Summary
Eine schnelle myokardiale und kardiale Entspannung ist für die normale Physiologie unerlässlich. Mechanische Relaxationsmechanismen sind heute bekannt, dass sie von der Dehnrate abhängig sind. Dieses Protokoll bietet einen Überblick über die Erfassung und Analyse von Experimenten, um die mechanische Kontrolle der Relaxation weiter zu untersuchen.
Abstract
Die diastolische Dysfunktion ist ein häufiger Phänotyp bei kardiovaskulären Erkrankungen. Neben der erhöhten Herzsteifigkeit (erhöhter linksventrikulärer enddiastolischer Druck) ist die gestörte Herzrelaxation ein wichtiger diagnostischer Indikator für eine diastolische Dysfunktion. Während die Entspannung die Entfernung von zytosolischem Kalzium und die Deaktivierung von sarkomerischen dünnen Filamenten erfordert, gibt es für die Bekämpfung solcher Mechanismen noch keine wirksamen Behandlungen. Mechanische Mechanismen, wie z. B. der Blutdruck (d. h. Nachlast), wurden theoretisiert, um die Entspannung zu verändern. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die Modifikation der Dehnungsrate einer Dehnung und nicht der Nachlast sowohl notwendig als auch ausreichend ist, um die anschließende Relaxationsrate des Myokardgewebes zu modifizieren. Die Dehnungsratenabhängigkeit der Relaxation, die sogenannte mechanische Kontrolle der Entspannung (MCR), kann anhand intakter kardialer Trabekel beurteilt werden. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung eines Kleintiermodells, des Versuchssystems und der Kammer, die Isolierung des Herzens und die anschließende Isolierung eines Trabekels, die Vorbereitung der Versuchskammer sowie die Versuchs- und Analyseprotokolle. Evidenz für die Verlängerung von Dehnungen im intakten Herzen deutet darauf hin, dass MCR neue Arenen für eine bessere Charakterisierung pharmakologischer Behandlungen bieten könnte, zusammen mit einer Methode zur Beurteilung der myofilamenten Kinetik in intakten Muskeln. Daher könnte die Untersuchung des MCR einen Weg zu neuen Ansätzen und neuen Grenzen in der Behandlung von Herzinsuffizienz aufzeigen.
Introduction
Die kardiale Entspannung ist bei fast allen Formen der Herzinsuffizienz (einschließlich Herzinsuffizienz mit reduzierter Auswurffraktion) und bei vielen Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinträchtigt. Neben zahlreichen Methoden zur Beurteilung der Herzfunktion in permeabilisierten Muskeln gewinnt die Beurteilung intakter Herzmuskeln an Interesse. Solche Gewebe werden unbelastet (Enden können sich frei kontrahieren) oder belastet (längen- oder kraftgesteuert) beurteilt. In der Vergangenheit wurden intakte isolierte Myozyten in einem unbelasteten Zustand untersucht, in dem sich der Zellkörper während der Kontraktion verkürzen kann. Intakte Herztrabekel werden oft unter isometrischen Bedingungen bewertet, bei denen sich die Länge nicht ändern darf, aber eine Spannung (Kraft pro Querschnittsfläche) erzeugt wird. Sowohl intakte Myozyten- als auch Trabekel beginnen sich mit Modifikationen der Belastungzu konvergieren 1,2.
Protokolle zur Belastungsklemmung eines Muskels (d. h. die Kontrolle der entwickelten Belastung eines Muskels bei einem bestimmten Wert, der physiologische Nachbelastungen simuliert) wurden über mehrere Jahrzehnte hinweg entwickelt 3,4,5. In intaktem Herzgewebe ermöglichen Lastklemmen den Forschern, den In-vivo-Herzzyklus mit isotonischen oder Windkessel-ähnlichen Nachlasten genauer nachzuahmen 6,7,8,9. Das Ziel dieses Protokolls ist es, Daten zu erhalten, die zur Quantifizierung des MCR (d. h. der Dehnratenabhängigkeit der Relaxationsrate) verwendet werden8,9.
Während das MCR-Protokoll aus früheren Arbeiten adaptiert wurde, liegt der Schwerpunkt dieses Protokolls (im Vergleich zu ähnlichen Protokollen, die intaktes Herzgewebe verwenden) auf biomechanischen Mechanismen, die die Entspannung modifizieren. Es gibt mehrere Protokolle, die die Lastklemmung 3,4,5,7,10 verwenden, und Protokolle, die sich auf die Windkesselmodelle 1,2,11 konzentrieren, aber dieses Protokoll beschreibt genau, wie die Dehnung vor der Entspannung die Relaxationsrate verändert. Wir haben gezeigt, dass diese Kontrolle während einer proto-diastolischen Periode8 stattfindet, einer Phase, die ursprünglich von Wiggers12 beschrieben wurde. Bei normalen, gesunden Herzen wird das Myokard während des Auswurfs vor dem Verschluss der Aortenklappe (d. h. vor der isovolumischen Entspannung) einer längeren Belastung ausgesetzt13. Dies wird nachgeahmt, indem die Dauer der Nachlastkontrolle verlängert wird, bis der Muskel beginnt, sich zu dehnen. Klinische Befunde deuten darauf hin, dass diese Verlängerung in Krankheitsstadien abgeschwächt oder verloren gehen kann14, und die Implikationen und Mechanismen veränderter endsystolischer Dehnungsraten sind noch nicht vollständig geklärt. Angesichts der spärlichen Behandlungsmöglichkeiten für diastolische Erkrankungen und Herzinsuffizienz mit einer erhaltenen Ejektionsfraktion gehen wir davon aus, dass die MCR Einblicke in neue Mechanismen geben könnte, die der gestörten Entspannung zugrunde liegen.
Während sich die hier beschriebene grobe Präparation auf Nagetiere konzentriert, kann die Trabekulaisolierung von jedem intakten Herzen aus durchgeführt werden und wurde bereits bei einer menschlichen Herztrabekelverwendet 8. In ähnlicher Weise kann die Datenerfassung und -analyse auch auf Kardiomyozyten oder andere isolierte Muskeltypen angewendet werden 1,10. Die Diskussion enthält Kommentare zu möglichen Änderungen und Anpassungen der Methode sowie zu Einschränkungen, wie z. B. die Vorsicht vor der Verwendung von Papillarmuskeln aufgrund der mechanischen Eigenschaften der Akkorden9.
Protocol
Das folgende Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wayne State University genehmigt. Das Protokoll beschreibt hier die Schritte zur Verwendung von Versuchspersonen an Nagetieren, kann aber auch für die Verwendung in anderen Modellorganismen angepasst werden.
1. Vorbereitung
- Holen Sie sich das Versuchsobjekt und lassen Sie es sich an das Labor gewöhnen.
- Bereiten Sie 250 ml Perfusionslösung und 250 ml modifizierte Tyrode-Lösung (Tabelle 1) vor, indem Sie jeweils 10-20 ppmO2 mit einem pH-Wert von 7,3 anreichern.
- Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze mit einer Kanüle vor. Füllen Sie die Spritze mit Perfusionslösung. Verwenden Sie Kanülen, die 23 g für eine Maus und 18 oder 16 g für eine kleine bzw. große Ratte sind. Schieben Sie einen 1 mm langen Schlauch aus Polyethylen (PE) auf das Ende einer stumpfen Nadel (Materialtabelle), um zu verhindern, dass die Aorta nach dem Binden von der Kanüle rutscht.
- Komplette Präparation des Präparier- und Kanülierungsbereichs (Abbildung 1)
- Füllen Sie zwei saubere Wägeschiffchen mindestens zur Hälfte mit Perfusionslösung. Tauchen Sie die Spitze der Kanüle in Perfusionslösung, wobei mindestens eine Doppelschlingennaht um die Kanüle gelegt wird. Halten Sie die Spritze mit einer Stangenklemme fest.
- Platzieren Sie eine chirurgische Schere, einen Hämostat, eine Iriszange, eine kleine gebogene Schere und zwei #3-Pinzetten für einen einfachen Zugang.
- Bereiten Sie das Versuchssystem vor (Abbildung 2), indem Sie die modifizierte Tyrodesche Lösung ansaugen und im gesamten Versuchssystem zirkulieren lassen. Stellen Sie sicher, dass die Kammer vollständig gefüllt und stabil ist.
- Schalten Sie alle Datenerfassungsboxen ein, einschließlich des Kraftaufnehmers, des Längenmotors, des Schrittmachersystems, des Temperaturregelungssystems und des Datenerfassungscomputers.
- Kopieren Sie einen Vorlagenordner, der die erforderlichen *.dap- und Zeigerdateien enthält, und benennen Sie ihn um, um auf das aktuelle Experiment zu verweisen. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware.
- Bereiten Sie die Trabekula-Isolationswerkzeuge (Vannas-Schere, Pinzette #5 oder #55, Glassonde) vor, indem Sie ihre Spitzen in 10%iges (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in Reinstwasser oder Perfusionslösung tauchen, um das Metall mit Protein zu beschichten (Abbildung 2B).
HINWEIS: Das gesamte Versuchssystem muss vor der Präparation vorbereitet werden.
2. Grobe Präparation und Kanülierung
- Notieren Sie die Identifikation, das Körpergewicht und andere relevante Informationen des Tieres.
- Optional können Sie dem Nagetier mindestens 10 Minuten vor der Euthanasie 1.000 E/kg Heparin in steriler Kochsalzlösung durch intraperitoneale Injektion injizieren, um das Gerinnungsrisiko vor der koronaren Perfusion zu minimieren.
- Legen Sie das Tier in eine Induktionskammer und induzieren Sie eine Vollnarkose mit 3%-5% Isofluran, das gemäß dem Standardverfahren in 100% Sauerstoff verdampft wird.
Anmerkungen: Schalten Sie alle externen Abscheider, Fallstromtische oder Abzüge ein, die verwendet werden, um die Exposition gegenüber Isofluran zu minimieren. - Sobald das Nagetier seinen Aufrichtreflex verliert und sich die Atemfrequenz verlangsamt hat:
- (Bei einer Ratte) nehmen Sie das Tier aus der Einleitungskammer und legen Sie es in Rückenlage auf ein Sezierpad, wobei die Anästhesie durch einen Nasenkegel fortgesetzt wird.
- (Bei einer Maus) führen Sie sofort nach der Entnahme des Tieres aus der Induktionskammer eine Zervixluxation durch. Der Nasenkonus ist nicht notwendig. Drehen Sie den Isofluran-Verdampfer auf 0%.
- Befestigen Sie bei Bedarf die oberen Gliedmaßen des Nagetiers mit Klebeband, das von der Brustwand entfernt ist, mit Klebeband, das von Stiften getragen wird, auf dem Sezierkissen, wobei Sie darauf achten, dass Sie nicht in das Tier stechen. Überprüfen Sie die richtige Anästhesietiefe (fehlende Zehenquetschreaktion), bevor Sie mit der Dissektion fortfahren.
- Mit einer chirurgischen Schere (Mayo für Ratten, Metzenbaum für Mäuse) wird die Haut direkt unterhalb des Xyphoideusfortsatzes quer über die gesamte Breite des Bauches des Nagetiers in den Peritonealraum geschnitten.
- Machen Sie mit einer chirurgischen Schere zwei vertikale Schnitte parasagittal (an den Seiten der Brustwand) sowohl auf der linken als auch auf der rechten Seite der Brustwand vom Querschnitt aus. Schneiden Sie dann über das Zwerchfell, verbinden Sie die parasagittalen Schnitte und geben Sie den Brustraum frei.
- Klemmen und heben Sie den Xypoidfortsatz mit einem Hämostat in Richtung des Kopfes des Nagetiers, um das Brustbein und die Brustwand nach oben in Richtung des Kopfes des Nagetiers zu bewegen und den Brustraum und das Herz freizulegen. Falls erforderlich, dehnen Sie die parasagittalen Schnitte schnell bis in die Nähe des zweiten Wirbelraums aus, um das Herz vollständig freizulegen und/oder die Perikardmembran zu durchbrechen.
- Heben Sie das Herz vorsichtig mit einer gebogenen Iriszange an, um die großen Gefäße zu visualisieren. Platzieren Sie die Zange zwischen dem Myokard und der Wirbelsäule des Nagetiers, klemmen Sie die großen Gefäße fest und heben Sie das Herz an, wobei Sie darauf achten, dass die Vorhöfe oder Ventrikelsegmente nicht eingeklemmt werden.
- Während Sie das Herz leicht anheben, platzieren Sie schnell die gebogene Irisschere (konkav nach oben) zwischen der gekrümmten Iriszange und der Wirbelsäule des Nagetiers und schneiden Sie die großen Gefäße und Lungen vom Herzen weg. Legen Sie das Herz schnell in ein Wiegeschiff oder einen Becher mit frischer Perfusionslösung und schütteln Sie es, um das Blut aus dem Herzen zu entfernen.
- Drehen Sie den Isofluran-Verdampfer auf 0%, falls noch nicht geschehen. Wenn große Segmente des Lungen-, Perikard- oder anderen Gewebes am Herzen verbleiben, schneiden Sie sie vorsichtig ab und entsorgen Sie sie zu diesem Zeitpunkt, um die Beeinträchtigung der Kanülierung zu minimieren.
- Bewegen Sie das Herz mit der gebogenen Iriszange in ein sauberes Wiegeschiffchen oder Becherglas, wobei die vorbereitete Kanüle untergetaucht ist. Kanülieren Sie die Aorta, sichern Sie die Aorta, indem Sie die geschlungene Seidennaht festziehen, und spülen Sie sie mit bis zu 5 ml Perfusionslösung.
- Nehmen Sie das Herz aus der Kanüle und legen Sie es in eine mit Silikonelastomer beschichtete Waagschale, um die Trabekulaisolierung vorzubereiten.
3. Isolierung und Äquilibrierung von Trabekel
- Legen Sie das Herz in die silikonelastomerbeschichtete Schale unter ein Stereomikroskop und beleuchten Sie es.
- Lokalisieren Sie den rechtsventrikulären Ausflusstrakt. Stecken Sie den linken Vorhof und die Ventrikelspitze an das Silikonelastomer in der Schale.
- Schneiden Sie mit einer langen Vannas-Schere vom rechtsventrikulären Ausflusstrakt bis zur Spitze entlang des Septums. Schnitt vom rechtsventrikulären Ausflusstrakt zum rechten Vorhof in der Nähe der Aorta und dann durch den rechten Vorhof (Abbildung 3B).
- Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die rechtsventrikuläre (RV) freie Wand aus dem Ausflusstrakt heraus und achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu dehnen.
HINWEIS: Experimentatoren können dünne, weiße Bindegewebsstränge finden, die ohne Bedenken durchtrennt werden können. Größere, rosafarbene Strähnen sollten mit Vorsicht beurteilt werden, da es sich um Trabekel handeln kann, die isoliert werden können. - Stecken Sie die freie Wand des rechten Ventrikeldreiecks an die Schale, um den rechten Ventrikel freizulegen (Abbildung 3C).
- Durchsuchen Sie das freiliegende Endokard mit einer Glaspipette, die geschmolzen und mit einem dünnen (<500 μm Durchmesser), aber nicht scharfen Ende geformt wurde, nach freistehenden Trabekeln (Abbildung 3C).
HINWEIS: Ein freistehender Trabekel ist ein Muskelstreifen, den man vollständig darunter sondieren kann. Verwenden Sie Trabekel mit parallelen Seiten (konstante Breite) und vermeiden Sie dreieckige Papillarmuskeln. Seien Sie während dieses Vorgangs und der anschließenden Präparation vorsichtig, da die Belastung des Trabekula zu Schäden führen und die entwickelte Kraft verringern kann. - Seziere die Trabekel mit einer kleinen Vannas-Schere. Lassen Sie an jedem Ende des Trabekels ein ≥1 mm großes Stück Gewebe liegen, damit es befestigt werden kann. Dehnen Sie die Trabekula nach Möglichkeit nicht und minimieren Sie den Kontakt mit Metallwerkzeugen, da beide auch den Muskel schädigen können. Verschieben Sie die Stifte, die das Herz halten, nach Bedarf, um die Belastung des Muskels in der Nähe der identifizierten Trabekel zu minimieren.
- Schneiden Sie ~ 2 Zoll vom Ende einer 7-ml-Transferpipette ab, ziehen Sie die Trabekula langsam in die Pipette und übertragen Sie sie in eine neue Wiegeschale, die 50 % Perfusionslösung und 50 % modifizierte Tyrode-Lösung enthält. Lassen Sie den Muskel einige Minuten lang auf den Anstieg des extrazellulären Kalziums in der gemischten Lösung abgleichen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.7-3.8, um zu diesem Zeitpunkt weitere Trabekel zu präparieren, um zusätzliche Trabekel als Backup zu erhalten.
- Schalten Sie die Pumpe aus, die die Experimentierkammer mit Superfusion und/oder Absaugung versorgt. Bewegen Sie die Trabekel mit der Transferpipette mit großem Durchmesser in die mit der Tyrode-Lösung gefüllte Versuchskammer.
- Stecken Sie ein >1 mm großes Würfelstück Gewebe am Ende der Trabekula an einen Haken am Kraftaufnehmer und heften Sie dann den zweiten Würfel an den Motor.
Anmerkungen: Trennen Sie den Motor und den Kraftaufnehmer, wenn Sie die erste Seite montieren, um einen besseren Zugang zum Schallkopf zu erhalten, und bewegen Sie dann die Haken so nah wie möglich zusammen, wenn Sie den zweiten Gewebewürfel montieren, während der Trabekel locker bleibt. - Starten Sie die Superfusion neu und beginnen Sie mit der Stimulation des Muskels, um die Schwellenspannung zu bestimmen. Gehen Sie ca. 1 Stunde lang bei 20 % über der Schwellenspannung, damit sich der Trabekel ausgleichen kann.
- Am Ende dieser Gleichgewichtsphase dehnen Sie den Muskel langsam mit dem an den Motor angeschlossenen Mikrometer, bis eine optimale Spannungserzeugung erreicht ist, indem Sie die entwickelte Spannung (Minimum bis Peak) beobachten. Hören Sie auf, die Muskellänge zu erhöhen, wenn die passive diastolische Spannung schneller ansteigt als die Spitzenspannung, was anzeigt, dass die optimale Länge überschritten wurde.
- Schalten Sie die Durchlichtmikroskopbeleuchtung aus und beleuchten Sie die Trabekel mit einem Schwanenhalsstrahler in einem steilen Winkel. Nehmen Sie mit einer Kamera, die über die zuvor kalibrierte Mikroskopoptik angeschlossen ist, ein Bild der Trabekula während der Diastole in den Versuchsordner auf. Wenn das Trabekel breiter ist als das Sichtfeld der Kamera, nehmen Sie mehrere Bilder über den Muskel auf.
- Öffnen Sie das/die Bild(er) in einer Bildbearbeitungssoftware, die Pixelabstände meldet.
- Messen Sie den Pixelabstand des Muskeldurchmessers viermal entlang seiner Länge. Messen Sie die Länge des Muskels (Trabekula) in Pixeln, ohne den großen Gewebewürfel.
- Wenn die Muskellänge länger als das Sichtfeld ist, verwenden Sie Referenzpunkte entlang des Muskels, um die gesamte Länge zu messen.
- Berechnen Sie mithilfe der Vorlage im Experimentordner den Mittelwert der Durchmessermessungen und konvertieren Sie den Durchmesser und die Längen von Pixeln in mm mithilfe einer zuvor erhaltenen Kalibrierung. Berechnen Sie die Querschnittsfläche als π*Durchmesser 2/4 in mm2 und die Muskellänge in μm.
4. Datenerfassung
- Sobald der Muskel ausgeglichen ist, öffnen Sie die Datenerfassungssoftware, wählen Sie Experimente | Längensteuerung, und geben Sie die kalibrierte Trabekellänge (FL) und die Querschnittsfläche (Fläche [m2]) in das Feld Kalibrierung ein.
- Stellen Sie im Vorlagenordner (Schritt 1.7) sicher, dass die freeform_file.txt auf den richtigen Ordner verweist, und öffnen Sie die Datei freeform.dap in einem Texteditor. Legen Sie den isotonischen Wert (isoton) in der *.dap-Datei auf 32.000 fest.
- Wählen Sie im Feld Längensteuerung die Registerkarte Freiform aus, und navigieren Sie zur entsprechenden Freiform-Listendatei. Stellen Sie sicher, dass der Datenablagepfad auch der richtige Ordner zum Speichern von Daten ist. Beginnen Sie mit der Erfassung von Daten aus vollständig isometrischen Zuckungen, indem Sie Run Experiment drücken, bevor Sie Last-Klemm-Daten mit einer Rückkopplungsregelung mit proportionalen und Integrationsverstärkungsparametern erfassen.
- Erfassen Sie lastgebundene Daten, indem Sie die Nachlast (isoton) in der *.dap-Datei definieren, und iterieren Sie Werte der Parameter proportionale Verstärkung (propgain) und Integration (Ki), indem Sie die Datei im Texteditor speichern. Klicken Sie in der Benutzeroberfläche der Datenerfassungssoftware auf Experiment ausführen .
- Stellen Sie sicher, dass die Klemme während dieser Iteration wieder auf ihre ursprüngliche Länge verlängert wird (manchmal auch als Relaxationsbelastung5 bezeichnet), um den maximalen Bereich der Dehnraten zu erreichen, indem Sie den Modus (flswitch) von eins einstellen und den Schwellenwert für das Beenden der Lastklemme (flthreshold) von Null erhöhen.
- Kontrollieren Sie das Ende der Lastklemme, indem Sie den Modus (flswitch) von eins auf Null ändern. Wiederholen Sie die Erfassung, während Sie das Ende der Lastklemme von einer Nullverlängerung auf eine vollständige Verlängerung zurück auf die Ausgangslänge ändern.
- Um die Länge zu erhöhen, erhöhen Sie schrittweise die Schwelle für das Beenden der Lastklemme (flthreshold) von Null, bis sich der Muskel fast wieder auf seine ursprüngliche Länge verlängert.
- Setzen Sie den Modus (flswitch = 1) und den Schwellenwert (flthreshold = 0) zurück, und führen Sie eine letzte Datenerfassung durch.
- Falls gewünscht, ändern Sie die Nachlast in der Studie, indem Sie die Schritte 4.4-4.6 wiederholen. Diese Akquisition kann sofort erfolgen.
- Falls gewünscht, modifizieren Sie die Vorspannung, indem Sie den Muskel dehnen oder verkürzen, oder behandeln Sie den Muskel, indem Sie der Tyrode-Lösung Verbindungen hinzufügen. Wenn Sie die Vorspannung ändern oder Verbindungen hinzufügen, warten Sie mindestens 20 Minuten, um sicherzustellen, dass sich die langsame Kraftantwort 9,15 stabilisiert hat und/oder die Verbindung vollständig in den Muskel eindringt.
- Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Trabekula. Bei Bedarf frieren Sie die Trabekel für die biochemische oder histologische Analyse ein oder fixieren Sie sie.
- Reinigen Sie die Arbeitsbereiche und das Versuchssystem, spülen Sie alle Schläuche mit Wasser und schalten Sie alle Komponenten aus.
5. Datenanalyse
- Öffnen Sie die Datendateien mit einem quantitativen Analyseprogramm, indem Sie das Programm an den entsprechenden Dateipfad weiterleiten.
- Quantifizieren Sie die Relaxation, indem Sie sicherstellen, dass das Datenanalyseprogramm den eingespannten Schlag analysiert und dass das Programm den Beginn der Lastklemme korrekt erfasst.
- Stellen Sie sicher, dass das Ende der Lastklemme identifiziert wird, damit die Relaxationsrate (1/τ) aus der negativen Spitzenableitung der Spannung während einer isometrischen Relaxation quantifiziert wird.
- Verwenden Sie die Glantz-Methode16, um diese exponentielle Zeitkonstante zu bestimmen, oder eine andere geeignete Quantifizierung der Relaxation (minimale Ableitung der Spannung, logistische Zeitkonstante 17 oder kinematisches Modell18).
- Stellen Sie sicher, dass das Datenanalyseprogramm die Dehnrate berechnet, indem es die Zeitableitung der Dehnung nimmt, wobei die Dehnung als Länge als Funktion der Zeit dividiert durch die Länge bei optimaler Kontraktion berechnet wird.
- Wiederholen Sie die obigen Schritte für alle Spuren einer bestimmten Bedingung.
- Zeichnen Sie die Beziehung zwischen der Relaxationsrate und der Dehnungsrate auf, wobei die maximalen Daten auf eine physiologische Dehnungsrate von weniger als 1 s-1 begrenzt werden. Schließen Sie Daten mit niedrigen Dehnungsraten aus (Abbildung 4C), da die Relaxationsphase möglicherweise nicht den exponentiellen Zerfallwiderspiegelt 17,18.
- Ermitteln Sie die Steigung der Geraden zwischen der Relaxationsrate und der Dehnungsrate, und zeichnen Sie die Steigung als MCR-Index auf.
- Wiederholen Sie die obige Analyse für jede abgefragte Bedingung.
Representative Results
Ein repräsentativer Datensatz ist in Abbildung 4 dargestellt, weitere Ergebnisse finden sich in früheren Veröffentlichungen 8,9. Kurz gesagt, die Dehnungsrate wird aus der Ableitung der Dehnung berechnet, kurz vor der isometrischen Relaxation. Die Belastung ist die Länge als Funktion der Zeit geteilt durch die Länge des Muskels bei optimaler Länge. Die Relaxationsrate wird als 1/τ berechnet, wobei τ die exponentielle Zeitkonstante16 ist. Mehrfachdehnungsraten und die daraus resultierenden Relaxationsraten sind erforderlich, um die mechanische Kontrolle der Relaxation (MCR) zu bestimmen. Diese Daten werden in einem Diagramm der Relaxationsrate über die Dehnungsrate aufgetragen. Die Steigung der Linie liefert den MCR-Index.
Beachten Sie, dass die systolischen und diastolischen Dehnungsraten am Ende wahrscheinlich nicht mehr als 1 s-1 betragen. Daher sollte die Steigung nur Dehnraten < 1 s-1 enthalten. Die Relaxationsrate bei niedrigen Dehnungsraten kann durch Änderungen der minimalen Zeitableitung der Spannung (dStress/dt min) verfälscht werden, und in diesen Fällen können Daten von Dehnungen von weniger als etwa 0,15 s-1 ignoriert werden.
Abbildung 1: Aufbau des Grobdissektions- und Herzkanülierungsbereichs. Von rechts nach links: a. Die Anästhesie-Induktionskammer für das Tier befindet sich in der Nähe des Präparierbereichs. b. Ein Schnorchel für einen optionalen Fänger für flüchtige Gase. c. Ein Sezierkissen, auf das das Tier in Rückenlage gelegt wird, wird von (im Uhrzeigersinn) flankiert d. einem Nasenkegel, um das Nagetier weiterhin zu betäuben, z. B. Hämostate, f. chirurgische Schere, g. gebogene feine Schere, die für einen einfachen Zugang mit der dominanten (schneidenden) Hand platziert ist, h. gebogene Iriszange, die für einen einfachen Zugang mit der nicht dominanten Hand platziert ist. Die oberen Gliedmaßen des Nagetiers können mit Klebeband auf dem Sezierkissen befestigt werden, und i. eine Sezierschale (oder ein kleiner Becher) mit Perfusionslösung sollte in der Nähe platziert werden, um das Herz zu spülen. j. Ein für die Kanülierung vorgesehener Bereich muss in der Nähe platziert werden. Eine Spritze mit einer entsprechenden Kanüle wird auf einem Ringständer montiert. k. (Einschub) Eine nähere Aufnahme einer 16-G-Kanüle mit 1 mm PE205-Schlauch und locker verknotetem Nahtmaterial. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Versuchsfläche und Werkzeuge . (A) Versuchsfläche. Die Experimentierkammer und das Datenerfassungssystem werden auf einem inversen Mikroskop in der Nähe (links) präpariert. Die Isolierung und Montage der Trabekel erfolgt unter einem Stereoskop (rechts). (B) Die Spitzen von zwei Pinzetten, einer großen und einer kleinen Vannas-Schere und einer kundenspezifischen Glassonde werden durch Einweichen in 10%iger BSA-Lösung hergestellt. (C) Zusätzliche Sezierwerkzeuge. Eine mit Silikonelastomer beschichtete Schale ermöglicht die Befestigung des Herzens während der Feinpräparation. Eine 7-ml-Transferpipette mit dem Endschnitt ist unter der Schale und der Glassonde dargestellt. Die abgeschnittene Spitze der Transferpipette wird verworfen und eine vergrößerte Bohrung verwendet, um den Muskel zu übertragen, mit minimalem Risiko einer Dehnung oder Dehydrierung. (D) Vergrößertes Bild des Endes einer Glaspipette, die ca. 2 mm lang ist und einen Durchmesser von 0,25-0,5 mm hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Anleitung zur Präparation . (A) Die grobe Dissektion sollte mit einem Querschnitt (1. grün) durch die Haut in die Bauchhöhle unterhalb des Processus xyphoideus beginnen (untere Rippen und Xyphoid sind durch eine dünne graue Linie gekennzeichnet). Es sollten parasagittale Schnitte von der Bauchhöhle bis zum Brustkorb folgen (2. blaugrüne und 3. blaue Linien), danach sollte das Zwerchfell durchtrennt werden. Mit einem Hämostat kann dann der Processus xyphoideus eingeklemmt und die Brustwand in Richtung Kopf angehoben werden. (B) Ein intaktes Rattenherz, das an einer Silizium-Elastomer-Schale befestigt ist und mit Blick auf den rechtsventrikulären Ausflusstrakt (RVOT), den rechten Vorhof (RA), die Aorta (Ao) und den linken Vorhof (LA) ausgerichtet ist. Die erste Reihe von Schnitten sollte von der RVOT bis zur Spitze entlang des Septums erfolgen (1. Gelbe Linie). Ein zweiter Satz Schnitte sollte von der RVOT entlang der Herzbasis und dann über den rechten Vorhof (2. orangefarbene Linie) erfolgen. (C) Die RVOT kann vorsichtig von der Aorta weggezogen werden, um das Herz zu öffnen und zurückzustecken. Gelbe und orangefarbene Linien entsprechen den in B beschriebenen Schnitten. Freistehende Trabekel finden sich oft in der Nähe der Basis der RV-freien Wand und in der Nähe des Septums, können aber überall auftreten (rote Linien weisen auf häufige Stellen hin). (D) Vergrößerte Ansicht der Glassonde unter einem Trabekel (gelber Pfeil zeigt den Schnittpunkt von Trabekel und Sonde an). (E) Ein Trabekel (roter Pfeil) ist zwischen Kraftaufnehmer (links) und Motor (Mitte-rechts) am Versuchssystem montiert und wird von zwei Schrittmacherleitungen flankiert (horizontal über und unter dem Trabekel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Spuren und Ergebnisse . (A) Ein einzelner Herz-Trabekel wird mit einem Schwanenhals-LED-Licht in einem steilen Winkel (~75°) von der Achse der Mikroskoplinse beleuchtet, wodurch der Kontrast der Trabekel verstärkt wird. In diesem Beispiel werden zwei Bilder gekachelt, um die volle Länge des Trabekula zu zeigen. (B) Spannungszeit- (oben) und Dehnungszeitkurven (unten) für dieselbe Trabekula. Gezeigt werden ein isometrisches Zucken sowie drei Last-Klemm-Zuckungen bei steigenden systolischen Dehnungsraten am Ende. (C) Repräsentative MCR-Berechnung. MCR ist definiert als die Steigung der Geraden zwischen der Relaxationsrate und der Dehnrate. Wie in der Diskussion erwähnt, können die Dehnraten eingeschränkt werden, um eine quantitative, reproduzierbare MCR zu liefern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Die mechanische Relaxationskontrolle (MCR) quantifiziert die Abhängigkeit der myokardialen Relaxationsrate von der Dehnungsrate der Muskelrelaxation 8,9. Die Dehnungsrate und nicht die Nachlast ist sowohl notwendig als auch ausreichend, um die Relaxationsrate8 zu ändern. Da Interventionen zur Veränderung der Kalziumrate nicht nachweislich die kardiale Entspannung wesentlich verbessern, könnten mechanische Eingriffe neue Einblicke in den Mechanismus liefern und eine neue Behandlung der diastolischen Dysfunktion ermöglichen.
Das hier beschriebene Protokoll zur Modifikation der myokardialen Dehnungsrate verwendet eine isotonische Lastklemme 8,9. Eine Stärke der isotonischen Lastklemme ist die quantitative Kontrolle der Nachlastspannung. Windkessel-ähnliche Protokolle könnten verwendet werden, um weitere Veränderungen der Nachlast, der Vorlast und der Herzarbeit zu untersuchen 2,6,7. Eine Rampe, die nicht durch die Lastklemme gesteuert wird, könnte auch verwendet werden, um die Dehnungsänderung besser von der Dehnrate zu isolieren. Unabhängig davon scheint die Nachlast selbst kein starker Modifikator der Relaxationsrate8 zu sein.
Das Protokoll kann auch angepasst werden, um physiologischere Bedingungen für Temperatur und Stimulationsrate anzunähern. Die aktuellen Protokolldetails wurden verwendet, um das Vorhandensein des MCR zu zeigen. Die Durchführung von Experimenten unter physiologischen Bedingungen wird in Abhängigkeit von der experimentellen Fragestellung generell empfohlen. Experimente, die bei 37 °C oder mit hohen Stimulationsraten durchgeführt werden, können jedoch schneller zu einer Schädigung des Muskels führen. Möglicherweise ist eine Lösung mit verbesserter Sauerstofftransportkapazität erforderlich. Darüber hinaus muss die Datenerfassung in der Lage sein, die Länge und Kraft schnell genug abzutasten, um die schnellen Zuckungen aufzulösen und eine Rückkopplungskontrolle zu ermöglichen.
Das aktuelle Protokoll beschreibt weder die Messung von Kalzium noch die Messung und Kontrolle von Sarkomerlängen. Kalziummessungen wurden in anderen Protokollen11 behandelt, während die Sarkomerlängenmessung mit entsprechender Ausrüstung hinzugefügt werden kann. Die Sarkomerlängenkontrolle wird in aktuellen MCR-Studien nicht verwendet, da die Muskellänge der korrelierendste Parameter für den klinischen Zustand ist19. Eine weitere Sarkomerlängenkontrolle (im Vergleich zur Muskellängenkontrolle) würde spezifische Antworten auf kinetische Fragen liefern, wird aber aufgrund der Variation zwischen den Sarkomern und des minimalen Verständnisses der Sarkomerlängenänderungen in vivo wahrscheinlich nicht zum translationalen Wissen beitragen.
Drei experimentelle Überlegungen werden hier hervorgehoben, um die Reproduzierbarkeit der Daten zu erhöhen.
Erstens können freistehende Herztrabekel bei einigen Tieren schwer zu finden sein (unveröffentlichte Ergebnisse und Mitteilungen). Während zuckende Muskeln bei den meisten Ratten zu finden sind, liegt eine vernünftige Erfolgsquote bei der Gewinnung von Daten aus Trabekel bei Ratten bei eins zu drei. Der Trabekula-Erfolg könnte bei Brown Norway x Lewis F1-Ratten höher sein, die auch in der Vergangenheit verwendet wurden20 und von denen berichtet wurde, dass sie mehr Trabekel aufweisen (unveröffentlichte Mitteilungen). Bei Mäusen sind die Erfolgsraten wahrscheinlich niedriger, wobei weniger als eine von 10 für Mäuse mit BL/6-Hintergrund erwartet wird. Eine höhere Rate wird jedoch für Mäuse mit FVBN-Hintergrund (unveröffentlichte Mitteilungen und Beobachtungen) erwartet.
Zweitens kann eine Schädigung der Muskeln die Leistung verringern. Wenn die entwickelten Kräfte weniger als 10 mN mm-2 bei 25 °C und 0,5 Hz Stimulation betragen, müssen die Untersucher möglicherweise eine Fehlersuche durchführen, um festzustellen, ob eine unbeabsichtigte Dehnung oder ein Kontakt zwischen Metallpinzette und Muskel auftritt, ob die Lösungen nicht richtig vorbereitet sind oder ob die Stimulations- oder Versuchsgeräte ordnungsgemäß funktionieren. Andere Protokolle, die intakte Trabekel verwenden, haben die Verwendung von Luer-Lock-Spritzen als Transfergefäße vorgeschlagen11. Dies ist zwar möglich, insbesondere wenn der Benutzer eine sehr langsame Flussrate oder ein kleineres Muskelsegment steuert, aber das aktuelle Protokoll verwendet eine Transferpipette mit viel größerer Bohrung, um mögliche Schäden zu minimieren. Ein weiterer Schritt, bei dem ischämische Schäden auftreten können, ist die Dissektion. Die Aorta sollte innerhalb von 3 Minuten nach dem ersten abdominalen Schnitt (Ratte) oder der ersten Zervixluxation (Maus) kanüliert und mit Perfusionslösung gespült werden, ähnlich den in den Kardiomyozyten-Isolationsprotokollen aufgeführten Grenzwerten21,22. Dadurch wird die Zeit minimiert, in der das Herzgewebe nicht mit der kardioplegieähnlichen Perfusionslösung in Berührung kommt. Darüber hinaus erzeugen Präparationen, die länger als 30 Minuten dauern, in der Regel keine zuckenden Trabekeln. Daher sollten Bediener eine schnelle, aber sorgfältige Präparation üben, um Schäden zu minimieren. Bei einer Querschnittsfläche von mehr als 0,2 mm2 (2 x 10-7 m2) kann eine Kernischämie20 vorliegen.
Drittens sollte die Art und Weise berücksichtigt werden, wie Muskeln mit dem Motor und dem Kraftaufnehmer verbunden sind. Dieses Protokoll konzentriert sich derzeit auf Haken und freistehende Trabekeln. Die manchmal schnelle Dehnungsrate der Dehnung vor der Entspannung kann dazu führen, dass ein Muskel rutscht, wenn er nicht richtig befestigt ist, weshalb das aktuelle Protokoll keine "Körbe" verwendet, um die Trabekel zu halten23,24. Alternative Montagemethoden (Klebstoffe, Clips usw.25,26) können ebenfalls in Betracht gezogen und validiert werden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet Trabekel und nicht Papillarmuskeln. Die Sehnen des Papillarmuskels induzieren eine Serienelastizität, die Veränderungen des MCR9 hemmen kann. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die genaue Platzierung der Ansätze im Muskel die Messungen beeinflusst, da die Länge (und der Durchmesser) der Trabekel erheblich variieren.
Eine Einschränkung beim Durchstechen der Muskelenden mit Haken besteht darin, dass auch der Befestigungspunkt selbst beschädigt werden kann. Ein möglicher Riss des fixierten Muskelgewebes bei häufigen Kontraktionen (je nach Stärke) kann die Länge oder Serienelastizität verändern. Diese Tränenrate ist schwer zu kontrollieren. Ebenso können sich Schäden am Gewebe und am Haken beim Dehnen verschlimmern, was ebenfalls zu Problemen führen kann. Eine Sichtprüfung und die entwickelten Kraftwerte, die >80 % der äquilibrierten isometrischen Kraft verbleiben, sollten verwendet werden, um zu beurteilen, ob das Präparat beschädigt ist, und sollten ausgeschlossen werden.
Eine weitere Einschränkung oder Überlegung betrifft die experimentellen Fragen, die mit der Methode beantwortet werden können. Denken Sie zum Beispiel an die Verwendung von 2,3-Butandionmonoxim (BDM) in der Perfusionslösung. BDM ist eine Phosphatase, die die Funktion des Muskels verändern kann. Darüber hinaus bedeuten die lange Zeit der Entladung und die fehlende Stimulation, dass sich der latente Phosphorylierungszustand wahrscheinlich geändert hat. Daher ist Vorsicht geboten, wenn man versucht, die Muskelkontraktilität eines Tieres direkt zu beurteilen (im Vergleich zu Unterschieden zwischen Genotypen oder Behandlungen), da sich der kontraktile Zustand wahrscheinlich geändert hat. Der Einfluss der Phosphorylierung kann jedoch pharmakologisch durch Zugabe eines Agonisten oder Antagonisten des Signalwegs beurteilt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MCR Aufschluss darüber gibt, wie die Entspannung durch Muskelbewegungen (Dehnungsrate) reguliert wird. Die MCR kann dazu beitragen, einen besseren Einblick in die Diagnose und Überwachung diastolischer Erkrankungen zu erhalten, zusammen mit Zielen für pharmakologische Interventionen, wie z. B. der Modifikation der Myosinkinetik. Das hier beschriebene Protokoll und die Ratschläge legen das Wissen dar, das in mehrjährigen Studien entwickelt wurde, und sollten auf andere Systeme und Modelle von Herzerkrankungen anwendbar sein.
Disclosures
Nichts.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health (1R01HL151738) und der American Heart Association (18TPA34170169) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
| 23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
| 5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
| 95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
| Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Data acquisition software | SLControl | ||
| Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
| Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
| Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
| Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
| Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Imaging software | IrfanView | ||
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
| Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
| Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
| Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
| Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
| Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
| Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
| pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
| Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
| Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
| Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
| Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
| Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
| Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
| Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |
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