клеточности и организации, которая была заменена большим количеством адипоцитов (пустые пространства, окруженные тонкими краями цитоплазмы, содержащими сжатые ядра) в поврежденных мышцах SSC по сравнению с контрольной группой (рис. 3A).

Полуколичественная оценка изображений H&E показала высокую степень внутримышечного присутствия адипоцитов в поврежденных мышцах SSC (36,5% ± 8,5%) по сравнению с контрольной группой (0,69% ± 0,18%) (рис. 3B). Трихромное окрашивание по Массону также подтвердило мышечную атрофию и дезорганизованное расположение коллагеновых волокон в поврежденных мышцах SSC по сравнению с контрольной группой (рис. 4A). Полуколичественная оценка трихромных изображений Массона показала снижение мышечной клеточности поврежденных мышц ССК (41,3% ± 2,6%) по сравнению с контрольной группой (99,2% ± 0,16%) (рис. 4Б). Несмотря на то, что дальнейшая полуколичественная оценка не показала каких-либо существенных различий в формировании фиброзной ткани между поврежденными мышцами SSC (22,3% ± 13,1%) и контрольной группой (0,07% ± 0,05%), в поврежденных мышцах SSC наблюдалась высокая степень фиброза (рис. 4C). В совокупности общая морфология тканей и гистологический анализ показали, что у травмированного кролика наблюдалась тяжелая мышечная атрофия, накопление жира и фиброз, которые являются известными признаками хронической патофизиологии РК.

Figure 1
Рисунок 1: Хирургическая процедура при хронической модели повреждения мышцы и сухожилия SSC. (А) Было создано хирургическое окно, и анатомические ориентиры, такие как плечевая кость, головка плечевой кости и ключица, были идентифицированы путем пальпации. (Б) Разрез кожи диаметром 3,0 см был сделан ниже ключицы. (C) Коракобрахиальная мышца была расщеплена, чтобы обнажить мышцу SSC. (D) Мышечно-сухожильная единица SSC была изолирована. (E) Для обертывания мышечно-сухожильной ткани SSC использовали дренаж пенроуза на основе силикона. (F) Пересечение мышцы-сухожилия SSC. (G) Коракобрахиальная мышца была реаппроксимирована с помощью швов PGA. (H) Разрез кожи был закрыт нейлоновыми швами. (I) После операции кроликам дали мягкий ошейник. Сокращения: SSC = subscapularis; PGA = полигликолевая кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Общая морфология репрезентативных мышц SSC. Черные стрелки обозначают белые жировые ткани. Аббревиатура: SSC = subscapularis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Гистологический анализ модели хронического РЦ через 4 недели. (A) Репрезентативные гистологические изображения, окрашенные H&E, показали атрофические мышечные волокна и скопление адипоцитов. (B) Количественная оценка процента накопления поврежденного мышечного жира. n = 3 кролика. Столбцы погрешности указывают на SEM.*, статистически значимое (p≤ 0,05). Масштабные линейки = 5 000 мкм (А, левый столбец), 600 мкм (А, правый столбец). Сокращения: SSC = subscapularis; RC = вращательная манжета плеча; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Гистологический анализ хронической модели РЦ-травмы через 4 недели. (А) На изображениях Массона, окрашенных трихромом, был обнаружен значительный фиброз. Волокнистая соединительная ткань окрашивается в синий цвет. (B) Количественная оценка доли мышечной и (C) фиброзной ткани. n = 3 кролика. Столбцы погрешности указывают на SEM.*, статистически значимое (p≤ 0,05). Масштабные линейки = 5 000 мкм (А, левый столбец), 200 мкм (А, правый столбец). Сокращения: SSC = subscapularis; RC = вращательная манжета плеча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Воспроизводимая и физиологически релевантная животная модель дает возможность углубить понимание патогенеза заболевания, оценить результаты клинической терапии, а также усовершенствовать и развить хирургические методы лечения35. В этом исследовании была создана надежная и точная модель SSC кролика, которая имитирует аспекты анатомии и патофизиологии RC человека. Разрывы RC связаны с прогрессирующими и, вероятно, необратимыми мышечно-дегенеративными изменениями, приводящими к снижению потенциала заживления. Например, Ko et al. показали, что повторное прикрепление ТКП кролика через 6 недель не обратило вспять мышечную атрофию или ФД в последующие 6 недель. Такая FD-опосредованная мышечная атрофия влияет на несколько важных клинических параметров, включая силу сухожилий и диапазон движений суставов, что может повлиять на исходы хирургического вмешательства36,37.

Протокол, установленный здесь, показал значимые хронические признаки после рассечения мышечно-сухожильных единиц SSC. В частности, эти изменения включают заметное уменьшение мышечной массы и увеличение содержания жира и фиброзной ткани (Рисунок 2, Рисунок 3 и Рисунок 4). Эти результаты согласуются с дегенеративными изменениями, зарегистрированными при разрывах РЦ у человека38. В последние годы крыса стала одной из наиболее интенсивно изучаемых животных моделей РЦ и травм из-за ее высокого анатомического сходства как с человеческими, так и с крысиными SSP, путешествующими под акромионом38,39,40. Тем не менее, следует отметить, что часть ТКП крысы, которая проходит под акромиальной дугой, является мышечной, а не сухожильной, как у человека41. Самое главное, что Barton et al. обнаружили отсутствие значительного накопления жира после отслоения сухожилий SSP у крыс23, что контрастирует с состоянием человека42. Таким образом, считается, что комплекс SSC кролика может обеспечить подходящую модель для имитации хронического разрыва RC у людей.

Чтобы обеспечить воспроизводимость этой модели, при выполнении данного протокола стоит отметить два момента. Во-первых, после пересечения мышечно-сухожильных единиц свободный конец пересеченного сухожилия может подвергаться риску образования спаек, что может затруднить извлечение сухожилия для последующих манипуляций. Чтобы избежать этой проблемы, была использована нерассасывающаяся силиконовая трубка для обмотки свободного конца соединения мышцы и сухожилия после рассечения, чтобы избежать спонтанного прилипания к окружающим тканям, а также спонтанного заживления (рис. 1E). Кроме того, во время второй процедуры вмешательства (т.е. для выполнения надежной репарации; данные не показаны) можно четко идентифицировать путем обертывания конца поврежденных тканей во время первоначальной операции. Эта методика экономична, эффективна и может быть легко применена в хирургии43. Во-вторых, кролики являются очень чувствительным видом, который может демонстрировать пагубное поведение после операции. Чтобы избежать таких проблем, настоятельно рекомендуется также использовать мягкий ошейник, чтобы предотвратить нежелательное поведение, включая членовредительство, облизывание хирургических участков и снятие швов (рисунок 1I). По сравнению с коммерчески обычными электронными ошейниками, изготовленными из жесткого пластика, самодельный мягкий ошейник не вызывал никаких повреждений кожи или других побочных эффектов, которые влияли бы на благополучие животных или качество научных исследований. В совокупности такие шаги имеют решающее значение для создания точно воспроизводимой модели RC-травмы кролика и дают возможность для изучения стратегий регенеративной репарации.

Для изучения патофизиологии и заживления сухожилий на животной модели необходимо создать отчетливую и воспроизводимую травму, а также тщательно выбрать точки времени исследования. Подавляющее большинство исследований повреждений и заживления сухожилий было выполнено на полностью пересеченных сухожилиях животных44, поскольку рассечение является простой процедурой, которая обладает высокой воспроизводимостью и может адекватно имитировать клинический сценарий45,46. Huegel et al. показали, что повреждение частично пересеченного сухожилия было менее серьезным, чем повреждение полностью пересеченного сухожилия, а иммобилизация оказывала пагубное влияние на механику сухожилия, включая увеличениежесткости сустава. Для оценки атрофии и ФД, которые наблюдаются при массивном разрыве RC, необходимо определить экспериментально наблюдаемые характерные моменты времени. Гупта и др. валидировали модель RC-травмы у самцов кроликов и наблюдали мышечную атрофию через 2 и 6 недель, с повышенным содержанием жира в более поздние моменты времени (менее 5% содержания жира через 2 недели по сравнению с более чем 10% содержанием жира через 6 недель), что согласуется с патологическим процессом, наблюдаемым приразрывах RC у человека. В этом исследовании массивный разрыв RC был создан путем рассечения мышечно-сухожильной единицы SSC у самцов и самок кроликов в течение 4 недель, что привело к SSC muscle FD (содержание жира 36,5%). Таким образом, 4-недельная временная точка подходит для генерации SSC мышечного FD у самцов и самок новозеландских белых кроликов.

У этого исследования есть несколько ограничений. К ним относятся: (i) этапы, связанные с созданием модели на животных, такие как относительно короткий период времени и потенциально воспалительные материалы (трубки Пенроуза на основе силикона) для получения хронической травмы; (ii) характеристика и анализ моделей животных, например, отсутствие анализа походки и электромиографии для оценки кинематики суставов и создания сократительной силы мышц; и (iii) сравнение моделей животных, например, отсутствие сравнения с другими местами RC-травм.

С точки зрения генерации модели, травмы РК у человека обычно включают прогрессирующую атрофию и ФД, которые могут возникать в течение нескольких лет, что относительно дольше, чем 4-недельный временной отметка, описанный здесь. Это считается приемлемым, так как животная модель, которая генерирует около 36,5% внутримышечного жира за относительно короткий промежуток времени, будет удобной с точки зрения логистики и может быть продлена при необходимости. Кроме того, биосовместимость имплантатов на основе силикона, таких как трубки Пенроуза, была источником давних споров из-за сообщений о клеточном иммунном ответе и воспалении47; таким образом, альтернативный инертный материал, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), может быть заменен для обмотки резецированного сухожилия при проведении исследований RC, связанных с воспалением.

С точки зрения характеристики и анализа животных моделей, отсутствие анализа походки49 и электромиографических исследований50 может ограничить результаты исследования качественными гистологическими данными. Эти аспекты могут быть рассмотрены в будущих исследованиях с использованием видеоанализа движения51 и поверхностной электромиографии50 для получения количественных данных о кинематике плечевого сустава и работе RC-мышц.

С точки зрения сравнения моделей, поскольку сухожилия SSP и подостной мышцы у кроликов также широко использовались для исследований RC, сравнение тяжести травмы, включая FD среди этих различных участков травмы, в будущем позволит выявить дополнительные участки для оптимизации модели.

Таким образом, в этом исследовании был разработан протокол моделирования хроноподобных травм РЦ у самцов и самок кроликов. Данная модель удобна для исследователей своей простотой (транссекция) и относительно коротким периодом индуцирования хроники (4 недели) при формировании большой степени (36,5%) внутримышечной ФД. Таким образом, ожидается, что этот протокол поможет исследователям в изучении патофизиологии РК, а также будет способствовать разработке новых терапевтических средств для восстановления и регенерации мышц и сухожилий.

Disclosures

У авторов нет конкурирующих интересов, которые они могли бы декларировать.

Acknowledgments

Исследование Дай Фэй Элмер Кер финансируется Бюро по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Гонконга (Фонд здравоохранения, медицины и исследований: 08190466), Комиссии по инновациям и технологиям, САР Гонконг (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK программы), Совет по исследовательским грантам Гонконга, САР Гонконг (Early Career Scheme Award: 24201720 и General Research Fund: 14213922) и Китайский университет Гонконга (Faculty Innovation Award: FIA2018/A/01). Исследование Дэна Вана финансируется Бюро по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Гонконга (Health Medical and Research Fund, 07180686), Комиссии по инновациям и технологиям САР Гонконг (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK программы) и Совет по исследовательским грантам Гонконга, САР Гонконг (Общий исследовательский фонд: 14118620 и 14121121).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical tools
4-0 Poly glycolic acid (PGA) e-Sutures GBK884
Toothed Adson forceps Taobao, China
Fine scissors  Taobao, China
Hemostatic forceps Taobao, China
Needle holders Taobao, China
Surgical scalpel with handle Taobao, China No. 11 blade
Suture (4-0 Nylon) Taobao, China 19054 Either nylon or silk sutures are acceptable for skin closure. Each suture has its own advantages and disadvantages and users are advised to choose one according to their preference.
Surgical accessories
Cotton balls Taobao, China
Gauze Taobao, China
Razor Taobao, China
Surgical heating pad Taobao, China
Surgical lamp
Syringe with needles Taobao, China 1 mL, 5 mL, 10 mL
Drugs
Buprenorphine LASEC, CUHK 0.12 mg/kg
Bupivacaine Sigma-Aldrich b5274-5g 1-2 mg/kg
Cephalexin Santa Cruz Biotechnology sc-487556 20 mg/kg
Ketamine  LASEC, CUHK 35 mg/kg
Sodium pentobarbital LASEC, CUHK more than 60 mg/kg
Xylazine LASEC, CUHK 5 mg/kg
Equipment
Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope Nikon Instruments Inc, USA
Software
Adobe Photoshop 20.01 Adobe Inc, USA
Other reagents 
Betadine Taobao, China 5%
Ethanol Taobao, China 70%
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS-1KG 10%
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713 4%
Silicone tubing Easy Thru, China ISO13485
Saline Taobao, China
Histological staining reagents
Eosin Stain Solution Sigma-Aldrich R03040 5% Aqueous
Hematoxylin Solution Sigma-Aldrich HHS32
Trichrome Stain (Masson) Kit Sigma-Aldrich HT15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goutallier, D., Postel, J. -M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. -C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre-and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. 304 (304), 78-83 (1994).
  2. Itoigawa, Y., Kishimoto, K. N., Sano, H., Kaneko, K., Itoi, E. Molecular mechanism of fatty degeneration in rotator cuff muscle with tendon rupture. Journal of Orthopaedic Research. 29 (6), 861-866 (2011).
  3. Mal Kim, H., et al. Relationship of tear size and location to fatty degeneration of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (4), 829-839 (2010).
  4. Melis, B., DeFranco, M. J., Chuinard, C., Walch, G. Natural history of fatty infiltration and atrophy of the supraspinatus muscle in rotator cuff tears. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468 (6), 1498-1505 (2010).
  5. Li, K., Zhang, X., Wang, D., Tuan, R. S., Ker, D. F. E. Synergistic effects of growth factor-based serum-free medium and tendon-like substrate topography on tenogenesis of mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. , 146 (2023).
  6. Derwin, K. A., Baker, A. R., Codsi, M. J., Iannotti, J. P. Assessment of the canine model of rotator cuff injury and repair. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S140-S148 (2007).
  7. Grumet, R. C., Hadley, S., Diltz, M. V., Lee, T. Q., Gupta, R. Development of a new model for rotator cuff pathology: The rabbit subscapularis muscle. Acta Orthopaedica. 80 (1), 97-103 (2009).
  8. Renström, P., Johnson, R. J. Overuse injuries in sports. Sports Medicine. 2 (5), 316-333 (1985).
  9. Hertel, R., Lambert, S. M. Supraspinatus rupture at the musculotendinous junction. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 432-435 (1998).
  10. Oh, J. H., Chung, S. W., Kim, S. H., Chung, J. Y., Kim, J. Y. Neer Award: Effect of the adipose-derived stem cell for the improvement of fatty degeneration and rotator cuff healing in rabbit model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 23 (4), 445-455 (2013).
  11. Gupta, R., Lee, T. Q. Contributions of the different rabbit models to our understanding of rotator cuff pathology. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S149-S157 (2007).
  12. Otarodifard, K., Wong, J., Preston, C. F., Tibone, J. E., Lee, T. Q. Relative fixation strength of rabbit subscapularis repair is comparable to human supraspinatus repair at time 0. Clinical Orthopaedics and Related Research. 472 (8), 2440-2447 (2014).
  13. Liu, X., Manzano, G., Kim, H. T., Feeley, B. T. A rat model of massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 588-595 (2011).
  14. Liu, X., et al. A mouse model of massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 94 (7), 41 (2012).
  15. Neer,, et al. Award 2007: Reversion of structural muscle changes caused by chronic rotator cuff tears using continuous musculotendinous traction. An experimental study in sheep. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 18 (2), 163-171 (2009).
  16. Warner, J. J., Parsons, I. M. Latissimus dorsi tendon transfer: A comparative analysis of primary and salvage reconstruction of massive, irreparable rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 10 (6), 514-521 (2001).
  17. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 86 (2), 219-224 (2004).
  18. Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
  19. Carpenter, J. E., Thomopoulos, S., Flanagan, C. L., DeBano, C. M., Soslowsky, L. J. Rotator cuff defect healing: A biomechanical and histologic analysis in an animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (6), 599-605 (1998).
  20. Jal Soslowsky, L., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: Role of extrinsic and overuse factors. Annals of Biomedical Engineering. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  21. Thomopoulos, S., et al. The localized expression of extracellular matrix components in healing tendon insertion sites: An in situ hybridization study. Journal of Orthopaedic Research. 20 (3), 454-463 (2002).
  22. Su, W., et al. Effect of suture absorbability on rotator cuff healing in a rabbit rotator cuff repair model. The American Journal of Sports Medicine. 46 (11), 2743-2754 (2018).
  23. Barton, E. R., Gimbel, J. A., Williams, G. R., Soslowsky, L. J. Rat supraspinatus muscle atrophy after tendon detachment. Journal of Orthopaedic Research. 23 (2), 259-265 (2005).
  24. Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: An experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
  25. Gerber, C., Schneeberger, A. G., Perren, S. M., Nyffeler, R. W. Experimental rotator cuff repair. A preliminary study. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 81 (9), 1281-1290 (1999).
  26. Hal Coleman, S., et al. Chronic rotator cuff injury and repair model in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 85 (12), 2391-2402 (2003).
  27. Turner, A. S. Experiences with sheep as an animal model for shoulder surgery: strengths and shortcomings. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S158-S163 (2007).
  28. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder MA, Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  29. Cooper, C. S., Metcalf-Pate, K. A., Barat, C. E., Cook, J. A., Scorpio, D. G. Comparison of side effects between buprenorphine and meloxicam used postoperatively in Dutch belted rabbits (Oryctolagus cuniculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (3), 279-285 (2009).
  30. Eal Ker, D. F., et al. Functionally graded, bone-and tendon-like polyurethane for rotator cuff repair. Advanced Functional Materials. 28 (20), 1707107 (2018).
  31. Toumi, H., et al. Regional variations in human patellar trabecular architecture and the structure of the proximal patellar tendon enthesis. Journal of Anatomy. 208 (1), 47-57 (2006).
  32. Noor, R. A. M., Shah, N. S. M., Zin, A. A. M., Sulaiman, W. A. W., Halim, A. S. Disoriented collagen fibers and disorganized, fibrotic orbicularis oris muscle fiber with mitochondrial myopathy in non-syndromic cleft lip. Archives of Oral Biology. 140, 105448 (2022).
  33. Wang, D., et al. Growth and differentiation factor-7 immobilized, mechanically strong quadrol-hexamethylene diisocyanate-methacrylic anhydride polyurethane polymer for tendon repair and regeneration. Acta Biomaterialia. 154, 108-122 (2022).
  34. Wang, D., et al. Combinatorial mechanical gradation and growth factor biopatterning strategy for spatially controlled bone-tendon-like cell differentiation and tissue formation. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
  35. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, (2016).
  36. Safran, O., Derwin, K. A., Powell, K., Iannotti, J. P. Changes in rotator cuff muscle volume, fat content, and passive mechanics after chronic detachment in a canine model. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 87 (12), 2662-2670 (2005).
  37. Gerber, C., Fuchs, B., Hodler, J. The results of repair of massive tears of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 82 (4), 505-515 (2000).
  38. Longo, U. G., Berton, A., Khan, W. S., Maffulli, N., Denaro, V. Histopathology of rotator cuff tears. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 19 (3), 227-236 (2011).
  39. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 375-380 (1998).
  40. Soslowsky, L. J., Carpenter, J. E., DeBano, C. M., Banerji, I., Moalli, M. R. Development and use of an animal model for investigations on rotator cuff disease. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 5 (5), 383-392 (1996).
  41. Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. 92 (13), 2270-2778 (2010).
  42. Gladstone, J. N., Bishop, J. Y., Lo, I. K., Flatow, E. L. Fatty infiltration and atrophy of the rotator cuff do not improve after rotator cuff repair and correlate with poor functional outcome. The American Journal of Sports Medicine. 35 (5), 719-728 (2007).
  43. Chen, W. F., Kim, B. -S., Lin, Y. -T. Penrose drain interposition-A novel approach to preventing adhesion formation after tenolysis. The Journal of Hand Surgery. Asian-Pacific Volume. 27 (1), 174-177 (2022).
  44. Lui, P. P. Y. Stem cell technology for tendon regeneration: Current status, challenges, and future research directions. Stem Cells and Cloning: Advances and Applications. 8, 163-174 (2015).
  45. Howell, K., et al. Novel model of tendon regeneration reveals distinct cell mechanisms underlying regenerative and fibrotic tendon healing. Scientific Reports. 7, 45238 (2017).
  46. Sharma, P., Maffulli, N. Tendinopathy and tendon injury: The future. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1733-1745 Forthcoming.
  47. Huegel, J., et al. Quantitative comparison of three rat models of Achilles tendon injury: A multidisciplinary approach. Journal of Biomechanics. 88, 194-200 (2019).
  48. Pal Heggers, J., et al. Biocompatibility of silicone implants. Annals of Plastic Surgery. 11 (1), 38-45 (1983).
  49. Liu, Y., et al. Evaluation of animal models and methods for assessing shoulder function after rotator cuff tear: A systematic review. Journal of Orthopaedic Translation. 26, 31-38 (2020).
  50. Disselhorst-Klug, C., Schmitz-Rode, T., Rau, G. Surface electromyography and muscle force: Limits in sEMG-force relationship and new approaches for applications. Clinical Biomechanics. 24 (3), 225-235 (2009).
  51. Kwon, D. R., Park, G. -Y., Moon, Y. S., Lee, S. C. Therapeutic effects of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells combined with polydeoxyribonucleotides on full-thickness rotator cuff tendon tear in a rabbit model. Cell Transplantation. 27 (11), 1613-1622 (2018).

Tags

Кролик Хроническая модель травмы вращательной манжеты плеча Фиброз Мышечно-жировая дегенерация Мускулатура Сухожилия Сила Втягивание Мышечно-сухожильная/миотендинная единица Функция плеча Результаты восстановления RC Животные модели Анатомия и патофизиология RC человека Тканевая инженерия Терапия на основе регенеративной медицины Модель подлопаточной мышцы кролика Костно-сухожилие-мышечная единица надостной мышцы человека Фиброз и мышечная жировая дегенерация (FD) Хирургические процедуры Изоляция SSC Коракобрахиальная мышца Транссекция по всей толщине трубка Пенроуза на основе силикона гистологическая оценка
Разработка модели хронической травмы вращательной манжеты плеча у кролика для изучения фиброза и мышечно-жировой дегенерации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, K., Zhang, X., Wang, D., Ker, D. … More

Li, K., Zhang, X., Wang, D., Ker, D. F. E. Development of a Rabbit Chronic-Like Rotator Cuff Injury Model for Study of Fibrosis and Muscular Fatty Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64828, doi:10.3791/64828 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter