Summary
Denne protokollen beskriver metoder for evaluering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider. Inkludert her er omfattende pletterings- og fargemetoder, samt detaljerte, objektive kvantifiseringsprosedyrer.
Abstract
Immunfluorescens er en av de mest brukte teknikkene for å visualisere målantigener med høy følsomhet og spesifisitet, noe som muliggjør nøyaktig identifisering og lokalisering av proteiner, glykaner og små molekyler. Mens denne teknikken er veletablert i todimensjonal (2D) cellekultur, er mindre kjent om bruken i tredimensjonale (3D) cellemodeller. Eggstokkreftorganoider er 3D-tumormodeller som rekapitulerer tumorcelle klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og cellecelle- og cellematriseinteraksjoner. Dermed er de overlegne cellelinjer for evaluering av legemiddelfølsomhet og funksjonelle biomarkører. Derfor er evnen til å utnytte immunfluorescens på primære eggstokkreftorganoider ekstremt gunstig for å forstå biologien til denne kreften. Den nåværende studien beskriver teknikken for immunfluorescens for å oppdage DNA-skadereparasjonsproteiner i høyverdige serøse pasientavledede eggstokkreftorganoider (PUD). Etter å ha utsatt PUDene for ioniserende stråling, utføres immunfluorescens på intakte organoider for å evaluere nukleære proteiner som foci. Bilder samles inn ved hjelp av z-stack-avbildning på konfokalmikroskopi og analyseres ved hjelp av automatisert programvare for focitelling. De beskrevne metodene tillater analyse av tidsmessig og spesiell rekruttering av DNA-skadereparasjonsproteiner og samlokalisering av disse proteinene med cellesyklusmarkører.
Introduction
Eggstokkreft er den viktigste dødsårsaken på grunn av gynekologisk malignitet. De fleste pasienter behandles med DNA-skadelige legemidler som karboplatin, og de med homolog rekombinasjonsreparasjon (HRR) -mangelfulle svulster kan gis poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) hemmere 1,2. Imidlertid utvikler de fleste pasienter motstand mot disse terapiene og dør innen 5 år etter diagnosen. Dysregulering av DNA-skaderesponsen (DDR) har vært assosiert med utvikling av eggstokkreft og både kjemoterapi og PARP-hemmerresistens3. Dermed er studiet av DDR viktig for å forstå patofysiologien til eggstokkreft, potensielle biomarkører og nye målrettede terapier.
Nåværende metoder for å evaluere DDR benytter immunfluorescens (IF), da dette muliggjør nøyaktig identifisering og lokalisering av DNA-skadeproteiner og nukleotidanaloger. Når det er en dobbeltstrenget pause (DSB) i DNA, blir histonproteinet H2AX raskt fosforylert, og danner et fokus der DNA-skadereparasjonsproteiner samles4. Denne fosforyleringen kan lett identifiseres ved hjelp av IF; faktisk har ɣ-H2AX-analysen ofte blitt brukt for å bekrefte induksjonen av en DSB 5,6,7,8,9. Økt DNA-skade har vært assosiert med platinafølsomhet og effekt av DNA-skadelige midler 10,11,12, og ɣ-H2AX har blitt foreslått som en biomarkør assosiert med kjemoterapirespons i andre kreftbehandlinger 13. På en DSB utfører en celle dyktig i HRR en rekke hendelser som fører til at BRCA1 og BRCA2 rekrutterer RAD51 for å erstatte replikasjonsprotein A (RPA) og binde seg til DNA. HRR-reparasjon bruker en DNA-mal for å reparere DSB trofast. Men når svulster er mangelfull i HRR, er de avhengige av alternative reparasjonsveier som ikke-homolog endekobling (NHEJ). NHEJ er kjent for å være utsatt for feil og skaper en høy mutasjonsbelastning på cellen, som bruker 53BP1 som en positiv regulator14. Disse DNA-skadeproteinene kan alle nøyaktig identifiseres som foci ved hjelp av IF. I tillegg til farging for proteiner, kan IF brukes til å studere gaffelbeskyttelse og enkeltstrenget DNA-gapdannelse. Evnen til å ha stabile gafler har vært korrelert med platinarespons, og nylig har gapanalyser vist potensialet til å forutsi responsen på PARP-hemmere 6,15,16,17. Derfor er farging for nukleotidanalogene etter innføring i genomet en annen måte å studere DDR på.
Hittil har evaluering av DDR i eggstokkreft i stor grad vært begrenset til homogene 2D-cellelinjer som ikke rekapitulerer den klonale heterogeniteten, mikromiljøet eller arkitekturen til in vivo-svulster 18,19. Nyere forskning tyder på at organoider er overlegne 2D-cellelinjer når de studerer komplekse biologiske prosesser som DDR-mekanismer6. Den nåværende metodikken evaluerer RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA og geminin i PUD. Disse metodene vurderer den intakte organoiden og tillater studier av DDR-mekanismer i en setting som ligner mer på in vivo-tumormikromiljøet. Sammen med konfokalmikroskopi og automatisert foci-telling, kan denne metoden hjelpe til med å forstå DDR-banen i eggstokkreft og tilpasse behandlingsplaner for pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorvev og ascites ble oppnådd etter å ha innhentet pasientens samtykke som en del av et gynekologisk onkologisk biorepositorium som ble godkjent av Washington University i St. Louis Institutional Review Board (IRB). Pasienter ble inkludert hvis de hadde avansert stadium høygradig serøs ovariekreft (HGSOC). Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur på benken med mindre annet er spesifisert. Alle reagenser ble tilberedt ved romtemperatur (med mindre annet er angitt) og oppbevart ved 4 °C.
1. Organoid generasjon
- Generer organoidene etter den tidligere publiserte rapporten20.
2. Plettering og bestråling av organoider
- Bruk organoider i kultur, løsne fanene til organoidene fra kulturskålen gjennom manuell manipulering av en pipettespiss. Samle organoider i et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger det koniske røret ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Bruk en pipette til å aspirere forsiktig av supernatanten.
- Tilsett 1000 μL av et animalsk opprinnelsesfritt, rekombinant enzym til pelleten (se materialtabellen). Bland oppløsningen og rug i 15 minutter ved 37 °C.
- Sentrifuger oppløsningen ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Bruk en pipette til å aspirere supernatanten forsiktig.
- Etter sentrifugering og aspirasjon, resuspender pelleten i 1000 μL fosfatbufret saltvann.
- Overfør 10 μL av oppløsningen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og bland med 10 μL trypanblått.
- Ta 10 μL av trypan blue cell-løsningen i et lysbilde for celletellekammer og sett det inn i celletellemaskinen (se Materialfortegnelse).
- Plate 40.000 celler per 20 μL kjellermembranekstrakt (BME) i et 8-brønns glasskammerlysbilde (se materialfortegnelse). Dette opprettholder organoidene i 3-5 dager for å tillate cellene å danne organoider og vokse til en passende størrelse.
- For å indusere dobbeltstrengede DNA-brudd, bestråle de belagte organoidene med 10 Gray (Gy) av ɣ-bestråling (se materialfortegnelse for bestrålerdetaljer).
MERK: Dette kan ta opptil 5-10 min. - Inkuber organoidene i deres kulturmedier i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 4 timer.
3. Farging av immunfluorescens
MERK: Volumer refererer til mengden per brønn i 8-brønns kammerlysbildet (~ 300 μL).
- Etter bestråling og inkubering av organoider, aspirer mediet med en pipette, forsiktig for ikke å forstyrre 3D-matrisen. Vask med 300 μL PBS.
- Fest organoidene i 300 μL 2% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter.
NOTATER: Ikke gå for lenge, da BME vil depolymerisere og kan aspireres av. - Vask organoidene med 300 μL fargebuffer (se materialfortegnelse). Legg på en shaker i 5 min.
- For permeabilisering, tilsett forsiktig 300 μL permeabiliseringsbuffer (se materialtabell) og inkuber i 20 minutter. Vask med 300 μL fargebuffer. Legg på en shaker i 5 min.
- Tilsett 300 μL fargebuffer for å blokkere permeabiliseringstrinnet. Legg på en shaker i 30 min. Aspirer av fargebufferen ved hjelp av en pipette.
- Tilsett 300 μL primære antistoffer (kanin anti-RAD51, mus anti-Geminin, kanin anti-RPA, mus anti-ɣH2AX, kanin anti-Geminin, mus anti-53BP1; se materialfortegnelse) fortynnet i fargebuffer. Inkuber ved 4 °C i 16 timer.
MERK: Unngå samtidig farging med samme vertsdyr. La lokket være av for å unngå at antistoffene blandes inn i nabobrønnene. - Fjern den primære antistoffoppløsningen. Utfør tre vasker med 300 μL fargebuffer i 5 min hver på shakeren.
- Tilsett 300 μL sekundært antistoff (geit anti-mus Alexa fluor 488 og geit anti-kanin Alexa fluor 647; se materialfortegnelse) løsning fortynnet i fargebuffer og inkuber i 1 time i mørket.
MERK: Alle påfølgende trinn må utføres i mørket. - Aspirer den sekundære antistoffoppløsningen. Tilsett 300 μL fortynnet DAPI. Legg på en shaker i 5 min.
- Utfør tre vasker med 300 μL fargebuffer i 5 min hver på shakeren. Fjern fargebufferen og løsne kamrene ved hjelp av fjerningssettet som følger med kammerlysbildene (se materialfortegnelse).
MERK: Pass på at du ikke skyver for langt fremover for å forstyrre 3D-matrisen. - Bruk en p200-pipettespiss med spissen avskåret, og tilsett monteringsmedium (se materialfortegnelse) for å dekke hver brønn med en organoidflik (f.eks. 20-30 μL for hver organoidflik).
- Plasser en dekkslip over prøven, unngå bobler.
- Ta klar neglelakk og mal den på sidene av dekselglasset for å forsegle lysbildet. La det herde i 1 time og sett det på -20 °C.
MERK: Etter avbildning kan lysbildet lagres i minst 6 måneder med minimalt tap av fluorescens.
4. Bildebehandling
- Ta bilder ved hjelp av et konfokalmikroskop (se materialtabell) ved 63x objektiv med nedsenkningsolje.
MERK: Hvis du avbilder nukleære proteiner, er 63x fordelaktig, men 40x er også akseptabelt. - Bruk DAPI til å lokalisere organoidene gjennom okularet. Velg passende filtre for mikroskopi basert på fluoroforene som brukes. Angi parametrene for å ta z-stack-bildene.
MERK: Fluoroforene som ble brukt i studien var DAPI, 488 og 647. 405, 488 og 638 lasere ble slått på for å visualisere fargingen.
MERK: Den anbefalte z-stakken avhenger av målets oppløsningsevne. - Juster live-bildet: still inn fokus, laserintensitet osv.
MERK: Jo høyere laserintensiteten er, desto mer sannsynlig er det at prøven vil fotobleke. Velg derfor en optimal laserintensitet. - Skaff deg z-stakken.
MERK: Dette kan ta opptil 5-10 min. - Fra bildene samlet i z-stacken, skjermbilde minst tre bilder per stabel.
MERK: Sørg for å få skjermbilder i hele stabelen for ikke å duplisere kjernene når du kvantifiserer. - Lagre hver fil som en TIFF og fortsett til analyse (trinn 5).
5. Analyse
MERK: Bruk JCountPro for all bildeanalyse etter den tidligere publiserte rapporten21. For å få tak i denne programvaren, referer du til den tilknyttede publikasjonen.
- Under objektanalysepanelet (øverst i programmet) i filvalgfanen (nederst i programmet) velger du TIFF-filene .
- Klikk Legg til for å flytte de valgte filene til den valgte filgruppen. Velg Skjerm.
- Under segmenteringsfanen velger du blå som fargen på kjernene. Velg Automatisk segmentering for å optimalisere terskelen til kjernene.
MERK: Hvis den automatiske segmenteringen ikke identifiserer objektene nøyaktig, kan brukeren justere finjusteringen og råjusteringen til bildet eller se brukerhåndboken for å optimalisere segmenteringen ytterligere. - Under objektpanelet velger du Del store objekter automatisk og optimaliser størrelsen på kjernene.
MERK: Kjernene har vanligvis en ubetinget størrelse på 5,000 piksler, mens den betingede størrelsen er 1,500 piksler. Se brukerhåndboken for å optimalisere størrelsen på objektene ytterligere. - Velg Identifiser objekter for å teste parameterne.
MERK: Hvis disse parametrene ikke er nøyaktige, kan størrelsen og innstillingen justeres sammen med andre innstillinger. Se brukerhåndboken for instruksjoner om videre optimalisering. - Når du har justert parameterne til bildet, velger du Identifiser objekter i alle bilder for å identifisere kjernene i alle bildene som er valgt.
- Velg Foci Analysis-panelet (øverst i programmet).
- Under kategorien velg filer (nederst i programmet) velger du TIFF-filene som ble brukt til objektanalyse og velger pilknappene (>>) for å flytte bildene til bildefilgruppen.
- I kataloggruppen under bildefilene som ble flyttet, dobbeltklikker du mappen Manuell redigering og velger å flytte ioc-filene til gruppen for objektsamlingsfiler.
MERK: Alle TIFF-er som velges, må ha samsvarende ioc-filer. - Trykk Velg for å flytte filene til den valgte filgruppen. Velg fanen Foci telling nederst i programmet.
- Optimaliser parametrene ved å følge trinnene nedenfor.
- Indeks for hatteinnstillinger: 12.
- Fokuskanal: Velg fargen på foci (grønn: ɣ-H2AX; rød: RAD51).
- H-kuppelinnstillinger: kuppelhøyde %: 30; Terskel%: 28 og 28.
- Innstilling for form/størrelse: Min fokusstørrelse, piksler: 5. Velg Bruk form/størrelse. Maks fokusstørrelse (betinget): 32. Min rundhet, x100: 96. Maks fokus, piksler: 60.
- Støyfilter: størrelse 1.
MERK: Hvis du bestemmer om en kjerne er positiv for gemininfarging, velger du grønt under den andre kanalen, og velg intensitet under analyse.
- For å teste parametersettet, velg knappene nedenfor i rekkefølge: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
MERK: Hvis disse parametrene ikke fungerer, kan størrelsen og innstillingen justeres sammen med andre innstillinger. Se brukerhåndboken for å lære mer om hvordan bildet kan optimaliseres ytterligere. - Når parametrene er optimalisert for de valgte bildene, velger du Automatisk telling for å telle foci i hvert bilde per kjerner. Hvis den andre kanalen er ønsket, vil programmet bestemme intensiteten som kan brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterte protokollen kan med hell flekke, visualisere og kvantifisere nukleære DNA-skadereparasjonsproteiner i organoider. Denne teknikken ble brukt til å beise og evaluere PUD både før og etter bestråling. PUD ble utsatt for 10 Gy stråling og evaluert for følgende biomarkører: ɣ-H2AX (figur 1), en markør for DNA-skade; RAD51 (figur 2), en markør for HRR; 53BP1, en markør for NHEJ; RPA, en markør for replikasjonsspenning (figur 3); og geminin, en G2/S fasecellesyklusmarkør14. Dosen på 10 Gy ble valgt basert på tidligere publisert forskning som studerte DNA-skade ved eggstokkreft 6,22. JCountPro-programvare ble brukt til å identifisere kjernen og kvantifisere antall foci i kjernen med illustrerte parametere13 (figur 4). Programvaren identifiserer kjernen (figur 4A, B), deretter nukleære foci (figur 4C), og filtrerer foci fra geminin-positive celler (figur 4D).
Figur 1: ɣ-H2AX foci i PUD før og etter bestråling. Representative bilder av DAPI og ɣ-H2AX foci i PUD før og etter bestråling ved 10x med 63x innsatser. Skala barer: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: RAD51 foci og geminin i PUD før og etter bestråling. Representative bilder av DAPI, geminin, RAD51 og co-farging av geminin / RAD51 foci PUD før og etter bestråling ved 10x med 63x innsatser. Skala barer: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: RPA og 53BP1 i PUD før og etter bestråling. Representative bilder av (A) DAPI, RPA; (B) geminin, 53BP1, og co-farging av geminin / 53BP1 foci ved 10x med 63x innsatser. Skala barer: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Arbeidsflyten for kvantifisering av JCountPro-programvaren. (A) Under objektanalysen velges den blå kanalen for å identifisere de blå objektene, kjernene, så optimaliseres den automatisk ved å velge automatisk segmentering (rød pil). (B) Under automatisk splitt tilpasses objektstørrelsen (kjernene) størrelsen på bildet og forstørrelsen. Identifiser objekt-knappen velges for å teste parameterne (1), og knappen identifiser objekter i alle bilder (rød pil) velges for å identifisere objekter (kjerner) for hvert bilde. (C) Under foci-analysefanen legges bildene inn og foci-tellingsparametrene er satt: først velges fargen på foci under fokuskanalen, grønn; topphattindeksen er satt til 12; H-kuppelinnstillingene er satt til å ha en kuppelhøydeprosent på 30 og en terskelprosent på 28; formen og størrelsen på foci er optimalisert til bildestørrelsen med de manuelle parametrene for maksimal fokusstørrelse piksler ved 60 og minimum rundhet x 100 ved 96; Til slutt påføres støyfilteret. Innstillingene testes ved å bruke flosshatt, H-kuppel og antall foci (1-3). For å kvantifisere ɣ-H2AX-foci per celle, trykk start (rød pil). (D) For RAD51-foci brukes innstillingene som illustrert for ɣ-H2AX foci, bortsett fra fokuskanalen som er endret til rød; For å identifisere kjerner som er farget med geminin, velges imidlertid den andre kanalen for grønn, og analysen endres til intensitet. Parametrene testes ved å bruke topphatt, H-kuppel og foci-antall (1-3), deretter trykke på start (rød pil) for å kvantifisere alle RAD51-foci og evaluere intensiteten av grønt per celle i hvert bilde. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-skaderesponsen spiller en integrert rolle i både utviklingen av eggstokkreft og kjemoterapiresistens. Derfor er en grundig forståelse av DNA-reparasjonsmekanismer avgjørende. Her presenteres en metodikk for å studere DNA-skadereparasjonsproteiner i 3D, intakte organoider. En reproduserbar, pålitelig protokoll er utviklet ved hjelp av kjennetegn antistoffer for å evaluere DNA-skade, homolog rekombinasjon, ikke-homolog slutt sammenføyning, og replikasjonsstress. Det er viktig at disse metodene valideres ved hjelp av genetisk modifiserte kontroller som demonstrerer spesifisiteten og følsomheten til disse metodene.
Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er plating og fiksering av organoider. Denne protokollen inkuberer spesifikt organoider i 2% PFA i 10 minutter med nøye overvåking av kjellermembranekstraktet (BME) under fikseringsprosessen. Dette skiller seg fra andre immunfluorescensprotokoller i organoider som foreslår å bruke 4% PFA i 10-60 min23,24,25. Det har blitt funnet at hvis fanene i BME er i en konsentrert mengde PFA for lenge, depolymeriserer fanene og er gjenstand for aspirasjon. Merk at produsenter av spesifikke BME-er ofte tilbyr forslag angående fiksering. Et annet viktig diskusjonspunkt er plating av organoider. Fargeprosessen kan resultere i å miste en del eller alle organoider. Derfor, jo mer sammenflytende fanen på tidspunktet for plating, desto større sannsynlighet vil prøven tåle trinnene for farging.
Styrken til denne protokollen inkluderer validering av kjernefysisk antistofffarging, evnen til å utføre immunfluorescens og avbildning av intakte 3D-organoider, og tilpasningsevnen til protokollen til enhver behandling eller molekyl av interesse.
Antistoffene som ble brukt i disse forsøkene ble strengt validert for spesifisitet ved bruk av genetisk modifiserte eggstokkreftceller. Metodene ble videre validert for sensitivitet ved å utsette PUD for økende stråledoser. Dette resulterte i økende ɣ-H2AX-, RAD51- og RPA-foci i HRR-dyktige PUD-er. Til slutt letter de objektive kvantifiseringsmetodene reproduserbarheten av denne analysen og unngår den subjektive skjevheten ved manuell kvantifisering.
Tradisjonelle metoder for å utforske DDR er gjennom 2D-dyrkingsforhold kjent som cellelinjer, men de har ikke evnen til å opprettholde den genetiske heterogeniteten til den opprinnelige svulsten. Tumormikromiljøet er viktig i tumorigenese og kjemoterapiresistens i eggstokkreft26,27,28, derfor gir disse modellene en fordel for 2D homogene cellekulturer når man studerer DDR. Når man studerer DDR, er det nødvendig å kontrollere for cellesyklus for å unngå feilklassifisering av manglende evne til å utføre bestemte typer DNA-reparasjon som er cellesyklusspesifikke (dvs. HRR). Fremtidig arbeid er fokusert på å studere spesifikke typer DNA-lesjoner forårsaket av platina kjemoterapi, poly (ADP-ribose) polymerasehemmere eller hydroksyurea.
Til slutt er denne protokollen tilpasningsdyktig for å studere ethvert antigen som kan endres til tradisjonell immunfluorescens og kan imøtekomme studiet av nye legemiddelbehandlinger. Protokollen som presenteres fokuserer på DDR-proteiner, men med en enkel endring av antistoffer kan denne protokollen modifiseres for å studere andre proteiner, glykaner og små molekyler. I tillegg, da organoidene er heterogene 3D-modeller dyrket in vitro, er enhver behandling av organoider mulig, inkludert immunterapi, antiangiogen terapi, metabolomisk terapi og andre nye terapier som er vanskelige å evaluere i homogene cellelinjer 29,30,31.
Begrensninger av denne metoden inkluderer bruk av en BME med inkonsekvent sammensetning og ikke-spesifikk farging. Som kommersielle BMEer produseres fra cellelinjer, kan sammensetningen av hver enhet variere enormt. Disse forskjellene kan påvirke fiksering og farging, samt organoid generering. I tillegg, avhengig av prøven, kan det være ikke-spesifikk farging av BME, noe som kan hindre proteinet av interesse. Ikke desto mindre er atomfargingen veldig spesifikk og demonstrerer klare kjernefysiske foci som lett kan kvantifiseres.
Avslutningsvis presenteres en detaljert protokoll for å evaluere DDR-proteiner i organoider. Etter hvert som teknologien utvikler seg, forventes det at organoider vil kunne brukes til å evaluere reparasjon av levende celle-DNA-skader i disse 3D-modellene. I tillegg, som den mest effektive metoden for dyrking, vil organoidene bli etablert, og mer sofistikerte analyser som DNA-fiber og replikasjonsgapanalyser vil være mulig32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for veiledningen fra Pavel Lobachevsky, PhD i etableringen av denne protokollen. Vi vil også gjerne anerkjenne Washington University's School of Medicine i St. Louis Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington Universitys Dean's Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
