Summary
幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。
Abstract
ヒト多能性幹細胞(hPS細胞)からインスリン分泌型ベータ細胞への分化は、ベータ細胞の機能や糖尿病治療の研究材料となります。しかし、天然のヒトベータ細胞を適切に模倣した幹細胞由来のベータ細胞を得るには課題が残っています。これまでの研究に基づいて、hPS細胞由来の膵島細胞を作製し、分化の結果と一貫性を改善したプロトコールを作成しました。ここで説明するプロトコルは、ステージ1〜4で膵臓前駆細胞キットを使用し、その後、ステージ5〜7で2014年に以前に発表された論文(以下「Rプロトコル」と呼ぶ)から変更されたプロトコルを使用します。膵臓前駆細胞キットと直径400 μmのマイクロウェルプレートを使用して膵臓前駆細胞クラスターを作製するための詳細な手順、96ウェル静的懸濁液フォーマットでの内分泌分化のためのRプロトコル、およびhPS細胞由来膵島の in vitro 特性評価と機能評価が含まれています。完全なプロトコルでは、最初のhPS細胞増殖に1週間かかり、その後、インスリン産生hPS細胞膵島を得るのに~5週間かかります。基本的な幹細胞培養技術と生物学的アッセイのトレーニングを受けた担当者は、このプロトコルを再現できます。
Introduction
膵臓のベータ細胞は、血糖値の上昇に反応してインスリンを分泌します。1型糖尿病(T1D)1におけるベータ細胞の自己免疫破壊、または2型糖尿病(T2D)2におけるベータ細胞機能障害により、十分なインスリン産生が欠如している患者は、通常、外因性インスリンの投与で治療される。この命を救う治療法にもかかわらず、正真正銘のベータ細胞からの動的なインスリン分泌によって達成される血糖値の絶妙なコントロールに正確に匹敵するものではありません。そのため、患者はしばしば生命を脅かす低血糖エピソードや慢性高血糖エクスカーションに起因する他の合併症の結果に苦しむ。ヒト死体膵島の移植は、T1D患者の厳密な血糖コントロールを正常に回復させますが、膵島ドナーの利用可能性と移植のための健康な膵島の浄化の難しさによって制限されます3,4。この課題は、原理的には、ヒトPS細胞を代替出発物質として使用することで解決できます。
in vitroでヒトPS細胞からインスリン分泌膵島を作製する現在の戦略は、in vivoでの膵臓胚発生の過程を模倣することを目的としていることが多い5,6。これには、発生中の胚性膵臓の重要な段階を模倣するために、責任あるシグナル伝達経路に関する知識と、対応する可溶性因子のタイムリーな追加が必要です。膵臓プログラムは、転写因子フォークヘッドボックスA2(FOXA2)と性決定領域Yボックス17(SOX17)7によって特徴付けられる決定的な内胚葉へのコミットメントから始まります。決定的な内胚葉の逐次分化には、原始的な腸管の形成、膵臓および十二指腸のホメオボックス1(PDX1)7,8,9を発現する後部前腸へのパターン形成、およびPDX1とNK6ホメオボックス1(NKX6.1)10,11を共発現する膵前駆細胞への上皮拡張が含まれます。
内分泌膵島細胞へのさらなる関与は、内分泌促進性マスターレギュレーターニューロゲニン-3(NGN3)12の一過性発現と、主要な転写因子であるニューロン分化1(NEUROD1)およびNK2ホメオボックス2(NKX2.2)13の安定的な誘導を伴います。その後、インスリン産生ベータ細胞、グルカゴン産生アルファ細胞、ソマトスタチン産生デルタ細胞、および膵臓ポリペプチド産生PPY細胞などの主要なホルモン発現細胞をプログラムする。この知識と、広範でハイスループットな薬物スクリーニング研究からの発見により、最近の進歩により、インスリン分泌が可能なベータ細胞に似た細胞を持つhPS細胞の作製が可能になりました14,15,16,17,18,19。
段階的なプロトコルはブドウ糖敏感なベータ細胞6,14,18,19を発生させるために報告されている。これらの研究に基づいて構築された、現在のプロトコルには、平面培養でPDX1 + / NKX6.1+膵臓前駆細胞を生成するための膵臓前駆細胞キットの使用が含まれ、続いてマイクロウェルプレートを均一なサイズのクラスターに凝集し、静的3D懸濁培養でRプロトコルを使用してインスリン分泌hPSC膵島をさらに分化します。フローサイトメトリー、免疫染色、機能評価などの品質管理分析は、分化細胞の厳密な特性評価のために実施されます。このホワイトペーパーでは、指向性分化の各ステップを詳細に説明し、in vitro 特性評価アプローチの概要を説明します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルは、H1、HUES4 PDXeG、Mel1 INSGFP/WなどのhPSC株をフィーダーフリー条件で使用することに基づいています。このセクションでは、ステップバイステップの手順を詳しく説明し、代表的な結果のセクションにMel1 INSGFP/W の分化からの裏付けデータを示します。ここに記載されていない他のhPSC株を扱う場合は、さらなる最適化が必要であることを推奨します。このプロトコルで使用されるすべての試薬および溶液に関する詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 分化培地および溶液の調製
注:調製するすべての溶液については表 1 を、分化培地については 表2 を参照してください。
- 細胞培養用のすべての培地と試薬を無菌バイオセーフティキャビネットで調製します。使用前に、細胞培養関連溶液および基礎培地を浴中で37°Cに短時間温めます。
注:以下に説明するように、サプリメントを追加して毎日新鮮な分化培地を作成し、同じ日に使用してください。あるいは、膵臓前駆細胞キットは、メーカーのプロトコルに従って数日間にわたって使用できる、より大きな容量を事前に準備するオプションを提供します。培地調製のための両方の方法は、うまく機能することが証明されています。培地をウォーターバスに長時間放置することはお勧めしません。毎日新鮮な培地を調製する場合は、凍結融解サイクルを繰り返さないようにサプリメントを分注することをお勧めします。
2. ヒトPS細胞の膵前駆細胞への分化
- mTeSR1完全培地中のマトリゲル被覆容器上の未分化hPS細胞を維持し、培地交換を毎日行います。維持培養中、細胞が~70%のコンフルエントに達したら、メーカーのプロトコルに従って細胞解離試薬を使用して、3〜4日ごとにhPS細胞を継代します。分化を開始するには、細胞を単一細胞に解離し、6ウェルまたは12ウェルの組織培養処理プレート(培地容量はウェルあたりそれぞれ2 mLまたは1 mL)に播種します。
注:内胚葉基礎培地とそのアリコートの保管に関する指示については、 表1 を参照してください。. - 培養ウェルをhESC認定マトリゲル(メーカーのプロトコルで推奨されている氷冷DMEM/F12で希釈)でプレコートし、プレートを加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターに30分間置きます。
- マトリゲルコーティングプレートを室温に戻します(3時間以内に使用)。
- 使用済みの培地をhPS細胞培養液から吸引し、DPBSで一度すすぎます。hPS細胞培養物を細胞解離酵素を用いて37°Cで3〜5分間、単一細胞に解離します。温かいDMEM/F12培地を加えて細胞を洗い流し、15 mLまたは50 mLのコニカルチューブに移し、300 × g で5分間泳動します。
- 幹細胞完全培地と10 μM Y-27632で細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤または自動セルカウンターで生細胞(トリパンブルー陰性)カウントを実行します。希釈したマトリゲルを吸引し、直ちに1.60-1.80 × 105/cm2 の密度で生細胞をマトリゲルでコーティングしたウェルに播種し、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。ステージ 1 に進みます。
注:これにより、分化を開始するためのコンフルエントが~95%開始されます。メーカーのプロトコルによると、2.6 × 105 / cm2 の播種密度が推奨されます。さまざまな播種密度をテストして、細胞株の最適値を決定し、細胞の生存率を確認することをお勧めします。生存率が80%未満の場合は、分化を進めないでください。細胞生存率の低下は、収穫時の過剰消化または過剰粉砕、または播種前に細胞をDMEM/F12培地に長時間放置した結果である可能性があります。 - ステージ 1 の 1 日目に、内胚葉基礎培地を浴中で 37 °C に短時間温め、Supplement MR と CJ を解凍します。内胚葉基礎培地にSupplement MRおよびCJを添加して、ステージ1A培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ1A培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
注意: 洗浄手順は不要です。培地交換の前に培養プレートを静かに振って、付着していない細胞を培養物から除去します。培地の除去中は、ピペットチップをウェルの底に触れないようにし、穏やかな培地添加を行うことで、単層を破壊しないようにしてください。 - ステージ1の2日目に、内胚葉基礎培地を37°Cの浴で短時間温め、Supplement CJを解凍します。内胚葉基礎培地にSupplement CJを添加して、ステージ1B培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ1B培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
- ステージ 1 の 3 日目に、手順 2.8 から 2.9 を繰り返します。ステージ 2 に進みます。
- ステージ2の1日目に、膵臓ステージ2-4基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメント2Aおよび2Bを解凍します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ2A培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
- ステージ2の 2日目に、膵臓ステージ2-4基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメント2Bを解凍します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ2B培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
- ステージ 2 の 3 日目に、手順 2.13 から 2.14 を繰り返します。ステージ 3 に進みます。
- ステージ 3 の 1 日目に、膵臓ステージ 2-4 基礎培地を 37 °C の浴で温め、サプリメント 3 を融解します。膵臓ステージ2-4基礎培地にサプリメント3を追加して、ステージ3培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ3培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
- ステージ 3 の 2 日目 と 3 日目に、手順 2.16 から 2.17 を繰り返します。 ステージ 4 に進みます。
- ステージ 4 の 1 日目に、膵臓ステージ 2-4 基礎培地を 37 °C の浴で温め、サプリメント 4 を融解します。膵臓ステージ2-4基礎培地にサプリメント4を追加して、ステージ4培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ4培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
- ステージ 4 の 2 日目から 4 日目に、手順 2.19 から 2.20 を繰り返します。集計手順に進みます。
3. 直径400μmのマイクロウェルプレートを用いた膵前駆細胞クラスターへの凝集
- ステージ 4 の 5 日目に、マイクロウェル (24 ウェルプレート形式など) をウェルあたり 500 μL の付着防止リンス溶液で前処理します。
- バランスプレートを準備し、マイクロウェルプレートを1,300 × g で5分間遠心分離します。
注意: 顕微鏡でプレートをチェックして、マイクロウェルに気泡が残っていないことを確認します。気泡がマイクロウェルに閉じ込められたままの場合は、さらに5分間遠心分離します。 - ウェルから付着防止リンス溶液を吸引し、1 mLのDPBSで1回すすぎます。ウェルからDPBSを吸引し、各ウェルに1 mLの凝集培地を添加します。
- 使用済みの培地を膵前駆細胞培養物から取り出し、DPBSで一度洗浄する。解離試薬を用いて、培養物を37°Cで10〜12分間、単一細胞に解離します。細胞を温かいDMEM/F12で洗い流し、チューブに移し、300 × g で5分間泳動させます。
- 細胞ペレットを凝集培地に再懸濁し、生細胞カウントを行います。ウェルあたり240万〜360万個の細胞(すなわち、マイクロウェルあたり2,000〜3,000個の細胞)を播種し、各ウェルに凝集培地を添加して、ウェルあたり2 mLの最終容量を達成します。
- P1000ピペットチップで細胞を数回静かに上下にピペットし、ウェル全体に細胞が均一に分布するようにします。マイクロウェルに気泡を入れないでください。マイクロウェルプレートを300 × g で5分間遠心分離し、マイクロウェル内の細胞を捕捉します。加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターでマイクロウェルプレートを24時間凝集させてインキュベートし、ステージ5〜7の分化に進みます。
注意: 凝集中にプレートを乱さないように注意してください。最適な凝集体形成には、最大48時間のインキュベーション時間が必要な場合があります。
4. キット由来膵臓前駆細胞クラスターのヒトPS細胞膵島への分化
- ステージ5の1日目に、 ステージ5〜7の基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメントを解凍します(表 1 および 表2を参照)。ステージ5〜7の基礎培地にサプリメント(最終使用濃度まで)を追加して、ステージ5培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- 凝集体を形成した後、P1000ピペットチップで凝集体を数回静かに上下にピペットで移動させ、凝集していない細胞を浮かせます。凝集体が重力によって落ち着くのを待ちます(~1分待ちます)。使用済みの培地(浮遊する非凝集細胞を含む)を、凝集体の吸引を避けながら、できるだけウェルから静かに取り除きます。
- 新鮮なステージ5培地をマイクロウェルプレートの表面に激しく分注し、マイクロウェルから凝集体を取り除きます。凝集体を超低接着性(ULA)6ウェルに移します。ステージ5培地で一度すすぎ、マイクロウェルから凝集体を完全に回収します。
- ULA 6ウェルですべての凝集体を回収し、ステージ5培地で凝集体を再懸濁し、密度を100μLあたり20クラスターに調整します(たとえば、各ウェルから~1,200クラスターが回収されると予想されます。1,200クラスターをステージ5培地6 mLに再懸濁します)。マルチチャンネルピペットを使用して、50 μLのステージ5培地をULA平底96ウェルプレートの各ウェルに分注します。コーナーウェルとエッジウェルに 200 μL の DPBS を充填します。
注:エッジウェルは蒸発しやすいため、凝集体の培養には使用しないでください。そうでない場合は、縁に沿った蒸発を最小限に抑えるように設計された96ウェルプレート(堀が組み込まれた96ウェルプレートなど)を使用するか、培養プレートを高湿度の微気候細胞培養インキュベーターに入れます。 - ULA平底96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのクラスター再懸濁液を添加し、ウェルあたり平均20個のクラスターを含む合計150 μLの培地が得られます。
注:クラスター再懸濁液は、96ウェルに分注する前に毎回穏やかに混合してください。 - 培養プレートを加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターの平らな面に24時間置きます。
- ステージ5の2日目に、ステップ4.1に従ってステージ5培地を準備します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから~90 μLの使用済み培地を除去し、100 μLのステージ5培地でリフレッシュします。
- ステージ 5 の 3 日目に、手順 4.7 から 4.8 を繰り返します。 ステージ 6 に進みます。
- ステージ 6の1日目に、ステージ5〜7の基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメントを解凍します(表 1 および 表2を参照)。ステージ5〜7の基礎培地にサプリメント(最終使用濃度まで)を追加して、ステージ6培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- マルチチャンネルピペットを使用して、使用済みの培地を~90 μL除去し、ウェルあたり100 μLのステージ6培地でリフレッシュします。
- ステージ 6 の 2 日目から 8 日目に、手順 4.10 から 4.11 を繰り返します。 ステージ 7 に進みます。
- ステージ7の1日目に、ステージ5〜7の基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメントを解凍します(表1および表2を参照)。ステージ5〜7の基礎培地にサプリメント(最終使用濃度まで)を追加して、ステージ7培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
- マルチチャンネルピペットを使用して、使用済みの培地を~90 μL除去し、ウェルあたり100 μLのステージ7培地でリフレッシュします。
- ステージ 7 の 2 日目から 12 日目に、手順 4.13 から 4.14 を繰り返します。 in vitro の特性評価に進みます。
5. フローサイトメトリー解析
- 培地を除去し、DPBSで一度洗浄する。培養物(平面前駆細胞または分化クラスター)を解離試薬で37°Cで10〜12分間インキュベートすることにより、単一細胞に解離します。FACS緩衝液で洗浄し、300 × g で5分間泳動させます。
- 細胞ペレットをFACSバッファーに再懸濁し、細胞カウントを行います。細胞を300 × g で5分間スピンさせます。単一細胞を500 μLのFix/Permバッファーに室温で10分間再懸濁します。
注意:使用前にFix/Permバッファーを室温に戻してください。フィックス/パーミバッファーにはパラホルムアルデヒド(PFA)が含まれています。PFAはドラフト内で慎重に取り扱い、施設のガイドラインに従って廃棄してください。 - 500 × g で3分間スピンし、500 μLの1x Perm/Washバッファーで2回洗浄し、300 μLの1x Perm/Washバッファーに再懸濁します。100 μLの単一細胞再懸濁液(それぞれ2.5〜3個×10個の5 細胞を含む)を3本のマイクロチューブに移し、未染色コントロール、アイソタイプコントロール、および抗体染色を行います(サンプル抗体および希釈情報については 、材料表 を参照)。室温で45分間インキュベートし、ホイルで覆います。
- 500 × g で3分間回転させます。500 μL の 1x Perm/Wash バッファーで 2 回洗浄します。サンプルを100 μLのFACSバッファーに再懸濁し、染色した細胞(特定の段階でのマーカーの細胞内染色については 材料表 を参照)をフローサイトメーターとソフトウェア(FlowJoなど)で分析します。
注:サンプルをすぐにアッセイしない場合は、光から保護して4°Cで保管してください。ゲーティング戦略では、フローデータを最初に散乱特性(FSC-AおよびSSC-A)によってゲーティングして小さな細胞デブリを除去し、次にFSC-AおよびFSC幅特性によってシングレットを同定します。ポジティブゲーティングとネガティブゲーティングは、幹細胞コントロールおよび/または未染色のアイソタイプコントロールによって決定されます。
6. ホールマウント免疫染色
- クラスターをマイクロチューブに集めます。重力によってクラスターを沈降させます。使用済みの培地を吸引し、1 mLのPBS(カルシウムとマグネシウムを含む)で1回すすぎます。クラスターを 1 mL の 4% PFA で 4°C で一晩固定します。
- PBSTで1回すすぎ、500 μLの0.3% TritonX-100で20〜30個のクラスターをマイクロチューブ内で周囲温度でチルトシェーカーで少なくとも6時間透過処理します。
注:大規模なクラスターでは、より長い透過時間(最大24時間)が必要です。 - クラスターを100 μLのブロッキングバッファーに混入し、常温でチルトシェーカーで1時間インキュベートします。ブロッキングバッファーを除去し、抗体希釈バッファーで希釈した一次抗体100 μLとともに、チルトシェーカーで常温で一晩インキュベートします。
注:イメージング中にバックグラウンドが強い場合は、一次抗体と4°Cでインキュベートしてください。 - チルトシェーカー(チルト角度を8、速度を20に設定)で500μLのPBSTで30分以内に3分間洗浄します。
- クラスターを抗体希釈バッファー中の100 μLの二次抗体とともに、チルトシェーカーで常温で一晩インキュベートします。チューブをホイルで覆います。
注:イメージング中にバックグラウンドが強い場合は、4°Cで二次抗体とインキュベートしてください。 - 500μLのPBSTで1回すすぎます。100 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液(10 μg/mL、PBST溶液)を加え、周囲温度で10〜15分間染色します。ホイルで覆い、光から保護します。
- チルトシェーカーで500 μLのPBSTで3 x 30分間完全に洗浄します。洗浄工程中にチューブをホイルで覆います。
- クラスターを、メーカーのプロトコルおよび公開されているプロトコル20,21に従って組織接着剤でプレコートされたイメージングチャンバースライド(材料表を参照)に取り付けます。
- 組織透明化培地(PBS溶液中の80%グリセロール)をマウントし、ガラスカバーガラスで覆います。共焦点イメージングまで光から保護します。
注:サンプルがすぐに画像化されない場合は、光から保護して4°Cで保管してください。
7. 静的GSISアッセイ
- 低グルコースのKreb's Ringer重炭酸塩(3.3G KRB)バッファー、高グルコース(16.7G)KRBバッファー、および30 mM KCl KRBバッファーを37°Cの浴で温めます。
- サイズに合ったクラスターを手摘みし、2 mLの温かい3.3G KRBバッファーですすぎます。クラスターを非組織培養処理した6ウェルプレートに移し、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで1時間、2 mLまたは温かい3.3G KRBバッファーで平衡化します。
- 平衡化後、アッセイチャンバー( 材料表を参照)に100 μLの温かい3.3G KRBバッファーを充填します。5つのクラスターを手摘みし、アッセイチャンバーの中央に移します。加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。
注:10 μLのピペットチップを使用して、最小限の中容量でクラスターを移します。 - ~100 μLの上清を慎重に回収し、基礎インスリン分泌が測定されるまで-30°Cで保存します(ステップ7.9を参照)。このステップでは、クラスターを乾燥させたり、失ったりしないでください。直ちに100 μLの温かい16.7G KRBバッファーをアッセイチャンバーに加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで同じクラスターを30分間インキュベートします。
- ~100 μLの上清を慎重に回収し、グルコース刺激インスリン分泌が測定されるまで-30°Cで保存します(ステップ7.9を参照)。直ちに100 μLの温かい30 mM KCl KRB KRBバッファーをアッセイチャンバーに加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで同じクラスターを30分間インキュベートします。
- ~100 μLの上清を慎重に回収し、KCl刺激インスリン分泌が測定されるまで-30°Cで保存します(ステップ7.9を参照)。ただちに100 μLのRIPA溶解バッファーをアッセイチャンバーに加え、5つのクラスターすべてを含む溶解バッファーをマイクロチューブに移します。
- オプション)P200ピペットチップで激しく粉砕し、手動でクラスターを破砕します。30秒間ボルテックスし、氷上で30分間インキュベートした後、さらに30秒間ボルテックスします。
注:ボルテックスによる完全な溶解と、氷上での十分なインキュベーション時間を確保してください。 - 8,000 × g で1分間回転させます。上清を回収し、総インスリン含有量が測定されるまで-30°Cで保存します(ステップ7.9を参照)。
- 製造元のプロトコルおよび公開されているプロトコル20,22に従って、ヒトインスリンELISAキットを使用して、上清サンプル中のヒトインスリンを測定します。
注:上清サンプルの凍結と解凍を繰り返すことは避けてください。凍結融解サイクルが 3 回を超えるサンプルはアッセイしないでください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
幹細胞をインスリン分泌性hPS細胞膵島に7つのステップで分化させるハイブリッド戦略を開発し、平面培養の最初の4段階では膵臓前駆細胞キットを使用し、最後の3段階では静的浮遊培養で以前に報告された方法6に基づいて構築された修正プロトコルを使用します(図1).このプロトコルでは、細胞播種後24時間(ステージ0)でほぼコンフルエント(90%-100%)の培養を確保することは、ほとんどのhPSC株の効率的な分化を開始するために重要です(図2A)。特定の細胞株に最適な条件を決定するために、さまざまな播種密度をテストすることを強くお勧めします。ステージ1の培養では、この段階でよく見られる死細胞の浮遊により、培地が曇って見える可能性があります。これは、付着した細胞が血管表面を完全に覆っている限り、キットの分化効率を損なうことはありません。ステージ2〜4では、細胞が増殖し、細胞死が減少するにつれて、単層はより圧縮され、使用済み培地はステージ1ほど曇らなくなります(図2A)。インスリンレポーターMel1 INSGFP/W hESCで実証されたように、ステージ1の終わりに少なくとも95%のFOXA2+/SOX17+決定的な内胚葉細胞、ステージ4の終わりに80%のPDX1+/NKX6.1+膵臓前駆細胞が日常的に達成できます(図2B-E)。膵臓前駆細胞の平面培養から浮遊培養への移行は、その後の内分泌細胞誘導を促進することが示されている23,24。この更新されたプロトコルでは、マイクロウェルプレートを使用し、24時間の細胞凝集を可能にします。これにより、一度に均一なサイズと形態を持つ数千の膵臓前駆細胞クラスターが生成され(図3A、B)、平均凝集効率(凝集体に取り込まれる細胞の割合を計算することによる)は74.1%±4.4%です(図3C)。重要なことに、PDX1およびNKX6.1の発現は、凝集後もこれらのクラスターで高レベルで維持されており(図3D、E)、分化キットとマイクロウェルプレートを使用してin vitroで膵臓前駆細胞を効率的に生産できることを示唆しています。
次に、ULA平底96ウェルプレートを用いた静的懸濁培養システムにおける最後の3段階分化にRプロトコル(Rezaniaら6から改変した方法)を用いて、これらのキット由来の膵臓前駆細胞をhPS細胞膵島に向けてさらに分化します(図1)。インスリン発現細胞は、時間の経過とともに生きた培養物におけるINS-GFPシグナルの増加によって示されるように、内分泌クラスター内で徐々に誘導されます(図4A、B)。クラスターサイズを定量化すると、ステージ5のクラスターの平均直径は150μmであり、ステージ7では平均直径が220μmに増加することが明らかになりました(図4C)。クラスターは、ステージ5からステージ7の間に成長するにつれて、主に滑らかな球状の外観を維持し、静的培養法は、軌道シェーカーベースの懸濁培養(通常、いくつかの特大のクラスターを生成する)と比較してクラスターの凝集を制限することを示唆しています25。滑らかな球形形態を持つ圧縮クラスターの維持は、分化細胞の良好な生存率の指標であり、最終的に機能的なhPS細胞膵島への分化を成功させるために重要です。
細胞組成の特性評価は、ハイブリッドプロトコルによって生成されたステージ7のhPSC膵島が主に内分泌であり、インスリン陽性ベータ細胞、グルカゴン陽性アルファ細胞、ソマトスタチン陽性デルタ細胞、および膵臓ポリペプチド陽性PPY細胞を含む4つの主要な膵島細胞タイプで構成され、エンテロクロマフィン細胞(オフターゲット系統26に由来する)も存在することを示しています(図5A-C).特に、このハイブリッドプロトコルでは、ステージ7の培養で、主に単ホルモン性膵島細胞(~50%のCPEP+/GCG-/SST-細胞、~17%のGCG+/CPEP細胞、および~12%のSST+/CPEP細胞)と少数のバイホルモン細胞(CPEP+/GCG+またはCPEP+/SST+)のみが生成されます(図5B-D)。ステージ7のhPSC膵島におけるいくつかの重要な転写因子と成熟ベータ細胞マーカーを調べたところ、分化したベータ細胞がPDX1、NKX6.1、NEUROD1、MAFA、およびグルコーストランスポーターGLUT1を発現していることが明らかになりました(図6A)。さらに、ステージ7の培養では、~60%のINS+/PDX1+細胞(図6B)と50%のCPEP+/NKX6.1+細胞(図6C)が誘導されており、ここに示されているようなハイブリッド戦略を用いて機能性ベータ細胞を効率的に作製できることが示唆されています。実際、in vitro静的グルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイでは、ステージ7のヒトPS細胞膵島が高グルコースと直接脱分極の両方に応答して高レベルのインスリンを分泌できることが実証されています(図6D)。この機能は有望ですが、インスリン分泌量に関しては、hPS細胞膵島からのin vitroでのグルコース応答性は依然として死体膵島と同等ではなく(図6D)、hPS細胞膵島の総インスリン含量は死体膵島の約半分です(図6E)。より成熟したベータ細胞表現型を持つhPS細胞膵島を実現するには、継続的な最適化が必要です。
図1:in vitroで機能性hPS細胞膵島を作製するための分化スキームの概要。 ワークフロー図は、膵臓前駆細胞キットを用いた平面培養におけるhPS細胞の膵前駆細胞への分化、マイクロウェルプレートを用いた膵前駆細胞クラスターへの凝集、静的懸濁培養におけるhPS細胞膵島への移行の7つのステップの概要を示しています。インスリンレポーターhESCラインであるMel1 INSGFP / Wは、このハイブリッド法の有効性を実証するための例として、この研究全体で使用されます。略語:hPSCs = ヒト多能性幹細胞;GSIS = グルコース刺激インスリン分泌。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:膵臓前駆細胞キットを用いた膵前駆細胞へのhPS細胞の分化指示。 (A)示された段階での細胞形態を示す代表的な位相差画像。スケールバー = 750 μm。 (B、C)ステージ1の確定的内胚葉細胞(FOXA2+/SOX17+)および(C)ステージ4の膵臓前駆細胞(PDX1+/NKX6.1+)の主要マーカーの代表的なフローサイトメトリープロット。(D)PDX1(赤)とNKX6.1(緑)の膵臓前駆細胞の代表的な免疫染色画像。核をDAPI(青色)で染色した。スケールバー = 200 μm。 (E)ステージ4、4日目の膵臓前駆細胞におけるPDX1+/NKX6.1+細胞のフローサイトメトリー定量(n = 5生物学的反復)。略語:hPSCs = ヒト多能性幹細胞;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:直径400 μmのマイクロウェルプレートを使用した均一なサイズの膵臓前駆細胞クラスターへの凝集。 (A)ステージ4終了時の代表的な位相差画像で、マイクロウェル内およびマイクロウェルからの回収後のクラスター形態を示す。スケールバー = 300 μm。 (B)ステージ 4 終了時のクラスター直径の定量化 (3 回の生物学的反復からの n = 60 クラスター)。(C)ステージ4終了時の凝集効率の定量化(n = 5生物学的反復)。(D)PDX1(赤)とNKX6.1(緑)の膵臓前駆細胞クラスターの代表的な免疫染色画像。核をDAPI(青色)で染色した。スケールバー = 100 μm。 (E)ステージ 4 の 5 日目の膵臓前駆細胞凝集体における PDX1+/NKX6.1+ 細胞のフローサイトメトリー定量(n = 4 生物学的反復)。略語:DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:静的懸濁培養システムにおける膵前駆細胞のhPS細胞膵島への分化 。 (A)代表的な位相差画像(上段)と蛍光画像(下段)は、示された段階でのクラスター形態とインスリン発現パターンを示しています。スケールバー = 300 μm。 (B)示されたステージにおけるクラスターあたりの平均INS-GFP蛍光強度の定量化(2つの生物学的反復からのn = 30クラスター)。(C)示された段階でのクラスター直径の定量化(3つの生物学的反復からのn = 60クラスター)。略語:hPSC = ヒト多能性幹細胞;INS = インスリン;GFP = 緑色蛍光タンパク質。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:ステージ7のhPS細胞膵島における細胞組成の特性評価。 (A)ステージ7のhPS細胞膵島の代表的な免疫染色画像(SYN、汎内分泌マーカー;CK19、ダクトマーカー;INS-GFP、インスリンはレポーターGFPシグナルによって示されます。GCGの;海面水温;PPYの;ENCはSLC18A1抗体)で染色した。核をDAPI(青色)で染色した。スケールバー = 100 μm。 (B,C)ステージ7のhPSC膵島におけるCPEP+およびGCG+細胞の割合、および(C)ステージ7のhPSC膵島におけるCPEP+およびSST+細胞の割合の代表的なフローサイトメトリープロット。(D)ステージ7のhPSC膵島における示された細胞マーカーのフローサイトメトリー定量(n = 4生物学的反復)。略語:hPSC = ヒト多能性幹細胞;INS =インスリン;GFP = 緑色蛍光タンパク質;SYN =シナプトフィジン;GCG = グルカゴン;SST = ソマトスタチン;PPY = 膵臓ポリペプチド;ENC = エンテロクロマフィン;CPEP = C-ペプチド;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:ステージ7のhPSC膵島のin vitro特性評価と機能評価。 (A)NKX6.1、MAFA、NEUROD1、PDX1、グルコーストランスポーターGLUT1などのいくつかの重要なベータ細胞マーカーとのインスリン(レポーターINS-GFPシグナルで示される)の共発現を示すステージ7のhPS細胞膵島の代表的な免疫染色画像。核をDAPI(青色)で染色した。スケールバー = 100 μm。 (B,C)INS+/PDX1+細胞の(B)パーセンテージおよびCPEP+/NKX6.1+細胞の(C)パーセンテージの代表的なフローサイトメトリープロット。(D)ステージ7のhPSC膵島(3つの生物学的複製と2つの技術的複製を含むn = 6)およびヒトの膵島(3つの生物学的複製と2つの技術的複製を含むn = 6)からのインスリン放出を示す静的GSISアッセイ 高グルコース(16.7G、16.7 mMグルコース)および30 mM KCl脱分極に応答します。データは平均±SEMで表されます。対応のない両側t検定(**p < 0.01)を使用して、示された2つのグループを比較しました。(E)ステージ7のhPS細胞膵島(n=6、生物学的複製3件、技術複製2件を含む)およびヒト膵島(生物学的複製3件、技術複製2件を含むn=6)の総インスリン含量。対応のない両側t検定(*p < 0.05)を使用して、2つのグループを比較しました。略語:hPSC = ヒト多能性幹細胞;INS = インスリン;GFP = 緑色蛍光タンパク質;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:このプロトコルで使用されるすべての溶液と培地の処方。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:ステージ1〜7の分化培地の製剤。 この表は、ステージ1〜7の分化培地を調製するためのレシピを示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この論文では、in vitroで培養してから40日以内に、グルコースチャレンジでインスリンを分泌できるhPS細胞膵島を作製できる7段階のハイブリッドプロトコルについて説明します。これらの複数のステップの中で、決定的な内胚葉の効率的な誘導は、最終的な分化の結果のための重要な出発点を設定すると考えられています18,27,28。メーカーのプロトコールでは、分化を開始するために2.6 × 105/cm 2の播種密度が推奨され、細胞をステージ1培地に2日間曝露します。1日目に細胞がほぼコンフルエント(90%-100%)に達するようにするには、最適な播種密度が異なる可能性があるため、新しいhPS細胞株で作業する際に播種密度をテストすることを強くお勧めします。例えば、3つのhPSC株すべてを手元に置いて試験したところ、2.60 × 105/cm 2ではなく、1.6-1.80 × 105/cm2が最適な播種密度であることがわかりました。ステージ1の培養期間を2日から3日に延長し、ステージ1B培地で1日増やすと、FOXA2+/SOX17+細胞の純度が80%から>93%に向上します(データは示していません)。ステージ1の終わりにFOXA2+/SOX17+細胞の割合が70%未満の場合、PDX1+細胞およびPDX1+/NKX6.1+細胞の誘導が損なわれる可能性があります。
ステージ1の培養全体を通して細胞死が観察される可能性がある一方で、付着した細胞は表面積の100%を覆う必要があることに注意することが重要です。ステージ2〜4では、細胞増殖と同時に細胞死が減少するため、細胞が圧縮され、多層化され、膵臓前駆細胞マーカーPDX1およびNKX6.1の効率的な誘導とそれらの核局在化に重要であることが報告されています29,30。ステージ4の最終日に、細胞を解離し、AggreWell 400 μm径マイクロウェルプレートを用いてクラスターに凝集させます。懸濁凝集、手動凝集、U底96ウェルプレートの使用などの他のアプローチと比較して、AggreWell凝集は数千の球状の均一なサイズのクラスターを生成し、この方法の頑健性を示しています。
静的3D培養におけるステージ5〜7の内分泌誘導のために、平均数~20個のキット由来の膵臓前駆細胞クラスターをULA平底96ウェルプレートの各ウェルに移します。この方法は、おそらくクラスター融合を制限したり、オービタルシェーカー培養中のせん断応力による細胞損失を低減したりすることで、特大のクラスターの形成を大幅に減らし、細胞の生存率を向上させます。使用済み培地の浮遊死細胞を除去し、培地交換時にクラスターが失われるリスクを軽減するには、培地全体の約3分の2をリフレッシュすることをお勧めします。この部分的な培地の変化は、内分泌分化を妨げず、代わりに異なる段階を切り替えるときに穏やかな移行を提供する可能性があることに注意してください。それにもかかわらず、平面培養から静的懸濁培養に移行する際に、このハイブリッドプロトコルでは、ステージ5およびステージ6の初期にいくつかの細胞死が観察される場合があります。レポーターhPS細胞株(例えば、Mel1 INSGFP/W hESC)は、生きた培養における後期分化のモニタリングに有用です。フローサイトメトリーを実行すると、ステージ5の終わりにNKX6.1+/NEUROD1+、ステージ6の終わりにINS+/NKX6.1+、ステージ7の終わりにCPEP+/NKX6.1+を調べるのに役立ちます。NKX6.1と共発現したCPEP+集団の効率的な誘導は、ベータ細胞でグルコース応答性を達成するために重要です31,32。この点で、このプロトコルは一貫して>50%のCPEP+/NKX6.1+細胞を生じるステージ7のhPSC膵島で生成し、in vitroでの高グルコースチャレンジに応じてインシュリンを分泌することができます。
本プロトコルは、インスリン産生hPS細胞膵島の効率的な作製を実証しているが、この方法には限界がある。この膵臓前駆細胞キットを使用したさまざまなhPS細胞株、特にiPS細胞とのステージ4終了時の分化効率は、依然として変動する可能性があります(データは示していません)。最適化はケースバイケースで実行する必要があります。この分化の最後の3つの段階では、96ウェルプレートでの静的懸濁培養を使用しますが、これは労働集約的でスケーラブルではないため、その使用は研究のみに限定されます。インスリン分泌能の獲得は有望ですが、hPS細胞膵島の in vitro グルコース反応性とインスリン含量は、死体膵島よりも有意に低いです。プロトコルの最適化を継続するためには、今後の取り組みが必要です。これらの限界はあるものの、本プロトコルは、分化誘導因子や膵島ホルモン分泌調節因子のスクリーニング、膵島細胞機能障害のモデル化に適したヒトPS細胞由来の材料を提供するものと考えています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Timothy J. Kiefferは、この原稿の作成中にViaCyteの従業員でした。他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、Stem Cell Network、JDRF、Canadian Institutes of Health Researchからの支援に感謝します。Jia ZhaoとShenghui Liangは、Michael Smith Health Research BC Trainee Awardを受賞しました。Mitchell J.S. Braamは、Mitacs Accelerate Fellowshipの受賞者です。Diepiriye G. Iworimaは、Alexander Graham Bell Canada Graduate ScholarshipとCFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Awardを受賞しています。MCRIとモナシュ大学のEdouard G. Stanley博士には、Mel1 INS GFP/W ラインを共有し、アルバータ糖尿病研究所の膵島コアには、ヒト膵島を分離して配布してくださったことに心から感謝します。また、ブリティッシュコロンビア大学のライフサイエンスインスティテュートイメージングおよびフローサイトメトリー施設からの支援にも感謝しています。 図 1 は BioRender.com で作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Petersen, M. C., Shulman, G. I.
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
