Summary
Настоящий протокол описывает методы оценки белков репарации повреждений ДНК в органоидах рака яичников пациента. Сюда включены комплексные методы нанесения покрытия и окрашивания, а также подробные и объективные процедуры количественной оценки.
Abstract
Иммунофлуоресценция является одним из наиболее широко используемых методов визуализации антигенов-мишеней с высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет точно идентифицировать и локализовать белки, гликаны и малые молекулы. Хотя этот метод хорошо зарекомендовал себя в двумерной (2D) культуре клеток, меньше известно о его использовании в трехмерных (3D) моделях клеток. Органоиды рака яичников представляют собой 3D-модели опухолей, которые повторяют клональную гетерогенность опухолевых клеток, микроокружение опухоли и взаимодействия между клетками и клеточным матриксом. Таким образом, они превосходят клеточные линии по оценке лекарственной чувствительности и функциональных биомаркеров. Таким образом, способность использовать иммунофлуоресценцию на органоидах первичного рака яичников чрезвычайно полезна для понимания биологии этого рака. В настоящем исследовании описывается метод иммунофлуоресценции для обнаружения белков репарации повреждений ДНК в высокодифференцированных серозных органоидах рака яичников (PDO). После воздействия ионизирующего излучения на ЗОП проводят иммунофлуоресценцию на интактных органоидах для оценки ядерных белков как очагов. Изображения собираются с помощью визуализации z-stack на конфокальной микроскопии и анализируются с помощью программного обеспечения для автоматического подсчета очагов. Описанные методы позволяют анализировать временную и специальную рекрутацию белков репарации повреждений ДНК и колокализацию этих белков с маркерами клеточного цикла.
Introduction
Рак яичников является основной причиной смерти от гинекологических злокачественных новообразований. Большинство пациентов лечатся препаратами, повреждающими ДНК, такими как карбоплатин, а пациентам с гомологичными опухолями, дефицитными рекомбинационной репарацией (HRR), можно назначать ингибиторы поли (АДФ-рибозы) полимеразы (PARP) 1,2. Однако у большинства пациентов развивается резистентность к этим методам лечения, и они умирают в течение 5 лет после постановки диагноза. Нарушение регуляции ответа на повреждение ДНК (DDR) было связано с развитием рака яичников и резистентностью как к химиотерапии, так и к ингибиторам PARP3. Таким образом, изучение РДР необходимо для понимания патофизиологии рака яичников, потенциальных биомаркеров и новых таргетных методов лечения.
Современные методы оценки DDR используют иммунофлуоресценцию (IF), поскольку она позволяет точно идентифицировать и локализовать белки, повреждающие ДНК, и аналоги нуклеотидов. Как только в ДНК происходит двухцепочечный разрыв (DSB), гистоновый белок H2AX быстро фосфорилируется, образуя очаг, в котором собираются белки репарации повреждений ДНК4. Это фосфорилирование можно легко идентифицировать с помощью IF; фактически, анализ ɣ-H2AX обычно используется для подтверждения индукции DSB 5,6,7,8,9. Повышенное повреждение ДНК было связано с чувствительностью платины и эффективностью повреждающих ДНК агентов 10,11,12, и ɣ-H2AX был предложен в качестве биомаркера, связанного с ответом на химиотерапию в других методах лечения рака 13. При DSB клетка, обладающая HRR, выполняет ряд событий, которые приводят к тому, что BRCA1 и BRCA2 рекрутируют RAD51 для замены репликационного белка A (RPA) и связывания с ДНК. Восстановление HRR использует шаблон ДНК для точного восстановления DSB. Однако, когда опухоли испытывают дефицит HRR, они полагаются на альтернативные пути репарации, такие как негомологичное соединение концов (NHEJ). Известно, что NHEJ подвержен ошибкам и создает высокую мутационную нагрузку на клетку, которая использует 53BP1 в качестве положительного регулятора14. Все эти белки, повреждающие ДНК, могут быть точно идентифицированы как очаги с помощью IF. В дополнение к окрашиванию белков, IF может быть использован для изучения защиты вилок и образования одноцепочечного разрыва ДНК. Способность иметь стабильные вилки коррелировала с ответом платины, и недавно анализы пробелов показали потенциал для прогнозирования ответа на ингибиторы PARP 6,15,16,17. Поэтому окрашивание на нуклеотидные аналоги после введения в геном является еще одним способом изучения ГДР.
На сегодняшний день оценка DDR при раке яичников была в значительной степени ограничена гомогенными 2D-клеточными линиями, которые не повторяют клональную гетерогенность, микроокружение или архитектуру опухолей in vivo 18,19. Недавние исследования показывают, что органоиды превосходят 2D-клеточные линии в изучении сложных биологических процессов, таких как механизмы DDR6. Настоящая методология оценивает RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA и геминин в PDO. Эти методы оценивают интактный органоид и позволяют изучать механизмы DDR в условиях, более похожих на микроокружение опухоли in vivo. Вместе с конфокальной микроскопией и автоматическим подсчетом очагов эта методология может помочь в понимании пути DDR при раке яичников и персонализации планов лечения для пациентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Опухолевая ткань и асцит были получены после получения согласия пациента в рамках биорепозитория гинекологической онкологии, который был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) Вашингтонского университета в Сент-Луисе. Пациенты были включены, если у них была поздняя стадия серозного рака яичников высокой степени злокачественности (HGSOC). Все процедуры проводились при комнатной температуре на стенде, если не указано иное. Все реагенты готовили при комнатной температуре (если не указано иное) и хранили при температуре 4 °C.
1. Генерация органоидов
- Сгенерируйте органоиды в соответствии с ранее опубликованным отчетом20.
2. Покрытие и облучение органоидов
- Используя органоиды в культуре, вытесните выступы органоидов из чашки для культивирования путем ручного манипулирования наконечником пипетки. Соберите органоиды в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугу конической пробирки при 1,650 x g в течение 5 мин при 4 °C. С помощью пипетки тщательно отспирируйте надосадочную жидкость.
- Добавьте в гранулу 1000 мкл рекомбинантного фермента, не содержащего животного происхождения (см. Таблицу материалов). Раствор перемешать и выдержать 15 мин при 37 °C.
- Центрифугируют раствор при 1,650 x g в течение 5 мин при 4 °C. С помощью пипетки тщательно отаспирируйте надосадочную жидкость.
- После центрифугирования и аспирации ресуспендируют гранулу в 1000 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора.
- Переложите 10 мкл раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и смешайте с 10 мкл трипанового синего.
- Возьмите 10 мкл раствора трипановых синих клеток в предметное стекло камеры подсчета клеток и вставьте его в счетную машину для клеток (см. Таблицу материалов).
- Поместите 40 000 клеток на 20 мкл экстракта базальной мембраны (BME) в 8-луночную стеклянную камеру (см. Таблицу материалов). Это поддерживает органоиды в течение 3-5 дней, чтобы клетки могли образовывать органоиды и расти до подходящего размера.
- Чтобы индуцировать разрывы двухцепочечной ДНК, облите покрытые органоиды 10 серыми (Гр) ɣ-облучением (см. Таблицу материалов для получения подробной информации об облучателе).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять до 5-10 минут. - Инкубируют органоиды в их питательных средах в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 в течение 4 часов.
3. Иммунофлуоресцентное окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы относятся к количеству на скважину 8-луночного горного стекла (~ 300 мкл).
- После облучения и инкубации органоидов аспирируйте среду пипеткой, аккуратно, чтобы не нарушить 3D-матрицу. Промойте 300 мкл PBS.
- Зафиксируйте органоиды в 300 мкл 2% параформальдегида (ПФА) в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЯ: Не оставляйте слишком долго, так как BME деполимеризуется и может быть отсасирован. - Органоиды промыть 300 мкл окрашивающего буфера (см. Таблицу материалов). Поставьте на шейкер на 5 минут.
- Для пермеабилизации аккуратно добавьте 300 мкл буфера для пермеабилизации (см. Таблицу материалов) и выдерживайте в течение 20 минут. Стирайте с 300 мкл окрашивающего буфера. Поставьте на шейкер на 5 минут.
- Добавьте 300 мкл окрашивающего буфера, чтобы заблокировать стадию пермеабилизации. Поставьте на шейкер на 30 минут. Отдохните от окрашивающего буфера с помощью пипетки.
- Добавьте 300 мкл первичных антител (кролик анти-RAD51, мышиный анти-Близнец, кролик анти-RPA, мышиный анти-ɣH2AX, кролик анти-Геминин, мышиный анти-53BP1; см . Таблицу материалов), разведенных в окрашивающем буфере. Инкубировать при 4 °C в течение 16 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте совместного окрашивания с одним и тем же животным-хозяином. Оставьте крышку закрытой, чтобы антитела не смешались с соседними лунками. - Удалите раствор первичных антител. Выполните три стирки с 300 мкл окрашивающего буфера в течение 5 минут каждая на шейкере.
- Добавляют 300 мкл вторичного антитела (козьего антимышиного Alexa fluor 488 и козьего антикроличьего Alexa fluor 647; см. Таблицу материалов) раствора, разведенного в окрашивающем буфере, и выдерживают в течение 1 ч в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие действия необходимо выполнять в темноте. - Аспирируйте вторичный раствор антитела. Добавьте 300 мкл разбавленного DAPI. Поставьте на шейкер на 5 минут.
- Выполните три стирки с 300 мкл окрашивающего буфера в течение 5 минут каждая на шейкере. Снимите буфер окрашивания и отсоедините камеры с помощью съемного комплекта, входящего в комплект направляющих камеры (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не продвигаетесь слишком далеко вперед, чтобы нарушить 3D-матрицу. - Используя наконечник пипетки p200 с отрезанным наконечником, добавьте монтажную среду (см. Таблицу материалов), чтобы покрыть каждую лунку органоидным язычком (например, 20-30 мкл для каждого органоидного язычка).
- Наложите покровное стекло на образец, избегая пузырьков.
- Возьмите прозрачный лак для ногтей и нанесите его на боковые стороны покровного стекла, чтобы запечатать предметное стекло. Дайте ему застыть в течение 1 часа и поставьте при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После визуализации предметное стекло может храниться не менее 6 месяцев с минимальной потерей флуоресценции.
4. Визуализация
- Получение изображений с помощью конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов) на 63-кратном объективе с иммерсионным маслом.
ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации ядерных белков 63x является преимуществом, но 40x также приемлем. - Используйте DAPI, чтобы найти органоиды через окуляр. Подбирайте подходящие фильтры для микроскопии в зависимости от используемых флуорофоров. Задайте параметры для захвата изображений z-stack.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуорофоры, использованные в исследовании, были DAPI, 488 и 647. Лазеры 405, 488 и 638 были включены для визуализации окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый z-стек зависит от разрешающей способности объектива. - Отрегулируйте живое изображение: установите фокус, интенсивность лазера и т. Д.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чем выше интенсивность лазера, тем больше вероятность того, что образец будет фотоотбеливаться. Поэтому выберите оптимальную интенсивность лазера. - Приобретите z-стек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять до 5-10 минут. - Из изображений, собранных в z-стеке, сделайте скриншот не менее трех изображений в стеке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы получили скриншоты по всему стеку, чтобы не дублировать ядра при количественном определении. - Сохраните каждый файл в формате TIFF и перейдите к анализу (шаг 5).
5. Анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте JCountPro для анализа всех изображений в соответствии с ранее опубликованным отчетом21. Чтобы получить это программное обеспечение, обратитесь к соответствующей публикации.
- На панели анализа объектов (вверху программы) на вкладке выбора файлов (внизу программы) выберите файлы TIFF .
- Нажмите кнопку Добавить , чтобы переместить выбранные файлы в выбранную группу файлов. Выберите Дисплей.
- На вкладке сегментации выберите синий цвет ядер. Выберите Автоматическая сегментация , чтобы оптимизировать порог ядер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если автоматическая сегментация не позволяет точно идентифицировать объекты, пользователь может настроить тонкую настройку и необработанную настройку изображения или обратиться к руководству пользователя для дальнейшей оптимизации сегментации. - На панели «Объекты» выберите « Автоматически разделять большие объекты» и оптимизировать размер ядер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ядра обычно имеют безусловный размер 5,000 пикселей, в то время как условный размер составляет 1,500 пикселей. Обратитесь к руководству пользователя для дальнейшей оптимизации размера объектов. - Выберите Идентификация объектов, чтобы проверить параметры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эти параметры неточны, размер и настройка могут быть скорректированы вместе с другими настройками. Инструкции по дальнейшей оптимизации см. в руководстве пользователя. - После настройки параметров изображения выберите «Идентифицировать объекты на всех изображениях», чтобы идентифицировать ядра на всех выбранных изображениях.
- Выберите панель «Анализ фокусов» (верхняя часть программы).
- На вкладке «Выбор файлов» (в нижней части программы) выберите файлы TIFF , которые использовались для анализа объектов, и нажмите кнопку со стрелками (>>), чтобы переместить изображения в группу файлов изображений.
- В группе каталогов под перемещенными файлами изображений дважды щелкните папку «Редактирование вручную » и выберите, чтобы переместить файлы ioc в группу файлов коллекции объектов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все выбранные файлы TIFF должны иметь совпадающие файлы ioc. - Нажмите кнопку Выбрать, чтобы переместить файлы в выбранную группу файлов. Выберите вкладку «Подсчет фокусов» в нижней части программы.
- Оптимизируйте параметры, выполнив следующие действия.
- Индекс настроек цилиндра: 12.
- Канал фокусировки: выберите цвет фокусов (зеленый: ɣ-H2AX; красный: RAD51).
- Настройки H-образного купола: высота купола %: 30; Порог %: 28 и 28.
- Настройка формы/размера: Минимальный размер фокуса, пикселей: 5. Выберите Применить форму/размер. Максимальный размер фокуса (условный): 32. Минимальная округлость, х100: 96. Максимальная фокусировка, пикселей: 60.
- Шумовой фильтр: размер 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы определяете, является ли ядро положительным для окрашивания геминином, во втором канале выберите зеленый цвет, а при анализе выберите интенсивность.
- Чтобы проверить набор параметров, выберите следующие кнопки по порядку: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эти параметры не работают, размер и настройка могут быть скорректированы вместе с другими настройками. Обратитесь к руководству пользователя, чтобы узнать больше о том, как можно дополнительно оптимизировать изображение. - После того, как параметры оптимизированы для выбранных изображений, выберите «Автоподсчет », чтобы подсчитать фокусы в каждом изображении на ядра. Если требуется второй канал, программа определит интенсивность, которую можно использовать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный протокол позволяет успешно окрашивать, визуализировать и количественно оценивать белки восстановления повреждений ядерной ДНК в органоидах. Этот метод использовался для окрашивания и оценки PDO как до, так и после облучения. PDO подвергались воздействию радиации 10 Гр и оценивались по следующим биомаркерам: ɣ-H2AX (рис. 1), маркер повреждения ДНК; RAD51 (рис. 2), маркер HRR; 53BP1 — маркер NHEJ; RPA, маркер репликационного стресса (рис. 3); и геминин, маркерклеточного цикла фазы G2 / S 14. Доза 10 Гр была выбрана на основе ранее опубликованных исследований, изучающих повреждение ДНК при раке яичников 6,22. Программное обеспечение JCountPro использовалось для идентификации ядра и количественной оценки количества очагов в ядре с проиллюстрированными параметрами13 (рис. 4). Программное обеспечение идентифицирует ядро (рис. 4A, B), затем ядерные очаги (рис. 4C) и фильтрует очаги от геминин-положительных клеток (рис. 4D).
Рисунок 1: Очаги ɣ-H2AX в ЗОП до и после облучения. Репрезентативные изображения очагов DAPI и ɣ-H2AX в PDO до и после облучения в 10 раз с 63-кратными вставками. Масштабные линейки: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Очаги RAD51 и геминин в ЗОП до и после облучения. Репрезентативные изображения DAPI, геминина, RAD51 и совместного окрашивания ЗОП очагов геминина / RAD51 до и после облучения в 10 раз с 63-кратными вставками. Масштабные линейки: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: RPA и 53BP1 в PDO до и после облучения. Репрезентативные изображения (A) DAPI, RPA; (B) геминин, 53BP1 и совместное окрашивание очагов геминина / 53BP1 в 10 раз с 63-кратными вставками. Масштабные линейки: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Рабочий процесс количественной оценки программного обеспечения JCountPro. (A) При анализе объектов выбирается синий канал для идентификации синих объектов, ядер, затем он автоматически оптимизируется путем выбора автоматической сегментации (красная стрелка). (B) При автоматическом разделении размер объекта (ядер) адаптируется к размеру изображения и увеличению. Кнопка «Идентифицировать объект» выбирается для проверки параметров (1), а кнопка «Идентифицировать объекты на всех изображениях» (красная стрелка) выбирается для идентификации объектов (ядер) для каждого изображения. (C) На вкладке анализа очагов вводятся изображения и задаются параметры подсчета очагов: сначала выбирается цвет очагов под каналом фокусировки, зеленый; индекс цилиндра установлен на 12; настройки купола H установлены на процент высоты купола 30 и пороговый процент 28; форма и размер фокусов оптимизированы под размер изображения с ручными параметрами максимального размера фокуса пикселей при 60 и минимальной округлости х 100 при 96; Наконец, применяется шумовой фильтр. Настройки проверяются путем применения цилиндра, H-образного купола и количества фокусов (1-3). Чтобы количественно оценить фокусы ɣ-H2AX на ячейку, нажмите старт (красная стрелка). (D) Для фокусов RAD51 применяются настройки, как показано на рисунке для фокусов ɣ-H2AX, за исключением канала фокусировки, который изменен на красный; Однако для идентификации ядер, окрашенных геминином, второй канал выбирается на зеленый, а анализ изменяется на интенсивность. Параметры проверяются путем применения цилиндра, H-купола и количества фокусов (1-3), а затем нажатия кнопки «Старт» (красная стрелка) для количественной оценки всех фокусов RAD51 и оценки интенсивности зеленого цвета на ячейку на каждом изображении. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Реакция на повреждение ДНК играет неотъемлемую роль как в развитии рака яичников, так и в резистентности к химиотерапии. Поэтому необходимо глубокое понимание механизмов репарации ДНК. Здесь представлена методология изучения белков репарации повреждений ДНК в 3D-интактных органоидах. Разрабатывается воспроизводимый, надежный протокол с использованием отличительных антител для оценки повреждения ДНК, гомологичной рекомбинации, негомологичного соединения концов и репликационного стресса. Важно отметить, что эти методы проверены с использованием генетически модифицированных средств контроля, демонстрирующих специфичность и чувствительность этих методов.
Наиболее важным шагом в этом протоколе является покрытие и фиксация органоидов. Этот протокол специально инкубирует органоиды в 2% PFA в течение 10 минут с тщательным мониторингом экстракта базальной мембраны (BME) во время процесса фиксации. Это отличается от других протоколов иммунофлуоресценции в органоидах, которые предполагают использование 4% PFA в течение 10-60 мин23,24,25. Было обнаружено, что если вкладки БМЭ находятся в концентрированном количестве ПФА слишком долго, вкладки деполимеризуются и подвержены аспирации. Следует отметить, что производители конкретных BME часто предлагают предложения относительно фиксации. Еще одним важным моментом обсуждения является покрытие органоидов. Процесс окрашивания может привести к потере части или всех органоидов. Следовательно, чем более сливающаяся вкладка в момент нанесения покрытия, тем выше вероятность того, что образец успешно выдержит этапы окрашивания.
Сильные стороны этого протокола включают валидацию окрашивания ядерных антител, возможность проведения иммунофлуоресценции и визуализации интактных 3D-органоидов, а также адаптивность протокола к любому лечению или молекуле, представляющей интерес.
Антитела, используемые в этих экспериментах, были строго проверены на специфичность с использованием генетически модифицированных клеток рака яичников. Эти методы были дополнительно проверены на чувствительность путем воздействия на ЗОП возрастающих доз радиации. Это привело к увеличению фокусов ɣ-H2AX, RAD51 и RPA в PDO с HRR-компетентностью. Наконец, объективные методы количественной оценки облегчают воспроизводимость этого анализа и позволяют избежать субъективной предвзятости ручной количественной оценки.
Традиционные методы исследования DDR заключаются в 2D-культивировании, известных как клеточные линии, но они не способны поддерживать генетическую гетерогенность исходной опухоли. Микроокружение опухоли имеет жизненно важное значение для онкогенеза и резистентности к химиотерапии при раке яичников 26,27,28, поэтому эти модели дают преимущество перед 2D-гомогенными клеточными культурами при изучении DDR. При изучении DDR необходимо контролировать клеточный цикл, чтобы избежать неправильной классификации неспособности выполнять определенные типы репарации ДНК, которые являются специфическими для клеточного цикла (т.е. HRR). Будущая работа сосредоточена на изучении конкретных типов повреждений ДНК, вызванных химиотерапией платиной, ингибиторами поли (АДФ-рибозы) полимеразы или гидроксимочевиной.
Наконец, этот протокол может быть адаптирован для изучения любого антигена, поддающегося поправке к традиционной иммунофлуоресценции, и может приспосабливаться к изучению новых лекарственных препаратов. Представленный протокол фокусируется на белках DDR, но с простой сменой антител этот протокол может быть модифицирован для изучения других белков, гликанов и малых молекул. Кроме того, поскольку органоиды представляют собой гетерогенные 3D-модели, культивируемые in vitro, возможно любое лечение органоидов, включая иммунотерапию, антиангиогенную терапию, метаболомную терапию и другие новые методы лечения, которые трудно оценить в гомогенных клеточных линиях 29,30,31.
Ограничения этого метода включают использование БМЭ с неоднородным составом и неспецифическим окрашиванием. Поскольку коммерческие БМЭ производятся из клеточных линий, состав каждой единицы может сильно различаться. Эти различия могут повлиять на фиксацию и окрашивание, а также на образование органоидов. Кроме того, в зависимости от образца может наблюдаться неспецифическое окрашивание БМЭ, которое может препятствовать интересующему белку. Тем не менее, ядерное окрашивание очень специфично и демонстрирует четкие ядерные очаги, которые могут быть легко количественно определены.
В заключение представлен подробный протокол оценки белков DDR в органоидах. Ожидается, что по мере развития технологий органоиды можно будет использовать для оценки восстановления повреждений ДНК живых клеток в этих 3D-моделях. Кроме того, в качестве наиболее эффективного метода культивирования органоиды будут установлены, и будут возможны более сложные анализы, такие как анализ ДНК-волокна и репликации32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы благодарны Павлу Лобачевскому, доктору философии, за руководство в создании этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить Медицинскую школу Вашингтонского университета на кафедре акушерства и гинекологии Сент-Луиса и отделение гинекологической онкологии, Стипендиальную программу декана Вашингтонского университета, Фонд группы гинекологической онкологии и Программу развития репродуктологов за поддержку этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
