Summary
Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) insülin salgılayan beta hücrelerine farklılaşması, beta hücre fonksiyonunu ve diyabet tedavisini araştırmak için materyal sağlar. Bununla birlikte, doğal insan beta hücrelerini yeterince taklit eden kök hücre kaynaklı beta hücrelerinin elde edilmesinde zorluklar devam etmektedir. Önceki çalışmalara dayanarak, gelişmiş farklılaşma sonuçları ve tutarlılığı olan bir protokol oluşturmak için hPSC'den türetilmiş adacık hücreleri üretilmiştir. Burada açıklanan protokol, Aşama 1-4 sırasında bir pankreas progenitör kiti kullanır, ardından Aşama 5-7 sırasında daha önce 2014'te yayınlanan bir makaleden (bundan sonra "R-protokolü" olarak adlandırılacaktır) değiştirilmiş bir protokol kullanır. Pankreas progenitör kümeleri oluşturmak için pankreatik progenitör kiti ve 400 μm çaplı mikrokuyu plakaları, 96 oyuklu statik süspansiyon formatında endokrin farklılaşması için R protokolü ve hPSC'den türetilen adacıkların in vitro karakterizasyonu ve fonksiyonel değerlendirmesi için ayrıntılı prosedürler dahildir. Protokolün tamamı, ilk hPSC genişlemesi için 1 hafta sürer, ardından insülin üreten hPSC adacıkları elde etmek için ~ 5 hafta sürer. Temel kök hücre kültürü tekniklerine ve biyolojik tahliller konusunda eğitim almış personel bu protokolü çoğaltabilir.
Introduction
Pankreas beta hücreleri, kan şekeri seviyelerindeki artışlara yanıt vererek insülin salgılar. Tip 1 diyabette (T1D)1 beta hücrelerinin otoimmün yıkımı veya tip 2 diyabette (T2D)2 beta hücre disfonksiyonu nedeniyle yeterli insülin üretimi olmayan hastalar tipik olarak ekzojen insülin uygulaması ile tedavi edilir. Bu hayat kurtarıcı tedaviye rağmen, iyi niyetli beta hücrelerinden dinamik insülin sekresyonu ile elde edilen kan şekerinin mükemmel kontrolüyle tam olarak eşleşemez. Bu nedenle, hastalar genellikle hayatı tehdit eden hipoglisemik atakların ve kronik hiperglisemik gezilerden kaynaklanan diğer komplikasyonların sonuçlarından muzdariptir. İnsan kadavra adacıklarının transplantasyonu, T1D hastalarında sıkı glisemik kontrolü başarılı bir şekilde geri kazandırır, ancak adacık donörlerinin mevcudiyeti ve transplantasyon için sağlıklı adacıkların saflaştırılmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlıdır 3,4. Bu zorluk, prensip olarak, alternatif bir başlangıç malzemesi olarak hPSC'ler kullanılarak çözülebilir.
İn vitro olarak hPSC'lerden insülin salgılayan adacıklar oluşturmak için mevcut stratejiler genellikle embriyonik pankreas gelişim sürecini in vivo 5,6 taklit etmeyi amaçlamaktadır. Bu, sorumlu sinyal yollarının bilinmesini ve gelişmekte olan embriyonik pankreasın kritik aşamalarını taklit etmek için karşılık gelen çözünür faktörlerin zamanlanmış eklenmesini gerektirir. Pankreas programı, transkripsiyon faktörleri çatal başlı kutu A2 (FOXA2) ve cinsiyet belirleyici bölge Y-kutusu 17 (SOX17)7 ile işaretlenen kesin endoderm taahhüdü ile başlar. Kesin endodermin ardışık farklılaşması, pankreas ve duodenal homeobox 1'i (PDX1)7,8,9 eksprese eden bir posterior ön bağırsağa desenlenen ilkel bir bağırsak tüpünün oluşumunu ve PDX1 ve NK6 homeobox 1'i (NKX6.1)10,11 birlikte eksprese eden pankreas progenitörlerine epitelyal genişlemeyi içerir.
Endokrin adacık hücrelerine daha fazla bağlılığa, pro-endokrin ana düzenleyici nörogenin-3'ün (NGN3)12 geçici ekspresyonu ve anahtar transkripsiyon faktörlerinin kararlı indüksiyonu eşlik eder: nöronal farklılaşma 1 (NEUROD1) ve NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. İnsülin üreten beta hücreleri, glukagon üreten alfa hücreleri, somatostatin üreten delta hücreleri ve pankreas polipeptit üreten PPY hücreleri gibi ana hormon eksprese eden hücreler daha sonra programlanır. Bu bilgi birikiminin yanı sıra kapsamlı, yüksek verimli ilaç tarama çalışmalarından elde edilen keşiflerle, son gelişmeler, insülin salgılayabilen beta hücrelerine benzeyen hücrelerle hPSC adacıklarının üretilmesini sağlamıştır 14,15,16,17,18,19.
Glikoza duyarlı beta hücreleri üretmek için adım adım protokoller bildirilmiştir 6,14,18,19. Bu çalışmalara dayanarak, mevcut protokol, düzlemsel bir kültürde PDX1 + / NKX6.1 + pankreas progenitör hücreleri oluşturmak için bir pankreas progenitör kitinin kullanılmasını, ardından tek tip boyutlu kümeler halinde mikrokuyu plakası agregasyonunu ve statik bir 3D süspansiyon kültüründe R protokolü ile insülin salgılayan hPSC adacıklarına doğru daha fazla farklılaşmayı içerir. Farklılaşan hücrelerin titiz karakterizasyonu için akış sitometrisi, immün boyama ve fonksiyonel değerlendirme dahil olmak üzere kalite kontrol analizleri yapılır. Bu makale, yönlendirilmiş farklılaşmanın her adımının ayrıntılı bir tanımını sağlar ve in vitro karakterizasyon yaklaşımlarını ana hatlarıyla belirtir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, besleyicisiz koşullarda H1, HUES4 PDXeG ve Mel1 INSGFP/W dahil olmak üzere hPSC hatlarıyla çalışmaya dayanır. Bu bölümde, temsili sonuçlar bölümünde Mel1 INSGFP/W'nin farklılaşmasından elde edilen destekleyici verilerle birlikte adım adım bir prosedür detaylandırılmıştır. Burada belirtilmeyen diğer hPSC hatlarıyla çalışırken daha fazla optimizasyon gerektiğini öneririz. Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler ve çözeltilerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Farklılaştırma ortamı ve çözümlerinin hazırlanması
NOT: Hazırlanacak tüm çözümler için Tablo 1'e ve farklılaşma ortamı için Tablo 2'ye bakınız.
- Steril bir biyogüvenlik kabininde hücre kültürü için tüm ortamları ve reaktifleri hazırlayın. Kullanmadan önce hücre kültürü ile ilgili solüsyonları ve bazal ortamı banyoda 37 °C'ye kadar kısaca ısıtın.
NOT: Aşağıda açıklandığı gibi, takviyeler ekleyerek günlük olarak taze farklılaşma ortamı yapın ve bunları aynı gün kullanın. Alternatif olarak, pankreas progenitör kiti, üreticinin protokolünü takiben birkaç gün boyunca kullanılabilecek daha büyük bir hacmi önceden hazırlama seçeneği sunar. Medya hazırlığı için her iki yöntem de işe yaradığını kanıtlıyor. Medyanın su banyosunda uzun süre bırakılmasının tavsiye edilmediğini unutmayın. Her gün taze ortam hazırlarken, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için takviyelerin kesilmesi önerilir.
2. hPSC'lerin pankreas progenitör hücrelerine farklılaşması
- Matrigel kaplı kaplarda farklılaşmamış hPSC'leri mTeSR1 tam ortamında tutun ve günlük olarak ortam değişiklikleri gerçekleştirin. Bakım kültürü sırasında, üreticinin protokolünü izleyerek hücre ayrışma reaktifini kullanarak hücreler ~%70 birleşmeye ulaştığında her 3-4 günde bir hPSC'leri geçindirin. Farklılaşmayı başlatmak için, hücreleri tek hücrelere ayırın ve bunları 6 oyuklu veya 12 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş plakalara (sırasıyla kuyucuk başına 2 mL veya 1 mL'lik ortam hacimleri ile) tohumlayın.
NOT: Endoderm bazal ortamının ve alikotlarının depolanması ile ilgili talimatlar için Tablo 1'e bakın. - Kültür kuyucuklarını hESC nitelikli Matrigel (üreticinin protokolü tarafından önerildiği şekilde buz gibi soğuk DMEM/F12 ile seyreltilmiş) ile ön kaplama yapın ve plakayı 30 dakika boyunca nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatöre yerleştirin.
- Matrigel kaplı plakayı oda sıcaklığına getirin (3 saat içinde kullanın).
- Harcanan ortamı hPSC kültüründen aspire edin ve DPBS ile bir kez durulayın. hPSC kültürünü 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca hücre ayrışma enzimi ile tek hücrelere ayırın. Sıcak DMEM / F12 ortamı ekleyerek hücreleri durulayın, 15 mL veya 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.
- Hücre peletini kök hücre tam ortamı artı 10 μM Y-27632 ile yeniden süspanse edin ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile canlı hücre (tripan mavisi negatif) sayımı gerçekleştirin. Seyreltilmiş Matrigel'i aspire edin ve Matrigel kaplı kuyucuklarda 1.60-1.80 × 10 5 /cm2 yoğunlukta canlı hücreleri hemen tohumlayın ve nemlendirilmiş 37 ° C,%5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin. Aşama 1'e geçin.
NOT: Bu, farklılaşmayı başlatmak için ~%95 başlangıç izdihamı ile sonuçlanacaktır. Üreticinin protokolüne göre, 2,6 × 105/cm2 tohumlama yoğunluğu önerilir. Bir hücre hattı için en uygun değeri belirlemek ve hücre canlılığını kontrol etmek için çeşitli tohumlama yoğunluklarının test edilmesi önerilir. Canlılık% 80'in altındaysa, farklılaşmaya devam etmeyin. Düşük hücre canlılığı, hasat sırasında aşırı sindirim veya aşırı tritürasyonun veya tohumlamadan önce hücrelerin DMEM / F12 ortamında uzun süre bırakılmasının bir sonucu olabilir. - Aşama 1 gün 1'de, endoderm bazal ortamını bir banyoda 37 ° C'ye kadar kısaca ısıtın ve MR ve CJ takviyesini çözün. Endoderm bazal ortamına Ek MR ve CJ ekleyerek Aşama 1A ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 1A ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
NOT: Yıkama adımları gereksizdir. Ortam değişiminden önce kültür plakasını hafifçe sallayarak bağlanmamış hücreleri kültürden çıkarın. Orta boy çıkarma sırasında pipet ucunu kuyu dibine değdirmeyerek ve nazik orta madde ilavesi yaparak tek tabakayı bozmaktan kaçının. - Aşama 1 gün 2'de, endoderm bazal ortamını 37 ° C'lik bir banyoda kısaca ısıtın ve Supplement CJ'yi çözün. Endoderm bazal ortamına Ek CJ ekleyerek Aşama 1B ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 1B ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
- Aşama 1 gün 3'te, 2.8-2.9 adımlarını tekrarlayın. Aşama 2'ye geçin.
- Aşama 2 gün 1'de, pankreas Evre 2-4 Bazal Ortamını 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve Ek 2A ve 2B'yi çözün. Pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamına Ek 2A ve 2B ekleyerek Aşama 2A ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 2A ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
- Aşama 2 gün 2'de, pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve Ek 2B'yi çözün. Pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamına Ek 2B ekleyerek Aşama 2B ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 2B ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
- Aşama 2 gün 3'te 2.13-2.14 adımlarını tekrarlayın. Aşama 3'e geçin.
- Aşama 3 gün 1'de, pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve Ek 3'ü çözün. Pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamına Ek 3 ekleyerek Aşama 3 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 3 ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
- Aşama 3 gün 2 ve gün 3'te 2.16-2.17 adımlarını tekrarlayın. Aşama 4'e geçin.
- Aşama 4 gün 1'de, pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamını 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve Ek 4'ü çözdürün. Pankreas Evre 2-4 Bazal Ortamına Ek 4 ekleyerek Aşama 4 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 4 ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
- Aşama 4'te 2. günden 4. güne kadar 2.19-2.20 arasındaki adımları tekrarlayın. Toplama adımlarına geçin.
3. 400 μm çaplı mikrokuyu plakaları kullanılarak pankreas progenitör kümelerine agregasyon
- Aşama 4 gün 5'te, mikro kuyucuklara (örn. 24 oyuklu plaka formatı) oyuk başına 500 μL Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu ile ön işleme tabi tutun.
- Bir denge plakası hazırlayın ve mikrokuyu plakasını 1.300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
NOT: Mikro kuyucuklarda kabarcık kalmadığından emin olmak için plakayı mikroskop altında kontrol edin. Kabarcıklar herhangi bir mikro kuyuda sıkışmış kalırsa 5 dakika daha santrifüjleyin. - Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonunu kuyulardan aspire edin ve 1 mL DPBS ile bir kez durulayın. DPBS'yi kuyulardan aspire edin ve her kuyucuğa 1 mL Agregasyon ortamı ekleyin.
- Harcanan ortamı pankreas progenitör kültürlerinden çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkayın. Kültürleri ayrışma reaktifi ile 37 °C'de 10-12 dakika boyunca tek hücrelere ayırın. Hücreleri ılık DMEM / F12 ile durulayın, bir tüpe aktarın ve 300 × g'da 5 dakika döndürün.
- Hücre peletini Agregasyon ortamında yeniden süspanse edin ve canlı hücre sayımı gerçekleştirin. Oyuk başına 2.4-3.6 milyon toplam hücreyi tohumlayın (yani, mikrokuyu başına 2.000-3.000 hücre) ve oyuk başına 2 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için her bir oyuğa Agregasyon ortamı ekleyin.
- Hücrelerin kuyu boyunca eşit dağılımını sağlamak için hücreleri bir P1000 pipet ucuyla birkaç kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Mikro kuyulara kabarcık sokmayın. Mikrokuyucuklardaki hücreleri yakalamak için mikrokuyucuk plakasını 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Mikrokuyucuk plakasını 24 saat agregasyon için nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatörde inkübe edin ve Aşama 5-7 farklılaşmasına geçin.
NOT: Toplama sırasında plakayı rahatsız etmemeye dikkat edin. Optimum agrega oluşumu için 48 saate kadar inkübasyon süresi gerekebilir.
4. Kit kaynaklı pankreas progenitör kümelerinin hPSC adacıklarına farklılaşması
- Aşama 5 gün 1'de, Aşama 5-7 bazal ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve takviyeleri çözdürün (bkz. Tablo 1 ve Tablo 2). Aşama 5-7 bazal ortama takviyeler (son çalışma konsantrasyonlarına) ekleyerek Aşama 5 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Agrega oluşumundan sonra, agrega olmayan hücreleri yüzdürmek için agregaları bir P1000 pipet ucuyla birkaç kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Agregaların yerçekimi ile çökmesine izin verin (~1 dakika bekleyin). Aspire eden agregalardan kaçınırken, harcanan ortamı (yüzen toplanmamış hücreleri içeren) kuyudan mümkün olduğunca nazikçe çıkarın.
- Agregaları mikro kuyulardan çıkarmak için taze Aşama 5 ortamını mikro kuyu plakasının yüzeyine kuvvetlice dağıtın. Agregaları ultra düşük ataşman (ULA) 6 kuyucuğuna aktarın. Agregaları mikro kuyulardan tamamen almak için Aşama 5 ortamı ile bir kez durulayın.
- ULA 6 kuyularındaki tüm agregaları toplayın, agregaları Aşama 5 ortamında yeniden süspanse edin ve yoğunluğu 100 μL başına 20 kümeye ayarlayın (örneğin, her kuyudan ~1.200 kümenin alınması beklenir. 1,200 kümeyi 6 mL Aşama 5 ortamında yeniden süspanse edin). ULA düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL Aşama 5 ortamı dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Köşe ve kenar kuyularını 200 μL DPBS ile doldurun.
NOT: Daha fazla buharlaşmaya eğilimli olduklarından, agregaları kültürlemek için kenar kuyularını kullanmaktan kaçının; Aksi takdirde, kenarlar boyunca buharlaşmayı en aza indirmek için tasarlanmış 96 oyuklu bir plaka kullanın (örneğin, yerleşik hendeklere sahip 96 oyuklu plakalar) veya kültür plakasını yüksek nemli bir mikro iklimlendirme hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. - ULA düz tabanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 μL küme yeniden süspansiyonu ekleyin, bu da oyuk başına ortalama 20 küme içeren toplam 150 μL kültür ortamı ile sonuçlanır.
NOT: 96 kuyucuğa dağıtmadan önce her seferinde küme yeniden süspansiyonunu yavaşça karıştırın. - Kültür plakalarını nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatörde 24 saat boyunca düz bir yüzeye yerleştirin.
- Aşama 5 gün 2'de, adım 4.1'i izleyerek Aşama 5 ortamını hazırlayın.
- Her bir oyuktan harcanan ortamın ~90 μL'sini çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve 100 μL Aşama 5 ortamı ile yenileyin.
- Aşama 5 3. günde, 4.7-4.8 adımlarını tekrarlayın. Aşama 6'ya geçin.
- Aşama 6 gün 1'de, Aşama 5-7 bazal ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve takviyeleri çözdürün (bkz. Tablo 1 ve Tablo 2). Aşama 5-7 bazal ortama takviyeler (son çalışma konsantrasyonlarına) ekleyerek Aşama 6 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Harcanan ortamın ~ 90 μL'sini çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve oyuk başına 100 μL Aşama 6 ortamı ile yenileyin.
- Aşama 6 2. günden 8. güne kadar 4.10-4.11 adımlarını tekrarlayın. Aşama 7'ye geçin.
- Aşama 7 gün 1'de, Aşama 5-7 bazal ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve takviyeleri çözdürün (bkz. Tablo 1 ve Tablo 2). Aşama 5-7 bazal ortamına takviyeler (son çalışma konsantrasyonlarına) ekleyerek Aşama 7 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
- Harcanan ortamın ~90 μL'sini çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve oyuk başına 100 μL Aşama 7 ortamı ile yenileyin.
- Aşama 7 2. günden 12. güne kadar 4.13-4.14 arasındaki adımları tekrarlayın. İn vitro karakterizasyona geçin.
5. Akış sitometrik analizi
- Kültür ortamını çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkayın. Kültürleri (düzlemsel progenitör hücreler veya farklılaşan kümeler) 37 °C'de 10-12 dakika inkübe ederek ayrışma reaktifi ile tek hücrelere ayırın. FACS tamponu ile durulayın ve 300 × g'da 5 dakika döndürün.
- Hücre peletini FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre sayımı yapın. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Tek hücreleri 500 μL Fix / Perm tamponunda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin.
NOT: Kullanmadan önce Fix/Perma tamponunu oda sıcaklığına getirin. Fix/Perm tamponu paraformaldehit (PFA) içerir. PFA'yı bir çeker ocakta dikkatlice kullanın ve kurumsal yönergelere göre atın. - 500 × g'da 3 dakika döndürün, 500 μL 1x Perm/Yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve 300 μL 1x Perm/Yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. 100 μL tek hücreli resüspansiyonu (her biri 2.5-3 × 105 hücre içeren) boyanmamış kontrol, izotip kontrolü ve antikor boyama için üç mikrofüj tüpüne aktarın (numune antikoru ve seyreltme bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın). Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin ve folyo ile örtün.
- 500 × g'da 3 dakika döndürün. 500 μL 1x Perma/Yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Numuneleri 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve boyanmış hücreleri bir akış sitometresi ve yazılımı (örneğin, FlowJo) ile analiz edin (belirli aşamalarda belirteçlerin hücre içi boyanması için Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Numuneler hemen test edilmezse, ışıktan koruyarak 4°C'de saklayın. Geçit stratejisi için, akış verileri önce küçük hücresel kalıntıları gidermek için saçılma özellikleri (FSC-A ve SSC-A) ile geçitlenir, ardından singlet'leri tanımlamak için FSC-A ve FSC genişlik özellikleri gelir. Pozitif ve negatif geçitleme, kök hücre kontrolleri ve/veya boyanmamış, izotip kontrolleri ile belirlenir.
6. Tüm montaj immün boyama
- Kümeleri bir mikrofüj tüpünde toplayın. Kümeleri yerçekimi ile yerleştirin. Harcanan ortamı aspire edin ve bir kez 1 mL PBS (kalsiyum ve magnezyum ile) ile durulayın. Kümeleri gece boyunca 1°C'de 4 mL %4 PFA ile sabitleyin.
- PBST ile bir kez durulayın ve 20-30 kümeyi 500 μL %0.3 TritonX-100 ile bir mikrofüj tüpünde ortam sıcaklığında en az 6 saat eğimli çalkalayıcı üzerinde geçirgenleştirin.
NOT: Büyük kümeler için daha uzun bir geçirgenlik süresi (24 saate kadar) gereklidir. - Kümeleri, bir eğimli çalkalayıcı üzerinde ortam sıcaklığında 100 μL bloke edici tamponda 1 saat inkübe edin. Bloke edici tamponu çıkarın ve kümeleri, bir tilt çalkalayıcı üzerinde gece boyunca ortam sıcaklığında antikor seyreltme tamponunda seyreltilmiş 100 μL birincil antikor ile inkübe edin.
NOT: Görüntüleme sırasında arka plan güçlüyse, 4 °C'de primer antikorlarla inkübe edin. - 3 x 30 dakika 500 μL PBST ile eğimli bir çalkalayıcıda iyice yıkayın (eğim açısı 8'e ayarlanmış, hız 20'ye ayarlanmıştır).
- Kümeleri, bir tilt çalkalayıcı üzerinde gece boyunca ortam sıcaklığında antikor seyreltme tamponunda 100 μL ikincil antikor ile inkübe edin. Tüpleri folyo ile örtün.
NOT: Görüntüleme sırasında arka plan güçlüyse, 4 °C'de ikincil antikorlarla inkübe edin. - 500 μL PBST ile bir kez durulayın. 100 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi (PBST'de 10 μg/mL) ekleyin ve ortam sıcaklığında 10-15 dakika boyayın. Folyo ile örtün ve ışıktan koruyun.
- 3 x 30 dakika 500 μL PBST ile eğimli bir çalkalayıcıda iyice yıkayın. Yıkama aşamasında tüpleri folyo ile örtün.
- Kümeleri, üreticinin protokolüne ve yayınlanmış protokollere göre doku yapıştırıcısı ile önceden kaplanmış görüntüleme odası slaytlarına (Malzeme Tablosuna bakın)yapıştırın 20,21.
- Doku temizleme ortamı (PBS çözeltisinde% 80 gliserol) ile monte edin ve cam lameller ile örtün. Konfokal görüntülemeye kadar ışıktan koruyunuz.
NOT: Numuneler hemen görüntülenmezse, bunları ışıktan koruyarak 4 °C'de saklayın.
7. Statik GSIS testi
- 37 °C'lik bir banyoda sıcak düşük glikozlu Kreb's Ringer bikarbonat (3.3G KRB) tamponu, yüksek glikozlu (16.7G) KRB tamponu ve 30 mM KCl KRB tamponu.
- Boyuta uygun kümeleri elle seçin ve 2 mL sıcak 3.3G KRB tamponu ile durulayın. Kümeleri doku kültürü ile muamele edilmemiş 6 oyuklu plakaya aktarın ve nemlendirilmiş 37 °C,% 5 CO 2 inkübatörde 1 saat boyunca2 mL veya ılık 3.3G KRB tamponunda dengeleyin.
- Dengelemeden sonra, tahlil odasını ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 μL sıcak 3.3G KRB tamponu ile doldurun. Beş kümeyi elle seçin ve bunları test odasının merkezine aktarın. Nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
NOT: Minimum orta hacimli kümeleri aktarmak için 10 μL pipet uçları kullanın. - Süpernatanın ~ 100 μL'sini dikkatlice toplayın ve bazal insülin sekresyonunun ölçümüne kadar -30 ° C'de saklayın (bkz. adım 7.9). Bu adımda herhangi bir kümeyi kurutmayın veya kaybetmeyin. Hemen tahlil odasına 100 μL ılık 16.7G KRB tamponu ekleyin ve aynı kümeleri nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
- Süpernatantın ~ 100 μL'sini dikkatlice toplayın ve glikozla uyarılan insülin sekresyonunun ölçümüne kadar -30 ° C'de saklayın (bkz. adım 7.9). Hemen tahlil odasına 100 μL ılık 30 mM KCl KRB tamponu ekleyin ve aynı kümeleri nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
- Süpernatanın ~ 100 μL'sini dikkatlice toplayın ve KCl ile uyarılan insülin sekresyonunun ölçümüne kadar -30 ° C'de saklayın (bkz. adım 7.9). Hemen tahlil odasına 100 μL RIPA lizis tamponu ekleyin ve beş kümenin tümünü içeren lizis tamponunu bir mikrofüj tüpüne aktarın.
- İsteğe bağlı) Bir P200 pipet ucuyla kuvvetli bir şekilde öğüterek kümeleri manuel olarak kırın. 30 saniye boyunca girdap yapın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, ardından 30 saniye daha girdap yapın.
NOT: Girdap ve buz üzerinde yeterli inkübasyon süresi ile tam liziz sağlayın. - 8.000 × g'da 1 dakika döndürün. Süpernatanı toplayın ve toplam insülin içeriği ölçülene kadar -30 °C'de saklayın (bkz. adım 7.9).
- Üreticinin protokolüne ve yayınlanmış protokollere göre bir İnsan İnsülin ELISA Kiti kullanarak süpernatan numunelerde insan insülinini ölçün20,22.
NOT: Süpernatan numunelerin tekrar tekrar dondurulmasını ve çözülmesini önleyin. Üçten fazla donma ve çözülme döngüsüne sahip numuneler test edilmemelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kök hücreleri yedi adımda insülin salgılayan hPSC adacıklarına farklılaştırmak için hibrit bir strateji geliştirdik, bu da düzlemsel kültürde ilk dört aşama için bir pankreas progenitör kiti kullanıyor, ardından son üç aşama için statik bir süspansiyon kültüründe daha önce bildirilen bir yöntem6 üzerine inşa edilmiş değiştirilmiş bir protokol kullandık (Şekil 1). Bu protokolle, hücre tohumlamadan (Aşama 0) 24 saat sonra yakın bir birleşme (%90-100) kültürünün sağlanması, çoğu hPSC hattı için verimli bir farklılaşma başlatmak için kritik öneme sahiptir (Şekil 2A). Belirli bir hücre hattı için en uygun durumu belirlemek için farklı tohumlama yoğunluklarının test edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Aşama 1 kültürü sırasında, bu aşamada yaygın olarak gözlenen yüzen ölü hücreler nedeniyle ortam muhtemelen bulanık görünecektir. Bu, bağlı hücreler damar yüzeyini tamamen kapladığı sürece kitin farklılaşma verimliliğinden ödün vermez. Aşama 2-4 sırasında, hücreler çoğaldıkça ve hücre ölümü azaldıkça, tek katmanlar daha sıkıştırılmış hale gelir ve harcanan ortam Aşama 1'deki kadar bulanık değildir (Şekil 2A). İnsülin raportörü Mel1 INSGFP/W hESC'lerde gösterildiği gibi, Evre 1'in sonunda en az %95 FOXA2+/SOX17+ kesin endoderm hücresi ve Evre 4'ün sonunda %80 PDX1+/NKX6.1+ pankreas progenitör hücresi rutin olarak elde edilebilir (Şekil 2B-E). Pankreas progenitör hücrelerinin düzlemsel kültürden süspansiyon kültürüne geçişinin, sonraki endokrin hücre indüksiyonunu desteklediği gösterilmiştir23,24. Bu güncellenmiş protokolde, mikrokuyu plakaları kullanıyoruz ve 24 saat hücre agregasyonuna izin veriyoruz. Bu, bir seferde tek tip boyut ve morfolojiye sahip binlerce pankreas progenitör kümesi oluşturur (Şekil 3A, B) ve ortalama agregasyon verimliliği (agregalara dahil edilen hücrelerin yüzdesini hesaplayarak)% 74.1 ±% 4.4'tür (Şekil 3C). Daha da önemlisi, PDX1 ve NKX6.1'in ekspresyonu, agregasyon sonrası bu kümelerde yüksek seviyelerde tutulur (Şekil 3D, E), bu da pankreas progenitörlerinin in vitro olarak diferansiyasyon kiti ve mikrokuyu plağı ile verimli bir şekilde üretildiğini düşündürür.
Daha sonra, bu kit kaynaklı pankreas progenitörlerini hPSC-adacıklarına doğru daha da farklılaştırmak için ULA düz tabanlı 96 oyuklu plakalar kullanan statik bir süspansiyon kültürü sisteminde son 3 aşamalı farklılaşma için R-protokolünü (Rezania ve ark.6'dan modifiye edilmiş bir yöntem) kullanıyoruz (Şekil 1). İnsülin eksprese eden hücreler, zaman içinde canlı kültürlerde artan INS-GFP sinyallerinin gösterdiği gibi, endokrin kümeleri içinde kademeli olarak indüklenir (Şekil 4A, B). Küme boyutunun ölçülmesi, Aşama 5 kümelerinin ortalama çapının 150 μm olduğunu ve Aşama 7'de ortalama çapın 220 μm'ye yükseldiğini ortaya koymaktadır (Şekil 4C). Kümeler, Aşama 5 ve Aşama 7 arasında büyüdükçe ağırlıklı olarak pürüzsüz, küresel görünümlerini korurlar, bu da statik kültür yönteminin, yörüngesel çalkalayıcı tabanlı süspansiyon kültürlerine (tipik olarak bazı büyük boyutlu kümeler oluşturan) kıyasla kümelenmeyi sınırladığını düşündürür25. Düzgün küresel morfolojiye sahip sıkıştırılmış kümelerin bakımı, sonunda fonksiyonel hPSC adacıklarına doğru başarılı bir farklılaşma için önemli olan, farklılaşan hücrelerin iyi yaşayabilirliğinin bir göstergesidir.
Hücre kompozisyonunun karakterizasyonu, hibrid protokol tarafından üretilen Evre 7 hPSC-adacıklarının öncelikle endokrin olduğunu ve insülin pozitif beta hücreleri, glukagon pozitif alfa hücreleri, somatostatin pozitif delta hücreleri ve pankreas polipeptit pozitif PPY hücreleri dahil olmak üzere dört ana adacık hücre tipinden oluştuğunu gösterirken, enterokromafin hücreleri (hedef dışı bir soydantüretilmiştir 26) de mevcuttur (Şekil 5A-C). Özellikle, bu hibrit protokol büyük ölçüde monohormonal adacık hücreleri (~% 50 CPEP +/GCG / SST- hücreleri, ~% 17 GCG + / CPEP- hücreleri ve ~% 12 SST + / CPEP hücreleri) ve sadece az sayıda bi-hormonal hücreler (CPEP + / GCG + veya CPEP + / SST +) Aşama 7 kültürlerinde (Şekil 5B-D). Evre 7 hPSC adacıklarında birkaç anahtar transkripsiyon faktörünün ve olgun beta hücresi belirteçlerinin incelenmesi, farklılaşan beta hücrelerinin PDX1, NKX6.1, NEUROD1, MAFA ve glikoz taşıyıcı GLUT1'i eksprese ettiğini ortaya koymaktadır (Şekil 6A). Ayrıca, Aşama 7 kültürlerinde ~%60 INS+/PDX1+ hücreleri (Şekil 6B) ve %50 CPEP+/NKX6.1+ hücreleri (Şekil 6C) indüklenir, bu da burada sunulduğu gibi hibrit stratejiyi kullanarak fonksiyonel beta hücrelerinin verimli bir şekilde üretildiğini düşündürür. Gerçekten de, in vitro statik glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonu (GSIS) testleri, Evre 7 hPSC adacıklarının hem yüksek glukoza hem de doğrudan depolarizasyona yanıt veren yüksek seviyelerde insülin salgılayabildiğini göstermektedir (Şekil 6D). Bu işlev cesaret verici olsa da, hPSC adacıklarından gelen in vitro glukoz yanıtı, insülin sekresyonunun büyüklüğü açısından hala kadavra adacıklarınınkine eşdeğer değildir (Şekil 6D) ve hPSC adacıklarının toplam insülin içeriği, kadavra adacıklarındakinin yaklaşık yarısı kadardır (Şekil 6E). Daha olgun beta hücre fenotiplerine sahip hPSC adacıkları elde etmek için sürekli optimizasyon gereklidir.
Şekil 1: İn vitro fonksiyonel hPSC adacıkları oluşturmak için farklılaşma şemasına genel bakış. İş akışı diyagramı, pankreatik progenitör kiti kullanılarak düzlemsel bir kültürde hPSC'lerin pankreas progenitör hücrelerine farklılaşması, mikrokuyu plakaları kullanılarak pankreas progenitör kümelerine agregasyon ve statik bir süspansiyon kültüründe hPSC adacıklarına geçişte yer alan yedi adımlı prosedüre genel bir bakış sağlar. Bu hibrit yöntemin etkinliğini göstermek için bir örnek olarak bu çalışma boyunca bir insülin raportörü hESC hattı olan Mel1 INSGFP/W kullanılmıştır. Kısaltmalar: hPSC'ler = insan pluripotent kök hücreleri; GSIS = glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Pankreatik progenitör kiti kullanılarak hPSC'lerin pankreas progenitör hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması. (A) Belirtilen aşamalarda hücre morfolojisini gösteren temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubukları = 750 μm. (B, C) (B) Evre 1 kesin endoderm hücrelerinin (FOXA2+/SOX17+) ve (C) Evre 4 pankreas progenitör hücrelerinin (PDX1+/NKX6.1+) anahtar belirteçleri için temsili akış sitometrisi grafikleri. (D) PDX1 (kırmızı) ve NKX6.1 (yeşil) için pankreas progenitör hücrelerinin temsili immün boyama görüntüleri. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu = 200 μm. (E) Aşama 4 Gün 4 pankreas progenitör tek tabakalı hücrelerde (n = 5 biyolojik kopya) PDX1 + / NKX6.1+ hücrelerinin akış sitometrik kantitasyonu. Kısaltmalar: hPSC'ler = insan pluripotent kök hücreleri; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 400 μm çaplı mikrokuyu plakaları kullanılarak tek tip boyutlu pankreas progenitör kümeleri halinde agregasyon. (A) Aşama 4'ün sonunda, mikro kuyudaki küme morfolojisini gösteren ve mikro kuyudan alındıktan sonra temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubukları = 300 μm. (B) Aşama 4'ün sonunda küme çapının ölçülmesi (n = 3 biyolojik kopyadan 60 küme). (C) Aşama 4'ün sonunda agregasyon verimliliğinin ölçülmesi (n = 5 biyolojik kopya). (D) PDX1 (kırmızı) ve NKX6.1 (yeşil) için pankreas progenitör kümelerinin temsili immün boyama görüntüleri. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu = 100 μm. (E) Aşama 4 Gün 5 pankreas progenitör agregatlarında (n = 4 biyolojik kopya) PDX1 + / NKX6.1+ hücrelerinin akış sitometrik kantitasyonu. Kısaltma: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Statik süspansiyon kültürü sisteminde pankreas progenitörlerinin hPSC adacıklarına farklılaşması. (A) Belirtilen aşamalarda küme morfolojisini ve insülin ekspresyon modelini gösteren temsili faz kontrast görüntüleri (üst panel) ve floresan görüntüler (alt panel). Ölçek çubukları = 300 μm. (B) Belirtilen aşamalarda küme başına ortalama INS-GFP floresan yoğunluklarının ölçülmesi (n = iki biyolojik kopyadan 30 küme). (C) Belirtilen aşamalarda küme çapının ölçülmesi (üç biyolojik kopyadan n = 60 küme). Kısaltmalar: hPSC = insan pluripotent kök hücresi; INS = insülin; GFP = yeşil floresan proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Evre 7 hPSC adacıklarında hücre kompozisyonunun karakterizasyonu. (A) Farklı hücre tiplerini gösteren Evre 7 hPSC adacıklarının temsili immün boyama görüntüleri (SYN, pan-endokrin belirteç; CK19, duktal işaretleyici; INS-GFP, insülin raportör GFP sinyalleri ile gösterilir; GCG; SST; PPY; ENC, SLC18A1 antikoru ile boyandı). Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubukları = 100 μm. (B,C) Aşama 7 hPSC adacıklarındaki CPEP+ ve GCG+ hücrelerinin (B) yüzdesinin ve (C) Aşama 7 hPSC adacıklarındaki CPEP+ ve SST+ hücrelerinin yüzdesinin temsili akış sitometrisi grafikleri. (D) Evre 7 hPSC adacıklarında (n = 4 biyolojik kopya) belirtilen hücre belirteçlerinin akış sitometrisi miktar tayini. Kısaltmalar: hPSC = insan pluripotent kök hücresi; INS = insülin; GFP = yeşil floresan proteini; SYN = sinaptofizin; GCG = glukagon; SST = somatostatin; PPY = pankreas polipeptiti; ENC = enterokromafin; CPEP = C-peptid; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Evre 7 hPSC adacıklarının in vitro karakterizasyonu ve fonksiyonel değerlendirmesi. (A) NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 ve glikoz taşıyıcı GLUT1 gibi birkaç anahtar beta hücre belirteci ile insülinin birlikte ekspresyonunu (muhabir INS-GFP sinyalleri ile gösterilir) gösteren Evre 7 hPSC adacıklarının temsili immün boyama görüntüleri. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubukları = 100 μm. (B,C) INS+/PDX1+ hücrelerinin (B) yüzdesinin ve CPEP+/NKX6.1+ hücrelerinin (C) yüzdesinin temsili akış sitometrisi grafikleri. (D) Yüksek glikoza (16.7G, 16.7 mM glikoz) ve 30 mM KCl depolarizasyonuna yanıt olarak Evre 7 hPSC adacıklarından (3 biyolojik ve 2 teknik kopya içeren n = 6) ve insan adacıklarından (3 biyolojik ve 2 teknik kopya içeren n = 6) insülin salınımını gösteren statik GSIS testleri. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Belirtilen iki grup arasında karşılaştırma yapmak için eşleştirilmemiş iki kuyruklu t-testi (**p < 0.01) kullanıldı. (E) Evre 7 hPSC adacıklarının (3 biyolojik ve 2 teknik kopya dahil n = 6) ve insan adacıklarının (3 biyolojik ve 2 teknik kopya dahil n = 6) toplam insülin içeriği. İki grubu karşılaştırmak için eşleşmemiş iki kuyruklu t-testi (*p < 0.05) kullanıldı. Kısaltmalar: hPSC = insan pluripotent kök hücresi; INS = insülin; GFP = yeşil floresan proteini; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tüm çözeltilerin ve ortamların formülasyonu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Aşama 1-7 farklılaşma ortamının formülasyonu. Tablo, Aşama 1-7 farklılaşma ortamını hazırlamak için reçete sağlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, in vitro kültürden sonraki 40 gün içinde glikoz tehdidi üzerine insülin salgılayabilen hPSC adacıklarının üretilmesine izin veren yedi aşamalı bir hibrit protokolü açıklamaktadır. Bu çoklu adımlar arasında, kesin endodermin etkin indüksiyonunun, nihai farklılaşma sonuçlarıiçin önemli bir başlangıç noktası oluşturduğuna inanılmaktadır 18,27,28. Üreticinin protokolünde, farklılaşmayı başlatmak için 2,6 × 105/cm2'de bir tohumlama yoğunluğu önerilir ve hücreler 2 gün boyunca Aşama 1 ortamına maruz bırakılır. Hücrelerin 1. günde (%90-%100) birleşmeye yakın olmasını sağlamak için, optimum tohumlama yoğunluğu değişebileceğinden, yeni bir hPSC hattı üzerinde çalışırken tohumlama yoğunluklarını test etmenizi şiddetle tavsiye ederiz. Örneğin, elimizde test edilen her üç hPSC hattı ile 2,60 × 10 5/cm2 yerine 1,6-1,80 × 105/cm2'nin optimal bir tohumlama yoğunluğu olduğu bulunmuştur. Aşama 1'in kültür süresinin 2 günden 3 güne uzatılması, Aşama 1B ortamında bir gün daha ek olarak FOXA2+/SOX17+ hücrelerinin saflığını %80'den %93'> çıkarır (veriler gösterilmemiştir). Aşama 1'in sonunda FOXA2+/SOX17+ hücrelerinin oranı %70'in altındaysa, PDX1+ hücrelerinin ve PDX1+/NKX6.1+ hücrelerinin indüksiyonu muhtemelen tehlikeye girecektir.
Bağlı hücrelerin yüzey alanının% 100'ünü kaplaması gerekirken, tüm Aşama 1 kültürü boyunca bir miktar hücre ölümünün gözlemlenebileceğine dikkat etmek önemlidir. Evre 2-4 sırasında, hücre proliferasyonu ile eşzamanlı hücre ölümündeki azalma, pankreas progenitör belirteçleri PDX1 ve NKX6.1'in verimli indüksiyonu ve nükleer lokalizasyonu için kritik olduğu bildirilen sıkıştırılmış ve çok katmanlı hücrelerle sonuçlanır29,30. Aşama 4'ün son gününde, hücreler ayrıştırılır ve AggreWell 400 μm çaplı mikrokuyu plakaları kullanılarak kümeler halinde toplanır. Askıya alınmış toplama, manuel toplama veya U-tabanlı 96 oyuklu plakaların kullanılması gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, AggreWell toplama, bu yöntemin sağlamlığını gösteren binlerce küresel tekdüze boyutlu küme oluşturur.
Statik bir 3D kültürde Aşama 5-7 sırasında endokrin indüksiyonu için, ULA düz tabanlı 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna ortalama sayıda ~20 kit kaynaklı pankreas progenitör kümesi aktarıyoruz. Bu yöntem, büyük boyutlu kümelerin oluşumunu büyük ölçüde azaltır ve muhtemelen küme füzyonunu sınırlayarak ve/veya orbital çalkalayıcı kültürü sırasında kesme gerilimi aracılı hücre kaybını azaltarak hücre canlılığını artırır. Ortam değişimi sırasında kümeleri kaybetme riskini azaltırken harcanan ortamdaki yüzen ölü hücreleri kaldırmak için, toplam ortam hacminin yaklaşık üçte ikisini yenilemenizi öneririz. Bu kısmi ortam değişikliğinin endokrin farklılaşmasını engellemediğini ve bunun yerine farklı aşamalar arasında geçiş yaparken yumuşak bir geçiş sunabileceğini not ediyoruz. Bununla birlikte, düzlemsel kültürden statik süspansiyon kültürüne geçerken bu hibrit protokol ile Aşama 5 ve erken Aşama 6 sırasında bazı hücre ölümleri hala gözlemlenebilir. Raportör hPSC hatları (örneğin, Mel1 INS,GFP/W hESC'ler), canlı kültürlerde geç aşama farklılaşmasını izlemek için kullanışlıdır. Koşu akışı sitometrisi, Aşama 5'in sonunda NKX6.1+/NEUROD1+, Aşama 6'nın sonunda INS+/NKX6.1+ ve Aşama 7'nin sonunda CPEP+/NKX6.1+'ın incelenmesine yardımcı olacaktır. NKX6.1 ile birlikte eksprese edilen CPEP+ popülasyonlarının verimli indüksiyonu, beta hücrelerinde glikoz duyarlılığını elde etmek için kritiköneme sahiptir 31,32. Bu bağlamda, bu protokol sürekli olarak ortaya çıkan Aşama 7 hPSC adacıklarında in vitro olarak yüksek glikoz tehdidine yanıt olarak insülin salgılayabilen %>50 CPEP+/NKX6.1+ hücreleri üretir.
Mevcut protokol, insülin üreten hPSC adacıklarının verimli bir şekilde üretildiğini göstermiş olsa da, bu yöntemin sınırlamaları vardır. Bu pankreas progenitör kiti ile Aşama 4'ün sonunda çeşitli hPSC hatlarından, özellikle iPSC'lerden farklılaşma verimlilikleri hala değişken olabilir (veriler gösterilmemiştir). Optimizasyon duruma göre yapılmalıdır. Farklılaşmanın son üç aşaması için bu yöntem, emek yoğun ve ölçeklenebilir olmayan 96 oyuklu plakalarda statik süspansiyon kültürünün kullanımına dayanır, bu nedenle kullanımını yalnızca araştırma ile sınırlar. İnsülin salgılama kabiliyeti elde etmek cesaret verici olsa da, hPSC adacıklarının in vitro glukoz yanıtı ve insülin içeriği kadavra adacıklarından önemli ölçüde daha düşüktür. Protokol optimizasyonunun devam etmesi için gelecekteki çabalara hala ihtiyaç vardır. Bu sınırlamalara rağmen, burada sunulan protokolün, farklılaşmayı indükleyen faktörlerin ve adacık hormonu sekresyonunun düzenleyicilerinin taranması ve ayrıca adacık hücresi disfonksiyonunun modellenmesi için uygun hPSC türevi materyaller sağladığına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Timothy J. Kieffer, bu makalenin hazırlanması sırasında ViaCyte'ın bir çalışanıydı. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nin desteğini minnetle kabul ediyoruz. Jia Zhao ve Shenghui Liang, Michael Smith Sağlık Araştırmaları BC Stajyer Ödülü'nün sahipleridir. Mitchell J.S. Braam, Mitacs Hızlandırma Bursu'nun bir alıcısıdır. Diepiriye G. Iworima, Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu ve CFUW 1989 Ecole Polytechnique Hatıra Ödülü sahibidir. MCRI ve Monash Üniversitesi'nden Dr. Edouard G. Stanley'e Mel1 INS GFP/W hattını ve Alberta Diyabet Enstitüsü Adacık Çekirdeği'ni insan adacıklarını izole ettiği ve dağıttığı için içtenlikle teşekkür ederiz. Ayrıca British Columbia Üniversitesi'ndeki Yaşam Bilimleri Enstitüsü Görüntüleme ve Akış Sitometrisi tesislerinin desteğini de kabul ediyoruz. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Thyroid hormone |
| 4% PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Should be handled in fume hood |
| 96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissociation reagent for Stage 4 cells |
| Aggrewell400 plates | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µm diameter microwell plates |
| Aggrewell800 plates | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µm diameter microwell plates |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG) | R&D Systems | IC2400G | 1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R&D Systems | IC108G | 1:100 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control | R&D Systems | IC0041G | 1:500 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2,000 in flow cytometry |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells |
| Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 557714 | 1:50 in flow cytometry |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta signaling inhibitor |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Assay chamber | Cellvis | D35-10-1-N | For static GSIS and confocal imaging purposes |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | For immunostaining procedure |
| CK19 antibody | DAKO | M0888 | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Medium supplement |
| DAPI | Sigma | D9542 | For nuclear counterstaining |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix diluting solution |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21447 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 in whole mount immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+ |
| ELISA, insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | For human insulin measurement |
| Fatty acid-free BSA | Proliant | 68700 | Medium supplement |
| Fixation and Permeabilization Solution Kit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | For clump passaging hPSCs during maintenance culture |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | 1:400 in whole mount immunofluorescence |
| GLUT1 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-glutamine supplement |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | For tissue clearing and mounting |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Notch inhibitor |
| Heparin | Sigma | H3149 | Medium supplement |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP antagonist |
| MAFA antibody | Abcam | ab26405 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Matrigel, hESC-qualified | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extracellular matrix for vessel surface coating |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base medium |
| mTeSR1 Complete Kit | STEMCELL Technologies | 85850 | stem cell medium and 5x supplement included |
| N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma | A9165 | Antioxidant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium supplement |
| NEUROD1 antibody | R&D Systems | AF2746 | 1:20 in whole mount immunofluorescence |
| NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12-c | 1:50 in whole mount immunofluorescence |
| Pancreatic polypeptide antibody | R&D Systems | AF6297 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PBS | Sigma | D8662 | With Ca2+ and Mg2+ |
| PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells |
| PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in flow cytometry |
| PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells |
| PE Mouse IgG1κ Isotype Control | BD Sciences | 554680 | 1:2,000 in flow cytometry |
| PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in flow cytometry |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL tyrosine kinase inhibitor |
| Retinoid acid, all-trans | Sigma | R2625 | Light-sensitive |
| RIPA lysis buffer, 10x | Sigma | 20-188 | For hormone extraction |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH inhibitor |
| SLC18A1 antibody | Sigma | HPA063797 | 1:200 in whole mount immunofluorescence |
| Somatostatin antibody | Sigma | HPA019472 | 1:100 in whole mount immunofluorescence |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basal media and supplements included |
| Synaptophysin antibody | Novus | NB120-16659 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | For permeabilization |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin E analog |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs |
| Trypsin1/2/3 antibody | R&D Systems | AF3586 | 1:25 in whole mount immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK inhibitor |
| Zinc sulfate | Sigma | Z0251 | Medium supplement |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Petersen, M. C., Shulman, G. I.
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
- Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
- Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
- Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
- Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
- Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
- Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
- Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
- Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
- Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
