Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64840
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 3, 1,2,4
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia
* These authors contributed equally

Summary

התמיינות תאי גזע לתאי איון מספקת פתרון חלופי לטיפול קונבנציונלי בסוכרת ולמידול מחלות. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של תרבית תאי גזע המשלב ערכת התמיינות מסחרית עם שיטה שאושרה בעבר כדי לסייע בייצור איים מפרישי אינסולין שמקורם בתאי גזע בצלחת.

Abstract

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) לתאי בטא מפרישי אינסולין מספקת חומר לחקר תפקוד תאי בטא וטיפול בסוכרת. עם זאת, נותרו אתגרים בהשגת תאי בטא שמקורם בתאי גזע המחקים כראוי תאי בטא אנושיים מקומיים. בהתבסס על מחקרים קודמים, תאי איון שמקורם ב-hPSC נוצרו כדי ליצור פרוטוקול עם תוצאות התמיינות ועקביות משופרות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בערכת אב לבלב בשלבים 1-4, ואחריה פרוטוקול שונה ממאמר שפורסם בעבר בשנת 2014 (להלן "פרוטוקול R") במהלך שלבים 5-7. נהלים מפורטים לשימוש בערכת אב הלבלב ולוחות מיקרווול בקוטר 400 מיקרומטר ליצירת אשכולות אב לבלב, פרוטוקול R להתמיינות אנדוקרינית בפורמט תרחיף סטטי של 96 בארות, ואפיון חוץ גופי והערכה תפקודית של איים שמקורם ב- hPSC, כלולים. הפרוטוקול המלא לוקח שבוע אחד להרחבה ראשונית של hPSC ואחריו ~ 5 שבועות להשגת איים hPSC מייצרי אינסולין. אנשי צוות עם טכניקות בסיסיות של תרבית תאי גזע והכשרה בבדיקות ביולוגיות יכולים לשחזר פרוטוקול זה.

Introduction

תאי בטא בלבלב מפרישים אינסולין המגיב לעלייה ברמות הגלוקוז בדם. חולים ללא ייצור אינסולין מספיק עקב הרס אוטואימוני של תאי בטא בסוכרת מסוג 1 (T1D)1, או עקב תפקוד לקוי של תאי בטא בסוכרת מסוג 2 (T2D)2, מטופלים בדרך כלל במתן אינסולין אקסוגני. למרות טיפול מציל חיים זה, הוא אינו יכול להתאים במדויק לשליטה המעודנת ברמת הגלוקוז בדם כפי שהיא מושגת על ידי הפרשת אינסולין דינמית מתאי בטא בתום לב. ככאלה, חולים סובלים לעתים קרובות מההשלכות של אירועי היפוגליקמיה מסכני חיים וסיבוכים אחרים הנובעים מטיולים היפרגליקמיים כרוניים. השתלת איים גוותיים אנושיים משחזרת בהצלחה שליטה גליקמית הדוקה בחולי סוכרת סוג 1, אך מוגבלת על ידי זמינותם של תורמי איים וקשיים בטיהור איים בריאים להשתלה 3,4. אתגר זה יכול, באופן עקרוני, להיפתר על ידי שימוש ב-hPSCs כחומר מוצא חלופי.

האסטרטגיות הנוכחיות ליצירת איים מפרישי אינסולין מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) במבחנה שואפות לעתים קרובות לחקות את תהליך התפתחות הלבלב העוברי in vivo 5,6. זה דורש ידע של מסלולי איתות אחראי והוספה מתוזמנת של גורמים מסיסים מתאימים כדי לחקות שלבים קריטיים של הלבלב העוברי המתפתח. תוכנית הלבלב מתחילה עם המחויבות לאנדודרם סופי, המסומן על ידי גורמי שעתוק תיבת מזלג A2 (FOXA2) ואזור קביעת מין Y-box 17 (SOX17)7. התמיינות רצופה של אנדודרם סופי כרוכה בהיווצרות של צינור מעיים פרימיטיבי, היוצר תבנית למעי קדמי אחורי המבטא את ההומיאובוקס 1 של הלבלב והתריסריון 1 (PDX1)7,8,9, והתרחבות אפיתל לאבות לבלב המבטאים יחד PDX1 ו- NK6 הומיאובוקס 1 (NKX6.1)10,11.

מחויבות נוספת לתאי איון אנדוקריני מלווה בביטוי ארעי של רגולטור ראשי פרו-אנדוקריני נוירוגנין-3 (NGN3)12 ואינדוקציה יציבה של גורמי שעתוק מרכזיים התמיינות עצבית 1 (NEUROD1) ו- NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. התאים העיקריים המבטאים הורמונים, כגון תאי בטא מייצרי אינסולין, תאי אלפא מייצרי גלוקגון, תאי דלתא מייצרי סומטוסטטין ותאי PPY מייצרי פוליפפטיד בלבלב, מתוכנתים לאחר מכן. עם הידע הזה, כמו גם תגליות ממחקרי סינון תרופות נרחבים ובעלי תפוקה גבוהה, ההתקדמות האחרונה אפשרה יצירת תאי hPSC עם תאים הדומים לתאי בטא המסוגלים להפריש אינסולין 14,15,16,17,18,19.

פרוטוקולים הדרגתיים דווחו לייצור תאי בטא מגיבים לגלוקוז 6,14,18,19. הפרוטוקול הנוכחי, המבוסס על מחקרים אלה, כולל שימוש בערכת אב לבלב ליצירת תאי אב לבלב PDX1+/NKX6.1+ בתרבית מישורית, ולאחר מכן צבירת לוחות מיקרווול לצבירים בגודל אחיד והתמיינות נוספת לעבר איי hPSC מפרישי אינסולין עם פרוטוקול R בתרבית תרחיף תלת-ממדית סטטית. ניתוחי בקרת איכות, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוסטיין והערכה תפקודית, מבוצעים לאפיון קפדני של התאים המתמיינים. מאמר זה מספק תיאור מפורט של כל שלב של הבידול המכוון ומתאר את גישות האפיון במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה מבוסס על עבודה עם קווי hPSC, כולל H1, HUES4 PDXeG ו-Mel1 INSGFP/W, בתנאים נטולי הזנה. הליך שלב אחר שלב מפורט בסעיף זה, עם נתונים תומכים מההבחנה של Mel1 INSGFP/W בסעיף התוצאות המייצגות. אנו ממליצים כי יש צורך במיטוב נוסף בעת עבודה עם קווי hPSC אחרים שאינם מצוינים כאן. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל הריאגנטים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת מדיה בידול ופתרונות

הערה: ראה טבלה 1 עבור כל הפתרונות שיש להכין וטבלה 2 עבור מדיית הבידול.

  1. הכינו את כל המדיה והריאגנטים לתרבית תאים בארון בטיחות ביולוגית סטרילי. יש לחמם לזמן קצר תמיסות הקשורות לתרבית תאים ומדיה בסיסית ל-37°C באמבטיה לפני השימוש.
    הערה: כמתואר להלן, הכינו מדיית בידול טרייה מדי יום על ידי הוספת תוספים והשתמשו בהם באותו היום. לחילופין, ערכת האב ללבלב מספקת את האפשרות להכין מראש נפח גדול יותר שניתן להשתמש בו במשך מספר ימים בהתאם לפרוטוקול היצרן. שתי השיטות להכנת מדיה מוכיחות את עצמן כעובדות היטב. שימו לב שלא מומלץ להשאיר את המדיה לזמן ממושך באמבט המים. בעת הכנת מדיה טרייה בכל יום, מומלץ aliquot תוספי כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.

2. התמיינות של hPSCs לתאי אב של הלבלב

  1. יש לשמור על hPSCs בלתי מובחנים על כלים מצופים מטריג'ל במדיום mTeSR1 מלא ולבצע שינויים בינוניים מדי יום. במהלך תרבית תחזוקה, עוברים hPSCs כל 3-4 ימים כאשר התאים מגיעים למפגש ~70% באמצעות מגיב הדיסוציאציה התאית בהתאם לפרוטוקול היצרן. כדי ליזום התמיינות, נתקו את התאים לתאים בודדים וזרעו אותם על צלחות מטופלות בתרבית רקמות של 6 או 12 בארות (עם נפחי מדיה של 2 מ"ל או 1 מ"ל לבאר, בהתאמה).
    הערה: ראה טבלה 1 להוראות הקשורות לאחסון התווך הבסיסי של אנדודרם והאליציטוטים שלו.
  2. בארות תרבית Precoat עם Matrigel מוסמך hESC (מדולל ב-DMEM/F12 קר כקרח לפי המלצת פרוטוקול היצרן) ומניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 למשך 30 דקות.
  3. מעבירים את הצלחת המצופה במטריג'ל לטמפרטורת החדר (יש להשתמש תוך 3 שעות).
  4. שאפו את המדיום המושקע מתרבית hPSC ושטפו פעם אחת עם DPBS. נתקו תרבית hPSC לתאים בודדים עם אנזים דיסוציאציה של תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות. שטפו את התאים על ידי הוספת מדיום DMEM/F12 חם, העבירו לצינור חרוטי של 15 מ"ל או 50 מ"ל, והסתובבו ב-300 × גרם במשך 5 דקות.
  5. השהה מחדש את גלולת התא עם תא גזע שלם בינוני בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 ובצע ספירת תאים חיים (טריפאן כחול שלילי) עם המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. לשאוף מטריגל מדולל ומיד לזרוע תאים חיים בצפיפות של 1.60-1.80 × 10 5/cm 2 על בארות מצופות Matrigel ולדגור ב 37 ° C לח,5% CO2 אינקובטור במשך 24 שעות. המשך לשלב 1.
    הערה: התוצאה תהיה ~95% התחלת מפגש ליזום בידול. על פי פרוטוקול היצרן, מומלצת צפיפות זריעה של 2.6 × 105/cm2 . מומלץ לבדוק צפיפויות זריעה שונות כדי לקבוע את הערך האופטימלי לקו תאים ולבדוק את כדאיות התא. אם הכדאיות היא מתחת 80%, לא להמשיך עם בידול. כדאיות תאים נמוכה יכולה להיות תוצאה של עיכול יתר או טריטורציה יתר במהלך הקציר או השארת תאים לזמן ממושך בתווך DMEM/F12 לפני הזריעה.
  6. בשלב 1 יום 1, יש לחמם לזמן קצר את האנדודרם הבסיסי בינוני ל-37°C באמבטיה ולהפשיר תוסף MR ו-CJ. הכן את מדיום שלב 1A על ידי הוספת תוספת MR ו- CJ למדיום הבסיסי של האנדודרם . מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  7. לשאוף את המדיום בילה מבארות, להוסיף שלב 1A מדיום לדגור ב 37 ° C לח, 5% CO2 אינקובטור במשך 24 שעות.
    הערה: שלבי הכביסה אינם נחוצים. הסר תאים שאינם מחוברים מהתרבית על ידי ניעור עדין של צלחת התרבית לפני חילופי המדיום. הימנעו מהפרעה לשכבה החד-שכבתית על ידי אי נגיעה בקצה הפיפטה בתחתית הבאר במהלך הסרה בינונית ובאמצעות תוספת בינונית עדינה.
  8. בשלב 1 יום 2, לחמם בקצרה את המדיום הבסיסי של אנדודרם באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר תוסף CJ. הכן את מדיום שלב 1B על ידי הוספת תוספת CJ למדיום הבסיסי של האנדודרם . מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  9. שאפו את המדיום המשומש מהבארות, הוסיפו מדיום שלב 1B, ודגרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
  10. בשלב 1 יום 3, חזור על שלבים 2.8-2.9. המשך לשלב 2.
  11. בשלב 2 יום 1, לבלב חם שלב 2-4 מדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס והפשירו את תוספת 2A ו-2B. הכינו את שלב 2A בינוני על ידי הוספת תוספת 2A ו-2B למדיום הבסיסי שלב 2-4 של הלבלב. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  12. לשאוף את המדיום המשומש מבארות, להוסיף מדיום שלב 2A, ולדגור בחממה לח 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 24 שעות.
  13. בשלב 2 יום 2, לבלב חם שלב 2-4 מדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס והפשיר תוספת 2B. הכינו את שלב 2B בינוני על ידי הוספת תוספת 2B ללבלב שלב 2-4 מדיום בסיסי. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  14. לשאוף את המדיום המשומש מבארות, להוסיף מדיום שלב 2B, ולדגור בחממה לח 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 24 שעות.
  15. בשלב 2 יום 3, חזור על שלבים 2.13-2.14. המשך לשלב 3.
  16. בשלב 3 יום 1, לבלב חם שלב 2-4 מדיום בסיסי באמבטיה 37 מעלות צלזיוס והפשרה תוספת 3. הכינו את שלב 3 בינוני על ידי הוספת תוספת 3 למדיום הבסיסי שלב 2-4 של הלבלב. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  17. שאפו את המדיום המשומש מבארות, הוסיפו מדיום שלב 3, ודגרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
  18. בשלב 3 יום 2 ויום 3, חזור על שלבים 2.16-2.17. המשך לשלב 4.
  19. בשלב 4 יום 1, לבלב חם שלב 2-4 מדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס והפשרה תוספת 4. הכינו את שלב 4 בינוני על ידי הוספת תוספת 4 למדיום הבסיסי שלב 2-4 של הלבלב. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  20. שאפו את המדיום המשומש מבארות, הוסיפו מדיום שלב 4, ודגרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
  21. בשלב 4 יום 2 עד יום 4, חזור על שלבים 2.19-2.20. המשך לשלבי הצבירה.

3. צבירה לצברי אבות לבלב באמצעות לוחות מיקרווול בקוטר 400 מיקרומטר

  1. בשלב 4 יום 5, טפלו במיקרו-בארות (למשל, פורמט צלחת 24 בארות) עם 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לכל באר.
  2. הכינו צלחת איזון וצנטריפוגה את צלחת המיקרווול במשקל של 1,300 × גרם למשך 5 דקות.
    הערה: בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שלא נותרו בועות במיקרו-בארות. צנטריפוגה שוב למשך 5 דקות נוספות אם הבועות נשארות לכודות במיקרו-בארות כלשהן.
  3. יש לשאוף את תמיסת השטיפה נגד היצמדות מהבארות ולשטוף פעם אחת ב-1 מ"ל DPBS. שאפו את ה-DPBS מהבארות והוסיפו 1 מ"ל של מדיום צבירה לכל באר.
  4. הסר את המדיום בילה מן תרביות אב הלבלב ולשטוף פעם אחת עם DPBS. נתק את התרביות לתאים בודדים עם מגיב דיסוציאציה ב 37 ° C למשך 10-12 דקות. שטפו את התאים עם DMEM/F12 חם, העבירו אותם לצינור וסובבו ב-300 × גרם במשך 5 דקות.
  5. השהה מחדש את גלולת התא בתווך הצבירה ובצע ספירת תאים חיים. זרעו 2.4-3.6 מיליון תאים בסך הכל לבאר (כלומר, 2,000-3,000 תאים למיקרו-באר) והוסיפו מדיום צבירה לכל באר כדי להגיע לנפח סופי של 2 מ"ל לבאר.
  6. טפטו בעדינות את התאים מעלה ומטה מספר פעמים עם קצה פיפטה P1000 כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים ברחבי הבאר. אין להכניס בועות לתוך microwells. צנטריפוגה את צלחת microwell ב 300 × גרם במשך 5 דקות כדי ללכוד את התאים microwells. דוגרים על צלחת המיקרווול באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לצבירה של 24 שעות וממשיכים להתמיינות שלבים 5-7.
    הערה: היזהר לא להפריע לצלחת בזמן הצבירה. ייתכן שיהיה צורך בעד 48 שעות של זמן דגירה להיווצרות אגרגטים אופטימלית.

4. הבחנה של אשכולות אבות לבלב שמקורם בערכה לאיי hPSC

  1. בשלב 5 יום 1, יש לחמם את שלב 5-7 במדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר תוספים (ראה טבלה 1 וטבלה 2). הכינו את מדיום שלב 5 על ידי הוספת תוספים (לריכוזי העבודה הסופיים) למדיום הבסיסי שלב 5-7. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  2. לאחר היווצרות הצבירה, טפטו בעדינות את הצברים מעלה ומטה מספר פעמים עם קצה פיפטה P1000 כדי לצוף תאים שאינם מצטברים. אפשרו לצברים לשקוע על ידי כוח הכבידה (חכו ~ 1 דקה). הסר בעדינות את התווך המשומש (המכיל את התאים הצפים שאינם מצטברים) מהבאר ככל האפשר תוך הימנעות משאיפה.
  3. יש לפזר מדיום שלב 5 טרי במרץ על פני השטח של צלחת המיקרווול כדי לעקור אגרגטים מהמיקרו-בארות. העברת אגרגטים לחיבור נמוך במיוחד (ULA) 6-בארות. יש לשטוף פעם אחת בתווך שלב 5 כדי לאחזר לחלוטין אגרגטים מהמיקרו-בארות.
  4. לאסוף את כל האגרגטים בבארות ULA 6, להשהות מחדש אגרגטים בשלב 5 בינוני, ולהתאים את הצפיפות ל -20 אשכולות לכל 100 μL (למשל, ~ 1,200 אשכולות צפויים להיות משוחזרים מכל באר. השהיה מחדש של 1,200 אשכולות ב-6 מ"ל של מדיום שלב 5). השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לפזר 50 μL של מדיום שלב 5 לתוך כל באר של צלחת תחתית שטוחה 96 באר ULA. מלא את בארות הפינה והקצה עם 200 μL של DPBS.
    הערה: הימנע משימוש בבארות הקצה לגידול אגרגטים מכיוון שהם נוטים להתאדות יותר; אחרת, השתמשו בצלחת בת 96 בארות שנועדה למזער את האידוי לאורך הקצוות (למשל, לוחות של 96 בארות עם תעלות מובנות) או הניחו את צלחת התרבית באינקובטור תרבית תאי מיקרו אקלים עם לחות גבוהה.
  5. הוסף 100 μL של מתלה אשכול לתוך כל באר של צלחת 96 באר תחתית שטוחה ULA, וכתוצאה מכך סך של 150 μL מדיום תרבית המכיל ממוצע של 20 אשכולות לכל באר.
    הערה: ערבבו בעדינות את מתלה המקבץ בכל פעם לפני הניפוק ל-96 בארות.
  6. הניחו את לוחות התרבית על משטח ישר באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 למשך 24 שעות.
  7. בשלב 5 יום 2, הכינו את שלב 5 מדיום לאחר שלב 4.1.
  8. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר ~ 90 μL של המדיום בילה מכל באר, ורענן עם 100 μL של מדיום שלב 5.
  9. בשלב 5 יום 3, חזור על שלבים 4.7-4.8. המשך לשלב 6.
  10. בשלב 6 יום 1, יש לחמם את שלב 5-7 במדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר תוספים (ראו טבלה 1 וטבלה 2). הכינו את מדיום שלב 6 על ידי הוספת תוספים (לריכוזי העבודה הסופיים) למדיום הבסיסי שלב 5-7. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  11. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר ~ 90 μL של המדיום בילה ורענן עם 100 μL של שלב 6 בינוני לכל באר.
  12. בשלב 6 יום 2 עד יום 8, חזור על שלבים 4.10-4.11. המשך לשלב 7.
  13. בשלב 7 יום 1, יש לחמם את שלב 5-7 במדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר תוספים (ראו טבלה 1 וטבלה 2). הכינו את המדיום שלב 7 על ידי הוספת תוספים (לריכוזי העבודה הסופיים) למדיום הבסיסי שלב 5-7. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  14. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר ~ 90 μL של המדיום בילה ורענן עם 100 μL של שלב 7 בינוני לכל באר.
  15. בשלב 7 יום 2 עד יום 12, חזור על שלבים 4.13-4.14. המשך לאפיון חוץ גופי .

5. ניתוח ציטומטרי זרימה

  1. הסר את חומרי התרבות ושטוף פעם אחת עם DPBS. נתקו את התרביות (תאי אב מישוריים או צבירי התמיינות לתאים בודדים עם מגיב דיסוציאציה על ידי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-12 דקות. יש לשטוף עם חיץ FACS ולסובב ב-300 × גרם במשך 5 דקות.
  2. השהה מחדש את גלולת התא במאגר FACS ובצע ספירת תאים. סובב תאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות. יש להשהות תאים בודדים ב-500 μL של חיץ Fix/Perm למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: יש להביא את מאגר Fix/Perm לטמפרטורת החדר לפני השימוש. מאגר Fix/Perm מכיל paraformaldehyde (PFA). יש לטפל בזהירות ב-PFA במכסה אדים ולסלק בהתאם להנחיות המוסדיות.
  3. יש לסחוט ב-500 × גרם למשך 3 דקות, לשטוף פעמיים עם 500 μL של 1x Perm/Wash buffer, ולהשהות מחדש ב-300 μL של 1x Perm/Wash buffer. העבר 100 μL של תרחיף חד-תאי (כל אחד מכיל 2.5-3 × 105 תאים) לשלוש מבחנות מיקרופוגה לבקרה לא מוכתמת, בקרת איזוטיפ וצביעת נוגדנים (ראה טבלת חומרים למידע על נוגדנים ודילול דגימה). דוגרים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ומכסים בנייר כסף.
  4. מסתובבים ב 500 × גרם במשך 3 דקות. יש לכבס פעמיים עם 500 μL של 1x Perm/Wash buffer. השהה מחדש את הדגימות במאגר FACS של 100 μL ונתח את התאים המוכתמים (ראה טבלת חומרים לצביעה תוך-תאית של סמנים בשלבים ספציפיים) באמצעות ציטומטר זרימה ותוכנה (לדוגמה, FlowJo).
    הערה: אם הדגימות אינן נבדקות מיד, אחסן אותן בטמפרטורה של 4°C המוגנות מפני אור. עבור אסטרטגיית gating, נתוני הזרימה מגודרים תחילה על ידי תכונות פיזור (FSC-A ו- SSC-A) כדי להסיר פסולת תאית קטנה, ולאחר מכן תכונות רוחב FSC-A ו- FSC כדי לזהות סינגלטים. גטינג חיובי ושלילי נקבע על ידי בקרות תאי גזע ו / או בקרות איזוטיפ לא מוכתמות.

6. הר שלם immunostaining

  1. לאסוף אשכולות בצינור microfuge. ליישב אשכולות על ידי כוח הכבידה. לשאוף את המדיום בילה ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS (עם סידן ומגנזיום). תקנו את האשכולות עם 1 מ"ל של 4% PFA ב-4°C למשך הלילה.
  2. יש לשטוף פעם אחת עם PBST ולהחדיר 20-30 אשכולות עם 500 μL של 0.3% TritonX-100 בצינור מיקרופוגה בטמפרטורת הסביבה למשך 6 שעות לפחות על שייקר הטיה.
    הערה: זמן חלחול ארוך יותר (עד 24 שעות) נדרש עבור אשכולות גדולים.
  3. יש לדגור על הצבירים ב-100 מיקרוליטר של חיץ חוסם בטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת על שייקר הטיה. הסר את המאגר החוסם ודגור על הצבירים עם 100 μL של נוגדנים ראשוניים המדוללים במאגר דילול נוגדנים בטמפרטורת הסביבה למשך הלילה על שייקר הטיה.
    הערה: אם הרקע חזק במהלך ההדמיה, יש לדגור עם נוגדנים ראשוניים בטמפרטורה של 4°C.
  4. יש לשטוף ביסודיות 3 x 30 דקות עם 500 מיקרוליטר PBST על שייקר הטיה (זווית ההטיה נקבעה על 8, מהירות מוגדרת על 20).
  5. יש לדגור על הצבירים עם 100 μL של נוגדנים משניים במאגר דילול נוגדנים בטמפרטורת הסביבה למשך הלילה על שייקר הטיה. מכסים את הצינורות בנייר כסף.
    הערה: אם הרקע חזק במהלך ההדמיה, יש לדגור עם נוגדנים משניים בטמפרטורה של 4°C.
  6. יש לשטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר PBST. הוסף 100 μL של תמיסת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBST) והכתים בטמפרטורת הסביבה למשך 10-15 דקות. מכסים בנייר כסף ומגנים מפני אור.
  7. יש לשטוף ביסודיות 3 x 30 דקות עם 500 מיקרוליטר PBST על שייקר הטיה. כסו את הצינורות בנייר כסף במהלך שלב הכביסה.
  8. יש לחבר את האשכולות לשקופיות של תאי הדמיה (ראה טבלת חומרים) מצופות מראש בדבק רקמות בהתאם לפרוטוקול היצרן ולפרוטוקולים20,21 שפורסמו.
  9. הרכבה עם מדיום ניקוי רקמות (80% גליצרול בתמיסת PBS) וכיסוי בכיסויי זכוכית. יש להגן מפני אור עד להדמיה קונפוקלית.
    הערה: אם הדגימות אינן מצולמות מיד, אחסן אותן בטמפרטורה של 4°C המוגנות מפני אור.

7. בדיקת GSIS סטטית

  1. חיץ ביקרבונט רינגר של Kreb (3.3G KRB) חם עם גלוקוז נמוך, מאגר KRB עם גלוקוז גבוה (16.7G) וחיץ KRB KCl של 30 mM באמבט של 37°C.
  2. בחרו ביד אשכולות תואמי גודל ושטפו עם 2 מ"ל של חיץ KRB חם של 3.3 גרם. מעבירים את האשכולות לצלחת 6 בארות שאינה מטופלת בתרבית רקמה ומאוזנים בחיץ חם של 3.3 גרם KRB למשך שעה אחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
  3. לאחר שיווי משקל, מלא את תא הבדיקה (ראה טבלת חומרים) ב- 100 μL של חיץ KRB חם של 3.3G. בחרו ידנית חמישה אשכולות והעבירו אותם למרכז תא הבדיקה. יש לדגור במשך 30 דקות באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 .
    הערה: השתמש בקצוות פיפטה של 10 μL להעברת אשכולות בנפח בינוני מינימלי.
  4. אספו בזהירות ~100 μL של הסופרנאטנט ואחסנו אותו בטמפרטורה של -30°C עד למדידת הפרשת האינסולין הבסיסי (ראו שלב 7.9). אין לייבש או לאבד אשכולות בשלב זה. הוסף מיד 100 μL של חיץ KRB חם 16.7G לתוך תא הבדיקה ודגור על אותם אשכולות במשך 30 דקות באינקובטור לח 37 ° C, 5% CO2 .
  5. אספו בזהירות ~100 μL של הסופרנאטנט ואחסנו אותו בטמפרטורה של -30°C עד למדידת הפרשת האינסולין המגורה על ידי גלוקוז (ראו שלב 7.9). הוסף מיד 100 μL של חיץ KCl KRB חם 30 mM לתוך תא הבדיקה ודגר על אותם אשכולות במשך 30 דקות באינקובטור לח של 37 ° C, 5% CO2 .
  6. יש לאסוף בזהירות ~100 μL של הסופרנאטנט ולאחסן בטמפרטורה של -30°C עד למדידת הפרשת האינסולין המגורה על ידי KCl (ראה שלב 7.9). הוסף מיד 100 μL של חיץ RIPA lysis לתוך תא הבדיקה ולהעביר את חיץ הליזיס המכיל את כל חמשת הצבירים לתוך צינור microfuge.
  7. אופציונלי) שברו את האשכולות באופן ידני על ידי טריטורציה נמרצת עם קצה פיפטה P200. מערבולת במשך 30 שניות ודגרה על קרח במשך 30 דקות ואחריה עוד 30 שניות של מערבולת.
    הערה: להבטיח ליזה מלאה על ידי מערבולות וזמן מספיק של דגירה על קרח.
  8. יש לסחור במהירות של 8,000 × גרם למשך דקה. יש לאסוף את הסופרנאטנט ולאחסן בטמפרטורה של -30°C עד למדידת תכולת האינסולין הכוללת (ראה שלב 7.9).
  9. למדוד אינסולין אנושי בדגימות supernatant באמצעות ערכת אינסולין אנושי ELISA על פי פרוטוקול היצרן ופרוטוקוליםשפורסמו 20,22.
    הערה: יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של דגימות סופרנטנט. אין לבדוק דגימות עם יותר משלושה מחזורי הקפאה והפשרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פיתחנו אסטרטגיה היברידית להתמיין תאי גזע לאיונים hPSC מפרישי אינסולין בשבעה שלבים, אשר משתמשת בערכת אב לבלב עבור ארבעת השלבים הראשונים בתרבית מישורית, ולאחר מכן פרוטוקול שונה הבנוי על שיטה6 שדווחה בעבר בתרבית תרחיף סטטי עבור שלושת השלבים האחרונים (איור 1). באמצעות פרוטוקול זה, הבטחת מפגש קרוב (90%-100%) של תרבית לאחר זריעת תאים (שלב 0) היא קריטית להתחלת התמיינות יעילה עבור רוב קווי hPSC (איור 2A). מומלץ מאוד לבדוק צפיפויות זריעה שונות כדי לקבוע את המצב האופטימלי לקו תאים מסוים. במהלך תרבית שלב 1, סביר להניח שהמדיה תיראה עכורה עקב תאים מתים צפים, אשר נצפים בדרך כלל בשלב זה. זה לא פוגע ביעילות ההתמיינות של הערכה כל עוד התאים המחוברים מכסים באופן מלא את שטח הכלי. במהלך שלבים 2-4, כאשר התאים מתרבים ומוות התאים פוחת, החד-שכבות נעשות דחוסות יותר והמדיה המשומשת אינה עכורה כמו בשלב 1 (איור 2A). כפי שהודגם עם כתב האינסולין Mel1 INSGFP/W hESCs, לפחות 95% תאי אנדודרם סופיים מסוג FOXA2+/SOX17+ בסוף שלב 1 ו-80% תאי אב של הלבלב PDX1+/NKX6.1+ בסוף שלב 4 ניתנים להשגה באופן שגרתי (איור 2B-E). המעבר של תאי אב של הלבלב מתרבית מישורית לתרבית תרחיף הוכח כמקדם השראת תאים אנדוקרינית עוקבת23,24. בפרוטוקול מעודכן זה, אנו משתמשים בצלחות microwell ומאפשרים 24 שעות של צבירת תאים. זה יוצר אלפי צבירי אבות לבלב עם גודל ומורפולוגיה אחידים בכל פעם (איור 3A, B), ויעילות הצבירה הממוצעת (על-ידי חישוב אחוז התאים המשולבים בצברים) היא 74.1% ±-4.4% (איור 3C). חשוב לציין שהביטוי של PDX1 ו-NKX6.1 נשמר ברמות גבוהות בצבירים האלה לאחר הצבירה (איור 3D, E), מה שמרמז על ייצור יעיל של אבות לבלב במבחנה עם ערכת ההתמיינות וצלחת המיקרו-באר.

בשלב הבא אנו משתמשים בפרוטוקול R (שיטה ששונתה מ-Rezania et al.6) עבור התמיינות תלת-שלבית האחרונה במערכת תרבית מתלה סטטית באמצעות לוחות 96 בארות שטוחים של ULA כדי להבדיל עוד יותר את אבות הלבלב האלה שמקורם בערכה לכיוון איי hPSC (איור 1). תאים המבטאים אינסולין מושרים בהדרגה בתוך אשכולות אנדוקריניים, כפי שמצוין על-ידי אותות INS-GFP מוגברים בתרביות חיות לאורך זמן (איור 4A, B). כימות גודל הצביר מגלה כי הקוטר הממוצע של אשכולות שלב 5 הוא 150 מיקרומטר, ובשלב 7 הקוטר הממוצע עולה ל-220 מיקרומטר (איור 4C). הצבירים שומרים בעיקר על המראה החלק והכדורי שלהם כשהם גדלים בין שלב 5 לשלב 7, דבר המצביע על כך ששיטת התרבית הסטטית מגבילה את התגבשות הצבירים בהשוואה לתרביות תרחיף מבוססות שייקר מסלוליות (שבדרך כלל מייצרות כמה צבירים גדולים מדי)25. תחזוקה של אשכולות דחוסים עם מורפולוגיה כדורית חלקה היא אינדיקטור לכדאיות טובה של התאים המתמיינים, אשר חשוב להתמיינות מוצלחת לקראת hPSC-איים פונקציונליים בסופו של דבר.

אפיון הרכב התאים מראה כי איים של hPSC בשלב 7 הנוצרים על-ידי הפרוטוקול ההיברידי הם בעיקר אנדוקריניים ומורכבים מארבעה סוגי תאי איון עיקריים, כולל תאי בטא חיוביים לאינסולין, תאי אלפא חיוביים לגלוקגון, תאי דלתא חיוביים לסומטוסטטין ותאי PPY חיוביים לפוליפפטיד בלבלב, בעוד שתאי אנטרוכרומפין (נגזרים משושלתמחוץ למטרה 26) נמצאים גם הם (איור 5A-C). יש לציין כי פרוטוקול היברידי זה מייצר בעיקר תאי איון מונו-הורמונליים (~50% תאי CPEP+/GCG-/SST, ~17% תאי GCG+/CPEP ו~12% תאי SST+/CPEP) ורק מיעוט של תאים דו-הורמונליים (CPEP+/GCG+ או CPEP+/SST+) בתרביות שלב 7 (איור 5B-D). בחינה של מספר גורמי שעתוק מרכזיים וסמנים בוגרים של תאי בטא בשלב 7 של hPSC מגלה כי תאי בטא מתמיינים מבטאים PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA וטרנספורטר גלוקוז GLUT1 (איור 6A). יתר על כן, ~60% תאי INS+/PDX1+ (איור 6B) ו-50% תאי CPEP+/NKX6.1+ (איור 6C) מושרים בתרביות שלב 7, מה שמרמז על ייצור יעיל של תאי בטא פונקציונליים באמצעות האסטרטגיה ההיברידית כפי שמוצגת כאן. ואכן, בדיקות הפרשת אינסולין סטטיות במבחנה (GSIS) מראות כי איים בשלב 7 hPSC יכולים להפריש רמות גבוהות של אינסולין המגיב הן לגלוקוז גבוה והן לדפולריזציה ישירה (איור 6D). בעוד שהפונקציה הזו מעודדת, תגובת הגלוקוז במבחנה מאיי hPSC עדיין אינה שוות ערך לזו של איים גוותיים במונחים של עוצמת הפרשת אינסולין (איור 6D), ותכולת האינסולין הכוללת של איי hPSC היא בערך מחצית מהכמות הזו באיים קדווריים (איור 6E). אופטימיזציה מתמשכת נדרשת כדי להשיג hPSC-איים עם פנוטיפים בוגרים יותר של תאי בטא.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של סכמת בידול ליצירת hPSC-איים פונקציונליים במבחנה. דיאגרמת זרימת העבודה מספקת סקירה כללית של התהליך בן שבעת השלבים המעורב בהתמיינות של hPSCs לתאי אב של הלבלב בתרבית מישורית באמצעות ערכת האב של הלבלב, צבירה לצברי אבות של הלבלב באמצעות לוחות מיקרו-באר, ומעבר לאיי hPSC בתרבית תרחיף סטטית. קו hESC של מדווח אינסולין, Mel1 INSGFP/W, משמש לאורך מחקר זה כדוגמה להדגמת יעילותה של שיטה היברידית זו. קיצורים: hPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים; GSIS = הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התמיינות מכוונת של hPSCs לתאי אב של הלבלב באמצעות ערכת האב של הלבלב. (A) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות המציגות מורפולוגיה של התא בשלבים שצוינו. פסי קנה מידה = 750 מיקרומטר. (B, C) תרשימי ציטומטריה של זרימה מייצגת עבור סמנים מרכזיים של (B) תאי אנדודרם סופיים בשלב 1 (FOXA2+/SOX17+) ו-(C) תאי אב לבלב בשלב 4 (PDX1+/NKX6.1+). (D) תמונות מייצגות של תאי אב של הלבלב עבור PDX1 (אדום) ו-NKX6.1 (ירוק). גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (E) כימות ציטומטרי זרימה של תאי PDX1+/NKX6.1+ בשלב 4 יום 4 תאים חד-שכבתיים של אב לבלב (n = 5 עותקים ביולוגיים). קיצורים: hPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צבירה לצברי אבות לבלב בגודל אחיד באמצעות לוחות מיקרו-באר בקוטר 400 מיקרומטר. (A) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות בסוף שלב 4 המציגות מורפולוגיית אשכול במיקרו-באר ולאחר שליפה מהמיקרו-באר. פסי קנה מידה = 300 מיקרומטר. (B) כימות קוטר הצביר בסוף שלב 4 (n = 60 אשכולות מ-3 העתקים ביולוגיים). (C) כימות יעילות הצבירה בסוף שלב 4 (n = 5 העתקים ביולוגיים). (D) תמונות מייצגות של צבירי אבות לבלב עבור PDX1 (אדום) ו-NKX6.1 (ירוק). גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) כימות ציטומטרי זרימה של תאי PDX1+/NKX6.1+ בשלב 4 יום 5 צברי אב לבלב (n = 4 העתקים ביולוגיים). קיצור: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התמיינות של אבות הלבלב לאיים hPSC במערכת תרבית תרחיף סטטית . (A) תמונות ניגודיות פאזה מייצגת (פאנל עליון) ותמונות פלואורסצנטיות (פאנל תחתון) המציגות מורפולוגיית אשכול ותבנית ביטוי אינסולין בשלבים שצוינו. פסי קנה מידה = 300 מיקרומטר. (B) כימות עוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות של INS-GFP לכל אשכול בשלבים שצוינו (n = 30 אשכולות משני העתקים ביולוגיים). (C) כימות קוטר הצביר בשלבים שצוינו (n = 60 אשכולות משלושה העתקים ביולוגיים). קיצורים: hPSC = תא גזע פלוריפוטנטי אנושי; INS = אינסולין; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אפיון הרכב התא באיים של hPSC בשלב 7. (A) תמונות מייצגות של איונים בעלי תאי hPSC בשלב 7 המציגות סוגי תאים שונים (SYN, סמן פאן-אנדוקריני; CK19, סמן צינור; INS-GFP, אינסולין מסומן על ידי אותות GFP כתב; GCG; SST; PPY; ENC הוכתם על ידי נוגדן SLC18A1). גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B,C) חלקות ציטומטריה של זרימה מייצגת של אחוז (B) של תאי CPEP+ ו- GCG+ בשלב 7 של איי hPSC ו- (C) אחוז תאי CPEP+ ו- SST+ בשלב 7 של איי hPSC. (D) כימות ציטומטריית זרימה של סמני תאים מסומנים בשלב 7 hPSC-איים (n = 4 שכפולים ביולוגיים). קיצורים: hPSC = תא גזע פלוריפוטנטי אנושי; INS = אינסולין; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; SYN = סינפטופיזין; GCG = גלוקגון; SST = סומטוסטטין; PPY = פוליפפטיד הלבלב; ENC = enterochromaffin; CPEP = C-פפטיד; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: אפיון חוץ גופי והערכה תפקודית של איים בעלי hPSC שלב 7. (A) תמונות מייצגות של איונים בעלי hPSC בשלב 7 המראות ביטוי משותף של אינסולין (מסומן על ידי אותות INS-GFP של כתב) עם מספר סמנים מרכזיים של תאי בטא, כגון NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 וטרנספורטר גלוקוז GLUT1. גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B,C) תרשימי ציטומטריה של זרימה מייצגת של אחוז (B) של תאי INS+/PDX1+ ואחוז (C) של תאי CPEP+/NKX6.1+. (D) מבחני GSIS סטטיים המראים שחרור אינסולין מאיים שלב 7 hPSC (n = 6 כולל 3 שכפולים ביולוגיים ו-2 טכניים) ומאיים אנושיים (n = 6 כולל 3 שכפולים ביולוגיים ו-2 טכניים) בתגובה לדפולריזציה של גלוקוז גבוה (16.7G, 16.7 mM גלוקוז) ו-30 mM KCl. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. מבחן t דו-זנבי לא מזווג (**p < 0.01) שימש להשוואה בין שתי קבוצות שצוינו. (E) תכולת האינסולין הכוללת של איים בשלב 7 hPSC (n = 6 כולל 3 שכפולים ביולוגיים ו-2 טכניים) ואיים אנושיים (n = 6 כולל 3 שכפולים ביולוגיים ו-2 טכניים). מבחן t דו-זנבי לא מזווג (*p < 0.05) שימש להשוואה בין שתי הקבוצות. קיצורים: hPSC = תא גזע פלוריפוטנטי אנושי; INS = אינסולין; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ניסוח כל הפתרונות והמדיה המשמשים בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: ניסוח אמצעי בידול שלבים 1-7. הטבלה מספקת את המתכון להכנת מדיית הבידול שלבים 1-7. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול היברידי בן שבעה שלבים המאפשר יצירת איים hPSC המסוגלים להפריש אינסולין על אתגר גלוקוז תוך 40 יום מהתרבית במבחנה. בין השלבים המרובים הללו, אינדוקציה יעילה של אנדודרם סופי נחשבת כנקודת התחלה חשובה לתוצאות הבידול הסופיות18,27,28. בפרוטוקול היצרן מומלצת צפיפות זריעה של 2.6 × 105/cm2 כדי להתחיל התמיינות, והתאים נחשפים למדיה שלב 1 למשך יומיים. כדי להבטיח שהתאים יגיעו למפגש קרוב ביום הראשון (90%-100%), אנו ממליצים בחום לבדוק את צפיפות הזריעה כאשר עובדים על קו hPSC חדש, שכן צפיפות הזריעה האופטימלית עשויה להשתנות. לדוגמה, עם כל שלושת קווי hPSC שנבדקו בידינו, 1.6-1.80 × 10 5/cm 2, במקום 2.60 × 105/cm2, נמצא צפיפות זריעה אופטימלית. הארכת משך התרבית של שלב 1 מיומיים לשלושה ימים עם יום נוסף בתווך שלב 1B מגדילה את הטוהר של תאי FOXA2+/SOX17+ מ-80% ל->-93% (הנתונים אינם מוצגים). אם שיעור תאי FOXA2+/SOX17+ נמוך מ-70% בסוף שלב 1, סביר להניח שהשראת תאי PDX1+ ותאי PDX1+/NKX6.1+ תיפגע.

חשוב לציין כי ניתן לצפות במוות תאי מסוים במהלך כל תרבית שלב 1 בעוד התאים המחוברים נדרשים לכסות 100% משטח הפנים. במהלך שלבים 2-4, הירידה במוות התא במקביל להתרבות התאים גורמת לתאים דחוסים ורב-שכבתיים, אשר דווחו כקריטיים לאינדוקציה יעילה של סמני אב הלבלב PDX1 ו-NKX6.1 וללוקליזציה הגרעינית שלהם29,30. ביום האחרון של שלב 4, התאים מנותקים ומצטברים לצבירים באמצעות לוחות מיקרווול בקוטר 400 מיקרומטר. בהשוואה לגישות אחרות כגון צבירה מרחפת, צבירה ידנית, או שימוש בלוחות 96 בארות U-bottom, אגרגציית AggreWell מייצרת אלפי אשכולות כדוריים בגודל אחיד, הממחישים את חוסנה של שיטה זו.

עבור אינדוקציה אנדוקרינית במהלך שלבים 5-7 בתרבית תלת-ממדית סטטית, אנו מעבירים מספר ממוצע של ~20 אשכולות אב לבלב שמקורם בערכה לכל באר של לוחות 96 בארות תחתונות שטוחות של ULA. שיטה זו מפחיתה באופן משמעותי את היווצרותם של צבירים גדולים מדי ומשפרת את יכולת הקיום של התא, אולי על ידי הגבלת איחוי הצביר ו/או הפחתת אובדן תאים בתיווך לחץ גזירה במהלך תרבית שייקר מסלולית. כדי להסיר תאים מתים צפים במדיה משומשת תוך הפחתת הסיכון לאבד אשכולות במהלך שינוי מדיה, אנו ממליצים לרענן כשני שלישים מהנפח הבינוני הכולל. נציין כי שינוי בינוני חלקי זה אינו מעכב התמיינות אנדוקרינית ובמקום זאת עשוי להציע מעבר עדין בעת מעבר בין שלבים שונים. עם זאת, עדיין ניתן לצפות במוות תאי מסוים במהלך שלב 5 ותחילת שלב 6 עם פרוטוקול היברידי זה בעת מעבר מתרבית מישורית לתרבית השעיה סטטית. קווי hPSC של כתב (לדוגמה, Mel1 INSGFP/W hESCs) שימושיים לניטור התמיינות בשלב מאוחר בתרבויות חיות. ציטומטריית זרימת ריצה תסייע לבחון את NKX6.1+/NEUROD1+ בסוף שלב 5, INS+/NKX6.1+ בסוף שלב 6, ו- CPEP+/NKX6.1+ בסוף שלב 7. השראות יעילות של אוכלוסיות CPEP+ המתבטאות יחד עם NKX6.1 היא קריטית להשגת תגובתיות גלוקוז בתאי בטא31,32. בהקשר זה, פרוטוקול זה מייצר באופן עקבי >50% תאי CPEP+/NKX6.1+ באיים שלב 7 hPSC המתקבלים שיכולים להפריש אינסולין בתגובה לאתגר גלוקוז גבוה במבחנה.

למרות שהפרוטוקול הנוכחי הוכיח ייצור יעיל של איים hPSC מייצרי אינסולין, ישנן מגבלות לשיטה זו. יעילות ההבחנה בסוף שלב 4 מקווי hPSC שונים, במיוחד iPSCs, עם ערכת אב לבלב זו עדיין יכולה להיות משתנה (הנתונים לא מוצגים). אופטימיזציה צריכה להתבצע על בסיס כל מקרה לגופו. שיטה זו בשלושת שלבי הבידול האחרונים מסתמכת על שימוש בתרבית מתלה סטטית בלוחות 96 בארות, שהיא עתירת עבודה ואינה ניתנת להרחבה, ובכך מגבילה את השימוש בה למחקר בלבד. בעוד שזה מעודד להשיג יכולת הפרשת אינסולין, תגובת גלוקוז במבחנה ותכולת האינסולין של איי hPSC נמוכים משמעותית מאלה של איים cadaveric. מאמצים עתידיים עדיין נדרשים להמשך אופטימיזציה של פרוטוקולים. למרות מגבלות אלה, אנו מאמינים כי הפרוטוקול המוצג כאן מספק חומרים שמקורם ב-hPSC המתאימים לסינון גורמים מעוררי התמיינות ולוויסות של הפרשת הורמוני איון, כמו גם למידול תפקוד לקוי של תאי איון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

טימותי ג 'יי קיפר היה עובד של ViaCyte במהלך הכנת כתב היד הזה. המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים בהכרת תודה על התמיכה של STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות. ג'יה ג'או ושנגהווי ליאנג הם מקבלי פרס מייקל סמית 'מחקר בריאות BC Trainee Award. מיטשל ג'.ס. בראם זכה במלגת Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima הוא חתן מלגת אלכסנדר גרהם בל קנדה בוגר ואת CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. אנו מודים מקרב לב לד"ר אדואר ג. סטנלי מ-MCRI ומאוניברסיטת מונאש על שיתוף קו Mel1 INS GFP/W ועל ליבת Islet Core של מכון אלברטה לסוכרת על בידוד והפצה של איים אנושיים. אנו מודים גם על התמיכה ממתקני הדמיה וציטומטריית זרימה של המכון למדעי החיים באוניברסיטת קולומביה הבריטית. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma T6397 Thyroid hormone
4% PFA solution Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom Corning Costar (VWR) CLS3474 Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase STEMCELL Technologies 07920 Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates STEMCELL Technologies 34415 400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates STEMCELL Technologies 34815 800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) R&D Systems IC2400G 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control R&D Systems IC108G 1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) BD Sciences 566032 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control R&D Systems IC0041G 1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) BD Pharmingen 565831 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) BD Sciences 565689 1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) BD Sciences 563338 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) BD Sciences 562594 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 557714 1:50 in flow cytometry
ALK5i II Cayman Chemicals 14794 TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution  STEMCELL Technologies 7010 Microwell Rinsing Solution
Assay chamber Cellvis D35-10-1-N For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific BP1600-100 For immunostaining procedure
CK19 antibody DAKO M0888 1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose Sigma G8769 Medium supplement
DAPI Sigma D9542 For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific 11330032 Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 Life technologies A21432 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 Life technologies A21447 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 Life technologies A31570 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A31571 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 Life technologies A31572 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 Life technologies A31573 1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 Life technologies A21448 1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS Sigma D8537 Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human Alpco 80-INSHU-E01.1 For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA Proliant 68700 Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit BD Sciences 554714 Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent STEMCELL Technologies 7174 For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody Sigma G2654 1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody Thermo Fisher Scientific PA1-37782 1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x) Gibco 35050061 L-glutamine supplement
Glycerol Thermo Fisher Scientific G33-4 For tissue clearing and mounting
GSi XX Sigma Millipore 565789 Notch inhibitor
Heparin Sigma H3149 Medium supplement
ITS-X (100x) Thermo Fisher Scientific 51500056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189  STEMCELL Technologies 72147 BMP antagonist
MAFA antibody Abcam ab26405 1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified Thermo Fisher Scientific 08-774-552 Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium Life technologies 10372019 Base medium
mTeSR1 Complete Kit STEMCELL Technologies 85850 stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma A9165 Antioxidant
NaHCO3 Sigma S6297 Medium supplement
NEUROD1 antibody R&D Systems AF2746 1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody DSHB F55A12-c 1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody R&D Systems AF6297 1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS Sigma D8662 With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody Abcam ab47267 1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) BD Sciences 565860 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) BD Sciences 563023 1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) BD Sciences 562161 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control BD Sciences 554680 1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) BD Sciences 564563 1:200 in flow cytometry
R428  Cayman Chemicals 21523 AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans Sigma R2625 Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x Sigma 20-188 For hormone extraction
SANT-1 Sigma S4572 SHH inhibitor
SLC18A1 antibody Sigma HPA063797 1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody Sigma HPA019472 1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit STEMCELL Technologies 05120 Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody Novus NB120-16659 1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100 Sigma X100 For permeabilization
Trolox  Sigma Millipore 648471 Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express Life technologies 12604-021 cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody R&D Systems AF3586 1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304 ROCK inhibitor
Zinc sulfate Sigma Z0251 Medium supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 196 ייצור אינסולין צבירי איים תאי בטא טיפול בסוכרת פרוטוקול ערכת אב הלבלב פרוטוקול R לוחות מיקרווול התמיינות אנדוקרינית פורמט תרחיף סטטי 96 בארות אפיון חוץ גופי הערכה תפקודית איים הנגזרים מ-HPSC טכניקות תרבית תאי גזע בדיקות ביולוגיות
התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J.… More

Zhao, J., Liang, S., Braam, M. J. S., Baker, R. K., Iworima, D. G., Quiskamp, N., Kieffer, T. J. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters. J. Vis. Exp. (196), e64840, doi:10.3791/64840 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter