Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в инсулин-продуцирующие островковые кластеры

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64840
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 3, 1,2,4
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia
* These authors contributed equally

Summary

Дифференцировка стволовых клеток в островковые клетки представляет собой альтернативное решение по сравнению с традиционным лечением диабета и моделированием заболевания. Мы описываем подробный протокол культивирования стволовых клеток, который сочетает в себе коммерческий набор для дифференцировки с ранее проверенным методом, помогающим в производстве инсулинсекретирующих островков, полученных из стволовых клеток, в чашке.

Abstract

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) в инсулинсекретирующие бета-клетки дает материал для изучения функции бета-клеток и лечения диабета. Тем не менее, остаются проблемы с получением бета-клеток, полученных из стволовых клеток, которые адекватно имитируют нативные бета-клетки человека. Основываясь на предыдущих исследованиях, островковые клетки, полученные из чПСК, были созданы для создания протокола с улучшенными результатами дифференцировки и согласованностью. Протокол, описанный здесь, использует набор предшественников поджелудочной железы на стадиях 1-4, а затем протокол, модифицированный на основе статьи, ранее опубликованной в 2014 году (далее именуемый «R-протокол») на стадиях 5-7. Включены подробные процедуры использования набора панкреатического предшественника и микролуночных планшетов диаметром 400 мкм для создания кластеров-предшественников поджелудочной железы, R-протокол для эндокринной дифференцировки в формате статической суспензии 96 лунок, а также характеристика in vitro и функциональная оценка островков, полученных из чПСК. Полный протокол занимает 1 неделю для первоначальной экспансии hPSC, а затем ~5 недель для получения инсулин-продуцирующих островков hPSC. Персонал, владеющий базовыми методами культивирования стволовых клеток и обученный биологическим анализам, может воспроизвести этот протокол.

Introduction

Бета-клетки поджелудочной железы секретируют инсулин в ответ на повышение уровня глюкозы в крови. Пациентов, у которых отсутствует достаточная выработка инсулина из-за аутоиммунного разрушения бета-клеток при диабете 1 типа (СД1)1 или из-за дисфункции бета-клеток при диабете 2 типа (СД2)2, обычно лечат введением экзогенного инсулина. Несмотря на эту жизненно важную терапию, она не может в точности сравниться с точным контролем уровня глюкозы в крови, который достигается за счет динамической секреции инсулина из настоящих бета-клеток. Таким образом, пациенты часто страдают от последствий опасных для жизни эпизодов гипогликемии и других осложнений, возникающих в результате хронических гипергликемических экскурсий. Трансплантация трупных островков человека успешно восстанавливает жесткий гликемический контроль у пациентов с СД1, но ограничена доступностью островковых доноров и трудностями в очистке здоровых островков для трансплантации 3,4. Эта проблема, в принципе, может быть решена путем использования ПСК в качестве альтернативного исходного материала.

Современные стратегии получения инсулинсекретирующих островков из ПСК in vitro часто направлены на имитацию процесса развития эмбриональной поджелудочной железы in vivo 5,6. Это требует знания ответственных сигнальных путей и своевременного добавления соответствующих растворимых факторов для имитации критических стадий развития эмбриональной поджелудочной железы. Программа поджелудочной железы начинается с вовлечения в дефинитивную энтодерму, которая отмечена транскрипционными факторами вилочной головки A2 (FOXA2) и определяющей пол областью Y-box 17 (SOX17)7. Последовательная дифференцировка дефинитивной энтодермы включает в себя формирование примитивной кишечной трубки, переходящей в заднюю переднюю кишку, которая экспрессирует гомеобокс поджелудочной и двенадцатиперстной кишки 1 (PDX1)7,8,9, и эпителиальную экспансию в предшественники поджелудочной железы, которые совместно экспрессируют гомеобокс PDX1 и гомеобокс 1 NK6 (NKX6.1)10,11.

Дальнейшая приверженность эндокринным островковым клеткам сопровождается транзиторной экспрессией главного проэндокринного регулятора нейрогенина-3 (NGN3)12 и стабильной индукцией ключевых транскрипционных факторов дифференцировки нейронов 1 (NEUROD1) и гомеобокса 2 NK2 (NKX2.2)13. Основные гормоноэкспрессирующие клетки, такие как инсулин-продуцирующие бета-клетки, глюкагон-продуцирующие альфа-клетки, соматостатин-продуцирующие дельта-клетки и полипептид-продуцирующие ППИ поджелудочной железы, впоследствии программируются. Благодаря этим знаниям, а также открытиям, сделанным в ходе обширных высокопроизводительных скрининговых исследований лекарственных средств, недавние достижения позволили создать hPSC-островки с клетками, напоминающими бета-клетки, способные секрецию инсулина 14,15,16,17,18,19.

Сообщалось о пошаговых протоколах генерации глюкозочувствительных бета-клеток 6,14,18,19. Основанный на этих исследованиях, настоящий протокол включает в себя использование набора панкреатических предшественников для получения клеток-предшественников поджелудочной железы PDX1+/NKX6.1+ в планарной культуре с последующей агрегацией микролуночных пластин в кластеры однородного размера и дальнейшей дифференцировкой в сторону инсулинсекретирующих hPSC-островков с помощью R-протокола в статической 3D-культуре суспензии. Контрольный анализ качества, включая проточную цитометрию, иммуноокрашивание и функциональную оценку, выполняется для точной характеристики дифференцирующих клеток. В данной работе подробно описан каждый этап направленной дифференциации и описаны подходы к характеризации in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол основан на работе с линиями hPSC, включая H1, HUES4 PDXeG и Mel1 INSGFP/W, в безфидерных условиях. Пошаговая процедура подробно описана в этом разделе, а подтверждающие данные дифференциации Mel1 INSGFP/W приведены в разделе репрезентативных результатов. Мы рекомендуем провести дальнейшую оптимизацию при работе с другими линиями hPSC, которые здесь не указаны. Смотрите таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми реагентами и растворами, используемыми в этом протоколе.

1. Приготовление дифференциальных сред и растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу 1 для всех готовых растворов и Таблицу 2 для дифференциации сред.

  1. Подготовьте все среды и реагенты для клеточной культуры в стерильном шкафу биобезопасности. Перед использованием кратковременно подогрейте растворы для клеточных культур и базальные среды до 37 °C в ванне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ниже, ежедневно готовьте свежие дифференциальные среды, добавляя добавки, и используйте их в тот же день. В качестве альтернативы набор для прагенита поджелудочной железы дает возможность заранее подготовить больший объем, который можно использовать в течение нескольких дней в соответствии с протоколом производителя. Оба метода подготовки среды хорошо себя зарекомендовали. Обратите внимание, что не рекомендуется оставлять среду на длительное время на водяной бане. При ежедневном приготовлении свежих сред рекомендуется аликвотировать добавки, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.

2. Дифференцировка ПСК в клетки-предшественники поджелудочной железы

  1. Поддерживайте недифференцированные ПСК на сосудах, покрытых Matrigel, в полной среде mTeSR1 и выполняйте ежедневную смену среды. Во время поддерживающего культивирования каждые 3-4 дня при достижении клеток ~70% слияния проводят с использованием реагента для диссоциации клеток в соответствии с протоколом производителя. Чтобы инициировать дифференцировку, диссоциируют клетки на отдельные клетки и высаживают их на 6-луночные или 12-луночные планшеты, обработанные культурой тканей (с объемом среды 2 мл или 1 мл на лунку соответственно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 приведены инструкции по хранению базальной среды энтодермы и ее аликвот.
  2. Обработайте лунки для культивирования Matrigel (разбавленным в ледяном DMEM/F12 в соответствии с протоколом производителя) и поместите планшет в инкубатор с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 на 30 минут.
  3. Переместите пластину с покрытием Matrigel до комнатной температуры (используйте в течение 3 часов).
  4. Отработанную среду отсасывают из культуры ПСК и один раз промывают ДПБС. Диссоциировать культуру hPSC на отдельные клетки с помощью фермента клеточной диссоциации при 37 °C в течение 3-5 мин. Промойте клетки, добавив теплую среду DMEM/F12, перелейте в коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл и отжим при 300 × г в течение 5 минут.
  5. Ресуспендируйте клеточную гранулу с полной средой стволовых клеток плюс 10 мкМ Y-27632 и выполните подсчет живых клеток (трипановый синий отрицательный) с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Аспирировать разбавленный Матригель и немедленно высевать живые клетки с плотностью 1,60-1,80 × 10 5/см2 в лунки, покрытые Матригелем, и инкубировать в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C,5%СО2 в течение 24 ч. Переходите к этапу 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к ~95% начальному слиянию для инициирования дифференциации. Согласно протоколу производителя, рекомендуется плотность посева 2,6 × 105/см2 . Рекомендуется тестировать различную плотность посева, чтобы определить оптимальное значение для клеточной линии и проверить жизнеспособность клеток. Если жизнеспособность ниже 80%, не приступайте к дифференциации. Низкая жизнеспособность клеток может быть результатом переваривания или перетирания во время сбора урожая или оставления клеток на длительное время в среде DMEM/F12 перед посевом.
  6. На 1-м этапе 1-го дня кратковременно прогревают базальную среду энтодермы до 37 °С в ванне и размораживают добавки MR и CJ. Приготовьте среду стадии 1А, добавив добавку MR и CJ в базальную среду энтодермы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  7. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 1A и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы стирки не требуются. Удалите все неприкрепленные клетки из культуры, осторожно встряхнув культуральную планшет перед заменой среды. Избегайте разрушения монослоя, не касаясь наконечника пипетки ко дну лунки во время извлечения среды и путем мягкого добавления среды.
  8. На этапе 1 день 2 кратковременно прогрейте базальную среду энтодермы в ванне с температурой 37 °С и разморозьте добавку CJ. Приготовьте среду стадии 1B, добавив добавку CJ в базальную среду энтодермы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  9. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 1B и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
  10. На этапе 1 день 3 повторите шаги 2.8-2.9. Переходите к этапу 2.
  11. На 1-й день 2-го этапа разогрейте базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы в ванне с температурой 37 °C и разморозьте добавки 2A и 2B. Приготовьте среду 2A, добавив добавки 2A и 2B в базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  12. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 2A и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
  13. На 2-й день 2-го этапа разогрейте базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы в ванне с температурой 37 °C и разморозьте добавку 2B. Приготовьте среду для стадии 2B, добавив добавку 2B к базальной среде 2-4 стадии поджелудочной железы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  14. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 2B и инкубируют в инкубаторе с влажностью 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
  15. На этапе 2 день 3 повторите шаги 2.13-2.14. Переходите к этапу 3.
  16. На стадии 3 день 1 разогреть базальную среду поджелудочной железы 2-4 стадии в ванне с температурой 37 °C и разморозить Добавка 3. Приготовьте среду 3-й стадии, добавив добавку 3 в базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  17. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 3 и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.
  18. На этапе 3 день 2 и день 3 повторите шаги 2.16-2.17. Переходите к этапу 4.
  19. На 4-й стадии 1-й день теплую базальную среду 2-4 стадии в ванне с температурой 37 °C и разморозить Дополнение 4. Приготовьте среду 4-й стадии, добавив добавку 4 в базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  20. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 4 и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.
  21. На 4-м этапе со 2-го по 4-й день повторите шаги 2.19-2.20. Перейдите к шагам агрегирования.

3. Агрегация в кластеры-предшественники поджелудочной железы с использованием микролуночных планшетов диаметром 400 мкм

  1. На этапе 4 и на 5-й день предварительно обработайте микролунки (например, в формате 24-луночных планшетов) 500 мкл раствора для промывки против адгезии на лунку.
  2. Подготовьте балансировочную пластину и центрифугируйте микролуночный планшет при 1 300 × г в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте планшет под микроскопом, чтобы убедиться, что в микролунках не осталось пузырьков. Снова центрифугируйте еще 5 минут, если пузырьки остаются в каких-либо микролунках.
  3. Отсосите раствор для промывки против прилипания из лунок и промойте один раз 1 мл DPBS. Аспирируйте DPBS из лунок и добавляйте 1 мл агрегационной среды в каждую лунку.
  4. Отработанную среду удалить из культур-предшественников поджелудочной железы и однократно промыть ДПБС. Диссоциируют культуры на отдельные клетки с помощью диссоциационного реагента при 37 °C в течение 10-12 мин. Промойте клетки теплым DMEM/F12, переложите в пробирку и отжмите при 300 × г в течение 5 минут.
  5. Повторно суспендируйте гранулы клеток в среде агрегации и выполните подсчет клеток в реальном времени. Засейте 2,4-3,6 миллиона клеток на лунку (т.е. 2000-3000 клеток на микролунку) и добавьте среду агрегации в каждую лунку, чтобы получить окончательный объем 2 мл на лунку.
  6. Осторожно пропипетируйте клетки вверх и вниз несколько раз наконечником P1000, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток по всей лунке. Не вводите пузырьки в микролунки. Центрифугируйте планшет микролунок при 300 × г в течение 5 мин для захвата клеток в микролунках. Инкубируют планшет с микролунками в инкубаторе с влажностью 37 °C, 5%СО2 в течение 24 ч агрегации и приступают к стадиям дифференциации 5-7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не потревожить пластину во время агрегации. Для оптимального формирования заполнителя может потребоваться до 48 часов инкубационного времени.

4. Дифференцировка кластеров-предшественников поджелудочной железы, полученных от kit, в hPSC-островки

  1. На 5-й стадии 1-й день прогревают базальную среду 5-7 стадии в ванне с температурой 37 °С и размораживают добавки (см. табл. 1 и табл. 2). Приготовьте среду 5-й стадии, добавив добавки (к конечным рабочим концентрациям) в базальную среду 5-7 стадии. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  2. После образования агрегата осторожно пропипетируйте агрегаты вверх и вниз несколько раз наконечником пипетки P1000, чтобы всплыть все неагрегированные ячейки. Дайте заполнителям осесть под действием силы тяжести (подождите ~1 минуту). Осторожно удалите отработанную среду (содержащую плавающие неагрегированные ячейки) из скважины, насколько это возможно, избегая аспирационных заполнителей.
  3. Энергично распределите свежую среду Stage 5 на поверхность планшета микролунок, чтобы удалить заполнители из микролунок. Перекачка заполнителей в 6-луночные установки со сверхнизким навесным оборудованием (ULA). Промойте один раз средой Stage 5, чтобы полностью извлечь заполнители из микролунок.
  4. Соберите все заполнители в 6-луночной скважине ULA, повторно суспендируйте агрегаты в среде Стадии 5 и отрегулируйте плотность до 20 кластеров на 100 мкл (например, ожидается, что из каждой скважины будет извлечено ~ 1 200 кластеров). Ресуспендировать 1 200 кластеров в 6 мл среды Stage 5). С помощью многоканальной пипетки дозируйте 50 мкл среды Stage 5 в каждую лунку планшета с плоским дном на 96 лунок ULA. Заполните угловые и краевые лунки 200 мкл DPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования крайних лунок для культивирования заполнителей, так как они склонны к большему испарению; В противном случае используйте 96-луночный планшет, который предназначен для минимизации испарения по краям (например, 96-луночные планшеты со встроенными рвами) или поместите культуральную планшет в инкубатор клеточных культур с высоким микроклиматом.
  5. Добавьте 100 мкл кластерной ресуспендирования в каждую лунку планшета с плоским дном 96 лунок ULA, в результате чего получится в общей сложности 150 мкл питательной среды, содержащей в среднем 20 кластеров на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перемешивайте ресуспендию доильного аппарата каждый раз перед дозированием в 96 лунок.
  6. Поместите культуральные планшеты на ровную поверхность в инкубатор с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 на 24 часа.
  7. На Этапе 5 день 2 приготовьте среду Стадии 5, следуя шагу 4.1.
  8. Используйте многоканальную пипетку, чтобы удалить ~90 мкл отработанной среды из каждой лунки и обновить 100 мкл среды Stage 5.
  9. На этапе 5 день 3 повторите шаги 4.7-4.8. Переходите к этапу 6.
  10. На 1-й день 6-й стадии подогреть базальную среду 5-7 стадии в ванне с температурой 37 °С и разморозить добавки (см. табл. 1 и табл. 2). Приготовьте среду 6-й стадии, добавив добавки (до конечных рабочих концентраций) в базальную среду 5-7 стадии. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  11. Используйте многоканальную пипетку, чтобы удалить ~90 мкл отработанной среды и обновить 100 мкл среды Stage 6 на лунку.
  12. На этапе 6, со 2-го по 8-й день, повторите шаги 4.10-4.11. Переходите к этапу 7.
  13. На 7-й стадии 1-й день прогрейте базальную среду 5-7 стадии в ванне с температурой 37 °С и оттайте добавки (см. табл. 1 и табл. 2). Приготовьте среду 7-й стадии, добавив добавки (к конечным рабочим концентрациям) в базальную среду 5-7 стадии. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  14. Используйте многоканальную пипетку, чтобы удалить ~90 мкл отработанной среды и обновить 100 мкл среды Stage 7 на лунку.
  15. На этапе 7, со 2-го по 12-й день, повторите шаги 4.13-4.14. Приступают к характеризации in vitro .

5. Проточный цитометрический анализ

  1. Удалите питательную среду и промойте один раз DPBS. Диссоциируют культуры (планарные клетки-предшественники или дифференцирующиеся кластеры) на отдельные клетки с помощью диссоциационного реагента путем инкубации при 37 °C в течение 10-12 мин. Смойте буфером FACS и отжим при 300 × г в течение 5 минут.
  2. Ресуспендируйте гранулу клетки в буфере FACS и выполните подсчет клеток. Отжим клетки при 300 × г в течение 5 мин. Ресуспендировать отдельные клетки в 500 мкл буфера Fix/Perm в течение 10 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием доведите буфер Fix/Perm до комнатной температуры. Буфер Fix/Perm содержит параформальдегид (PFA). Осторожно обращайтесь с PFA в вытяжном шкафу и утилизируйте в соответствии с рекомендациями учреждения.
  3. Отжим при 500 × г в течение 3 мин, дважды промыть 500 мкл 1 буфера для химической завивки/промывки и ресуспендировать в 300 мкл 1 буфера для химической завивки/стирки. Переложите 100 мкл одноклеточной ресуспензии (каждая из которых содержит 2,5-3 × 105 клеток) в три пробирки для контроля неокрашенности, контроля изотипа и окрашивания антителами (см. Таблицу материалов для получения информации об образцах антител и разведении). Выдерживать 45 мин при комнатной температуре и накрыть фольгой.
  4. Отжим при 500 × г в течение 3 мин. Промойте два раза с 500 мкл 1x буфера для химической завивки/стирки. Ресуспендируйте образцы в 100 мкл буфера FACS и проанализируйте окрашенные клетки (см. Таблицу материалов для внутриклеточного окрашивания маркеров на определенных стадиях) с помощью проточного цитометра и программного обеспечения (например, FlowJo).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы не анализируются немедленно, храните их при температуре 4°C в защищенном от света месте. Для стратегии стробирования данные потока сначала стробируются по свойствам рассеяния (FSC-A и SSC-A) для удаления мелкого клеточного мусора, а затем по свойствам FSC-A и FSC-ширины для идентификации синглетов. Положительное и отрицательное стробирование определяется контролем стволовых клеток и/или неокрашенными изотипами.

6. Иммунное окрашивание по всему креплению

  1. Соберите грозди в пробирку для микрофуги. Заселяют кластеры под действием силы тяжести. Отработанную среду аспирировать и один раз промыть 1 мл PBS (с кальцием и магнием). Зафиксируйте кластеры 1 мл 4% PFA при температуре 4°C на ночь.
  2. Однократно промыть PBST и пермеабилизировать 20-30 кластеров 500 мкл 0,3% TritonX-100 в пробирке для микрофуги при температуре окружающей среды в течение не менее 6 ч на наклонном шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для больших кластеров требуется более длительное время пермеабилизации (до 24 ч).
  3. Кластеры инкубируют в 100 мкл блокирующего буфера при температуре окружающей среды в течение 1 ч на наклонном шейкере. Удалите блокирующий буфер и инкубируйте кластеры со 100 мкл первичных антител, разведенных в буфере для разведения антител при температуре окружающей среды, в течение ночи на наклонном шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фон сильный во время визуализации, инкубируйте с первичными антителами при 4 °C.
  4. Тщательно промыть 3 x 30 минут с 500 мкл PBST на наклонном шейкере (угол наклона установлен на 8, скорость установлена на 20).
  5. Инкубируют кластеры со 100 мкл вторичных антител в буфере для разведения антител при температуре окружающей среды в течение ночи на наклонном шейкере. Накройте трубочки фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фон во время визуализации сильный, инкубируйте со вторичными антителами при 4 °C.
  6. Промойте один раз 500 мкл PBST. Добавить 100 мкл раствора 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (10 мкг/мл в PBST) и окрашивать при температуре окружающей среды в течение 10-15 мин. Накройте пленкой и берегите от света.
  7. Тщательно промывайте 3 x 30 минут 500 мкл PBST на наклонном шейкере. Накройте тюбики фольгой на этапе мойки.
  8. Кластеры прикрепляют к предметным стеклам камеры визуализации (см. таблицу материалов), предварительно покрытым тканевым клеем в соответствии с протоколом производителя и опубликованными протоколами20,21.
  9. Закрепить средством для очистки тканей (80% глицерин в растворе PBS) и накрыть стеклянными покровными стеклами. Беречь от света до получения конфокальной визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы не визуализируются сразу, храните их при температуре 4 °C в защищенном от света месте.

7. Статический анализ ГСИС

  1. Теплый буфер бикарбоната Kreb's Ringer (3,3 г KRB) с низким содержанием глюкозы, буфер KRB с высоким содержанием глюкозы (16,7 г) и буфер KCl KRB 30 мМ в ванне с температурой 37 °C.
  2. Вручную выберите кластеры подходящего размера и промойте 2 мл теплого буфера KRB 3,3 г. Переложите кластеры в 6-луночный планшет, не обработанный тканевой культурой, и уравновешивают в 2 мл теплого буфера 3,3G KRB в течение 1 ч в инкубаторе с влажностью 37 °C, 5% CO2 .
  3. После уравновешивания заполните пробирную камеру (см. Таблицу материалов) 100 мкл теплого буфера KRB 3,3G. Вручную соберите пять гроздей и перенесите их в центр пробирной камеры. Инкубируют в течение 30 мин в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники для дозаторов объемом 10 мкл для переноса кластеров с минимальным объемом среды.
  4. Осторожно соберите ~100 мкл надосадочной жидкости и храните ее при -30 °C до измерения базальной секреции инсулина (см. шаг 7.9). Не сушите и не теряйте грозди на этом этапе. Немедленно добавьте 100 мкл теплого буфера KRB 16,7G в пробирную камеру и инкубируйте те же кластеры в течение 30 мин в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 .
  5. Осторожно соберите ~100 мкл надосадочной жидкости и храните ее при -30 °C до измерения стимулированной глюкозой секреции инсулина (см. шаг 7.9). Немедленно добавьте 100 мкл теплого 30 мМ буфера KCl KRB в пробирную камеру и инкубируйте те же кластеры в течение 30 мин в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C и 5% CO2 .
  6. Осторожно соберите ~100 мкл надосадочной жидкости и храните при -30 °C до измерения секреции инсулина, стимулированного KCl (см. шаг 7.9). Немедленно добавьте 100 мкл лизисного буфера RIPA в пробирную камеру и перенесите лизисный буфер, содержащий все пять кластеров, в пробирку для микрофуги.
  7. Опционально) Разбейте доильные аппараты вручную путем энергичного растирания наконечником дозатора P200. Вихрь в течение 30 с и инкубация на льду в течение 30 мин, после чего еще 30 с вихрем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте полный лизис с помощью вихря и достаточное время инкубации на льду.
  8. Отжим при 8 000 × г в течение 1 мин. Соберите надосадочную жидкость и храните при температуре -30 °C до измерения общего содержания инсулина (см. шаг 7.9).
  9. Измеряют инсулин человека в образцах надосадочной жидкости с помощью набора для ИФА инсулина человека в соответствии с протоколом производителя и опубликованными протоколами20,22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторного замораживания и размораживания образцов надосадочной жидкости. Образцы с более чем тремя циклами замораживания и оттаивания не должны подвергаться анализу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы разработали гибридную стратегию дифференцировки стволовых клеток в инсулин-секретирующие hPSC-островки в семь этапов, которая использует набор предшественников поджелудочной железы для первых четырех стадий планарной культуры, за которой следует модифицированный протокол, построенный на ранее описанном методе6 в статической суспензионной культуре для последних трех стадий (рис.). При использовании этого протокола обеспечение близкого слияния (90%-100%) культивирования через 24 ч после посева клеток (стадия 0) имеет решающее значение для инициирования эффективной дифференцировки для большинства линий hPSC (рис. 2A). Настоятельно рекомендуется тестировать различную плотность посева, чтобы определить оптимальное состояние для конкретной клеточной линии. Во время 1-й стадии культивирования среда, скорее всего, будет казаться мутной из-за плавающих мертвых клеток, которые обычно наблюдаются на этой стадии. Это не влияет на эффективность дифференцировки набора до тех пор, пока прикрепленные клетки полностью покрывают поверхность сосуда. На стадиях 2-4, по мере пролиферации клеток и уменьшения их гибели, монослои становятся более компактными, а отработанная среда не такой мутной, как на стадии 1 (рис. 2А). Как было продемонстрировано на примере инсулиновых репортёрных клеток Mel1 INSGFP/W, в конце 1-й стадии может быть достигнуто не менее 95% дефинитивных клеток энтодермы FOXA2+/SOX17+ и 80% клеток-предшественников поджелудочной железы PDX1+/NKX6.1+ в конце стадии 4 (рис. 2B-E). Показано, что переход клеток-предшественников поджелудочной железы из планарной культуры в суспензионную культуру способствует последующей индукции эндокринных клеток23,24. В этом обновленном протоколе мы используем планшеты с микролунками и обеспечиваем агрегацию клеток в течение 24 часов. При этом одновременно образуются тысячи кластеров-предшественников поджелудочной железы с одинаковым размером и морфологией (рис. 3А, В), а средняя эффективность агрегации (путем вычисления процента клеток, включенных в агрегаты) составляет 74,1% ± 4,4% (рис. 3С). Важно отметить, что экспрессия PDX1 и NKX6.1 поддерживается на высоких уровнях в этих кластерах после агрегации (рис. 3D, E), что позволяет предположить эффективное производство предшественников поджелудочной железы in vitro с помощью набора для дифференцировки и планшета с микролунками.

Затем мы используем R-протокол (метод, модифицированный Rezania et al.6) для последней 3-ступенчатой дифференцировки в статической суспензионной культуральной системе с использованием плоскодонных 96-луночных планшетов ULA для дальнейшей дифференциации этих панкреатических предшественников, полученных из набора, к hPSC-островкам (рис. 1). Инсулиноэкспрессирующие клетки постепенно индуцируются в эндокринных кластерах, на что указывает увеличение сигналов INS-GFP в живых культурах с течением времени (рис. 4A, B). Количественная оценка размера кластера показывает, что средний диаметр кластеров 5-й стадии составляет 150 мкм, а к 7-й стадии средний диаметр увеличивается до 220 мкм (рис. 4C). Кластеры преимущественно сохраняют свой гладкий, сферический вид по мере роста между стадиями 5 и 7, что позволяет предположить, что метод статического культивирования ограничивает скопление кластеров по сравнению с орбитальными суспензионными культурами на основе встряхивания (которые, как правило, генерируют скопления большого размера)25. Сохранение компактных кластеров с гладкой сферической морфологией является показателем хорошей жизнеспособности дифференцирующихся клеток, что важно для успешной дифференцировки в сторону функциональных hPSC-островков в конечном итоге.

Характеристика клеточного состава показывает, что hPSC-островки 7-й стадии, генерируемые гибридным протоколом, в основном эндокринны и состоят из четырех основных типов островковых клеток, включая инсулин-положительные бета-клетки, глюкагон-положительные альфа-клетки, соматостатин-положительные дельта-клетки и полипептид-положительные PPY-клетки поджелудочной железы, в то время как энтерохромаффинные клетки (полученные из нецелевой линии26) также присутствуют (рис. 5A-C). Примечательно, что этот гибридный протокол генерирует в основном моногормональные островковые клетки (~50% CPEP+/GCG-/SST-клеток, ~17% GCG+/CPEP-клеток и ~12% SST+/CPEP-клеток) и только меньшинство бигормональных клеток (CPEP+/GCG+ или CPEP+/SST+) в культурах 7-й стадии (рис. 5B-D). Исследование нескольких ключевых транскрипционных факторов и маркеров зрелых бета-клеток в hPSC-островках 7-й стадии показывает, что дифференцирующиеся бета-клетки экспрессируют PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA и транспортер глюкозы GLUT1 (рис. 6A). Кроме того, ~60% клеток INS+/PDX1+ (рис. 6B) и 50% клеток CPEP+/NKX6.1+ (рис. 6C) индуцируются в культурах 7-й стадии, что позволяет предположить эффективную генерацию функциональных бета-клеток с использованием гибридной стратегии, представленной здесь. Действительно, анализ статической глюкозостимулированной секреции инсулина (GSIS) in vitro показывает, что hPSC-островки 7-й стадии могут секретировать высокие уровни инсулина, реагируя как на высокий уровень глюкозы, так и на прямую деполяризацию (рис. 6D). Несмотря на то, что эта функция обнадеживает, реакция in vitro на глюкозу от островков hPSC все еще не эквивалентна таковой у трупных островков с точки зрения величины секреции инсулина (рис. 6D), а общее содержание инсулина в островках hPSC составляет примерно половину от такового в трупных островках (рис. 6E). Для получения hPSC-островков с более зрелыми фенотипами бета-клеток требуется постоянная оптимизация.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор схемы дифференцировки для генерации функциональных hPSC-островков in vitro. На диаграмме рабочего процесса представлен обзор семиступенчатой процедуры, включающей дифференцировку чПСК в клетки-предшественники поджелудочной железы в планарной культуре с использованием набора панкреатических предшественников, агрегацию в кластеры-предшественники поджелудочной железы с использованием микролуночных планшетов и переход к островкам чПСК в статической суспензионной культуре. Инсулиновая репортерная линия hESC, Mel1 INSGFP/W, используется в этом исследовании в качестве примера для демонстрации эффективности этого гибридного метода. Сокращения: чПСК = плюрипотентные стволовые клетки человека; GSIS = глюкозостимулированная секреция инсулина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Направленная дифференцировка чПСК в клетки-предшественники поджелудочной железы с использованием набора панкреатических предшественников. (A) Репрезентативные фазово-контрастные изображения, показывающие морфологию клеток на указанных стадиях. Масштабные линейки = 750 мкм. (B, C) Репрезентативные графики проточной цитометрии для ключевых маркеров (B) дефинитивных клеток энтодермы 1-й стадии (FOXA2+/SOX17+) и (C) клеток-предшественников поджелудочной железы 4-й стадии (PDX1+/NKX6.1+). (D) Репрезентативные иммуноокрашивающие изображения клеток-предшественников поджелудочной железы для PDX1 (красный) и NKX6.1 (зеленый). Ядра окрашивали DAPI (синим). Масштабная линейка = 200 мкм. (E) Проточная цитометрическая количественная оценка клеток PDX1+/NKX6.1+ в клетках-предшественниках поджелудочной железы 4-го дня 4-го дня (n = 5 биологических репликатов). Сокращения: чПСК = плюрипотентные стволовые клетки человека; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Агрегация в кластеры-предшественники поджелудочной железы одинакового размера с использованием микролуночных планшетов диаметром 400 мкм. (A) Репрезентативные фазово-контрастные изображения в конце Стадии 4, показывающие морфологию кластера в микролунке и после извлечения из микролунки. Масштабные линейки = 300 мкм. (B) Количественная оценка диаметра кластера в конце этапа 4 (n = 60 кластеров из 3 биологических репликаций). (C) Количественная оценка эффективности агрегации в конце 4-го этапа (n = 5 биологических репликаций). (D) Репрезентативные иммуноокрашивающие изображения кластеров-предшественников поджелудочной железы для PDX1 (красный) и NKX6.1 (зеленый). Ядра окрашивали DAPI (синим). Масштабная линейка = 100 мкм. (E) Проточная цитометрическая количественная оценка клеток PDX1+/NKX6.1+ в агрегатах-предшественниках поджелудочной железы 4-го дня 4-го дня (n = 4 биологических репликата). Аббревиатура: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Дифференцировка предшественников поджелудочной железы в hPSC-островки в системе статической суспензии . (A) Репрезентативные фазово-контрастные изображения (верхняя панель) и флуоресцентные изображения (нижняя панель), показывающие морфологию кластеров и картину экспрессии инсулина на указанных стадиях. Масштабные линейки = 300 мкм. (B) Количественная оценка средней интенсивности флуоресцентных излучений INS-GFP на кластер на указанных стадиях (n = 30 кластеров из двух биологических репликаций). (C) Количественная оценка диаметра кластера на указанных стадиях (n = 60 кластеров из трех биологических репликаций). Сокращения: чПСК = плюрипотентная стволовая клетка человека; ИНС = инсулин; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Характеристика клеточного состава в hPSC-островках 7-й стадии. (A) Репрезентативные иммуноокрашивающие изображения hPSC-островков 7-й стадии, показывающие различные типы клеток (SYN, панэндокринный маркер; CK19, маркер протоков; INS-GFP, инсулин обозначается репортерными сигналами GFP; ОЦГ; ТСТ; ППИ; ЭНК окрашивался SLC18A1 антителами). Ядра окрашивали DAPI (синим). Масштабные линейки = 100 мкм. (B,C) Репрезентативные графики проточной цитометрии (B) процентного содержания клеток CPEP+ и GCG+ в hPSC-островках 7-й стадии и (C) процентного содержания клеток CPEP+ и SST+ в hPSC-островках 7-й стадии. (D) Количественная оценка методом проточной цитометрии указанных клеточных маркеров в hPSC-островках 7-й стадии (n = 4 биологических репликата). Сокращения: чПСК = плюрипотентная стволовая клетка человека; INS= инсулин; GFP = зеленый флуоресцентный белок; SYN = синаптофизин; ГКТ = глюкагон; ТСТ = соматостатин; PPY = панкреатический полипептид; ЭНК = энтерохромаффин; CPEP = С-пептид; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Характеристика in vitro и функциональная оценка hPSC-островков 7-й стадии. (A) Репрезентативные иммуноокрашивающие изображения островков hPSC 7-й стадии, показывающие коэкспрессию инсулина (на что указывают репортерные сигналы INS-GFP) с несколькими ключевыми маркерами бета-клеток, такими как NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 и транспортер глюкозы GLUT1. Ядра окрашивали DAPI (синим). Масштабные линейки = 100 мкм. (B,C) Репрезентативные графики проточной цитометрии (B) процентного содержания клеток INS+/PDX1+ и (C) процентного содержания клеток CPEP+/NKX6.1+. (D) Статические анализы GSIS, показывающие высвобождение инсулина из hPSC-островков 7-й стадии (n = 6, включая 3 биологических и 2 технических репликата) и островков человека (n = 6, включая 3 биологических и 2 технических репликатов) в ответ на высокий уровень глюкозы (16,7 G, 16,7 мМ глюкозы) и 30 мМ деполяризацию KCl. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Для сравнения двух указанных групп использовали непарный двусторонний t-критерий (**p < 0,01). (E) Общее содержание инсулина в hPSC-островках 7-й стадии (n = 6, включая 3 биологических и 2 технических репликата) и человеческих островках (n = 6, включая 3 биологических и 2 технических репликата). Для сравнения двух групп использовали непарный двусторонний t-критерий (*p < 0,05). Сокращения: чПСК = плюрипотентная стволовая клетка человека; ИНС = инсулин; GFP = зеленый флуоресцентный белок; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Рецептура всех растворов и сред, используемых в данном протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Составление дифференцирационных сред 1-7 стадий. В таблице приведена рецептура приготовления дифференцирующей среды 1-7 стадий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье описывается семиступенчатый гибридный протокол, который позволяет генерировать островки hPSC, способные секретировать инсулин при глюкозном исследовании в течение 40 дней культивирования in vitro. Считается, что среди этих многочисленных этапов эффективная индукция окончательной энтодермы является важной отправной точкой для окончательных результатов дифференцировки18,27,28. В протоколе производителя для инициирования дифференцировки рекомендуется плотность посева 2,6 × 105/см2, а клетки подвергают воздействию среды 1-й стадии в течение 2 дней. Чтобы убедиться, что клетки достигают близкого слияния на 1-й день (90%-100%), мы настоятельно рекомендуем проверить плотность посева при работе на новой линии hPSC, поскольку оптимальная плотность посева может варьироваться. Например, при тестировании всех трех линий hPSC в наших руках оптимальным было обнаружено 1,6-1,80 × 10 5/см2, а не 2,60 × 105/см2. Увеличение продолжительности культивирования на стадии 1 с 2 до 3 дней с одним дополнительным днем в среде стадии 1B повышает чистоту клеток FOXA2+/SOX17+ с 80% до > 93% (данные не показаны). Если доля клеток FOXA2+/SOX17+ ниже 70% в конце стадии 1, индукция клеток PDX1+ и клеток PDX1+/NKX6.1+, скорее всего, будет нарушена.

Важно отметить, что некоторая гибель клеток может наблюдаться в течение всей культуры 1-й стадии, в то время как прикрепленные клетки должны покрывать 100% площади поверхности. На стадиях 2-4 снижение клеточной гибели одновременно с пролиферацией клеток приводит к компактным и многослойным клеткам, что, как сообщается, имеет решающее значение для эффективной индукции маркеров-предшественников поджелудочной железы PDX1 и NKX6.1 и их ядерной локализации29,30. В последний день 4-й стадии клетки диссоциируют и агрегируют в кластеры с помощью микролуночных планшетов AggreWell диаметром 400 мкм. По сравнению с другими подходами, такими как подвешенная агрегация, ручная агрегация или использование U-образных 96-луночных планшетов, агрегация AggreWell генерирует тысячи сферических кластеров одинакового размера, что иллюстрирует надежность этого метода.

Для эндокринной индукции на этапах 5-7 в статической 3D-культуре мы переносим среднее количество ~20 кластеров панкреатического предшественника, полученных из KIT, в каждую лунку плоскодонных 96-луночных планшетов ULA. Этот метод значительно уменьшает образование скоплений слишком большого размера и улучшает жизнеспособность клеток, возможно, за счет ограничения слияния кластеров и/или снижения опосредованной сдвиговым стрессом потери клеток во время орбитальной культуры шейкера. Чтобы удалить плавающие мертвые ячейки в отработанной среде и снизить риск потери кластеров при смене среды, мы рекомендуем обновить около двух третей от общего объема среды. Мы отмечаем, что это частичное изменение среды не препятствует эндокринной дифференцировке, а вместо этого может обеспечить мягкий переход при переключении между различными стадиями. Тем не менее, некоторая гибель клеток все еще может наблюдаться во время стадии 5 и ранней стадии 6 с помощью этого гибридного протокола при переходе от планарной культуры к статической суспензионной культуре. Репортерные линии hPSC (например, Mel1 INSGFP/W hESCs) полезны для мониторинга дифференциации на поздних стадиях в живых культурах. Проточная цитометрия поможет исследовать NKX6.1+/NEUROD1+ в конце стадии 5, INS+/NKX6.1+ в конце стадии 6 и CPEP+/NKX6.1+ в конце стадии 7. Эффективная индукция популяций CPEP+, экспрессируемых совместно с NKX6.1, имеет решающее значение для достижения чувствительности к глюкозе в бета-клетках31,32. В связи с этим этот протокол последовательно генерирует >50% клеток CPEP+/NKX6.1+ в результирующих hPSC-островках 7-й стадии, которые могут секретировать инсулин в ответ на высокий уровень глюкозы in vitro.

Несмотря на то, что данный протокол продемонстрировал эффективную генерацию инсулин-продуцирующих островков hPSC, у этого метода есть ограничения. Эффективность дифференцировки в конце 4-й стадии от различных линий ЧПСК, в частности ИПСК, с помощью этого набора предшественников поджелудочной железы все еще может быть вариабельной (данные не показаны). Оптимизация должна проводиться в индивидуальном порядке. Этот метод для последних трех стадий дифференциации основан на использовании статической суспензионной культуры в 96-луночных планшетах, что является трудоемким и не масштабируемым, что ограничивает его применение только исследованиями. Несмотря на обнадеживающую способность к секреции инсулина, реакция на глюкозу in vitro и содержание инсулина в островках hPSC значительно ниже, чем в трупных островках. Для дальнейшей оптимизации протокола потребуются дальнейшие усилия. Несмотря на эти ограничения, мы считаем, что представленный здесь протокол предоставляет материалы, полученные из ПСК, пригодные для скрининга факторов, индуцирующих дифференцировку, и регуляторов секреции островкового гормона, а также для моделирования дисфункции островковых клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Тимоти Киффер (Timothy J. Kieffer) был сотрудником ViaCyte во время подготовки этой рукописи. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мы выражаем признательность за поддержку со стороны компаний STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF и Канадского института исследований в области здравоохранения. Цзя Чжао (Jia Zhao) и Шэнхуэй Лян (Shenghui Liang) являются лауреатами премии Майкла Смита Health Research BC Trainee Award. Митчелл Дж.С. Браам (Mitchell J.S. Braam) является стипендиатом Mitacs Accelerate Fellowship. Диепирие Г. Иворима является лауреатом стипендии Александра Грэма Белла для выпускников Канады и памятной премии Политехнической школы CFUW 1989 года. Мы искренне благодарим д-ра Эдуарда Г. Стэнли (Edouard G. Stanley) из MCRI и Университета Монаша за совместное использование линии Mel1 INS GFP/W, а также Институт диабета Альберты (Alberta Diabetes Institute Islet Core) за изоляцию и распространение островков человека. Мы также выражаем признательность за поддержку со стороны Института наук о жизни (Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry) при Университете Британской Колумбии. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma T6397 Thyroid hormone
4% PFA solution Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom Corning Costar (VWR) CLS3474 Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase STEMCELL Technologies 07920 Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates STEMCELL Technologies 34415 400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates STEMCELL Technologies 34815 800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) R&D Systems IC2400G 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control R&D Systems IC108G 1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) BD Sciences 566032 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control R&D Systems IC0041G 1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) BD Pharmingen 565831 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) BD Sciences 565689 1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) BD Sciences 563338 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) BD Sciences 562594 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 557714 1:50 in flow cytometry
ALK5i II Cayman Chemicals 14794 TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution  STEMCELL Technologies 7010 Microwell Rinsing Solution
Assay chamber Cellvis D35-10-1-N For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific BP1600-100 For immunostaining procedure
CK19 antibody DAKO M0888 1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose Sigma G8769 Medium supplement
DAPI Sigma D9542 For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific 11330032 Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 Life technologies A21432 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 Life technologies A21447 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 Life technologies A31570 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A31571 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 Life technologies A31572 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 Life technologies A31573 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 Life technologies A21448 1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS Sigma D8537 Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human Alpco 80-INSHU-E01.1 For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA Proliant 68700 Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit BD Sciences 554714 Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 7174 For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody Sigma G2654 1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody Thermo Fisher Scientific PA1-37782 1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x) Gibco 35050061 L-glutamine supplement
Glycerol Thermo Fisher Scientific G33-4 For tissue clearing and mounting
GSi XX Sigma Millipore 565789 Notch inhibitor
Heparin Sigma H3149 Medium supplement
ITS-X (100x) Thermo Fisher Scientific 51500056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189  STEMCELL Technologies 72147 BMP antagonist
MAFA antibody Abcam ab26405 1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified Thermo Fisher Scientific 08-774-552 Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium Life technologies 10372019 Base medium
mTeSR1 Complete Kit STEMCELL Technologies 85850 stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma A9165 Antioxidant
NaHCO3 Sigma S6297 Medium supplement
NEUROD1 antibody R&D Systems AF2746 1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody DSHB F55A12-c 1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody R&D Systems AF6297 1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS Sigma D8662 With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody Abcam ab47267 1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) BD Sciences 565860 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) BD Sciences 563023 1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) BD Sciences 562161 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 554680 1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) BD Sciences 564563 1:200 in flow cytometry
R428  Cayman Chemicals 21523 AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans Sigma R2625 Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x Sigma 20-188 For hormone extraction
SANT-1 Sigma S4572 SHH inhibitor
SLC18A1 antibody Sigma HPA063797 1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody Sigma HPA019472 1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit STEMCELL Technologies 05120 Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody Novus NB120-16659 1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100 Sigma X100 For permeabilization
Trolox  Sigma Millipore 648471 Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express Life technologies 12604-021 cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody R&D Systems AF3586 1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304 ROCK inhibitor
Zinc sulfate Sigma Z0251 Medium supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Tags

Биология развития выпуск 196 Инсулин-продуцирующие кластеры Островковые кластеры Бета-клетки Лечение диабета Протокол Набор предшественников поджелудочной железы R-протокол Микролуночные планшеты Эндокринная дифференцировка 96-луночный формат статической суспензии Характеристика in vitro Функциональная оценка Островки полученные из HPSC Методы культивирования стволовых клеток Биологические анализы
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в инсулин-продуцирующие островковые кластеры
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J.… More

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J. S., Baker, R. K., Iworima, D. G., Quiskamp, N., Kieffer, T. J. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters. J. Vis. Exp. (196), e64840, doi:10.3791/64840 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter