Summary
Burada, sanal gerçeklik (VR) kullanarak fare uzamsal öğrenimini araştırmak için basitleştirilmiş bir açık kaynaklı donanım ve yazılım kurulumu sunuyoruz. Bu sistem, bir mikrodenetleyici ağı ve kullanımı kolay bir Python grafik yazılım paketi çalıştıran tek kartlı bir bilgisayar kullanarak bir tekerlek üzerinde çalışan kafası kısıtlanmış bir fareye sanal bir doğrusal iz görüntüler.
Abstract
Farelerde kafa kısıtlı davranışsal deneyler, sinirbilimcilerin yüksek çözünürlüklü elektrofizyolojik ve optik görüntüleme araçlarıyla sinir devresi aktivitesini gözlemlemelerini sağlarken, davranan bir hayvana hassas duyusal uyaranlar sağlar. Son zamanlarda, sanal gerçeklik (VR) ortamlarını kullanan insan ve kemirgen çalışmaları, VR'nin, mekansal ve bağlamsal ipuçları gibi parametreler üzerinde son derece hassas kontrol nedeniyle, hipokampus ve kortekste mekansal öğrenmenin altında yatan nöral mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemli bir araç olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, kemirgen mekansal davranışları için sanal ortamlar kurmak maliyetli olabilir ve mühendislik ve bilgisayar programlamada kapsamlı bir arka plan gerektirir. Burada, araştırmacıların bir VR ortamı kullanarak kafası kısıtlanmış farelerde mekansal öğrenmeyi incelemelerini sağlayan ucuz, modüler, açık kaynaklı donanım ve yazılıma dayanan basit ama güçlü bir sistem sunuyoruz. Bu sistem, hareketi ölçmek ve davranışsal uyaranlar vermek için birleştirilmiş mikrodenetleyiciler kullanırken, kafası kısıtlanmış fareler, tek kartlı bir bilgisayarda çalışan bir grafik yazılım paketi tarafından oluşturulan sanal bir doğrusal iz ortamıyla uyum içinde bir tekerlek üzerinde çalışır. Dağıtılmış işlemeye yapılan vurgu, araştırmacıların memeli beynindeki nöral devre aktivitesi ile mekansal öğrenme arasındaki bağlantıyı belirlemek için farelerde karmaşık mekansal davranışları ortaya çıkarmak ve ölçmek için esnek, modüler sistemler tasarlamalarına olanak tanır.
Introduction
Mekansal navigasyon, hayvanların yeni yerlerin özelliklerini olası ödül alanlarını bulmak ve potansiyel tehlike alanlarından kaçınmak için kullanılan bilişsel bir haritaya kodladığı etolojik olarak önemli bir davranıştır. Hafıza ile ayrılmaz bir şekilde bağlantılı olan uzamsal navigasyonun altında yatan bilişsel süreçler, hipokampus1 ve kortekste bir nöral substratı paylaşır; burada bu alanlardaki nöral devreler gelen bilgileri bütünleştirir ve daha sonra hatırlamak için ortamların ve olayların bilişsel haritalarını oluşturur2. Hipokampus 3,4'teki yer hücrelerinin ve entorinal korteks5'teki ızgara hücrelerinin keşfi, hipokampus içindeki bilişsel haritanın nasıl oluştuğuna ışık tutarken, hipokampüsün spesifik nöral alt tiplerinin, mikrodevrelerinin ve bireysel alt bölgelerinin (dentat girus ve kornu ammonis alanları, CA3-1) nasıl etkileşime girdiği ve mekansal hafıza oluşumu ve geri çağırmasına nasıl katıldığı hakkında birçok soru devam etmektedir.
İn vivo iki foton görüntüleme, duyusal nörofizyolojide hücresel ve popülasyon dinamiklerini ortaya çıkarmada yararlı bir araç olmuştur 6,7; Bununla birlikte, baş desteği için tipik gereklilik, memeli mekansal davranışını incelemek için bu yöntemin yararlılığını sınırlar. Sanal gerçekliğin (VR)8 ortaya çıkışı, hipokampus 8,9,10 ve korteks11'de uzamsal ve bağlamsal kodlamayı incelemek için kafası kısıtlanmış fareler bir top veya koşu bandı üzerinde koşarken, sürükleyici ve gerçekçi görsel uzamsal ortamlar sunarak bu eksikliği gidermiştir. Ayrıca, VR ortamlarının davranan farelerle kullanılması, sinirbilim araştırmacılarının, VR ortamının12 unsurlarını (örneğin, görsel akış, bağlamsal modülasyon) Morris su labirenti, Barnes labirenti veya delik tahtası görevleri gibi gerçek dünyadaki mekansal öğrenme deneylerinde mümkün olmayan şekillerde hassas bir şekilde kontrol ederek mekansal davranışın bileşenlerini incelemelerine izin vermiştir.
Görsel VR ortamları tipik olarak, hareketli bir 3B ortamı gerçek zamanlı olarak bir ekranda modellemek için gereken binlerce çokgeni hızlı bir şekilde hesaplama yükünü üstlenen bir bilgisayarın grafik işlem biriminde (GPU) işlenir. Büyük işleme gereksinimleri genellikle, hareket hayvanın altındaki bir koşu bandından, tekerlekten veya köpük topundan kaydedildiğinden, görsel ortamı bir monitöre, birden fazla ekrana13 veya projektör 14'e işleyen bir GPU'ya sahip ayrı bir bilgisayarın kullanılmasını gerektirir. VR ortamını kontrol etmek, işlemek ve yansıtmak için ortaya çıkan aparat, bu nedenle, nispeten pahalı, hantal ve hantaldır. Ayrıca, literatürdeki bu tür birçok ortam, hem pahalı hem de yalnızca özel bir PC'de çalıştırılabilen özel mülk yazılımlar kullanılarak uygulanmıştır.
Bu nedenlerden dolayı, Raspberry Pi tek kartlı bir bilgisayar kullanarak kafası kısıtlanmış farelerde mekansal öğrenme davranışlarını incelemek için açık kaynaklı bir VR sistemi tasarladık. Bu Linux bilgisayar hem küçük hem de ucuzdur, ancak VR ortamlarının çeşitli bireysel kurulumlarda ekran veya davranışsal aparatlarla entegrasyonuna izin veren 3D oluşturma için bir GPU çipi içerir. Ayrıca, Python ile yazılmış "HallPassVR" adlı bir grafik yazılım paketi geliştirdik, bu da grafik kullanıcı arayüzü (GUI) kullanılarak seçilen özel görsel özellikleri yeniden birleştirerek basit bir görsel uzamsal ortam, sanal bir doğrusal parça veya koridor oluşturmak için tek kartlı bilgisayarı kullanıyor. Bu, pekiştirmeli öğrenmeyi kolaylaştırmak için diğer duyusal uyaran modalitelerinin veya ödüllerin sunulması gibi hareketleri ölçmek ve davranışı koordine etmek için mikrodenetleyici alt sistemleriyle (örneğin, ESP32 veya Arduino) birleştirilir. Bu sistem, mekansal öğrenme davranışının altında yatan nöral devreleri incelemek için iki fotonlu görüntüleme (veya kafa fiksasyonu gerektiren diğer teknikler) sırasında kafa kısıtlı farelere görsel uzamsal VR ortamları sunmak için ucuz, esnek ve kullanımı kolay bir alternatif yöntem sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokoldeki tüm prosedürler New York Eyalet Psikiyatri Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
NOT: Tek kartlı bir bilgisayar, kafası kısıtlanmış bir farenin tekerlek üzerinde çalışmasıyla koordine edilmiş bir VR görsel ortamını görüntülemek için kullanılır. Hareket bilgileri, tekerlek aksına bağlı döner bir kodlayıcıyı okuyan bir ESP32 mikrodenetleyicisinden seri giriş olarak alınır. VR ortamı, Raspberry Pi için pi3d Python 3D paketini kullanan Raspberry Pi GPU'daki OpenGL donanım hızlandırma kullanılarak oluşturulur. İşlenen ortam daha sonra bir projektör aracılığıyla, kafası kısıtlanmış farenin görme alanı15,16 üzerinde ortalanmış kompakt bir sarma parabolik ekrana çıkarılırken, davranış (örneğin, uzamsal ödüllere yanıt olarak yalama) ikinci bir davranış ESP32 mikrodenetleyicisi ile ölçülür. Grafik yazılım paketi, bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) ile sanal bir koridor veya koridor boyunca tekrarlanan görsel uyaran kalıplarından oluşan sanal doğrusal iz ortamlarının oluşturulmasını sağlar. Bu tasarım kolayca parametrelendirilir, böylece beynin mekansal öğrenme sırasında yerleri ve görsel ipuçlarını nasıl kodladığını anlamayı amaçlayan karmaşık deneylerin oluşturulmasına izin verir (bkz. bölüm 4). Bu sistem için gerekli özel donanım bileşenlerine yönelik tasarımlar (yani, koşu tekerleği, projeksiyon ekranı ve baş bağlama aparatı) genel bir GitHub deposunda (https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR) biriktirilir. Site, sistemin gelecekteki geliştirmeleriyle güncelleneceğinden, bu deponun belgelerini bu protokolle birlikte okumanız önerilir.
1. Donanım kurulumu: Koşu tekerleğinin, projeksiyon ekranının ve kafa sabitleme aparatının yapımı
NOT: Bu kurulumlar için özel bileşenler, kullanıcının 3D baskı ve lazer kesim ekipmanlarına erişimi varsa kolayca üretilebilir veya profesyonel üretim veya 3D prototipleme hizmetlerine (örneğin, eMachinehop) dış kaynak sağlanabilir. Tüm tasarım dosyaları . STL 3D dosyaları veya . DXF AutoCAD dosyaları.
- Koşu tekerleği ve davranışsal kurulum (Şekil 1)
NOT: Tekerlek, bilyalı rulmanlar aracılığıyla lazerle kesilmiş akrilik bağlantılardan asılı bir aks üzerinde ortalanmış şeffaf bir akrilik silindirden (6 çapında, 3 genişliğinde, 1/8 kalınlığında) oluşur. Tekerlek tertibatı daha sonra hafif bir alüminyum çerçeveye (t-oluklu) monte edilir ve bir optik breadboard'a güvenli bir şekilde sabitlenir (Şekil 1C-E).- Tekerleğin kenarlarını ve aks bağlantılarını 1/4 akrilik levhadan lazerle kesin ve tekerlek kenarlarını akrilik çimento ile akrilik silindire tutturun. Aks flanşını tekerlek yan parçasının ortasına vidalayın.
- Aksı tekerlek merkezi flanşına takın, bilyalı rulmanları aks bağlantılarına oturtun ve dikey alüminyum destek çubuğuna takın.
- Tekerlek aksını monte edilmiş bilyalı rulmanlara takın ve döner kodlayıcının takılması için aksın 0,5-1 inçini rulmanların üzerinde bırakın.
- Döner kodlayıcı montajını tekerleğin karşısındaki aksın ucuna takın ve döner kodlayıcıyı takın; Ardından, tekerlek aksını döner kodlayıcı miline bağlamak için mil kuplörünü kullanın.
- Yalama portunu esnek kola takın ve ardından t-yuvası somunlarıyla alüminyum tekerlek çerçevesine yapıştırın. Yalama portunu solenoid valfe ve vanayı su haznesine bağlamak için 1/16 inç boru kullanın.
NOT: Yalama portu, davranış ESP32'nin kapasitif dokunma algılama pimlerine tutturmak için lehimlenmiş bir tel ile metalden yapılmış olmalıdır.
- Projeksiyon perdesi
NOT: VR ekranı, Christopher Harvey'inlaboratuvarında geliştirilen bir tasarıma dayanan küçük bir parabolik arka projeksiyon ekranıdır (tuval boyutu: 54 cm x 21,5 cm). Kullanılan LED projektörün projeksiyon açısı (keystone), daha önce kullanılan lazer projektörünkinden farklıdır; Böylece, ünite ekranın altına monte edilerek ve ayna sistemi basitleştirilerek orijinal tasarım biraz değiştirilir (Şekil 1A, B). VR ortamını kullanıcının ihtiyaçlarına göre uyarlamak için Harvey laboratuvarının belgelerini bizimkilerle birlikte okumanız şiddetle tavsiye edilir15.- Projeksiyon perdesi kenarlarını siyah mat akrilik levhalarda 1/4'ten lazerle kesin. Arka projeksiyon aynasını aynalı akrilik olarak 1/4'ten lazerle kesin.
- Projeksiyon perdesi çerçevesini alüminyum çubuklarla birleştirin ve akrilik panelleri lazerle kesin.
- Yarı saydam projeksiyon perdesi malzemesini çerçevedeki parabolik yuvaya yerleştirin. Arka projeksiyon aynasını, projeksiyon perdesi çerçevesinin arkasındaki yuvaya yerleştirin.
- Projeksiyon perdesi çerçevesinin içindeki alt montaj plakasına bir LED projektör yerleştirin. Parabolik arka projeksiyon ekranında yansıtılan görüntünün konumunu optimize etmek için projektörü montaj cıvatalarıyla hizalayın.
- Gerekirse optik sensörlerin ışığının kirlenmesini önlemek için projektör kutusu ünitesini kapatın.
- Baş dayanağı aparatı
NOT: Bu baş dayanağı aparatı tasarımı, metal bir kafa direğini sabitlemek için birbirine kenetlenen iki adet 3D baskılı manifolddan oluşur (Şekil 1E, F).- Yüksek çözünürlüklü bir SLM 3D yazıcı kullanarak, 3D kolları tutan baş direği yazdırın.
NOT: Reçine baskılı plastik, davranış deneyleri için kararlı kafa fiksasyonu sağlayabilir; Bununla birlikte, tek hücreli kayıt veya iki fotonlu görüntüleme gibi hassas uygulamalarda maksimum stabilite elde etmek için, işlenmiş metal parçaların (örneğin, eMachineShop) kullanılması önerilir. - 3D baskılı kafa direği tutucusunu, optik montaj direklerine sahip çift eksenli bir gonyometre üzerine takın, böylece hayvanın kafası hazırlığı düzleştirmek için eğilebilir.
NOT: Bu özellik, sonraki görüntüleme seanslarında aynı hücre popülasyonunun bulunması gerektiğinde uzun süreli in vivo görüntüleme deneyleri için vazgeçilmezdir. Aksi takdirde, kurulum maliyetini azaltmak için bu özellik atlanabilir. - Baş direklerini imal et.
NOT: Farklı karmaşıklığa (ve fiyata) sahip iki tür baş direği, bu talimatlarla birlikte Malzemeler Tablosunda verilen bağlantıya yatırılır.- Deneme türüne bağlı olarak, hangi baş gönderinin uygulanacağına karar verin. Kafa çubukları paslanmaz çelikten yapılmıştır ve genellikle üretim için herhangi bir yerel makine atölyesine veya çevrimiçi servise (örneğin, eMachineShop) dış kaynak olarak verilir.
- Yüksek çözünürlüklü bir SLM 3D yazıcı kullanarak, 3D kolları tutan baş direği yazdırın.
2. Elektronik donanım/yazılım kurulumu (tek kartlı bilgisayar, ESP32 mikrodenetleyicileri, Şekil 2)
- Tek kartlı bilgisayarı yapılandırın.
NOT: Malzeme Tablosunda (Raspberry Pi 4B) bulunan tek kartlı bilgisayar, VR ortamı oluşturmayı kolaylaştırmak için yerleşik bir GPU'ya ve deney kontrolü/izleme ve VR projeksiyonu için iki HDMI bağlantı noktasına sahip olduğu için bu kurulum için idealdir. Bu özelliklere sahip diğer tek kartlı bilgisayarlar potansiyel olarak değiştirilebilir, ancak aşağıdaki talimatlardan bazıları Raspberry Pi'ye özgü olabilir.- Tek kartlı bilgisayar görüntüleyici uygulamasını PC'ye indirin ve işletim sistemini (şu anda Raspberry Pi OS r.2021-05-07) microSD karta (16+ GB) yükleyin. Kartı takın ve tek kartlı bilgisayarı önyükleyin.
- Tek kartlı bilgisayarı pi3d Python 3D kütüphanesi için yapılandırın: (menü çubuğu) Raspberry Pi Yapılandırması > Tercihler.
- Devre Dışı Bırak > Ekran Karartma > Görüntüle'ye tıklayın.
- Etkinleştir > Seri Bağlantı Noktası > Arayüzler'e tıklayın.
- GPU Belleği > 256 (MB) > Performans'a tıklayın.
- Pi3d için Python görüntü kitaplığı paketini yükseltin: (terminal)> sudo pip3 install pillow --upgrade.
- Tek kartlı bilgisayar için pi3d Python 3D paketini yükleyin: (terminal)> sudo pip3 install pi3d.
- Projektör için HDMI çıkış seviyesini artırın: (terminal)> sudo nano /boot/config.txt, uncomment config_hdmi_boost=4, kaydedin ve yeniden başlatın.
- Entegre geliştirme ortamını (IDE) arduino.cc/en/software'den (örneğin, arduino-1.8.19-linuxarm.tar.gz) indirin ve yükleyin, bu da kodu döner kodlayıcıya ve davranış ESP32 mikrodenetleyicilerine yüklemek için gereklidir.
- IDE'ye ESP32 mikrodenetleyici desteğini yükleyin:
- Dosya > Tercihleri'ne tıklayın > Ek Pano Yöneticisi URL'leri = https://raw.githubusercontent.com/espressif/arduino-esp32/gh-pages/package_esp32_index.json
- ESP32 (Espressif tarafından) > Araçlar > Panolar > Panolar Yöneticisi'ne tıklayın. v.2.0.0'ı yükleyin (yükleme şu anda v2.0.4'te başarısız oluyor).
- VR sırasında fare davranışının kaydedilmesi ve çevrimiçi olarak çizilmesi için gerekli olan İşleme IDE'sini https://github.com/processing/processing4/releases'den (örneğin, processing-4.0.1-linux-arm32.tgz) indirin ve yükleyin.
NOT: Arduino ve İşleme ortamları, istenirse VR tek kartlı bilgisayardan ayrı bir PC'de çalıştırılabilir.
- Döner kodlayıcı ESP32 bağlantılarını kurun.
NOT: Tekerlek aksına bağlı döner kodlayıcı, bir ESP32 mikrodenetleyicisi ile sayılan fare hareketi ile tekerlek dönüşünü ölçer. Konum değişiklikleri daha sonra grafik yazılım paketini kullanarak sanal ortamdaki hareketi kontrol etmek için tek kartlı bilgisayar GPIO seri portuna ve ödül bölgelerini kontrol etmek için ESP32 davranışına gönderilir (Şekil 2).- Döner kodlayıcı bileşeni ile döner ESP32 arasındaki kabloları bağlayın. Döner kodlayıcılar genellikle dört telden oluşur: +, GND, A ve B (dörtlü kodlayıcılar için iki dijital hat). Bunları jumper kabloları aracılığıyla ESP32 3.3 V, GND, 25, 26'ya bağlayın (ekli kod durumunda).
- Seri RX/TX kablolarını döner ESP32 ile davranış ESP32 arasına bağlayın. Döner ESP32 Serial0 RX/TX (alma/iletme) ile ESP32 davranışının Serial2 bağlantı noktası arasında basit bir iki telli bağlantı kurun (TX/RX, pin 17, 16; OMwSmall PCB'nin sağındaki Serial2 bağlantı noktasına bakın). Bu, hareket bilgilerini döner kodlayıcıdan ödül bölgeleri gibi uzamsal bölgeler için davranış kurulumuna taşıyacaktır.
- Seri RX/TX kablolarını döner ESP32 ile tek kartlı bilgisayar GPIO (veya doğrudan USB bağlantısı) arasına bağlayın. Tek kartlı bilgisayar GPIO pimleri 14, 15 (RX/TX) ile döner ESP32 Serial2 (TX/RX, pimler 17, 16) arasında iki telli bir bağlantı kurun. Bu, hareket bilgilerini döner kodlayıcıdan tek kartlı bilgisayarda çalışan grafik yazılım paketine taşıyacaktır.
NOT: Bu adım yalnızca döner ESP32 bir USB üzerinden bağlanmamışsa (yani, "/dev/ttyS0" konumunda bir GPIO seri bağlantısıdır) gereklidir, ancak HallPassVR_wired.py kodu aksi takdirde "/dev/ttyUSB0" kullanacak şekilde değiştirilmelidir. Bu kablolu bağlantı, gelecekteki sürümlerde kablosuz Bluetooth bağlantısıyla değiştirilecektir. - İlk döner kodlayıcı kodunu yüklemek için döner ESP32 USB'yi tek kartlı bilgisayar USB'sine (veya IDE'yi çalıştıran başka bir bilgisayara) takın.
- Davranışsal donanımla ESP32 bağlantılarının davranışını ayarlayın (OpenMaze PCB aracılığıyla ).
NOT: ESP32 mikrodenetleyici davranışı, tasarımları OpenMaze web sitesinde (www.openmaze.org) bulunan ESP32, "OMwSmall" için genel bir PCB "koparma tahtası" aracılığıyla bağlanan VR olmayan tüm hayvan etkileşimlerini (VR olmayan uyaranlar ve ödüller sunmak, fare yalamalarını tespit etmek) kontrol edecektir. PCB, sıvı ödülleri vermek için kullanılan solenoid valfler gibi elektromekanik bileşenleri sürmek için gerekli elektronik bileşenleri içerir.- 12 V sıvı solenoid valfi OMwSmall PCB'nin en solundaki ULN2803 IC çıkışına bağlayın (örnek kurulum ve kodda pim 12). Bu IC, ESP32 mikrodenetleyicisinin davranışı üzerindeki bir GPIO çıkışı tarafından kontrol edilen ödül solenoid valfine 12 V güç açar.
- Yalama bağlantı noktasını ESP32 dokunmatik girişine bağlayın (örneğin, örnek kodda T0, GPIO4). ESP32, ESP32 kodunun VR davranışı sırasında farenin bağlı metal yalama portunu yalamasını algılamak için kullandığı belirli pimlerde yerleşik kapasitif dokunma algılamasına sahiptir.
- Seri RX/TX kablolarını davranış ESP32 Serial2 (pimler 16, 17) ile döner kodlayıcı ESP32 Serial0 arasına bağlayın (bkz. adım 2.2.2).
- Farklı deneysel paradigmalar (örneğin, ödül bölgelerinin sayısı/konumu) için ESP32 davranışına yeni programlar yüklemek ve birlikte verilen İşleme çizimini kullanarak davranış verilerini yakalamak için USB'yi tek kartlı bilgisayarın USB bağlantı noktasına (veya başka bir bilgisayara) takın.
- Ödül solenoid valfinin gücünü sağlamak için 12 V DC duvar adaptörünü ESP32 OMwSmall PCB davranışındaki 2,1 mm silindirik jak konektörüne takın.
- Tek kartlı bilgisayarın HDMI #2 çıkışını projektörün HDMI bağlantı noktasına takın; bu, tek kartlı bilgisayar GPU'su tarafından oluşturulan VR ortamını projeksiyon ekranına taşıyacaktır.
- (isteğe bağlı) Senkronizasyon kablosunu (pin 26) bir nöral görüntüleme veya elektrofizyolojik kayıt kurulumuna bağlayın. Sistemleri milisaniyeye yakın hassasiyetle hizalamak için her 5 saniyede bir 3,3 V transistör-transistör-mantık (TTL) sinyali gönderilecektir.
- Yazılımı ayarlayın: IDE'yi kullanarak ürün yazılımını/yazılımı ESP32 (Şekil 2B) döner kodlayıcıya ve davranış ESP32'ye (Şekil 2E) yükleyin ve VR Python yazılımını tek kartlı bilgisayara indirin. Bkz. https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software.
- Döner kodlayıcı ESP32'yi önce tek kartlı bilgisayarın USB bağlantı noktasına takın - bu, işletim sistemi tarafından otomatik olarak "/dev/ttyUSB0 " olarak adlandırılacaktır.
- Döner kodlayıcı kodunu yükleyin: IDE'de RotaryEncoder_Esp32_VR.ino dosyasını açın ve ardından ESP32 Geliştirme Modülü > Araçlar > Anakartlar altında ESP32'yi seçin. Araçlar > Bağlantı Noktası > /dev/ttyUSB0'a tıklayarak ESP32 bağlantı noktasını seçin ve ardından Karşıya Yükle'ye tıklayın.
- ESP32 davranışını tek kartlı bilgisayarın USB bağlantı noktasına takın - bu, işletim sistemi tarafından "/dev/ttyUSB1" olarak adlandırılacaktır.
- Davranış sırası kodunu ESP32 davranışına yükleyin (IDE, ESP32 Geliştirme Modülü zaten seçili), ardından Araçlar > Bağlantı Noktası > /dev/ttyUSB1'e tıklayın ve Yükle: wheel_VR_behavior.ino'ya tıklayın.
- IDE'deki (Araçlar > Bağlantı Noktası > /dev/ttyUSB0 veya /dev/ttyUSB1) içindeki her ESP32 için seri bağlantı noktasını seçip döner karttan ( USB0) veya davranış kartından (USB1) seri çıkışı gözlemlemek için Araçlar > Seri Monitör'e (baud hızı: 115.200) tıklayarak seri bağlantıları test edin. USB0 üzerinde döner ESP32'den ham hareket çıkışını veya USB1'de ESP32 davranışından biçimlendirilmiş hareket çıkışını görmek için tekerleği döndürün.
- Grafik yazılım paketi Python kodunu https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR/tree/master/software/HallPassVR'den indirin (/home/pi/Documents adresine). Bu klasör, pi3d Python3 paketi daha önce doğru şekilde yüklenmişse grafik yazılım paketini çalıştırmak için gerekli tüm dosyaları içerir (adım 2.1).
3. Grafik yazılım paketinin çalıştırılması ve test edilmesi
NOT: Bir VR doğrusal parça ortamı başlatmak, VR yazılımı ve davranış ESP32 kodundaki mesafeleri kalibre etmek ve birlikte verilen İşleme dili çizimi ile farenin çalışma ve yalama davranışının edinilmesini ve çevrimiçi çizimini test etmek için grafik yazılım paketi GUI'yi çalıştırın.
- Tek kartlı bilgisayarda terminal penceresini açın ve HallPassVR klasörüne gidin (terminal:> cd /home/pi/Documents/HallPassVR/HallPassVR_Wired)
- VR GUI: (terminal)> python3 HallPassVR_GUI.py çalıştırın (GUI penceresi açılacaktır, Şekil 3A).
- Grafik yazılım GUI
- Parça boyunca üç desenin her biri için liste kutusundan dört öğe (resim) seçip ekleyin (veya aşağıda önceden depolanmış deseni seçin ve ardından Yükle'ye tıklayın) ve ardından Oluştur'a tıklayın.
NOT: Yeni görüntü dosyaları (.jpeg), GUI çalıştırılmadan önce HallPassVR/HallPassVR_wired/images/ELEMENTS klasörüne yerleştirilebilir. - Açılır menülerden zemin ve tavan görüntülerini seçin ve bu örnek kod için parçanın uzunluğunu 2 m olarak ayarlayın (davranış ESP32 kodunda ve İşleme kodunda milimetre [mm] cinsinden trackLength'e eşit olmalıdır).
- İsterseniz bu kalıbı adlandırın (HallPassVR_wired/images/PATH_HIST dizininde saklanacaktır).
- Başlat düğmesine tıklayın (başka bir yere tıklamadan önce VR penceresinin başlamasını bekleyin). VR ortamı Ekran #2'de görünecektir (projeksiyon ekranı, Şekil 3B, C).
- Parça boyunca üç desenin her biri için liste kutusundan dört öğe (resim) seçip ekleyin (veya aşağıda önceden depolanmış deseni seçin ve ardından Yükle'ye tıklayın) ve ardından Oluştur'a tıklayın.
- Davranışsal verileri/hareketi elde etmek ve çizmek için İşleme çizimini çalıştırın.
- İşleme IDE'sinde VRwheel_RecGraphSerialTxt.pde dosyasını açın.
- Hayvanı değiştirin = "yourMouseNumber"; değişkenini ayarlayın ve sessionMinutes'i davranışsal oturumun dakika cinsinden uzunluğuna eşit olarak ayarlayın.
- İşleme IDE'sindeki Çalıştır düğmesine tıklayın.
- Tekerlek dönerken sanal doğrusal pistteki geçerli fare konumunu, ödül bölgeleri ve her 30 saniyede bir güncellenen yalamaların, turların ve ödüllerin çalışan histogramlarıyla birlikte göstermesi gereken İşleme grafiği penceresini kontrol edin (Şekil 3D). Test için çalışan farenin benzetimini yapmak için koşu tekerleğini elle ilerletin veya ilk kurulum için bir test faresi kullanın.
- Grafik penceresine tıklayın ve davranışsal verileri almayı durdurmak için klavyedeki q tuşuna basın. Davranışsal olayların ve zamanların bir metin dosyası (
sessionMinutes geçtiğinde veya kullanıcı çıkmak için q tuşuna bastığında kaydedilir.
NOT: Çıktı .txt dosyalarının küçük boyutu nedeniyle, tek kartlı bilgisayarın SD kartında en az birkaç bin davranış kaydının saklanabileceği tahmin edilmektedir. Veri dosyaları daha sonra analiz edilmek üzere bir başparmak sürücüsüne kaydedilebilir veya yerel bir ağa bağlıysa, veriler uzaktan yönetilebilir.
- VR parça uzunluğu ile davranış izi uzunluğunu kalibre edin.
- VR koridorunu ve fare konumunu gözlemlerken tekerleği elle ilerletin (İşleme grafiğinde). VR koridoru, fare davranış grafiğinin sonuna ulaşmadan önce/sonra sona ererse, parça iki sistemde aynı anda sıfırlanana kadar VR parça uzunluğunu kademeli olarak (santimetre [cm] cinsinden HallPassVR_wired.py, corridor_length_default) artırın/azaltın.
NOT: Kod şu anda 256 konumlu bir dörtlü döner kodlayıcı kullanılarak 6 inç çapında bir koşu tekerleği için kalibre edilmiştir, bu nedenle kullanıcının diğer yapılandırmaları hesaba katmak için VR (HallPassVR_wired.py, corridor_length_default, santimetre [cm] cinsinden) ve davranış kodunu (wheel_VR_behavior.ino, trackLength, milimetre [mm] cinsinden) değiştirmesi gerekebilir. Bununla birlikte, davranışsal konum, sistemler arasındaki yazışmaları sürdürmek için her VR turunda sıfırlanır.
- VR koridorunu ve fare konumunu gözlemlerken tekerleği elle ilerletin (İşleme grafiğinde). VR koridoru, fare davranış grafiğinin sonuna ulaşmadan önce/sonra sona ererse, parça iki sistemde aynı anda sıfırlanana kadar VR parça uzunluğunu kademeli olarak (santimetre [cm] cinsinden HallPassVR_wired.py, corridor_length_default) artırın/azaltın.
4. Fare eğitimi ve mekansal öğrenme davranışı
NOT: Fareler baş sabitleme için implante edilir, baş dayanağına alıştırılır ve daha sonra direksiyonda koşmak ve kademeli olarak sıvı ödülleri için tutarlı bir şekilde yalamak üzere eğitilir ("rastgele yiyecek arama"). Tutarlı koşu ve yalama elde eden fareler daha sonra sanal doğrusal pistte görsel bir ipucunun ardından tek bir ödül bölgesinin sunulduğu VR ortamını kullanarak mekansal bir gizli ödül görevi üzerinde eğitilir. Uzamsal öğrenme daha sonra ödül bölgesinden hemen önceki pozisyonlar için artan yalama seçiciliği olarak ölçülür.
- Baş implantasyon sonrası cerrahi: Bu prosedür bu derginin başka bir yerinde ve diğerlerinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır, bu nedenle özel talimatlar için bu literatüre bakın 7,17,18,19,20,21.
- Su tarifesi
- İlk kullanımdan 24 saat önce su kısıtlaması yapın (aşağıya bakın) ve her alışkanlık veya baş kısıtlama davranışı seansından sonra ad libitum su tüketimine izin verin. Alışkanlık sırasında üç gün boyunca su mevcudiyeti süresini kademeli olarak yaklaşık 5 dakikaya düşürün ve bireysel farelerin miktarını, vücut ağırlıkları kısıtlama öncesi ağırlıklarının% 80'inin altına düşmeyecek şekilde ayarlayın. Her hayvanın ağırlığını günlük olarak izleyin ve ayrıca dehidrasyon belirtileri için her farenin durumunu gözlemleyin22. Kısıtlama öncesi vücut ağırlığının% 80'ini koruyamayan veya susuz görünen fareler çalışmadan çıkarılmalı ve serbest su mevcudiyeti verilmelidir.
NOT: Su kısıtlaması, fareleri sıvı ödüller kullanarak direksiyon üzerinde koşmaya motive etmek ve mekansal yalamayı pist boyunca öğrenilen yerlerin bir göstergesi olarak kullanmak için gereklidir. Kurumsal kılavuzlar, bu prosedür için özel talimatlar konusunda farklılık gösterebilir, bu nedenle kullanıcı, su kısıtlaması sırasında hayvan sağlığını ve refahını sağlamak için bireysel kurumsal hayvan bakım komitelerine danışmalıdır.
- İlk kullanımdan 24 saat önce su kısıtlaması yapın (aşağıya bakın) ve her alışkanlık veya baş kısıtlama davranışı seansından sonra ad libitum su tüketimine izin verin. Alışkanlık sırasında üç gün boyunca su mevcudiyeti süresini kademeli olarak yaklaşık 5 dakikaya düşürün ve bireysel farelerin miktarını, vücut ağırlıkları kısıtlama öncesi ağırlıklarının% 80'inin altına düşmeyecek şekilde ayarlayın. Her hayvanın ağırlığını günlük olarak izleyin ve ayrıca dehidrasyon belirtileri için her farenin durumunu gözlemleyin22. Kısıtlama öncesi vücut ağırlığının% 80'ini koruyamayan veya susuz görünen fareler çalışmadan çıkarılmalı ve serbest su mevcudiyeti verilmelidir.
- Kullanım: İmplante edilen fareleri insan temasına alıştırmak için günlük olarak tutun, ardından sınırlı ad libitum suyu takviye olarak uygulanabilir (1-5 dakika / gün, 2 gün ila 1 hafta).
- Baş dayanağına alışkanlık
- Fareleri, baş sabitleme stresini azaltmak için ara sıra su damlalarıyla ödüllendirirken, baş bağlama aparatına yerleştirerek artan süreler boyunca baş desteğine alıştırın.
- 5 dakikalık kafa fiksasyonu ile başlayın ve fareler 30 dakikaya kadar fiksasyonu tolere edene kadar süreyi günde 5 dakikalık artışlarla artırın. Fareleri, mücadele ediyor veya çok az hareket ediyor gibi görünüyorlarsa, sabitleme aparatından çıkarın. Bununla birlikte, fareler genellikle birkaç seans içinde kendiliğinden direksiyon üzerinde koşmaya başlar, bu da eğitimin bir sonraki aşamasına hazır oldukları anlamına gelir.
NOT: Baş desteği altında tekrar tekrar mücadele eden veya ödüller için koşmayan ve yalayan fareler, eğitimin önceki aşamalarına gerilemeli ve bu tür üç iyileştirici döngü boyunca ilerleyemezlerse çalışmadan çıkarılmalıdır (bakınız Tablo 1).
- Koşma/yalama eğitimi (rastgele yiyecek arama)
NOT: VR ortamında mekansal öğrenme görevini gerçekleştirmek için, fareler önce direksiyonda koşmayı öğrenmeli ve ara sıra ödüller için sürekli olarak yalamalıdır. İşlevsel davranış parametrelerindeki ilerleme, davranış ESP32 mikrodenetleyicisi aracılığıyla kontrol edilir.- İşlevsel olmayan ödüllerle rastgele yiyecek arama
- Grafik yazılımı GUI programını rastgele görsel öğelerden oluşan bir yolla çalıştırın (kullanıcı seçimi, bkz. adım 3.3).
- Fareleri çalıştırmak ve yalamak üzere koşullandırmak için davranış programını birden çok işlenmeyen ödülle (kod değişkenleri: isOperant=0, numRew=4, isRandRew=1) ESP32 davranışına yükleyin. Fareler seans başına en az 20 tur koşana kadar fareleri 20-30 dakikalık oturumlarda çalıştırın ve rastgele yerlerde (bir ila dört seans) sunulan ödüller için yalayın.
- Alternatif turlarda operant ödüllerle rastgele yiyecek arama
- Davranış programını altOpt=1 (alternatif operant/non-operant turları) ile yükleyin ve fareleri hem operant olmayan hem de operant ödül bölgeleri (bir ila dört oturum) için yalayana kadar eğitin.
- Tamamen işlevsel rastgele yiyecek arama
- Davranış programını dört işlenmiş rastgele ödül bölgesi (davranış ESP32 kod değişkenleri: isOperant=1, numRew=4, isRandRew=1) ile karşıya yükleyin. Bu eğitim adımının sonunda, fareler tutarlı bir şekilde çalışmalı ve tüm pist uzunluğu boyunca test yalamaları gerçekleştirmelidir (bir ila dört seans; Şekil 4A).
- İşlevsel olmayan ödüllerle rastgele yiyecek arama
- Uzamsal öğrenme
NOT: Pist boyunca karanlık panellere sahip 2 m uzunluğunda bir koridor ve ortada görsel bir ipucu olarak tek bir yüksek kontrastlı görsel uyaran paneli (0,9-1,1 m konum) seçerek, tek bir görsel ipucundan biraz uzakta tek bir gizli ödül bölgesi ile uzamsal bir öğrenme deneyi gerçekleştirin,uzamsal koku alma ipuçlarıyla yapılan son deneylere benzer 20 . Farelerin, sanal doğrusal iz ortamındaki görsel ipucundan uzakta bulunan bir ödül bölgesinde (1,5-1,8 m konumda) yalamaları gerekir.- Grafik yazılım programını, ortasında tek bir görsel ipucu bulunan karanlık bir koridorun yolu ile çalıştırın (örneğin, satranç tahtası, bkz. adım 3.3, Şekil 3A).
- Tek bir gizli ödül bölgesi olan davranış programını ESP32 davranışına yükleyin (davranış ESP32 kod değişkenleri: isOperant=1, isRandRew=0, numRew=1, rewPosArr[]= {1500}).
- Fareyi yavaşça kafa sabitleme aparatına yerleştirin, yalama ağzını farenin ağzının hemen önündeki bir konuma ayarlayın ve fare tekerleğini projeksiyon perdesi bölgesinin ortasına yerleştirin. Son ayarlamalardan sonra farenin başının ekrandan ~ 12-15 cm uzakta olduğundan emin olun.
- İşleme çiziminde hayvanın adını ayarlayın ve ardından davranışsal verileri almaya ve çizmeye başlamak için İşleme IDE'sinde çalıştır'a basın (bkz. adım 3.4).
- Tek bir gizli ödül bölgesi ve tek bir görsel ipucu VR koridoru ile fareyi 30 dakikalık oturumlar boyunca çalıştırın.
- Çevrimdışı: .txt veri dosyasını Çizim İşleme klasöründen indirin ve uzamsal yalama davranışını analiz edin (örneğin, Matlab'da procVRbehav.m ve vrLickByLap.m dosyalarıyla birlikte).
NOT: Fareler başlangıçta tüm sanal pist üzerinde test yalamaları ("rastgele yiyecek arama") gerçekleştirmeli ve daha sonra VR görsel ipucunu takiben yalnızca ödül yerinin yakınında seçici olarak yalamaya başlamalıdır (Şekil 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu açık kaynaklı sanal gerçeklik davranış kurulumu, yalama davranışını, kafası kısıtlanmış fareler sanal bir doğrusal iz ortamında gezinirken mekansal öğrenmenin bir okuması olarak ölçmemize izin verdi. 4 aylıkken her iki cinsiyetten yedi C57BL / 6 fare, sınırlı bir su programına yerleştirildi ve ilk önce VR olmadan rastgele mekansal ödüller ("rastgele yiyecek arama") için direksiyonda koşarken düşük seviyelerde sürekli yalamak üzere eğitildi. Performansları başlangıçta 2 m rastgele koridor desenine sahip VR projeksiyon ekranı kurulumuna taşındığında etkilenmiş olsa da, birkaç VR oturumunda önceki seviyelere geri döndü (Şekil 4A). VR ile rastgele yiyecek arama stratejisini geliştiren farelerin (yedi fareden altısı,% 86; bir fare tutarlı bir şekilde çalışamadı ve dışlandı) daha sonra su ödülleri ("gizli ödül görevi") almak için başka türlü özelliksiz 2 m'lik bir sanal pistin ortasındaki tek bir görsel konum ipucunu takiben 0,5 m'de işaretsiz bir operant ödül bölgesinde yalamaları gerekiyordu ("gizli ödül görevi"). Bu sistemle mevcut pilot verilere göre, yedi fareden dördü (% 57), VR olmayan bir koşu bandı ile önceki sonuçlarımıza benzeyen (Tablo 1, Şekil 4B, C) artan seçicilikle ödül bölgesinin yakınında yalayarak gösterildiği gibi, iki ila dört seansta tek bir görsel ipucu ile gizli ödül görevini öğrenebildi17 . Bu gerçek, mekansal öğrenme çalışmasında önemlidir, çünkü kapsamlı bir eğitim olmadan öğrenmenin kritik dönemlerinde sinirsel aktivitenin izlenmesine ve / veya manipüle edilmesine izin verir. Ayrıca, fareler hem oturum içi hem de seanslar arası önemli öğrenme sergilediler (Şekil 4C), mekansal öğrenmeye eşlik eden hem kısa vadeli hem de uzun vadeli sinir devresi adaptasyonlarını gözlemleme fırsatı sağladılar. Eşdeğer bir VR olmayan görevin öğrenme oranını test etmedik, ancak Morris su labirenti gibi birçok klasik gerçek dünya hipokampusuna bağımlı mekansal görev, daha kapsamlı bir eğitim gerektirir ve önemli ölçüde daha az davranışsal deneme sunar ve bu nedenle, sinirsel aktivite değişiklikleriyle birlikte öğrenme davranışının izlenmesi için daha az uygundur.
Bu pilot gruptaki farelerin çoğunluğu (% 57) gizli ödül görevini az sayıda oturumda öğrenebilse de, ek fareler daha uzun zaman dilimlerinde uzamsal öğrenme sergileyebilir ve bireyselleştirilmiş eğitim farelerin bu oranını artırmalıdır. Gerçekten de, öğrenme oranlarındaki farklılıklar, hipokampus gibi beyin bölgelerindeki sinirsel aktivite ile davranışsal öğrenme arasındaki spesifik ilişkileri ayrıştırmak için yararlı olabilir. Bununla birlikte, farelerin küçük bir yüzdesinin tekerleğin üzerinde koşmayı veya çalışmayan veya operant ödüller (yedi fareden biri,% 14) için yalamayı öğrenmediğini ve bu nedenle sonraki deneyler için kullanılamadığını gözlemledik. Ek kullanım ve alışkanlık ve arzu edilen gıda muamelelerini kullanmak gibi daha fazla takviye yoluyla hayvanın genel stres durumunda bir azalma, bu hayvanların tekerlek üzerinde baş kısıtlama davranışı sırasında aktif koşma ve yalama benimsemelerine yardımcı olmak için yararlı olabilir.
Bir deneyci, sanal pistteki aralıklı turlarda işaret ve ödül bölgelerinin varlığını ve konumunu manipüle ederek, örneğin farelerin bir ortamdaki konumlarını belirlemek için yerel veya uzak ipuçlarına veya kendi kendine hareket bilgilerine nasıl güvendiklerini belirlemek için VR'deki belirli bilgi kanallarına mekansal olarak seçici yalamanın bağımlılığını daha da ayırt edebilir. Gizli ödül yerini öğrenen farelerin yalama seçiciliği, bu mekansal ipucunu aktif olarak bir dönüm noktası olarak kullanıyorlarsa, bu mekansal ipucunu bir dönüm noktası olarak aktif olarak kullanıyorlarsa, iz boyunca görsel ipucunun kaymasından veya ihmal edilmesinden etkilenmelidir. Bununla birlikte, burada sunduğumuz basit örnekle bile, fareler tarafından elde edilen son derece seçici yalama (Şekil 4C, sağda), VR görsel ortamını, nerede oldukları ve dolayısıyla ne zaman yalayacakları konusundaki kararlarını bildirmek için kodladıklarını gösterir, çünkü ödül bölgesi yalnızca VR ortamındaki görsel ipuçlarıyla ilgili olarak belirgindir. Bu VR sistemi ayrıca, farklı duyusal ipuçlarının karmaşık kombinasyonları için sinirsel aktivite ve davranışın seçiciliğini test etmek için kullanılabilecek koku alma, dokunsal ve işitsel ipuçları gibi görsel VR ortamına ek olarak diğer mekansal ve bağlamsal ipuçlarının modalitelerinin sunulmasına da izin verir. Ek olarak, görev performansının hipokampal aktiviteye bağımlılığını test etmemiş olsak da, benzer bir görev kullanan ancak dokunsal ipuçları içeren yeni bir çalışma, bu çalışmada gerçekleştirilen VR gizli ödül görevi için doğrulanması gereken hipokampal inaktivasyon23 ile mekansal öğrenmenin bir bozulmasını göstermiştir.
Şekil 1: Kafa kısıtlamalı VR donanım kurulumu: Projeksiyon perdesi, koşu tekerleği ve kafa sabitleme aparatı. (A) Koşu tekerleğinin ve projeksiyon ekranının 3D tasarım şeması. (B) Tamamlanan VR davranış kurulumu. VR ortamı (1) tek kartlı bir bilgisayarda işlenir ve parabolik (2) arka projeksiyon ekranına yansıtılır (Chris Harvey'in laboratuvarının tasarımı15,16'ya dayanarak). (3) Tekerlek tertibatı. (4) Baş direk tutucu. (5) Ödül teslimi için su deposu. (C) Projeksiyon ekranının üstten görünümü ve davranış kurulumu. (1) LED projektör. (2) VR koridorunu kavisli ekrana arkaya yansıtmak için ayna. (3) Koşu tekerleği. (D) Tekerlek tertibatının arkadan görünümü. Tekerlek dönüşleri (1) döner kodlayıcı tarafından çevrilir ve (2) ESP32 mikrodenetleyicisi aracılığıyla tek kartlı bilgisayara iletilir. (3) Optik görüntüleme için kafa pozisyonuna ince ayar yapmak için çift eksenli bir gonyometre kullanılır. (E) (1) kafa sabitleme aparatını ve (2) (3) çalışan tekerlek yüzeyi üzerindeki yalama bağlantı noktası yerleşimini gösteren, fare yerleştirme düzeyinde kurulum. (F) Ödül ağzının farenin ağzına yakın bir yere hassas bir şekilde yerleştirilmesi için (2) esnek kola bağlı (1) yalama bağlantı noktasının fotoğrafı. Ödüller, ESP32 davranışı tarafından kontrol edilen (3) bir solenoid valf aracılığıyla verilir (OpenMaze OMwSmall PCB aracılığıyla). Ayrıca (4) tekerlek aksına bağlı döner kodlayıcı ve (5) kafa açısı ayarı için gonyometre de görülebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: VR elektronik kurulum şeması. Bu şematik, fareler için açık kaynaklı sanal gerçeklik sistemindeki elektronik bileşenler arasındaki en alakalı bağlantıları göstermektedir. (A) Fareler, akrilik bir koşu tekerleğinin üzerindeki özel bir 3D baskılı kafa sabitleme aparatı üzerinde kafa tutucudur. (B) Fare çalışırken tekerlek aksının dönüşü, bir mikrodenetleyiciye bağlı yüksek çözünürlüklü bir döner kodlayıcı (Döner kod çözücü ESP32) tarafından algılanır. (C) Hareket bilgileri, farenin hareketine bağlı olarak VR sanal doğrusal iz ortamındaki konumu güncelleyen HallPassVR GUI yazılımını ve 3D ortamını çalıştıran tek kartlı bir bilgisayara seri bağlantı yoluyla iletilir. (D) İşlenen VR ortamı, tek kartlı bilgisayarın HDMI #2 video çıkışı (VR video, HDMI) aracılığıyla projektöre/ekrana gönderilir. (E) Döner kodlayıcı ESP32'den gelen hareket bilgileri, VR ortamıyla uyum içinde mekansal, VR olmayan davranışsal olayları (ödül bölgeleri veya uzamsal koku alma, dokunsal veya işitsel uyaranlar gibi) kontrol etmek için farenin konumunu kullanan ve kapasitif dokunma algılama yoluyla farenin ödül musluğunu yalamasını ölçen başka bir mikrodenetleyiciye (OpenMaze OMwSmall PCB ile Behavior ESP32) de gönderilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Grafik yazılım GUI'si ve davranışı. (A) HallPassVR GUI: Her bir yoldaki parça uzunluğuna eşit üç desen için parça uzunluğunun üçte birini kapsayan (veya önceden kaydedilmiş kombinasyon deseni yüklenen) her uzamsal desenin üzerine döşemek üzere dört görüntü seçilir. Tavan ve zemin görüntüleri seçilir ve ardından tek kartlı bilgisayarın HDMI çıkışında (projeksiyon ekranı) VR ortamını başlatmak için Başlat'a basılır. (B) A'da gösterilen GUI parametreleriyle oluşturulan ve mekansal öğrenmeyi test etmek için gizli bir ödül deneyi için kullanılan örnek sanal koridor. (C) B'de gösterilen sanal ortamda direksiyon üzerinde koşan başı kısıtlanmış bir farenin fotoğrafı. (D) Üst panel, davranışsal verileri kaydetmek ve çizmek için dahil edilen İşleme taslağından bir VR ortamında hayvan davranışının çevrimiçi grafiğini gösterir. Yalamalar, turlar ve ödüller, gizli ödül mekansal öğrenme sırasında 30 dakikalık oturum için 30 saniyelik zaman kutuları başına çizilir. Alt panelde, davranış sırasında geçerli fare konumu (siyah) ve ödül bölgelerinin konumu (gri) gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Grafik yazılım ortamını kullanarak uzamsal öğrenme. Sanal doğrusal pist boyunca rastgele ipuçlarıyla rastgele yiyecek arama sırasında bir hayvandan (A) temsili uzamsal yalama verileri ve (B-C) pistin ortasında tek bir görsel ipucu ile 1,5 m'de statik bir gizli ödül bölgesi ile 2 günlük eğitim. (A) Tur başına dört ödül bölgesi için 0. Gün rastgele yiyecek arama, 2 m sanal doğrusal pist boyunca eşit aralıklarla yerleştirilmiş sekiz konumdan rastgele seçilir. (Solda) 30 dakikalık oturum boyunca uzamsal bölme başına ortalama yalama sayısı (5 cm) (üstte: rastgele görsel uyaran panellerine sahip VR koridoru). (Sağda) Bu seans sırasında tur başına her 5 cm'lik uzamsal kutudaki yalama sayısı, bir ısı haritası ile temsil edilir. (B) 1. Gün, 0,8-1,2 m konumunda tek bir yüksek kontrastlı uyaran içeren sanal bir pist kullanarak 1,5 m'de tek bir ödül bölgesi (pist diyagramında kırmızı kutu, üstte) ile antrenmanın ilk günüdür (Solda) Ortalama uzamsal yalama, hayvan ödül bölgesine yaklaştığında artan yalamalar gösteren seans boyunca sayılır. (Sağda) Tur başına uzamsal yalamalar, ödül öncesi bölgede yalamanın seçiciliğinin arttığını gösterir. (C) 2. Gün, 1. Gün ile aynı gizli ödül görevinden ve sanal koridordan ve aynı fareden. (Solda) Uzamsal bölme başına toplam yalama, ödül öncesi bölgenin dışındaki yalamalarda bir azalma gösterir. (Sağda) 2. Gün'de tur başına uzamsal yalamalar, ödül bölgesinden önce artan yalama ve başka yerlerde yalamanın azaldığını göstererek, mekansal olarak spesifik beklentili yalamanın gelişimini gösterir. Bu, bu hayvanın (ipucu verilmemiş) gizli ödül yerini öğrendiğini ve bir ödülün bulunmasını beklemedikleri bölgelerde çabayı (yalamayı) en aza indirmek için bir strateji geliştirdiğini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Davranışsal sonuç | Fare sayısı | Farelerin yüzdesi |
| Fare koşmadı/yalamadı | 1 | 14% |
| Yalnızca rastgele yiyecek arama | 2 | 29% |
| Öğrenilen gizli ödül | 4 | 57% |
| Toplam (N) | 7 |
Tablo 1: VR uzamsal öğrenme davranışsal pilot sonuçları. 4 aylıkken her iki cinsiyetten yedi C57BL / 6 fare, VR'de mekansal gizli bir ödül görevini yerine getirmek için aşamalı olarak eğitildi. Bu farelerden bir fare, ilk eğitimden sonra koşmadı / yalamadı (yedi fareden biri,% 14), kalan farelerden altısı direksiyonda koşmayı ve eğitimin rastgele yiyecek arama adımında rastgele uzamsal ödüller için yalamayı öğrendi (yedi fareden altısı,% 86). Rastgele yiyecek arama davranışını gerçekleştirebilen altı fareden dördü daha sonra gizli ödül görevinde ipucu verilmeyen ödül beklentisiyle seçici olarak yalamayı öğrendi (yedi fareden dördü, toplamda% 57'si, altı fareden dördü, rastgele yiyecek arayan farelerin% 66'sı), ikisi ise yapmadı (yedi fareden ikisi, 29%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fareler için bu açık kaynaklı VR sistemi, yalnızca döner ve davranışlı ESP32 mikrodenetleyicileri ile IDE seri monitörü (adım 2.4.5) kullanılarak doğrulanabilen tek kartlı bilgisayar (adım 2) arasında seri bağlantılar düzgün bir şekilde yapılırsa çalışacaktır. Bu protokolden başarılı davranışsal sonuçlar elde etmek için (adım 4), fareler cihaza alışmalı ve sıvı ödüller için direksiyonda rahatça çalışmalıdır (adım 4.3-4.5). Bu, yeterli (ancak aşırı olmayan) su kısıtlaması gerektirir, çünkü ev kafesinde ad libitum suyu verilen fareler ödüller için koşmayacak ve yalaymayacaktır (yani, algılanan konumlarını belirtmek için) ve susuz bırakılmış fareler uyuşuk olabilir ve tekerlek üzerinde çalışmayabilir. Su kısıtlaması olmadan fare davranışını motive etmek için alternatif yöntemler olduğunu da belirtmek gerekir24; ancak bu yöntemleri burada test etmedik. Eğitim prosedürü için, başlangıçta çalışmayan hayvanlara, deneyci tarafından ekli bir isteğe bağlı düğmeye basılarak geçici (yani mekansal olmayan) su ödülleri verilebilir veya tekerleğin hareketi teşvik etmek için hafifçe hareket ettirilmesi sağlanabilir. Rastgele yiyecek arama davranışı geliştirmek için, koşan ancak yalamayan fareler, ödüller için koşup yalayana kadar çalışmayan ödüllerle (davranış ESP32 kodu: isOperant = 0;, adım 4.5.1) çalıştırılmalı ve daha sonra çalışmayan ve işletimsel ödül bölgelerinin alternatif turlarıyla çalıştırılabilirler (altOpt=1; Adım 4.5.2) tamamen çalışan rastgele ödül bölgelerine geçmeden önce operant turlarında yalamaya başlayana kadar (adım 4.5.3).
Bir tür uzamsal öğrenmeyi (sanal doğrusal iz ortamında gizli bir ödül konumunda koşullu yalama) ortaya çıkarmayı amaçlayan temel bir deney kümesi için eksiksiz talimatlar ve örnek sonuçlar sağlamış olsak da, aynı temel donanım ve yazılım kurulumu, Raspberry Pi için pi3d Python paketini kullanarak daha karmaşık görsel uzamsal ortamların sunulması için de değiştirilebilir. Örneğin, bu sistem değişken uzunluklara sahip koridorlar, çoklu desenler ve 3D nesneler ve doğal 3D VR manzaraları gibi daha karmaşık labirentleri içerebilir. Ayrıca, su ödüllerinin ve diğer görsel olmayan uyaranların dağıtımı için davranışsal yazılım, anahtar değişkenleri değiştirerek (davranış ESP32 kodunun başında sunulan) veya aynı koda yeni mekansal olay türleri ekleyerek diğer eğitim paradigmaları için değiştirilebilir. Kullanıcılara, bu VR kurulumuyla veya sorun giderme ile ilgili diğer davranışsal deney türlerini uygulama yöntemleri hakkında tavsiyelerde bulunmaktan mutluluk duyarız.
Sürükleyici VR ortamları, hem klinik hem de hayvan çalışmalarında mekansal navigasyonun altında yatan nöral mekanizmaları 6,7,8, ödül öğrenme davranışları9 ve görsel algı25'i incelemek için çok yönlü bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Bu yaklaşımın temel avantajı, deneycinin görsel ipuçları ve belirli mekansal uyaranlar (örneğin, ödüller ve koku alma, işitsel veya dokunsal uyaranlar) gibi bağlamsal unsurlar üzerinde sıkı bir kontrole sahip olmasıdır; bu, serbestçe hareket eden hayvanların bulunduğu gerçek dünya ortamlarında pratik değildir. Bununla birlikte, VR ortamlarının, gerçek dünya ortamlarının kullanımıyla karşılaştırıldığında, hipokampus gibi beyin bölgeleri tarafından kodlanma biçiminde farklılıklar olabileceği belirtilmelidir26,27. Bu uyarı ile, VR ortamlarının kullanımı, deneycilerin dikkatle kontrol edilen uyaranlarla çok sayıda davranışsal deneme yapmalarına izin vererek, farklı duyusal öğelerin mekansal navigasyona katkılarının ayrışmasına izin verir.
Özel VR kurulumları oluşturmanın karmaşıklığı genellikle mühendislik ve bilgisayar programlamada kapsamlı bir arka plan gerektirir, bu da kurulum süresini artırabilir ve fareleri deney için eğitmek için inşa edilebilecek cihazların sayısını sınırlayabilir. VR kurulumları ticari satıcılardan da edinilebilir; Ancak, kullanıcı yeni özellikler uygulamak veya eğitim/kayıt kapasitesini birden fazla kuruluma genişletmek isterse bu çözümler pahalı ve sınırlı olabilir. Burada sunulan açık kaynaklı VR kurulumunun tahmini fiyat aralığı <1.000 ABD Doları'dır (USD); Bununla birlikte, eğitim için basitleştirilmiş bir versiyon (örneğin, kafa açısı ayarı için gonyometrelerin bulunmaması) 500 $ (USD) < karşılığında üretilebilir, böylece fareleri eğitmek için daha büyük ölçekte birden fazla kurulumun yapılmasına izin verilir. Bileşenlerin modüler düzenlemesi aynı zamanda VR'nin, daha önce20 kullandığımız uzamsal koku alma ve dokunsal uyaranlara sahip koşu bandı sistemi gibi davranışsal kontrol için diğer sistemlerle entegrasyonuna izin verir ve bu nedenle VR ve diğer uyaran modaliteleri birbirini dışlamaz.
Bu açık kaynaklı VR sistemi, ilişkili donanımı (koşu tekerleği, projeksiyon ekranı ve kafa sabitleme aparatı), elektronik kurulumu (tek kartlı bilgisayar ve ESP32 mikrodenetleyicileri) ve yazılımı (VR GUI ve davranış kodu) ile birlikte, kafa kısıtlı mekansal navigasyon sırasında farelere parametreli sürükleyici VR ortamları sunmak için ucuz, kompakt ve kullanımı kolay bir kurulum sağlar. Bu davranış daha sonra uzamsal öğrenme sırasında nöral aktiviteyi incelemek için nöral görüntüleme veya elektrofizyolojik kayıt ile senkronize edilebilir (adım 2.3.7). VR ile uyumlu deneysel tekniklerin spektrumu, tek başına mekansal öğrenme davranışından fiber fotometri, miniskop görüntüleme, tek foton ve çoklu foton görüntüleme ve elektrofizyolojik tekniklerle (örneğin, Nöropikseller veya hücre içi kayıt) kombinasyona kadar geniştir. Bu kayıt tekniklerinin bazıları için baş desteği gerekli olsa da, uyaran sunumunun son derece hassas doğası ve davranışın kalıplaşmış doğası, miniskop görüntüleme ve fiber fotometri gibi kafa fiksasyonu gerektirmeyen diğer teknikler için de yararlı olabilir. Bununla birlikte, yalamaları tespit etmek için kapasitif sensör tabanlı çözümümüzün elektrofizyolojik izler üzerinde önemli bir gürültü yaratabileceği unutulmamalıdır. Bu tür artefaktlardan kaçınmak için, yalama tespiti için optik veya diğer (örneğin, mekanik), sensör tabanlı çözümler uygulanmalıdır.
VR sisteminde gelecekteki iyileştirmeler proje GitHub sayfasına (https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR) yüklenecektir, bu nedenle kullanıcılar güncellemeler için bu sayfayı düzenli olarak kontrol etmelidir. Örneğin, mikrodenetleyiciler ve tek kartlı bilgisayar arasındaki kablolu seri bağlantıları, bu tasarımda zaten kullanılan ESP32 mikrodenetleyicilerine özgü Bluetooth işlevselliği ile değiştirme sürecindeyiz. Buna ek olarak, HallPassVR GUI'yi, her davranışsal oturumda farklı yolların belirlenmesine, farklı turlardaki önemli dönüm noktası görsel uyaranları için farklı konumlar içerecek şekilde yükseltmeyi planlıyoruz. Bu, belirli görsel ve bağlamsal özelliklerin mekansal öğrenme sırasında uzayın nöral kodlaması üzerindeki etkisini ayrıştırmak için daha fazla esneklik sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Clay Lacefield, bu protokolde kullanılan OMwSmall PCB için ücretsiz tasarımlar sağlayan OpenMaze.org'in kurucusu ve geliştiricisidir.
Acknowledgments
Harvey laboratuvarından Noah Pettit'e bu yazıdaki protokolü geliştirirken tartışma ve önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NINDS R56NS128177 (R.H., C.L.) ve NIMH R01MH068542 (R.H.) 'ye ek olarak BBRF Genç Araştırmacı Ödülü ve NIMH 1R21MH122965 (G.F.T.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4 " diam aluminum rod | McMaster-Carr | 9062K26 | 3" in length for wheel axle |
| 1/4"-20 cap screws, 3/4" long (x2) | Amazon.com | B09ZNMR41V | for affixing head post holders to optical posts |
| 2"x7" T-slotted aluminum bar (x2) | 8020.net | 1020 | wheel/animal mounting frame |
| 6" diam, 3" wide acrylic cylinder (1/8" thick) | Canal Plastics | 33210090702 | Running wheel (custom width cut at canalplastics.com) |
| 8-32 x 1/2" socket head screws | McMaster-Carr | 92196A194 | fastening head post holder to optical post |
| Adjustable arm (14") | Amazon.com | B087BZGKSL | to hold/adjust lick spout |
| Analysis code (MATLAB) | custom written | file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Analysis code | |
| Axle mounting flange, 1/4" ID | Pololu | 1993 | for mounting wheel to axle |
| Ball bearing (5/8" OD, 1/4" ID, x2) | McMaster-Carr | 57155K324 | for mounting wheel axle to frame |
| Behavior ESP32 code | custom written | file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Arduino code/Behavior board | |
| Black opaque matte acrylic sheets (1/4" thick) | Canal Plastics | 32918353422 | laser cut file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR screen assembly |
| Clear acrylic sheet (1/4" thick) | Canal Plastics | 32920770574 | laser cut file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR wheel assembly |
| ESP32 devKitC v4 (x2) | Amazon.com | B086YS4Z3F | microcontroller for behavior and rotary encoder |
| ESP32 shield | OpenMaze.org | OMwSmall | description at www.openmaze.org (https://claylacefield.wixsite.com/openmazehome/copy-of-om2shield). ZIP gerber files at: https://github.com/claylacefield/OpenMaze/tree/master/OM_PCBs |
| Fasteners and brackets | 8020.net | 4138, 3382,3280 | for wheel frame mounts |
| goniometers | Edmund Optics | 66-526, 66-527 | optional for behavior. Fine tuning head for imaging |
| HallPassVR python code | custom written | file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/HallPassVR | |
| Head post holder | custom design | 3D design file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR head mount/Headpost Clamp | |
| LED projector | Texas Instruments | DLPDLCR230NPEVM | or other small LED projector |
| Lick spout | VWR | 20068-638 | (or ~16 G metal hypodermic tubing) |
| M 2.5 x 6 set screws | McMaster-Carr | 92015A097 | securing head post |
| Matte white diffusion paper | Amazon.com | screen material | |
| Metal headposts | custom design | 3D design file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR head mount/head post designs | |
| Miscellenous tubing and tubing adapters (1/16" ID) | for constructing the water line | ||
| Optical breadboard | Thorlabs | as per user's requirements | |
| Optical posts, 1/2" diam (2x) | Thorlabs | TR4 | for head fixation setup |
| Processing code | custom written | file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Processing code | |
| Raspberry Pi 4B | raspberry.com, adafruit.com | Single-board computer for rendering of HallPassVR envir. | |
| Right angle clamp | Thorlabs | RA90 | for head fixation setup |
| Rotary encoder (quadrature, 256 step) | DigiKey | ENS1J-B28-L00256L | to measure wheel rotation |
| Rotary encoder ESP32 code | custom written | file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Arduino code/Rotary encoder | |
| SCIGRIP 10315 acrylic cement | Amazon.com | ||
| Shaft coupler | McMaster-Carr | 9861T426 | to couple rotary encoder shaft with axle |
| Silver mirror acrylic sheets | Canal Plastics | 32913817934 | laser cut file at github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR screen assembly |
| Solenoid valve | Parker | 003-0137-900 | to administer water rewards |
References
- Lisman, J., et al. Viewpoints: How the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
- Buzsaki, G., Moser, E. I. Memory, navigation and theta rhythm in the hippocampal-entorhinal system. Nature Neuroscience. 16 (2), 130-138 (2013).
- O'Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Research. 34 (1), 171-175 (1971).
- O'Keefe, J. Place units in the hippocampus of the freely moving rat. Experimental Neurology. 51 (1), 78-109 (1976).
- Fyhn, M., Molden, S., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B.
- Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480 (7377), 331-335 (2011).
- Lacefield, C. O., Pnevmatikakis, E. A., Paninski, L., Bruno, R. M. Reinforcement learning recruits somata and apical dendrites across layers of primary sensory cortex. Cell Reports. 26 (8), 2000-2008 (2019).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Gauthier, J. L., Tank, D. W. A dedicated population for reward coding in the hippocampus. Neuron. 99 (1), 179-193 (2018).
- Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature Neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
- Yadav, N., et al. Prefrontal feature representations drive memory recall. Nature. 608 (7921), 153-160 (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Pettit, N., et al. Harvey Lab Mouse VR. , Available from: https://github.com/Harvey/Lab/mouseVR (2021).
- Pettit, N. L., Yap, E. L., Greenberg, M. E., Harvey, C. D. Fos ensembles encode and shape stable spatial maps in the hippocampus. Nature. 609 (7926), 327-334 (2022).
- Turi, G. F., et al. Vasoactive intestinal polypeptide-expressing interneurons in the hippocampus support goal-oriented spatial learning. Neuron. 101 (6), 1150-1165 (2019).
- Ulivi, A. F., et al. Longitudinal two-photon imaging of dorsal hippocampal CA1 in live mice. Journal of Visual Experiments. (148), e59598 (2019).
- Wang, Y., Zhu, D., Liu, B., Piatkevich, K. D. Craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice. Journal of Visual Experiments. (173), e62266 (2021).
- Tuncdemir, S. N., et al. Parallel processing of sensory cue and spatial information in the dentate gyrus. Cell Reports. 38 (3), 110257 (2022).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Jordan, J. T., Gonçalves, J. T. Silencing of hippocampal synaptic transmission impairs spatial reward search on a head-fixed tactile treadmill task. bioRxiv. , (2021).
- Urai, A. E., et al. Citric acid water as an alternative to water restriction for high-yield mouse behavior. eNeuro. 8 (1), (2021).
- Saleem, A. B., Diamanti, E. M., Fournier, J., Harris, K. D., Carandini, M. Coherent encoding of subjective spatial position in visual cortex and hippocampus. Nature. 562 (7725), 124-127 (2018).
- Ravassard, P., et al. Multisensory control of hippocampal spatiotemporal selectivity. Science. 340 (6138), 1342-1346 (2013).
- Aghajan, Z. M., et al. Impaired spatial selectivity and intact phase precession in two-dimensional virtual reality. Nature Neuroscience. 18 (1), 121-128 (2015).
