Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Validierung von Verhaltenstests und zur bioinformatischen Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit von Zadi-5, einer traditionellen mongolischen Medizin, bei Depressionen.
Abstract
Zadi-5 ist ein traditionelles mongolisches Arzneimittel, das häufig zur Behandlung von Depressionen und Reizsymptomen eingesetzt wird. Obwohl die therapeutischen Wirkungen von Zadi-5 gegen Depressionen in zuvor berichteten klinischen Studien angezeigt wurden, wurden die Identität und die Wirkung der im Medikament enthaltenen pharmazeutischen Wirkstoffe nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Studie wurde die Netzwerkpharmakologie verwendet, um die Zusammensetzung des Arzneimittels vorherzusagen und die therapeutisch wirksamen Verbindungen in Zadi-5-Pillen zu identifizieren. Hier etablierten wir ein Rattenmodell für chronischen unvorhergesehenen milden Stress (CUMS) und führten einen offenen Feldtest (OFT), eine Morris-Wasserlabyrinth-Analyse (MWM) und einen Saccharoseverbrauchstest (SCT) durch, um die potenzielle therapeutische Wirksamkeit von Zadi-5 bei Depressionen zu untersuchen. Diese Studie zielte darauf ab, die therapeutischen Wirkungen von Zadi-5 bei Depressionen zu demonstrieren und den kritischen Wirkungspfad von Zadi-5 gegen die Störung vorherzusagen. Die vertikalen und horizontalen Scores (OFT), SCT und Zonenüberquerungszahlen der Fluoxetin- (Positivkontrolle) und Zadi-5-Gruppen waren signifikant höher (P < 0,05) als die der Ratten der CUMS-Gruppe ohne Behandlung. Nach den Ergebnissen der netzwerkpharmakologischen Analyse erwies sich der PI3K-AKT-Signalweg als essentiell für die antidepressive Wirkung von Zadi-5.
Introduction
Depression, auch bekannt als Major Depressive Disorder (MDD), ist eine schwere neuropsychiatrische Erkrankung, die für wachsende medizinische und wirtschaftliche Belastungen der Gesellschaft verantwortlich ist. Aufgrund der damit verbundenen Komplexität, Morbidität und Mortalität wurde eine beträchtliche Menge an Forschung durchgeführt, um Heilmittel für die Erkrankung zu finden 1,2. Laut einer Umfrage der Weltgesundheitsorganisation leiden derzeit weltweit rund 350 Millionen Menschen an Depressionen und den damit verbundenen Symptomen. Es wird prognostiziert, dass Depressionen bis 2030 Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen als Hauptursache für die weltweite Krankheitslast ablösen werden. Daher wird die Prävention und Behandlung von Depressionen in naher Zukunft zu einer globalen Prioritätwerden 3. Die Pathogenese der MDD ist noch nicht geklärt. Dennoch wird sie häufig auf die folgenden Faktoren zurückgeführt: genetische Veranlagung, Dysfunktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse, Verringerung der Neurotransmittersekretion, Neuroimmundysregulation-induzierte Neuroinflammation, Zellapoptose und reduzierte Zellproliferation 4,5.
Unter diesen Faktoren haben die durch neuroimmune Dysregulation induzierte Neuroinflammation und die veränderte Sekretion neurotropher Faktoren besondere Aufmerksamkeit für ihre Rolle bei der Entwicklung von Depressionen und vielen anderen psychiatrischen Erkrankungen erhalten6. In den letzten zehn Jahren haben Wissenschaftler gezeigt, dass der Hippocampus der dominante Ort für regenerative Nervenfunktionen ist und an der Regulierung von Emotionen und Kognition beteiligt ist. In diesem Zusammenhang werden die Neuronen des Hippocampus als neue therapeutische Ziele für in der Entwicklung befindliche Antidepressiva anerkannt 7,8. Darüber hinaus wird berichtet, dass der Hippocampus auch am Kurzzeit- und Langzeitgedächtnis beim Lernen und Festigen von Erinnerungen beteiligt ist. Insbesondere der Mangel an pyramidalen Neuronen in der CA1-Region des Hippocampus verursacht eine retrograde und anterograde Amnesie9. Eine typische antidepressive Therapiestrategie zielt darauf ab, die Zellproliferation und Neurogenese im Gyrus dentatus des Hippocampus zu verbessern. Aus Naturstoffen gewonnene Verbindungen und kleine Moleküle, die auf der Grundlage medizinischer Chemietechniken synthetisiert werden, gelten als Hauptquellen für innovative Therapeutika für verschiedene neuropsychiatrische Erkrankungen.
Traditionelle mongolische Arzneimittel, die eine lange Geschichte und ein gut gestütztes theoretisches Medizinsystem haben, stammen von den Nomaden des mongolischen Plateaus ab. Diese Arzneimittel zeigen Multi-Target- und Multi-Pathway-Wirkungen aufgrund der verschiedenen medizinischen Komponenten, die zusammenwirken, um synergistische Funktionen zu erzeugen. Zadi-5 ist eine gut etablierte Formulierung unter solchen Medikamenten und wurde erstmals in der "Klinischen Erfahrung von Dr. Gao Shi" aufgezeichnet, die von einem herausragenden mongolischen Kliniker namens Dr. Gao Shi (1804-1876) geschrieben wurde. In der Mongolei ist es seit langem klinische Praxis, diese Pillen zur Behandlung der Symptome von Leiden, Herzklopfen, Reizungen und stechenden Herzschmerzen einzusetzen10,11. Darüber hinaus hat Zadi-5 nachgewiesene Wirkungen auf die Linderung von Depressionen nach einem Schlaganfall bei betroffenen Patienten12. Die jüngste experimentelle Forschung zu CUMS hat gezeigt, dass die Zadi-5-Formulierung Depressionen lindert, indem sie die zentralen Neurotransmitter reguliert13; In der Tat wurden mit Zadi-5 erhöhte Spiegel des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF) und des Tyrosinkinase-Rezeptors B (TrkB) nachgewiesen und mit verbessertem Lernen und Gedächtnis in einem Rattenmodell für Depressionen korreliert14. Der genaue Wirkmechanismus von Zadi-5 für eine solche Linderung von Depressionen wurde jedoch nicht aufgeklärt.
Diese Studie zielte darauf ab, die therapeutischen Wirkungen von Zadi-5 gegen Depressionen bei Ratten mit einem Verhaltenstest zu demonstrieren und die Bestandteile von Zadi-5 mit Hilfe von Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) und Swiss Target Prediction zu identifizieren, um die potenziellen Mechanismen vorherzusagen, die der Wirksamkeit von Zadi-5, einem traditionellen mongolischen Arzneimittel, bei der Behandlung von Depressionen zugrunde liegen.
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Protocol
Alle Versuchsprotokolle wurden vom Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Medizinischen Universität der Inneren Mongolei genehmigt und folgten den Richtlinien der National Institutes of Health zur Tierpflege und -ethik. Männliche Sprague Dawley (SD) Ratten im Alter von 8 Wochen (200 g ± 20 g) wurden 1 Woche lang in einem Raum mit kontrollierter Temperatur (22 °C ± 2 °C) und Luftfeuchtigkeit (55 % ± 15 %) unter einem 12 h/12 h regulierten Hell/Dunkel-Zyklus untergebracht. Abbildung 1 zeigt den Ablauf der Analyse der Netzwerkpharmakologie.
1. Verhaltenstest bei Ratten
- Etablierung eines CUMS-Rattenmodells
- Wenden Sie die folgenden Stimuli in Kombination mit einer Isolierung für 28 Tage auf alle Ratten an, mit Ausnahme der Kontrollen: Umkehrung des Hell-Dunkel-Zyklus für 24 Stunden, Futterentzug für 24 Stunden, Wasserentzug für 24 Stunden, Schütteln mit hoher Geschwindigkeit für 15 Minuten (einmalig/s), Schwanzklemme für 2 Minuten, Schwimmen in kaltem Wasser (4 °C) für 5 Minuten, 45 °C Wärmestimulation und Nasspolsterung für 24 h (Tabelle 1). Ziehe die Ratten in einzelnen Käfigen auf.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die gleiche Art von Reizen an aufeinanderfolgenden Tagen zu wiederholen. Die oben genannten Verfahren zur Etablierung eines CUMS-Rattenmodells wurden von der Tierethikkommission genehmigt und zuvor beschrieben15.
- Wenden Sie die folgenden Stimuli in Kombination mit einer Isolierung für 28 Tage auf alle Ratten an, mit Ausnahme der Kontrollen: Umkehrung des Hell-Dunkel-Zyklus für 24 Stunden, Futterentzug für 24 Stunden, Wasserentzug für 24 Stunden, Schütteln mit hoher Geschwindigkeit für 15 Minuten (einmalig/s), Schwanzklemme für 2 Minuten, Schwimmen in kaltem Wasser (4 °C) für 5 Minuten, 45 °C Wärmestimulation und Nasspolsterung für 24 h (Tabelle 1). Ziehe die Ratten in einzelnen Käfigen auf.
- Herstellung von Medikamenten
- Pulverisieren Sie die Zadi-5-Pille in einer Mühle und bereiten Sie eine Lösung von 1,16 g/ml in destilliertem Wasser vor. Separat wird eine Fluoxetinlösung von 0,36 mg/ml in destilliertem Wasser hergestellt.
- Verabreichung von Medikamenten
- Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen eingeteilt (n = 10): Kontrolle (CON), Modell (MOD), Zadi-5-Gruppe (Zadi-5, 1,6 g Zadi-5/kg16), Fluoxetin-Gruppe (Fluoxetin, 3,6 mg Fluoxetin/kg). Verabreichen Sie 28 Tage lang einmal täglich 1 ml/g der geeigneten Arzneimittellösung pro Ratte per Sonde und behandeln Sie die CON- und MOD-Gruppen mit einer gleichen Menge destilliertem Wasser.
HINWEIS: Die Gavage beginnt mit dem Beginn der Modelletablierung für alle Gruppen.
- Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen eingeteilt (n = 10): Kontrolle (CON), Modell (MOD), Zadi-5-Gruppe (Zadi-5, 1,6 g Zadi-5/kg16), Fluoxetin-Gruppe (Fluoxetin, 3,6 mg Fluoxetin/kg). Verabreichen Sie 28 Tage lang einmal täglich 1 ml/g der geeigneten Arzneimittellösung pro Ratte per Sonde und behandeln Sie die CON- und MOD-Gruppen mit einer gleichen Menge destilliertem Wasser.
- Freilandversuch (OFT)
- Teilen Sie eine Black Box (50 cm x 50 cm x 30 cm) in neun quadratische Bereiche mit gleicher Fläche. Statten Sie die Box mit einem Video-Tracking-Analysesystem aus. Legen Sie die Ratte einen Tag nach der letzten Magensonde in das mittlere Quadrat und zeichnen Sie ihre horizontalen und vertikalen Aktivitäten 3 Minuten lang auf.
- Bewerten Sie die Anzahl der Quadrate, die mit allen Pfoten gekreuzt sind, als horizontale Aktivität und bewerten Sie das Stehen und die Fellpflege als vertikale Aktivität. Reinigen Sie die Box nach jedem Test mit 75%igem Alkohol, um den Geruch der Ratte für nachfolgende Tests zu entfernen17.
- Saccharose-Verzehrtest (SCT)
- Wiegen Sie die jeweiligen Flaschen vor und nach dem Verzehr und berechnen Sie die 60-minütigen Saccharose-Präferenzraten an Tag 0, Tag 7, Tag 14, Tag 21 und Tag 28 mit Gleichung (1):
Saccharoseverbrauch =
× 100% (1)
- Wiegen Sie die jeweiligen Flaschen vor und nach dem Verzehr und berechnen Sie die 60-minütigen Saccharose-Präferenzraten an Tag 0, Tag 7, Tag 14, Tag 21 und Tag 28 mit Gleichung (1):
- Morris Wasserlabyrinth (MWM)
- Teilen Sie den Pool in vier Quadranten. Ordnen Sie die Quadranten von eins bis vier an und platzieren Sie die versteckte Plattform im dritten Quadranten, 1 cm unter der Wasseroberfläche.
- Platzieren Sie das Rattensubjekt in verschiedenen Quadranten, um 120 s lang nach der Plattform zu suchen, und zeichnen Sie die Latenzzeit mit dem MWM Videospuranalysesystem auf.
- Platzieren Sie das Rattenobjekt in einer festen Position im Pool. Wenn das Subjekt die versteckte Plattform innerhalb von 120 Sekunden nicht finden kann, notieren Sie die Latenz mit 120 Sekunden.
- Als nächstes verschiebst du die Plattform, setzt die Ratte ins Wasser und zeichnest die Anzahl der Zonenübergänge 120 s lang auf.
- Gib Milch in den Pool, um ein gewisses Maß an Deckkraft zu erreichen. Halten Sie die Wassertemperatur während des Experiments bei 23 °C ± 1 °C.
× 100% (1)2. Pharmakologische Vorhersage des Netzwerks
- Screenen Sie die aktiven Komponenten in Zadi-5.
- Durchsuchen Sie die Systempharmakologie der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) und geben Sie "Myristicae Samensamen", "Aucklandiae Radix-Wurzeln " und "Piperis Longi Fructus" in den Abschnitt "Kräutername" ein, um die Namen der Chemikalien zu erhalten. Stellen Sie den pharmakokinetischen Index der oralen Bioverfügbarkeit (OB) auf >30 % und den arzneimittelähnlichen Index (DL) auf >0,18 ein (Zusatzdatei 1).
- Suche "Rou Dou Kou" (Myristica fragrans Houtt), "Tu Mu Xiang" (Inula helenium L.), "Mu Xiang" (Aucklandia lappa Decne.), "Guang Zao" (Choerospondias axillaris Roxb. Burtt Hill) und "Bi Ba" (Piper longum L.) im Arzneibuch der Chinesischen Medizin (http://www.zhongyaocai360.com/zhongguoyaodian/), um die chemischen Namen der einzelnen Komponenten zu identifizieren.
- Durchsuchen Sie die identifizierten chemischen Namen in PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), um die isomeren SMILES oder InChIkey zu finden
- Identifizieren Sie die Zielproteine der aktiven Komponenten in Zadi-5.
- Identifizieren Sie die Zielproteine der Wirkstoffe mit SEA (http://sea.bkslab.org/), BATMAN (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) und Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) mit isomeren SMILES oder InChIkey und finden Sie die überlappenden Proteine.
- Verwenden Sie die Proteindatenbank UniProt (http://www.uniprot.org/uploadlists/), um die identifizierten Ziele in einheitliche Gennamen umzuwandeln.
- Suchen Sie nach den Zielproteinen für Depressionen.
- Suchen und identifizieren Sie die potenziellen Proteinziele für Depressionen, indem Sie die Schlüsselwörter "Depression" und "depressive Störung" in Genecards (https://www.genecards.org/), Disgenet (https://www.disgenet.org/) und Drugbank (https://www.drugbank.com/) verwenden.
- Finde die Zielgene.
- Durchsuchen Sie das Venn-Diagramm (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/), laden Sie die Ziele der aktiven Komponenten von Zadi-5 in Liste-1 hoch, laden Sie die Ziele für Depressionen in Liste-2 hoch und senden Sie sie ab. Besorgen Sie sich das Venn-Diagramm und filtern Sie die überlappenden Zielkandidaten heraus.
- Bauen Sie das Netzwerk auf.
- Erstellen Sie eine Tabelle mit dem Namen "Typ und Netzwerk" (Zusatzdatei 2). "Typ" ist die Signatur des Netzwerks, und "Netzwerk" veranschaulicht die Beziehung zwischen den Zeichen.
- Exportieren Sie den "Typ und das Netzwerk" nach Cytoscape v3.9.0, um das Netzwerk "Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets" zu erstellen.
- Analysieren Sie das Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) der Zielkandidaten.
- Legen Sie die allgemeinen Ziele in der STRING-Datenbank (https://cn.string- db.org/) fest, um ihre Interaktionen zu analysieren. Legen Sie den Proteintyp als "Homo sapiens" fest. Legen Sie den Interaktionsschwellenwert auf 0,9 fest, und wählen Sie nur die experimentell verifizierten Typen aus. Zeigen Sie die einsamen Inselknoten nicht an.
- Durchführung einer Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) und Genontologie-Anreicherungsanalysen (GO) der zielbezogenen Signalwege.
- Fügen Sie 86 potenzielle Antidepressiva-Ziele von Zadi-5 in die Startanalyseklammer in DAVID (https:// david.ncifcrf.gov/) ein, um die verwandten Signalwege zu untersuchen, indem Sie die Gene Ontology (GO)-Funktion - einschließlich biologischer Prozesse, zellulärer Komponenten und molekularer Funktionen - und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalweg-Anreicherungsanalysen durchführen.
HINWEIS: KEGG wird im Blasendiagramm mithilfe eines Online-IMageGP (http://www.ehbio.com /ImageGP/index.php/Home/Index/) visualisiert. Die Blasengröße stellt die Anzahl der Ziele dar, die im angegebenen Pfad angereichert sind, und die Blasenfarbe stellt den P-Wert der Anreicherung dar.
- Fügen Sie 86 potenzielle Antidepressiva-Ziele von Zadi-5 in die Startanalyseklammer in DAVID (https:// david.ncifcrf.gov/) ein, um die verwandten Signalwege zu untersuchen, indem Sie die Gene Ontology (GO)-Funktion - einschließlich biologischer Prozesse, zellulärer Komponenten und molekularer Funktionen - und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalweg-Anreicherungsanalysen durchführen.
- Konstruieren Sie das Netzwerk, um die Wirkstoffe in Zadi-5 zu veranschaulichen, die mit dem PI3K-AKT-Signalweg interagieren.
- Laden Sie das KEGG-Signalweg-Dokument herunter, wählen Sie die Gene des PI3K-AKT-Signalwegs aus der Anreicherungsanalyse aus und fügen Sie sie in die Tabelle ein, um ein "Typ und Netzwerk"-Dokument zu erstellen.
- Exportieren Sie das Dokument "Typ und Netzwerk" in das Cytoscape, um das "PI3K-AKT visualized compounds-targets-pathways network" (Zusatzdatei 3) zu generieren.
HINWEIS: "Typ" ist die Signatur des Netzwerks, und "Netzwerk" veranschaulicht die Beziehung zwischen den Zeichen.
3. Statistische Analyse
- Verwenden Sie eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Duncans Post-hoc-Test, um die signifikanten Unterschiede in den biochemischen und Genexpressionsparametern zu bestimmen. Berechnen Sie den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) und visualisieren Sie die Daten. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.
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Representative Results
Verhaltenstest bei Tieren
Ergebnisse der Verhaltenstests im CUMS-induzierten Rattendepressionsmodell
Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den getesteten Gruppen für den OFT-Score, den Saccharoseverbrauch und die MWM-Analyse vor der CUMS-Stimulation gefunden. Nach der Etablierung des CUMS-Modells waren die vertikalen und horizontalen Werte der MOD-Gruppe niedriger als die der CON-Gruppe (P < 0,05). Im Vergleich zur MOD-Gruppe waren die vertikalen und horizontalen Werte der POS- und Zadi-5-Gruppen signifikant höher (P < 0,05) (Abbildungen 2A,B).
Am Tag 0 hatten die getesteten Gruppen keinen signifikanten Unterschied im Saccharosekonsum (%). Der Saccharosekonsum (%) der Zadi-5- und POS-Gruppe war an Tag 28 höher als der der MOD-Gruppe (Abbildung 2C).
Im Vergleich zur CON-Gruppe war die Latenz der MOD-Gruppe zum Auffinden der Plattform im MWM signifikant höher (P < 0,01). Die Latenz in der POS-Gruppe war deutlich geringer als in der MOD-Gruppe. Die Latenzen der Ratten in der Zadi-5-Gruppe waren niedriger als in der MOD-Gruppe, aber nicht in signifikantem Maße. In Bezug auf die Anzahl der Zonenübergänge wies die MOD-Gruppe weniger Kreuzungen auf als die CON-Gruppe. Die POS- und Zadi-5-Gruppen zeigten mehr Kreuzungen als die MOD-Gruppe (Abbildung 2D,E).
Vorhersage der Netzwerkpharmakologie
Es gab 134 aktive Komponenten in Zadi-5, und 220 Zielproteinkandidaten wurden für diese Komponenten gewonnen. Darüber hinaus wurden 1.000 mit Depressionen in Verbindung stehende Proteinziele vorhergesagt. Nach der Analyse des Venn-Diagramms wurden 86 überlappende Ziele als kritische depressionsbezogene Ziele von Zadi-5 identifiziert (Abbildung 3). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden "Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets" und eine PPI-Netzwerkanalyse der Zielkandidaten erstellt (Abbildung 4A, B, Abbildung 5 und Tabelle 2). Der PI3K-AKT-Signalweg zeigte relativ unregelmäßige Kanten, was darauf hindeutet, dass dieser Signalweg für die antidepressive Wirkung von Zadi-5 essentiell ist. Nach der KEGG-Signalweganalyse belegte der PI3K-AKT-Signalweg den siebten Platz (Abbildung 6) und war mit vielen Signalwegen assoziiert. Dementsprechend wurde es als relativ wichtiger angesehen als die anderen Anreicherungswege (Abbildung 7A-C und Abbildung 8).
Abbildung 1: Workflow der netzwerkpharmakologischen Analyse für die in vivo Validierung. Abkürzungen: PPI = Protein-Protein-Interaktion; KEGG = Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome; GO = Gen-Ontologie; OFT = Freilandversuch; MWM = Morris Water Maze; SCT = Saccharose-Verzehrtest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswirkungen von Zadi-5 auf das CUMS-induzierte Rattendepressionsmodell. (A) OFT-Vertikalwerte. (B) Horizontale OFT-Scores. (C) Saccharoseverbrauch (%) an Tag 0 und Tag 28. (D) Latenzzeit für den MWM-Test. (E) Zonenübergangsnummern für die MWM-Prüfung. ##P < 0,01 zeigt an, dass die CUMS MOD-Gruppe signifikante Unterschiede im Vergleich zur CON-Gruppe zeigte. *P < 0,05 deutet darauf hin, dass die POS-Gruppe und die Zadi-5-Gruppe signifikante Unterschiede im Vergleich zur MOD-Gruppe aufwiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Venn-Diagramm der Proteinziele von Zadi-5 und Depressions-assoziierten Proteinen. Der rote Kreis stellt die Ziele der aktiven Komponenten in Zadi-5 dar, während der blaue Kreis die Proteine darstellt, die mit Depressionen in Verbindung gebracht werden. Der Schnittpunkt der beiden Farben stellt die überlappenden Proteine dar, die als therapeutische Ziele für die Linderung von Depressionen durch Zadi-5 identifiziert werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Aufbau des "Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets network". Die roten Parallelogramme stellen Zadi-5 und seine Kräuter dar, während die rosafarbenen, orangefarbenen, gelben, grünen und violetten Kreise die Bestandteile jedes Krauts darstellen. Die blauen Diamanten stellen die Proteine dar, die mit Depressionen in Verbindung gebracht werden, was das grüne Sechseck ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: PPI der überlappenden Proteinziele. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Das Blasendiagramm für die 20 mit KEGGs angereicherten Begriffe basierend auf den 86 überlappenden Proteinzielen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Die wichtigsten bioinformatischen Ergebnisse für die Zadi-5-Komponenten und Depressions-assoziierte Proteinziele. (A) Die 20 wichtigsten überlappenden molekularen Funktionen GO-Begriffe von Zadi-5 und Depression. (B) Die 20 wichtigsten überlappenden zellulären Komponenten GO-Begriffe von Zadi-5 und Depression. (C) Die 20 wichtigsten überlappenden biologischen Prozesse GO-Begriffe von Zadi-5 und Depression. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Das Zadi-5 Ingredients-PI3K-AKT-Signalweg-Enrichment-Target-Netzwerk für die Behandlung von Depressionen. Der Kreis stellt die Inhaltsstoffe von Zadi-5 dar, die Sechsecke stehen für jedes Medikament von Zadi-5 und die grünen Diamanten für die angereicherten Ziele des PI3K-AKT-Signalwegs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Sequenz und Methoden der Anwendung von Stressreizen zur Induktion von CUMS bei Rattenprobanden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Die in Abbildung 2 verwendeten ID-Codes. Abkürzungen: MF = Myristica Fragrans Inula IH = Innula helenium L.; FC = Fructus choerospondiatis; AL = Aucklandia lappa Decne.; PL = Piper longum L. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Datei 1: Screenshot-Bilder des Netzwerk-Pharmakologie-Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 2: Zadi-5-Komponenten-Proteine-Depressionsnetzwerk. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 3: Art des Netzwerks. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Depression ist eine psychische Erkrankung, die durch schlechte Stimmung, Anhedonie und Energiemangel gekennzeichnet ist. Diese Störung geht mit Ablenkung, kognitiver Dysfunktion, sozialem Rückzug, Schlaflosigkeit, sexueller Dysfunktion und Magen-Darm-Erkrankungen einher18,19. Bei der Erforschung von Depressionen ist die Etablierung eines Tiermodells entscheidend, um die pathologischen Mechanismen und Wirkungen neuer Medikamente zu verstehen. In dieser Studie wurde ein CUMS-induziertes Rattendepressionsmodell durch die in Protokollabschnitt 2 und Tabelle 1 beschriebenen Irritationen erstellt, um Stress, Angriff und Frustration aus Quellen im Zusammenhang mit Gesellschaft, Familie und Arbeit zu simulieren. Die richtige Reihenfolge und Anpassung der Intensitäten der Reize sind entscheidend für die Etablierung dieses Depressionsmodells. Darüber hinaus muss die Box nach jedem Rattentest von OFT sofort gereinigt werden, um eine Beeinflussung der Spur der nächsten Ratte zu vermeiden. CUMS in Kombination mit der Isolierung schafft effektiv ein zuverlässiges Rattendepressionsmodell20, das die Entwicklung depressiver Symptome und biochemischer Anzeichen bei menschlichen Patienten simuliert. Dieses Modell wurde häufig verwendet, um die pathophysiologischen Mechanismen von Depressionen zu erforschen und Antidepressiva in der Entwicklung zu bewerten 21,22. Tests wie OFT, SCT und MWM sind einfache, objektive und vernünftige Methoden, um den Appetit, die mangelnde Motivation, die Lernfähigkeit und das Gedächtnis der Rattenprobanden zu beurteilen. Diese Tests gelten als Goldstandard für das Testen von Tiermodellen für Neuroerkrankungen.
In dieser Studie basierte die Netzwerkpharmakologie auf der TCMSP-Datenbank von Online-Sites, die Daten aus vielen verfügbaren Quellen wie Websites, Büchern und wissenschaftlichen Zeitschriften sammelt, speichert und verarbeitet23. Es unterstützt effektiv die Erforschung traditioneller Arzneimittel mit komplexen Wirkmechanismen, indem es den Zeit- und Kostenaufwand für die Untersuchung reduziert24,25. In der Netzwerkpharmakologie werden die Daten in die Excel-Dateien kopiert und anhand der einzelnen Medikamente und Datenbanken eindeutig klassifiziert. Die traditionelle mongolische Medizin unterscheidet sich von der traditionellen chinesischen Medizin dadurch, dass die Bestandteile der einzelnen Medikamente nicht durchsucht werden können. In diesem Zusammenhang listet Protokollschritt 2.2.1 eine wertvolle Datenbasis zur Identifizierung wirksamer chemischer Komponenten in dieser Studie auf. Wie in Protokollschritt 2.4 beschrieben, könnte die Bestimmung der überlappenden Zielproteine von Zadi-5 und Depression auf der Grundlage von drei verschiedenen Datenbanken die Genauigkeit und Effizienz der Untersuchung sicherstellen. Dies stellt eine wichtige Modifikation des Experiments dar, die für die Verbesserung der Genauigkeit der Ergebnisse unerlässlich ist. Die PPI-Interaktions-, KEGG- und GO-Funktionelle-Enrichment-Analysen zeigten, dass der PI3K-AKT-Signalweg eine wichtige Rolle bei der therapeutischen Wirkung von Zadi-5 gegen Depressionen spielt. Der überlebensfördernde Kinase-Signalkaskaden-PI3K/AKT-Signalweg ist ein intrazellulärer Signaltransduktionsweg, der durch antioxidativen Stress und anti-apoptotische Effekte eine zentrale Rolle bei der Verletzung von Neuronen spielt26. Der PI3K-AKT-Signalweg ist eng mit grundlegenden zellulären Funktionen wie Proliferation, Überleben, Differenzierung und Proteintranslation verbunden. Darüber hinaus spielt es eine dominante Rolle im Stoffwechsel von Zellen in bestimmten Organen wie Herz und Gehirn27. Es wurde berichtet, dass die Aktivierung des PI3K-AKT-Signalwegs Neuronenfunktionen kontrollieren und Neuronen vor oxidativen Schäden schützen kann, indem antioxidative Bcl-2-Proteine reguliert werden, um die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu hemmen28,29.
In dieser Studie wurden ein Verhaltenstest und eine pharmakologische Netzwerkvorhersage verwendet, um die Auswirkungen von Zadi-5 abzuschätzen. In Zukunft kann die Netzwerkpharmakologie zur Vorhersage der bioaktiven Bestandteile pflanzlicher Arzneimittel und ihrer Zielproteine eingesetzt werden. Pathologische Bewertungen und Schlüsselmolekültests werden durchgeführt, um die bioaktiven Komponenten von Zadi-5 zu charakterisieren. Verhaltenstests werden durchgeführt, um die Motivation, den Appetit und das Gedächtnis der Tiere zu validieren. Um die Qualität der Validierung zu gewährleisten, wird die Vorhersage der Komponenten von Zadi-5 auf Basis von Online-Datenbanken mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) analysiert. Die Zielproteine werden mittels Western Blot und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) analysiert30.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Instrumente und das Labor, die von der mongolischen medizinischen Fakultät der Inneren Mongolischen Medizinischen Universität, China, zur Verfügung gestellt werden. Diese Studie wurde von der National Natural Sciences Foundation of China (81760762) und dem Science and Technology Plan Project der Gesundheitskommission der Inneren Mongolei, China (202201300) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytoscape software | version 3.7.0 | ||
| Fluoxetine | Lilly Suzhou Pharmaceutical Co., Ltd | J20160029 | |
| Morris water maze video trail analysing system | Tai Meng Tech Co., Ltd | WMT-200 | |
| Sprague Dawley rats | Beijing Biotechnology Co., Ltd, China | SCXK (JING) 2016-0002 | |
| video tracking system | Tai Meng Tech Co., Ltd | ZH-ZFT | |
| Zadi-5 pill | Pharmaceutical Preparation Center of International Mongolian Hospital, Inner Mongolia, China | M1301006 |
References
- Jiang, N., et al. The antidepressant-like effects of Shen Yuan in a chronic unpredictable mild stress rat model. Frontiers in Psychiatry. 12, 622204 (2021).
- Yang, L. F., et al. The effects of psychological stress on depression. Current Neuropharmacology. 13 (4), 494-504 (2015).
- Liu, Q. Q., et al. Changes in the global burden of depression from 1990 to 2017: Findings from the Global Burden of Disease study. Journal of Psychiatric Research. 126, 134-140 (2020).
- Pinto, B., Conde, T., Domingues, I., Domingues, M. R. Adaptation of lipid profiling in depression disease and treatment: A critical review. International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2032 (2022).
- Rahman, S., et al. Increased serum resistin but not G-CSF levels are associated in the pathophysiology of major depressive disorder: Findings from a case-control study. PLoS One. 17 (2), 0264404 (2022).
- Liu, C., et al. Danzhi Xiaoyao powder promotes neuronal regeneration by downregulating Notch signaling pathway in the treatment of generalized anxiety disorder. Frontiers in Pharmacology. 12, 772576 (2021).
- Tanti, A., Belzung, C. Hippocampal neurogenesis: a biomarker for depression or antidepressant effects? Methodological considerations and perspectives for future research. Cell and Tissue Research. 354 (1), 203-219 (2013).
- Zhu, C., et al. Silencing of RGS2 enhances hippocampal neuron regeneration and rescues depression-like behavioral impairments through activation of cAMP pathway. Brain Research. 1746, 147018 (2020).
- Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
- Bold, S. History and Development of Traditional Mongolian Medicine, third edition. , Sodpress Kompanid Khevlv. Ulaanbaatar, Mongolia. (2013).
- Medical, E. committee of Mongolian Encyclopedia. Mongolian Studies' Encyclopedia: Mongolian Medicine, third edition. , Hohhot, Mongolia. (2012).
- Fan, L., Wang, W. Clinical observation of Mongolian medicine Zadi-5 combined with Western medicine to treat depression after stroke. China Practice Medicine. 14 (2), 115-116 (2019).
- Hu, R. L. B. G., et al. Experimental research on nutmeg wuwei pills against of depression model rats behavior and hippocampus monoamine neurotransmitters. Chinese Journal of ETMF. 21 (11), 146-149 (2015).
- Hu, R. L. B. G., et al. Effects of Rou kou Wuwei Pill on the learning and memory abilities and the expression of BDNF and TrkB in hippocampus of depression rats. CJTCMP. 32 (8), 3797-3800 (2017).
- Yang,, et al. Morinda officinalis oligosaccharides mitigate depression-like behaviors in hypertension rats by regulating Mfn2-mediated mitophagy. J Neuroinflammation. 20 (1), 31 (2023).
- Hu, R. L. B. G., et al. Effect of Zadi Wuwei pills on behaviors and learning memory in the depression model rats. World Journal of ITWM. 10 (10), 1367-1370 (2015).
- Ghasemi, M., Raza, M., Dehpour, A. R. NMDA receptor antagonists augment antidepressant-like effects of lithium in the mouse forced swimming test. Journal of Psychopharmacology. 24 (4), 585-594 (2010).
- Zhang, Y., et al. tea attenuates chronic unpredictable mild stress-induced depressive-like behavior in rats via the gut-brain axis. Nutrients. 14 (1), 99 (2021).
- Kandola, A., Ashdown-Franks, G., Hendrikse, J., Sabiston, C. M., Stubbs, B. Physical activity and depression: Towards understanding the antidepressant mechanisms of physical activity. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 107, 525-539 (2019).
- Sun, J., et al. Clostridium butyricum attenuates chronic unpredictable mild stress-induced depressive-like behavior in mice via the gut-brain axis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8415-8421 (2018).
- Willner, P. Chronic mild stress (CMS) revisited: Consistency and behavioural-neurobiological concordance in the effects of CMS. Neuropsychobiology. 52 (2), 90-110 (2005).
- Albrakati, A., et al. Neuroprotective efficiency of prodigiosins conjugated with selenium nanoparticles in rats exposed to chronic unpredictable mild stress is mediated through antioxidative, anti-inflammatory, anti-apoptotic, and neuromodulatory activities. International Journal of Nanomedicine. 16, 8447-8464 (2021).
- Chan, K., et al. Good practice in reviewing and publishing studies on herbal medicine, with special emphasis on traditional Chinese medicine and Chinese materia medica. Journal of Ethnopharmacology. 140 (3), 469-475 (2012).
- Su, H., et al. Exploration of the mechanism of Lianhua Qingwen in treating influenza virus pneumonia and new coronavirus pneumonia with the concept of "different diseases with the same treatment" based on network pharmacology. Evidence Based Complementary Alternative Medicine. 2022, 5536266 (2022).
- Zhou, P., et al. Network pharmacology and molecular docking analysis on pharmacological mechanisms of Astragalus membranaceus in the treatment of gastric ulcer. Evidence Based Complementary Alternative Medicine. 2022, 9007396 (2022).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Aoyagi, T., Matsui, T. Phosphoinositide-3 kinase signaling in cardiac hypertrophy and heart failure. Current Pharmaceutical Design. 17 (18), 1818-1824 (2011).
- Zhu, H., et al. The neuroprotection of liraglutide against ischaemia-induced apoptosis through the activation of the PI3K/AKT and MAPK pathways. Scientific Reports. 6, 26859 (2016).
- Radak, Z., Zhao, Z., Koltai, E., Ohno, H., Atalayet, M. Oxygen consumption and usage during physical exercise: The balance between oxidative stress and ROS-dependent adaptive signaling. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (10), 1208-1246 (2013).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 2022, 115278 (2022).
