Summary
APTrack er et software-plugin udviklet til Open Ephys-platformen, der muliggør datavisualisering i realtid og lukket elektrisk tærskelsporing af neuronale handlingspotentialer. Vi har med succes brugt dette i mikroneurografi til humane C-fiber nociceptorer og mus C-fiber og Aδ-fiber nociceptorer.
Abstract
Nociceptorer er en klasse af primære afferente neuroner, der signalerer potentielt skadelige skadelige stimuli. En stigning i nociceptor excitabilitet forekommer i akutte og kroniske smertetilstande. Dette producerer unormal løbende aktivitet eller reducerede aktiveringstærskler til skadelige stimuli. Identifikation af årsagen til denne øgede excitabilitet er nødvendig for udvikling og validering af mekanismebaserede behandlinger. Enkeltneuron elektrisk tærskelsporing kan kvantificere nociceptor excitabilitet. Derfor har vi udviklet en applikation til at tillade sådanne målinger og demonstrere dets anvendelse hos mennesker og gnavere. APTrack giver datavisualisering i realtid og identifikation af handlingspotentiale ved hjælp af et tidsmæssigt rasterplot. Algoritmer registrerer handlingspotentialer ved tærskelkrydsning og overvåger deres latenstid efter elektrisk stimulering. Pluginet modulerer derefter den elektriske stimuleringsamplitude ved hjælp af en op-ned-metode til at estimere nociceptorernes elektriske tærskel. Softwaren blev bygget på Open Ephys-systemet (V0.54) og kodet i C ++ ved hjælp af JUCE-rammen. Det kører på Windows-, Linux- og Mac-operativsystemer. Open source-koden er tilgængelig (https://github.com/
Introduction
Nociceptorer er primære afferente neuroner i det perifere nervesystem, der aktiveres af åbenlyse eller potentielt vævsskadelige hændelser og spiller en kritisk beskyttende rolle i akut smerte1. Elektrofysiologiske optagelser fra C-fiber og Aδ-fiber nociceptorer i dyremodeller, raske frivillige forsøgspersoner og patienter har afsløret sensibilisering og unormal spontan aktivitet i en bred vifte af smertetilstande 2,3,4,5,6,7. Forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for disse ændringer i nociceptorexcitabilitet hos patienter, kan muliggøre målrettede terapeutiske interventioner8. Der er dog få værktøjer til at vurdere nociceptorexcitabilitet direkte, især hos patienter9, men potentialet for nytten af sådanne værktøjer er velkendt10,11.
Helnerve elektrisk tærskelsporing kan bruges til at undersøge aksonal excitabilitet hos mennesker12. Da store, myelinerede, perifere neuroner imidlertid bidrager uforholdsmæssigt til amplituden af det sensoriske sammensatte handlingspotentiale, tillader helnerve elektrisk tærskelsporing ikke vurdering af C-fiberfunktion11,13. Faktisk viste helnerve elektrisk tærskelsporing i kroniske neuropatiske smertekohorter med diabetisk neuropati og kemoterapi-induceret polyneuropati ingen forskelle i aksonal excitabilitet11.
I en tidligere undersøgelse blev elektrisk tærskelsporing på enkeltneuronniveau brugt til at undersøge excitabiliteten af C-fibernociceptorer under drillede fiberoptagelser i et ex vivo rottehudnervepræparat14. Forfatterne viste, at en øget kaliumkoncentration, sure forhold og bradykinin alle øgede C-fiber nociceptor excitabilitet, som afspejlet ved en reduceret elektrisk tærskel for generering af handlingspotentiale. Desuden reducerede opvarmning af det modtagelige felt for de varmefølsomme nociceptorer deres elektriske tærskel, mens varmefølsomme nociceptorer udviste en stigning i deres elektriske tærskel14. Dette giver et vigtigt bevis på, at enkeltneuron elektrisk tærskelsporing er mulig og kan være til nytte, men der er i øjeblikket ingen software og / eller hardwareløsninger til rådighed for at muliggøre sådanne undersøgelser, især til menneskelige undersøgelser.
Hos mennesker er mikroneurografi den eneste tilgængelige metode til direkte vurdering af de elektrofysiologiske egenskaber af C-fibre15. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at påvise nociceptordysfunktion hos patienter med kroniske smerter 2,3,4,5,6,7. Mikroneurografi kan detektere enkeltneuronaktionspotentialer; På grund af de lave signal-støj-forhold bruger forskere imidlertid mærkningsteknikken til at karakterisere C-fiberaktivitet16. I mærkningsteknikken anvendes suprathreshold elektrisk stimulering på C-fibermodtagelige felter i huden. Denne elektriske stimulering genererer et handlingspotentiale, der forekommer ved en konstant latenstid, som bestemmes af C-fiberens ledningshastighed. C-fibre udviser aktivitetsafhængig opbremsning, hvorved deres ledningshastighed reduceres, og derfor øges deres ledningslatens i perioder med handlingspotentiel udledning17. Under basale forhold genererer C-fibre normalt ikke handlingspotentialer i fravær af skadelige stimuli, og derfor er deres ledningslatens som reaktion på lavfrekvent elektrisk stimulering konstant. Mekaniske, termiske eller farmakologiske stimuli, der fremkalder fyring, inducerer aktivitetsafhængig opbremsning, hvilket øger latenstiden for de handlingspotentialer, der fremkaldes af samtidig lavfrekvent elektrisk stimulering. Dette muliggør objektiv identifikation af reaktioner på de anvendte ikke-elektriske stimuli i forbindelse med et lavt signal-støj-forhold. Derfor kan aktivitetsafhængig opbremsning bruges til funktionelt at karakterisere C-fibre16. Faktisk udviser forskellige funktionelle klasser af C-fibre karakteristiske mønstre af aktivitetsafhængig opbremsning i elektriske stimuleringsparadigmer, der involverer varierende stimuleringsfrekvens18,19. Denne variation i latenstiden for C-fiberaktionspotentialer udgør en udfordring for algoritmer, der er designet til at overvåge dem.
Løbende aktivitet i en nociceptor fører til øget variabilitet i dens latenstid under lavfrekvent elektrisk stimulering, og dette skyldes igen aktivitetsafhængig opbremsning. Denne øgede variabilitet, eller jitter, er et kvantificerbart proxymål for excitabilitet2. Yderligere årsager til variabilitet i handlingspotentiel latenstid inkluderer flip-flop, hvor alternative terminale grene af en enkelt neuron stimuleres, hvilket får det fremkaldte handlingspotentiale til at have to (eller flere) baseline-latenstider, der gensidigt udelukker20. Endelig forårsager ændringer i temperaturen på en perifer neurons terminale grene også ændringer i handlingspotentiel latenstid på en termodynamisk måde, hvor opvarmning øger ledningshastigheden og afkøling bremser ledningshastigheden19. Således skal enhver software, der søger at udføre lukket elektrisk tærskelsporing af nociceptive C-fibre, tillade ændringer i latenstid i elektrisk fremkaldte handlingspotentialer.
For at nå vores mål om krydsartssporing af elektriske tærskelsporinger af C-fibernociceptorer udviklede vi APTrack, et open source-software-plugin til Open Ephys-platformen21, for at muliggøre realtids, lukket kredsløb, elektrisk tærskelsporing og latenssporing. Vi leverer proof-of-concept-data, der viser, at C-fiber nociceptor elektrisk tærskelsporing under human mikroneurografi er mulig. Desuden viser vi, at dette værktøj kan bruges i gnaver ex vivo teased-fiber elektrofysiologi, hvilket muliggør translationelle undersøgelser mellem mennesker og gnavere. Her vil vi i detaljer beskrive, hvordan forskere kan implementere og bruge dette værktøj til at hjælpe deres undersøgelse af nociceptorfunktion og excitabilitet.
Protocol
De humane mikroneurografiske eksperimenter blev godkendt af Det Biovidenskabelige Forskningsetiske Udvalg ved University of Bristol (referencenummer: 51882). Alle undersøgelsens deltagere gav skriftligt informeret samtykke. Dyreforsøgene blev udført på University of Bristol i overensstemmelse med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 efter godkendelse fra University of Bristol Animal Welfare og etisk review board og var omfattet af en projektlicens.
1. Installation af Open Ephys GUI og APTrack
- Se dokumentationen til softwaren for at finde den nyeste version af den grafiske brugergrænseflade Open Ephys (GUI), der understøttes (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme), og hent og installer derefter den grafiske brugergrænseflade.
- Installer en kompatibel version af GUI'en fra følgende URL-adresse: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
- Download den nyeste version fra GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. For en Windows-computer skal du kopiere .dll-filen til plugins-mappen, som normalt findes på C: \ Program Files \ Open Ephys \ plugins. For en MacOS-computer skal du kopiere .bundle-arkivet til mappen Contents/PlugIns i pakken.
2. Samling af optage- og stimuleringsapparatet
- Tilslut anskaffelseskortet til computeren ved hjælp af det kabel, der leveres af producenten, og tænd det.
BEMÆRK: Til human mikroneurografi blev en USB 3.0-isolator brugt til elektrisk isolering af deltageren fra computeren, og anskaffelseskortet blev drevet af et bærbart batteri i modsætning til strømforsyningen til netspænding, der blev brugt til gnaverundersøgelser. Alle USB-forbindelser, undtagen stepmotorens kontrolkort, blev ført gennem USB-isolatoren under de menneskelige undersøgelser. - Tilslut I/O-kortet til den analoge indgang på anskaffelseskortet. Tilslut en Intan RHD-optagelse headstage til anskaffelseskortet ved hjælp af et SPI-kabel (Serial-Peripheral Interface).
BEMÆRK: Intan 16-kanals bipolær headstage blev brugt her, men andre monopolære RHD2000-serie headstages kan bruges. - Tilslut PulsePal til computeren22. For montering med en analog spændingsstyret stimulator (f.eks. en DS4) ved hjælp af en PulsePal, som med musens drillede fiberoptagelser, skal du følge trin 2.5.1-2.5.3; For samling med en roterende enkoderbaseret stimulator (f.eks. en DS7) ved hjælp af en stepmotor, som med de humane mikroneurografiske optagelser, skal du følge trin 2.6.1-2.6.8 (figur 1).
- Opbyg signalkæden i GUI'en som beskrevet nedenfor.
- Indsæt Rhythm FPGA-pluginet i signalkæden ved at venstreklikke og trække det ind i signalkæden; dette forbinder GUI'en med anskaffelsestavlen. Sørg for, at der er klikket på ADC-knappen for at starte optagelsen af ADC-kanalerne fra I/O-kortet. ADC-knappen lyser orange, når den er tændt.
BEMÆRK: Hvis du ønsker at afspille tidligere optagede eksperimentelle data, kan File Reader-pluginet bruges i starten i stedet for Rhythm FPGA. Brug af dette i kombination med APTrack giver mulighed for visualisering og latenssporing af handlingspotentialerne i tidligere eksperimenter. - Indsæt et båndpasfilter i signalkæden; standardindstillingerne på 300-6,000 Hz er velegnede til både menneske- og museoptagelser. Derudover skal du indsætte en splitter efter den.
- Indsæt APTrack-pluginet i signalkæden på den ene side af splitteren og LFP Viewer på den anden side. LFP Viewer giver en traditionel oscilloskoplignende spændingssporingsvisning, hvilket er nyttigt under eksperimenter.
- Indsæt en postnode efter pluginet. I rullemenuen skal du ændre datalagringsformatet fra binært til Open Ephys. Dette fuldender en simpel signalkæde, der fungerer godt (figur 2); Imidlertid kan yderligere komponenter tilføjes som bestemt af eksperimentelle krav.
BEMÆRK: Hvis postnoden placeres før pluginet i signalkæden, gemmes sporingsoplysningerne om handlingspotentiale ikke. - Øverst til højre på GUI'en skal du klikke på afspilningsknappen for at begynde at overføre data fra anskaffelseskortet og visualisere det. For at starte optagelsen skal du klikke på den cirkulære optageknap ved siden af afspilningsknappen.
BEMÆRK: Det er let at glemme at klikke på optag; Vi registrerer data fra det øjeblik, vi begynder at erhverve for at forhindre, at dette sker.
- Indsæt Rhythm FPGA-pluginet i signalkæden ved at venstreklikke og trække det ind i signalkæden; dette forbinder GUI'en med anskaffelsestavlen. Sørg for, at der er klikket på ADC-knappen for at starte optagelsen af ADC-kanalerne fra I/O-kortet. ADC-knappen lyser orange, når den er tændt.
- For montering med en analog spændingsstyret stimulator skal du følge trinene som beskrevet nedenfor.
- Tænd for en konstant strømstimulator, der har sin stimuleringsamplitude styret af en analog spændingsindgang. En DS4 blev brugt i dette tilfælde (figur 1).
- PulsePal-udgangskanalen 1 er til den analoge spændingskommando. Opdel dette signal ved hjælp af en BNC T-splitter, og tilslut det derefter til konstantstrømsstimulatorindgangen og I / O-kortet, så kommandospændingen registreres.
- PulsePal-udgangskanal 2 er til TTL-hændelsesmarkøren for elektrisk stimulering. Tilslut dette til I / O-kortet, så stimulering TTL-hændelsesmarkørerne registreres for pluginet, der skal bruges, og til post-hoc-analysen.
- For montering med en analog spændingsstyret stimulator skal du følge trinene som beskrevet nedenfor.
- Tænd for en konstant strømstimulator, hvis stimuleringsamplitude styres af et roterende kodningshjul. En DS7 blev brugt i dette tilfælde (figur 1).
- Tilslut stepmotorens kontrolkort til stepmotoren ved hjælp af det af producenten leverede kabel og magnetiske holder.
- Tilslut kontrolkortet direkte til computeren ved hjælp af et hvilket som helst standard USB A til USB micro-B-kabel. Tilslut ikke kontrolkortet på deltagersiden af USB-isolatoren, da denne også er tilsluttet en 12 V strømforsyning.
- Hvis det er første gang, du bruger kontrolkortet, skal du uploade stepmotorscriptet fra GitHub til kontrolkortet; Dette skal kun gøres én gang, eller hvis der frigives softwareopdateringer til Stepper Motor-scriptet.
- Indstil stimuleringsamplitudevælgeren på konstantstrømstimulatoren til 0 mA. Brug et brugerdefineret monteringsbeslag til at forbinde stepmotoren og stimuleringsamplitudehjulet. Disse kan 3D-printes, hvilket muliggør billige, hurtige og tilpasselige monteringsløsninger. Kontakt GitHub for at se, om en holder allerede er designet til den valgte stimulator.
- Brug en brugerdefineret tøndeadapter til at forbinde stepmotorcylinderen til stimuleringsamplitudekontrolhjulet. Disse adaptere skal være konstrueret af metal af hensyn til styrke og holdbarhed; 3D-printede dele vil dog også være egnede, selvom de muligvis skal udskiftes regelmæssigt. Kontakt GitHub for at se, om en tøndeadapter allerede er designet til den valgte stimulator.
- Fastgør kontrolkortet / stepmotorapparatet løst til stimulatorens kontrolhjul ved hjælp af en brugerdefineret montering og tøndeadapter.
BEMÆRK: Holderen og tøndeadapteren strammes senere, når softwaren er startet, og stepmotoren indstilles automatisk til nulposition. - Tilslut PulsePal som beskrevet i protokoltrin 2.5.2-2.5.3 (minus tilslutning af udgangskanal 1 til en stimulator), da generering af TTL-hændelsesmarkører stadig er nødvendig til analyse og for at pluginet kan fungere. Tilslut desuden outputkanal 2 til DS7-stimulatoren for at udløse den.
- Forbered musens hud-nervepræparat som beskrevet nedenfor.
- Giv C57BL/6J-mus (Charles River Laboratories, UK, i denne undersøgelse) i alderen 2-4 måneder og af begge køn mad og vand ad libitum.
- Efter nedslagning ved bedøvelsesoverdosering gennem en intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital (≥200 mg / kg) og bekræftelse af ophør af cirkulation, dissekeres huden fra det dorsale aspekt af musens bagpote og saphenøs nerve, som inderverer dette område ved hjælp af metoderne beskrevet af Zimmermann et al.23.
- Hud-nervepræparatet i carbogeneret syntetisk interstitiel væske (tabel 1) opretholdes ved 30-32 °C i halvdelen af et specialfremstillet akrylbad med to kamre (15 ml/min perfusionshastighed, 30 ml volumen). Tråd nerven gennem et lille hul i det mineraloliefyldte kammer, og forsegl med vaselin. Olien giver et isoleret optagemiljø.
- Drill to fine filamenter væk fra nervestammen ved hjælp af superfine tang og hæng en på hver side af en bipolær sølv / sølvchlorid optageelektrode.
- Digitaliser og forstærk det neurale signal ved hjælp af et RHD2216 16-kanals bipolært headstage, og behandl det ved hjælp af anskaffelseskortet. Prøve signalet ved 30 kHz med et båndpasfilter på 300-6.000 Hz, og visualiser det ved hjælp af GUI.
- Brug en stump glasstang til at stryge præparatets hud. Brug masseaktiviteten med lav amplitude til at bekræfte, at præparatet er i live.
- Udfør human C-fiber mikroneurografi som beskrevet nedenfor.
- Udføre mikroneurografi med deltagere, der har givet skriftligt informeret samtykke, som tidligere beskrevet24.
- Med deltageren siddende tilbagelænet komfortabelt på en seng og støttet med puder, identificer den overfladiske peroneale nerve ved hjælp af en ultralydsscanner og markér et målområde ca. 5-10 cm proksimalt til lateral malleolus, omkring midten af skinnebensniveauet.
- Steriliser huden omkring målområdet med en 2% chlorhexidin i 70% alkoholserviet, og indsæt en steril referenceelektrode subkutant nær det tilsigtede registreringssted på midten af skinnebensniveauet.
- Indsæt en steril optageelektrode i den overfladiske peronealnerve under ultralydsvejledning inden for målområdet.
- Digitaliser og forstærk det neurale signal ved hjælp af et RHD2216 16-kanals bipolært headstage, og behandl det ved hjælp af anskaffelseskortet. Prøve signalet ved 30 kHz med et båndpasfilter på 300-6.000 Hz, og visualiser det ved hjælp af GUI.
BEMÆRK: Anskaffelsesudstyret blev elektrisk isoleret fra den bærbare computer med en USB 3.0-isolator med 5 kV RMS-isolering og drevet via en specialfremstillet 12 V batteristrømforsyning. - Bekræft vellykket intraneural positionering ved forsigtigt at stryge huden for at afsløre mekanisk fremkaldt masseaktivitet. Derudover rapporterer deltagerne normalt paræstesi i det dorsolaterale aspekt af foden efter vellykket intraneural positionering.
3. Software opsætning og identifikation og fænotypning af perifere neuroner
- Konfigurer softwaren som beskrevet nedenfor.
- Åbn GUI'en (figur 3). Hvis stepmotorens kontrolkort er tilsluttet din pc, registreres det og indstiller sig til position nul. Stram den brugerdefinerede holder og tøndeadapter, der er beskrevet i trin 2.6.5-2.6.7, da stimulatorens stimuleringsamplitudehjul og stepmotor begge er indstillet til nul.
BEMÆRK: Hvis stepmotoren og stimuleringsamplitudehjulet ikke begge er "nulstillet", kan dette resultere i, at stepmotoren forsøger at dreje kontrolhjulet ud af sit område, hvilket kan forårsage skade. - I indstillingsmenuen skal du vælge udløserkanalen. Vælg ADC-kanalen , der indeholder TTL-markøren for elektrisk stimulering, fra PulsePal-udgangskanalen 2.
- Vælg datakanalen i indstillingsmenuen, og vælg den kanal, der indeholder de elektrofysiologiske data.
- I stimuleringskontrolpanelet skal du definere de indledende, minimale og maksimale stimuleringsamplituder ved hjælp af skyderen. Sørg for, at den aktuelle stimulering er indstillet over 0, så TTL-markører genereres.
BEMÆRK: Nogle stimulatorer har et input-til-output-skaleringsforhold, der ikke er 1: 1; Overvej dette, når du vælger en passende stimuleringsamplitude. For eksempel kan der vælges et udgangsforhold på 1:10 på nogle stimuleringssystemer for at opnå et højere output fra konstantstrømstimulatoren. - I stimuleringskontrolpanelet skal du klikke på F for at indlæse en fil, der indeholder stimuleringsinstruktionerne. Elektriske stimuleringsprotokoller gemmes som kommaseparerede filer (CSV), der er sammensat af de ønskede stimuleringsfrekvenser og varighed, hvilket giver brugerne mulighed for at oprette komplekse stimuleringsparadigmer til deres eksperimenter. Et eksempel på en skabelon er tilgængelig her: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
- I stimuleringskontrolpanelet skal du klikke på > for at starte det indlæste stimuleringsparadigme. Som standard anmoder APTrack PulsePal om at generere positive kvadratbølgeimpulser med 0,5 ms varighed med varierende amplituder for at kontrollere konstantstrømstimulatorens stimuleringsamplitude.
- Det temporale rasterplot begynder at opdatere med responsen på elektrisk stimulering, hvor hvert nyt stimuleringsrespons vises som en ny kolonne til højre.
- Åbn GUI'en (figur 3). Hvis stepmotorens kontrolkort er tilsluttet din pc, registreres det og indstiller sig til position nul. Stram den brugerdefinerede holder og tøndeadapter, der er beskrevet i trin 2.6.5-2.6.7, da stimulatorens stimuleringsamplitudehjul og stepmotor begge er indstillet til nul.
- Visualiser og identificer enkeltneuronaktionspotentialer.
- For en vellykket påvisning af enkeltneuronaktionspotentialer er det vigtigt at have passende billedtærskler indstillet. I panelet for temporale rasterafbildninger skal du justere tærskelværdierne for lav, registrering og høj billedværdi.
- Vælg et farveskema i indstillingsmenuen. I WHOT (White Hot)-tilstand (standard) er spændinger under den lave billedtærskel kodet i sort. Spændinger mellem de lave billed- og registreringstærskler er kodet i gråtoner. Spændinger over detektionstærsklen er kodet med grønt, og spændinger over den høje billedtærskel er kodet med rødt.
- Perifere neuroner udviser konstante latensresponser ved lave stimuleringsfrekvenser (<0,25 Hz), og disse reaktioner bestemmes af deres ledningshastighed og afstanden mellem stimulerings- og optagelsesstederne. Når passende billedtærskler er indstillet, kodes tærskelkrydsningshændelserne, der registreres af algoritmerne, med grønt (figur 4).
- Bevæg systematisk den stimulerende elektrode rundt i hudområdet innerveret af nerven, der registreres, hvilket giver mulighed for mindst tre stimuleringshændelser på hvert sted. Overvåg det tidsmæssige rasterplot for tærskelkrydsningshændelser (markeret med grønt), der forekommer på samme tidspunkt efter hver elektrisk stimuleringshændelse.
BEMÆRK: Hos mus blev der anvendt en søgestimulus på 5 mA. Hos mennesker blev amplituden af den transkutane elektriske søgestimulus titreret til en verbal smertevurdering, således at den aldrig oversteg 7/10. - Kontroller, om der er tre tærskelkrydsningshændelser (grønne bjælker), der vises i træk med samme latenstid og i samme stimuleringsposition; Dette indikerer identifikation af et perifert neuronaktionspotentiale.
- Optimer den stimulerende elektrodeposition ved at identificere det mest elektrisk følsomme punkt i målneuronens modtagelige felt, og fastgør derefter elektroden i position. På dette tidspunkt i human mikroneurografi skal du skifte til at bruge intradermale elektroakupunkturnåle (0,2 mm diameter) til bipolar elektrisk stimulering, hos mus anvendes en brugerdefineret transkutan stimulerende sonde, så stimuleringspositionen er konstant.
- For en vellykket påvisning af enkeltneuronaktionspotentialer er det vigtigt at have passende billedtærskler indstillet. I panelet for temporale rasterafbildninger skal du justere tærskelværdierne for lav, registrering og høj billedværdi.
- Udfør klassificering og sensorisk fænotypning af de perifere neuroner.
- Anslå den elektriske tærskel for målhandlingspotentialet ved at justere simuleringsamplituden manuelt eller ved hjælp af APTrack, hvis det ønskes (beskrevet i trin 4.1-4.2).
- Stimuler det modtagelige felt ved 2x den estimerede elektriske tærskel ved en frekvens på 0,25 Hz gennem hele den sensoriske fænotypeprotokol.
- Beregn neuronens ledningshastighed ved at dividere ledningsafstanden med ledningsforsinkelsen. C-fibre kan identificeres ved en ledningshastighed på ≤2 m / s.
- Mekanisk stimulere det modtagelige felt ved hjælp af von Frey-filamenter til bestemmelse af den mekaniske tærskel for aktivering. Mekanosensation kan identificeres ved fremkaldte handlingspotentialer, der er synlige på spændingssporet og en stigning i neuronens latenstid, hvis det er en C-fiber, ved tilstrækkelig kraft.
- Opvarm neuronens modtagelige felt, og se igen efter handlingspotentialer, der er synlige på spændingssporet og en stigning i neuronens latenstid, hvis det er en C-fiber, ved tilstrækkelig varmepåføring. Varmefølsomme neuroner vil udvise et fald i latenstid på grund af den termodynamiske effekt på aksonal udbredelse.
BEMÆRK: I human mikroneurografi skal du bruge en TSC-II til hurtig og nøjagtig termisk kontrol. I musepræparatet tilsættes opvarmet eller afkølet syntetisk interstitiel væske til et aluminiumisoleringskammer placeret over det modtagelige felt for at give adgang til neuronterminalerne, samtidig med at hurtig varmeafledning i den omgivende væske begrænses. Optag temperaturen ved hjælp af et termoelement. - Afkøl det modtagelige felt, og se igen efter handlingspotentialer, der er synlige på spændingssporet og en markant stigning i neuronens latenstid, hvis det er en C-fiber, ved tilstrækkelig kold påføring. Alle neuroner vil udvise en stigning i latenstid på grund af den termodynamiske effekt på aksonal udbredelse, så vær forsigtig med at mærke neuroner som koldfølsomme baseret på en latensforøgelse alene.
4. Latenstid og elektrisk tærskelsporing
- Udfør sporing af ventetid som beskrevet nedenfor.
- Efter identifikation af enkeltneuronaktionspotentiale(r) på det temporale rasterplot skal du flytte den grå lineære skyder i højre side af det tidsmæssige rasterplot for at justere søgefeltets position.
- Under det tidsmæssige rasterplot skal du justere drejeskyderen for søgefeltets bredde til en passende bredde. Gør søgefeltets bredde snæver for at reducere risikoen for, at forbigående støjspidser, spontant udløsende handlingspotentialer eller andre nærliggende handlingspotentialer med konstant ventetid fejlagtigt identificeres som handlingspotentialet af interesse.
- For at begynde at spore det målrettede handlingspotentiale skal du klikke på + under sporingstabellen for flere enheder. En ny række føjes til tabellen, der indeholder detaljer om målhandlingspotentialet, herunder latensplaceringen, procentdelen af affyring over 2-10 stimuli (justeret i indstillingsmenuen) og den detekterede topamplitude.
- Når et handlingspotentiale er føjet til sporingstabellen med flere enheder, udføres latenssporingsalgoritmen (figur 5) automatisk på den ved hver efterfølgende elektrisk stimulering.
- Hvis der er flere diskrete handlingspotentialer synlige på det tidsmæssige rasterplot, skal du føje dem til sporingstabellen med flere enheder som beskrevet ovenfor. Det teoretiske maksimale antal handlingspotentialer, der kan føjes til tabellen for samtidig latenssporing, er den maksimale 32 bit heltalsværdi.
- Markér afkrydsningsfeltet Spor spids i sporingstabellen for flere enheder for at flytte søgefeltet til den relevante position for det pågældende handlingspotentiale som bestemt af algoritmen til sporing af ventetid. Dette giver mulighed for at overvåge latenssporing i realtid og sikre, at sporingen følger handlingspotentialet som forventet. Latenssporing af andre spidser fortsætter som normalt i baggrunden.
- Fjern sporede handlingspotentialer fra sporingstabellen med flere enheder ved hjælp af knappen Slet i slutningen af hver række.
- Udfør elektrisk tærskelsporing som beskrevet nedenfor.
- Juster tilvækst- og reduktionshastighederne i stimuleringskontrolpanelet mellem 0,1 V og 0,5 V. Hold disse værdier ens, og juster dem ikke under eksperimentet, medmindre dette er en del af det eksperimentelle paradigme.
- Sørg for, at stimuleringsfrekvensen er indstillet til en passende hastighed, typisk 0,25-0,5 Hz, medmindre modulering af stimuleringsfrekvens er en del af det eksperimentelle paradigme. Stigende nociceptor fyringshastigheder kan ændre den elektriske tærskel for nociceptor.
- Når et handlingspotentiale spores, skal du markere afkrydsningsfeltet Sportærskel i sporingstabellen for flere enheder, som starter algoritmen til sporing af elektrisk tærskel (figur 6).
BEMÆRK: Elektrisk tærskelsporing køres kun på det målrettede handlingspotentiale; Faktisk vil affyringshastighederne for andre handlingspotentialer i sporingstabellen med flere enheder blive opdateret i overensstemmelse hermed, efterhånden som stimuleringsamplituden ændres. - Juster stimuleringsamplituden manuelt til estimatet af den elektriske tærskel; Dette reducerer ventetiden for at bestemme den elektriske tærskel. Den tid, det tager at etablere en pålidelig elektrisk tærskel, afhænger af stimuleringsfrekvensen, tilvækst- og dekrementhastighederne og forskellen i stimuleringsamplitude fra den indledende stimulering til neuronens elektriske tærskel.
- Softwaren bruger en op-ned metode til estimering af den elektriske tærskel af neuronerne. I sporingstabellen med flere enheder bestemmes affyringshastigheden over 2-10 tidligere stimuleringer (valgt i indstillingsmenuen). Vælg antallet af stimuleringshændelser, der skal overvejes; Et højere tal vil øge pålideligheden af tærskelestimatet, men vil tage længere tid at nå.
- Under human mikroneurografi er det vigtigt at overvåge smertefuldheden af elektriske stimuli for at forhindre overdreven ubehag hos deltagerne; noget ubehag er uundgåeligt under undersøgelsen af nociceptorer, især af tavse / sovende C-fibre. Bed regelmæssigt om smertevurderinger, mens stimuleringsamplituden øges under den elektriske tærskelsporing, og bliv i nærheden af konstantstrømstimulatoren for at frakoble den efter deltagerens anmodning.
BEMÆRK: Alternativt kan den elektriske stimulering frakobles via brugergrænsefladen ved at klikke på knappen [ ] i stimuleringskontrolpanelet. - En fyringshastighed på 50% angiver, at den omtrentlige elektriske tærskel er bestemt.
- Mens elektrisk tærskelsporing skal du anvende en eksperimentel manipulation på det modtagelige felt, såsom temperatur- eller lægemiddelmanipulationer. Virkningerne af disse manipulationer på nociceptorens elektriske tærskel spores.
BEMÆRK: Giv tilstrækkelig tid til at identificere en ny nociceptortærskel efter den eksperimentelle manipulation.
Representative Results
Et repræsentativt eksempel på software, der arbejder for at styre et eksperiment, er vist i figur 7. Det justerer iterativt stimuleringsamplituden ved hjælp af en op-ned-metode til effektivt at finde den elektriske tærskel for enkelte nociceptorer. For første gang demonstrerer vi gennemførligheden af realtids enkeltneuron elektrisk tærskelsporing hos mennesker under mikroneurografi (figur 7A). Derudover viser vi elektrisk tærskelsporing i en mus Aδ-fiber (figur 7B). Identifikationen af aktionspotentialer ved tærskeloverskæring, som anvendt her, er tilstrækkelig til at spore elektriske tærskler over tid. Vi anbefaler, at brugerne tager skridt til at minimere elektrisk støj under deres optagelser, f.eks. ved at bruge et Faraday-bur og båndpasfiltre for at forbedre signal-støj-forholdet.
For at demonstrere, at elektrisk tærskelsporing kan bruges som et mål for ændringer i nociceptorexcitabilitet hos mennesker, blev der udført sporing af den elektriske tærskel under et trinvist opvarmningsparadigme (figur 8). Forøgelse af nociceptorterminalernes temperatur reducerede den elektriske stimuleringsstrøm, der kræves for at fremkalde et handlingspotentiale, hvilket afspejler en stigning i nociceptorexcitabilitet (figur 8C). Dette var sandsynligvis forårsaget af generering af receptorpotentialer af de varmefølsomme ionkanaler udtrykt i C-fiber nociceptor14. Ved det højeste temperaturtrin, 44 °C, fremkaldte termisk fremkaldte aktionspotentialer (figur 8A, stimulusnummer 86-96). Dette medfører en stigning i den elektriske tærskel, da nociceptoren kan være i ildfast tilstand efter højfrekvent udladning. Som forventet faldt latenstiden for det sporede aktionspotentiale, efterhånden som temperaturen steg. Dette menes at ske på grund af en termodynamisk effekt på ledningsmaskineriet, hvilket øger ledningshastigheden af C-fiberen. Denne C-fiber kan også udvise flip-flop (figur 8B, stimulusnummer 47-54), hvilket kan resultere i, at følgende elektriske stimulering fejlagtigt øges i amplitude, hvis handlingspotentialet falder uden for algoritmens søgevindue.
Figur 1: Et skema over udstyrsopsætning og kabelforbindelser, der kræves til nociceptor elektrisk tærskelsporing med APTrack hos gnavere og mennesker. Bemærk de to forskellige metoder til stimuleringsamplitudekontrol: en stepmotor til manuelt justerede stimulatorer i vores menneskelige opsætning og en PulsePal til indgangsspændingsstyrede stimulatorer i vores gnaveropsætning. (1) En pc (Windows, Mac eller Linux), der kører pluginet til Open Ephys-platformen. (2) En stepmotor, der betjener stimuleringsamplitudehjulet på DS7. (3) En konstantstrømsstimulator, der er godkendt til brug hos mennesker; her brugte vi en DS7. (4) En USB 3.0-optoisolator, som isolerer den menneskelige deltager fra pc'en (valgfrit, kræves kun til forskning på mennesker). (5) En PulsePal V2-pulsgenerator, der genererer TTL-tidsstempler (udgangskanal 2) og spændingstrin svarende til den ønskede stimuleringsamplitude (udgangskanal 1). 6) En konstantstrømstimulator til brug hos dyr; her brugte vi en DS4. (7) En jævnstrømsforsyning til systemet (jævnstrømsstrømforsyning, der bruges til gnaveropsætningen, og batteri-jævnstrømsforsyning, der bruges til den menneskelige opsætning). (8) Et opkøbsråd. (9) Et I/O-kort til tilslutning af BNC-koaksialkabler, der bærer de signaler, der skal registreres, såsom termoelementudgange og TTL-markører. (10) Hud-nervepræparatet med mus, der gennemgår nociceptorelektrofysiologiske registreringer. (11) En menneskelig deltager, der gennemgår mikroneurografi optagelse fra C-fibre i den overfladiske peroneale nerve. (12) Et Intan RHD2216-hovedscene til erhvervelse og digitalisering af optagelserne. (13) Et Intan-elektrodeadapterkort, som optageelektroderne er tilsluttet, og som gør det muligt at sende signalet til RHD2216-hovedkvarteret. (14) Et termisk stimuleringssystem, der kan udsende temperaturen via en BNC-koaksialforbindelse. (15) En 3,3 V batteridrevet knap/fodpedal, der bruges til at markere mekaniske stimuleringshændelser og lægemiddelapplikationer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skabelon signalkæde. Den røde pil peger på knappen til aktivering af ADC-input fra I/O-kortet. Den gule pil angiver rullemenuen til valg af Open Ephys-filformatet. Den grønne pil angiver knapperne Afspil og Optag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Grafisk brugergrænseflade. GUI'en består af fire hovedkomponenter. (1) Panelet Temporal Raster Plot (grønt) til datavisualisering og de indstillinger, der er knyttet til styring af plottet. Et konstant latensrespons, der viser gradvis aktivitetsafhængig opbremsning, er angivet med den grønne pil. (2) Stimuleringskontrolpanel (gult) til indstilling af stimuleringsamplitudeparametre og indlæsning af stimuleringsparadigmeskripter. (3) Multi-Unit Tracking Table (blå) til tilføjelse af aktionspotentialer til sporing og aktivering af latenstid og elektrisk tærskelsporing. (4) Indstillinger Menu til valg af farveformater og inputkanal for data og TTL-udløsere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Facilitering af identifikation af konstante latenshandlingspotentialer gennem datavisualisering i realtid på et tidsmæssigt rasterplot ved hjælp af APTrack. Dette er et eksempel på et højt signal-støj-forhold. De data, der præsenteres i det tidlige rasterplot, er fra en human C-fiberoptagelse fra den overfladiske peroneale nerve under mikroneurografi. Voltage Trace er det oscilloskoplignende LFP Viewer-plugin i Open Ephys. APTrack-brugergrænsefladen er pluginets grafiske brugergrænseflade. Det sporede handlingspotentiale er angivet med grønne pile, og den cirkulære skyder på grænsen til det tidsmæssige rasterplot er til styring af søgefeltets position, hvor algoritmerne vil søge efter tærskelkrydsningshændelser. Den elektriske stimuleringsartefakt er markeret med blåt på spændingssporet. Stimuleringsamplituden for den analoge spændingskommando er angivet med rødt; Bemærk, at dette muligvis ikke er det samme som stimuleringsstrømamplituden afhængigt af skaleringsfaktoren indstillet på stimulatoren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Grafisk repræsentation af latenssporingsalgoritmen. Enkelt sagt, hvis et handlingspotentiale registreres ved tærskeloverskæring, justerer søgefeltet sin position til at centrere sig selv på tidspunktet for spidsspændingen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Grafisk repræsentation af algoritmen til sporing af elektrisk tærskel. Enkelt sagt, hvis et handlingspotentiale detekteres ved tærskelkrydsning, vil stimuleringsamplituden blive reduceret med reduktionshastigheden. Hvis der ikke påvises noget handlingspotentiale, øges stimuleringsamplituden med tilvæksthastigheden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Automatiseret elektrisk tærskelsporing af enkeltneuronaktionspotentialer ved en stimuleringsfrekvens på 0,25 Hz . (A) Sekventielle spor af en human C-fiber af den overfladiske peroneale nerve under et mikroneurografisk eksperiment. (B) Sekventielle spor af en mus Aδ-fiber af saphenøs nerve under hud-nerve forberedelse drillet fiber elektrofysiologi. Sporene blev farvet røde, når et handlingspotentiale blev identificeret, hvilket resulterede i et fald i stimulusamplituden. Softwarealgoritmen finder effektivt den stimulusamplitude, der kræves for en 50% sandsynlighed for fyring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Elektrisk tærskelsporing ved en 0,25 Hz stimuleringsfrekvens under termisk stimulering af en human C-fiber nociceptor. Y-aksen koder for stimuleringstallet fra paradigmets start. (A) Spændingsspor i 4.000 ms efter elektrisk stimulering, med tærskelkrydsningshændelser markeret med rødt. (B) Spændingsspor fra A zoomede ind omkring det sporede aktionspotentiale. Sporene blev farvet røde, da det sporede aktionspotentiale blev detekteret. Den lodrette blå linje er den sporede enheds basislinjeventetid. (C) Stimuleringsstrøm befalet af APTrack. Den lodrette blå linje er den elektriske tærskel for basislinjen. D) Termisk stimulerende sondetemperatur med modtagefelt TCS-II. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Forbindelse | Koncentration |
| NaCl | 107,8 mM |
| NaHCO3 | 26,2 mM |
| KCl | 3,5 mM |
| NaH2PO4 | 1,67 mM |
| CaCl2 Annoncer | 1,53 mM |
| MgSO4 | 0,69 mM |
| Natriumgluconat | 9,64 mM |
| Saccharose | 7,6 mM |
| Glukose | 5,55 mM |
Tabel 1: Indhold af den syntetiske interstitielle væske til musehud-nervepræparatet23.
Discussion
APTrack er et software-plugin til brug med Open Ephys-platformen. Vi har valgt denne platform, da den er open source, fleksibel og billig at implementere. Ikke inklusive omkostningerne ved konstantstrømstimulatoren, kunne alt det udstyr, der kræves for at begynde at bruge pluginet, købes for omkring $ 5,000 USD i skrivende stund. Vi håber, at dette vil gøre det muligt for forskere lettere at implementere APTrack i deres perifere nerveelektrofysiologiske undersøgelser. Desuden kan forskere frit ændre softwaren, så den passer til deres eksperimentelle behov. Det er vigtigt, at dette værktøj har tilladt elektrisk tærskelsporing af enkelte C-fiber nociceptorer for første gang hos mennesker.
Jo højere signal-støj-forholdet, jo bedre kan algoritmerne identificere aktionspotentialer. Signal-støj-forholdet under mikroneurografi var tilstrækkeligt i de fleste af vores optagelser, men brugerne skal være opmærksomme på risikoen for signalforringelse over tid. Dette er især vigtigt for længere eksperimentelle protokoller, fordi hvis det sporede handlingspotentiales amplitude falder under detektionstærsklen, øges stimuleringsamplituden fejlagtigt; Dette kan afhjælpes ved at eksperimentere overvåger pluginet og derefter justerer indstillingerne, hvis det kræves. Signal-støj-forholdet forbedres med båndpasfiltrering, men større transienter kan stadig fejlagtigt identificeres som handlingspotentialer, hvis de ankommer i løbet af søgefeltets tidsvindue. Risikoen for fejlagtig identifikation af forbigående støj som et aktionspotentiale kan reduceres ved at indsnævre tidsvinduet, hvor pluginet søger efter handlingspotentialer og ved at optimere tærskelindstillingerne. Der er dog stadig situationer, man kan støde på, der hæmmer pluginets ydeevne. Spontan aktivitet kan forårsage vanskeligheder, hvis aktionspotentialer med større amplitude falder inden for algoritmens søgefeltvindue, da de fejlagtigt identificeres som målhandlingspotentialet. Derudover kan spontan aktivitet i neuronen af interesse betyde, at den elektriske stimulering falder i løbet af sin ildfaste periode, hvilket forårsager manglende generering af et handlingspotentiale. Vanskeligheder med at bruge softwaren kan også opstå, når primære afferente neuroner udviser flip-flop, hvorved alternative terminale grene af en enkelt neuron stimuleres, hvilket får det fremkaldte handlingspotentiale til at have to (eller flere) baseline latenstider, der gensidigt udelukker20. Under optagelser fra neuroner, der udviser flip-flop med høje signal-støj-forhold, udførte vi med succes latenstid og elektrisk tærskelsporing ved at øge søgefeltets bredde for at indkapsle alle de potentielle ledningshastigheder, som neuronen udviste. Imidlertid kan den elektriske tærskel variere afhængigt af den terminale gren af neuronen, der bliver spændt, hvilket sandsynligvis delvis skyldes forskelle i afstanden fra stedet for den elektriske stimulering til de alternative nociceptorterminaler. Yderligere arbejde med processen til identifikation af aktionspotentiale, der f.eks. skal omfatte skabelonmatchning, er muligt og kan integreres i denne software. GUI-plugins til båndstop eller adaptiv støjfiltrering kan også bruges opstrøms for APTrack i signalkæden, hvis de udvikles.
Vi anser den elektriske tærskel bestemt til at være den strøm, der kræves for at fremkalde et handlingspotentiale 50% af tiden over et brugerdefineret antal elektriske stimuli, typisk 2-10. Morfologien for elektrisk stimulering er 0, 5 ms og positive, firkantede bølgeimpulser. Dette er ikke det samme som at bestemme reobasen, et almindeligt anvendt mål for neuronal excitabilitet. Pluginet kunne tilpasses til at bestemme rheobase. Vi forfulgte imidlertid en enklere foranstaltning, da dynamiske ændringer i excitabilitet, såsom dem, der antages at forekomme under opvarmning, ville have været vanskeligere at kvantificere med reobaseændringer end vores elektriske tærskelestimat.
Denne software kan bruges i både menneskelige og gnaverforsøg. Dette er muliggjort af fleksibel understøttelse af de elektriske stimuleringssystemer. Softwaren fungerer med enhver stimulator, der accepterer en analog kommandospænding eller kan forbindes manuelt med en stepmotor. Til mikroneurografi brugte vi den med en CE-mærket konstantstrømstimulator, der var designet til brug i menneskelig forskning og havde sin stimulering styret af en urskive. Stimulatorer, der accepterer analoge spændingskommandoer, kan være støjende, da de ikke afbryder kredsløbet mellem stimuli, hvilket betyder, at enhver 50/60 Hz brummen eller støj på den analoge indgang overføres til optagelsen. En stimulator, der kræver et ekstra TLL-triggersignal for at forbinde kredsløbet, hvilket tillader en stimulus ved en strøm, der er analog med den analoge spændingsindgang, der skal genereres, er ideel til brug med pluginet. Dette forhindrer støj i at blive overført til optagelsen mellem stimuli.
Softwaren bruger en simpel op-ned-metode til at estimere den elektriske tærskel. Dette er blevet brugt i psykofysiske tests i mange årtier25. I overensstemmelse med op-ned-metoden tager den elektriske tærskelsporingsalgoritme til modulering af stimuleringsamplituden kun hensyn til den tidligere stimulerings amplitude og respons ved beregning af den næste stimulerings amplitude. Dette betyder, at stimuleringsamplituden vil svinge omkring den sande elektriske tærskel og dermed producere en 50% fyringshastighed, forudsat at tærsklen er stabil. Minimumsstørrelsen af en stigning eller formindskelse er 0,01 V; dette svarer til 0,01 mA, forudsat at stimulatoren har et input-til-output-forhold på 1 V: 1 mA og tilstrækkelig opløsning til at opnå trinændringer så lille. Pluginet opdaterer live-estimatet af målhandlingspotentialets elektriske tærskel, hver gang det når en 50% affyringshastighed over et brugerdefineret antal tidligere stimuli (2-10). Post hoc anbefaler vi at bruge et rullende gennemsnit af stimuleringsamplituden over de sidste 2-10 stimuli til at estimere den elektriske tærskel, og det skal bemærkes, at dette skøn kun vil være nøjagtigt, når fyringshastigheden er relativt stabil på 50%. I både live og post hoc estimater af den elektriske tærskel er der en balance mellem opløsning, pålidelighed og tid til at overveje. Brug af mindre trintrin og reduktionstrin øger nøjagtigheden af estimatet for den elektriske tærskel, men øger den tid, det tager at finde den nye elektriske tærskel oprindeligt og efter forstyrrelse. Beregning af den elektriske tærskel over et større antal tidligere stimuli vil give bedre pålidelighed, men vil øge den tid, der kræves for at nå et nøjagtigt skøn.
APTrack blev designet til brug i perifere nerveoptagelser, specifikt til at spore de elektriske tærskler for C-fibre under eksperimentelle og patologiske forstyrrelser over perioder, hvor aktionspotentiallatenstiden kan variere afhængigt af den underliggende neuronale aktivitet. Denne metode vil gøre det muligt at undersøge ikke kun aksonal excitabilitet, men også nociceptorgeneratorpotentialer hos raske frivillige og patienter. Vi forventer, at andre områder inden for elektrofysiologi kan vedtage og tilpasse dette værktøj til brug i ethvert eksperiment, der kræver elektrisk tærskelsporing af en stimuluslåst aktivitet. For eksempel kunne dette lige så let tilpasses til optogenetisk stimulering med lysimpulser drevet fra APTrack. Pluginet er open source og tilgængeligt for forskere under en GPLv3-licens. Det er bygget på Open Ephys-platformen, som er et tilpasningsdygtigt, billigt, open source-dataindsamlingssystem. Pluginet giver yderligere kroge til downstream-plugins for at udtrække handlingspotentialeoplysningerne og give yderligere brugergrænseflader eller tilpasningsparadigmer. Pluginet giver en enkel brugergrænseflade til visualisering og latenssporing af handlingspotentialer i realtid. Det kan også afspille tidligere data og visualisere dem ved hjælp af det tidsmæssige rasterplot. Desuden kan den også udføre latenssporing under afspilning af tidligere data. Selvom der er andre softwarepakker tilgængelige til sporing af latenstid i realtid, er de ikke open source og kan ikke udføre elektrisk tærskelsporing26,27. APTrack har en fordel i forhold til traditionelle metoder til at identificere konstante latenshandlingspotentialer fra spændingsspor, da det bruger et tidsmæssigt rasterplot til datavisualiseringen. Desuden har vores erfaringer med at bruge det i eksperimenter med lave signal-støj-forhold indikeret, at den tidsmæssige rasterplotvisualiseringsmetode gør det muligt at identificere konstante latensaktionspotentialer, der ellers kunne være gået glip af.
Helnervetærskelsporing er en meget anvendt metode til vurdering af aksonal excitabilitet13. Enkeltneuron elektrisk tærskelsporing i gnavere C-fibre er tidligere blevet brugt til at kvantificere nociceptor excitabilitet14, og dets anvendelighed hos mennesker anerkendes10,11; Men indtil nu var dette ikke muligt. Vi leverer et nyt open source-værktøj til direkte måling af enkelt nociceptorexcitabilitet i både elektrofysiologiske undersøgelser af gnavere og human perifer nerve. APTrack muliggør for første gang open source, elektrisk tærskelsporing i realtid af enkeltneuronaktionspotentialer hos mennesker. Vi forventer, at det vil lette translationelle undersøgelser af nociceptorer mellem gnavere og mennesker.
Disclosures
G.W.T.N. er et BBSRC Collaborative Training Partnership Doctoral Studentship med University of Bristol og Eli Lilly and Company (BB / T508342 / 1). A.P.N. er en nuværende medarbejder hos Eli Lilly and Company og kan eje aktier i dette selskab.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke vores bidragydere for deres støtte: Academy of Medical Sciences (J.P.D., A.E.P.), Versus Arthritis (J.P.D., A.E.P.), Jean Golding Institute Seedcorn Grant (J.P.D., A.E.P., G.W., A.C.S., M.M.P.) og Biotechnology and Biological Sciences Research Council collaborative training partnership ph.d.-studerende med Eli Lilly (G.W.T.N.). Vi vil gerne takke alle bidragydere til udviklingen af APTrack. Vi vil også gerne takke vores frivillige, der deltog i mikroneurografiske eksperimenter, og vores patient- og borgerinddragelse og engagementssamarbejdspartnere for deres uvurderlige bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC Power Supply | NA | NA | To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators. |
| 36 Pin Electrode Adapter Board | Intan Technology | C3410 | APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021. |
| APTrack Plugin | NA | NA | https://github.com/Microneurography/APTrack |
| Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode | Custom | NA | Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Concentric Stimulating Electrode | World Precision Instruments | SNE-100 | For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode | Custom | NA | For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography. |
| BNC T Splitter (1+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter. |
| BNC to BNC cables (3+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC cables. |
| C6H11NaO7 | Merck | S2054 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| CaCl2 | Merck | C5670 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Digitimer DS4 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS4 | Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022. |
| Digitimer DS7 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS7A | Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022. |
| Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes | Harmony Medical | NA | For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography. |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0450/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| HDMI Cable | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board. |
| KCl | Merck | P9541 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| MgSO4 | Acros Organics | 213115000 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Mineral Oil | Merck | 330779 | Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| NaCl | Merck | S9888 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S6014 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S0751 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Open Ephys Acquisition Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022. |
| Open Ephys Graphical User Interface | Open Ephys | NA | https://github.com/open-ephys/plugin-GUI |
| Open Ephys I/O Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022. |
| PulsePal V2 | Sanworks | 1102 | APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly. |
| RHD 6ft SPI Cable | Intan Technology | C3206 | APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021 |
| RHD2216 16ch Bipolar Headstage | Intan Technology | C3313 | APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8560/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| TCS-II Thermal Stimulator | QST.Lab | NA | For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography. |
| Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference) | FHC | 30085 | For microneurography recordings. 35mm. |
| Ultrasound Scanner iQ+ | Butterfly Network | NA | For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography. |
| USB 3.0 5kV RMS Isolation | Inota Technology | 7055-D | For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022. |
| USB-A to micro USB-B cable (2) | NA | NA | APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing. |
| uStepper S-lite + NEMA17 motor | uStepper | NA | To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022. |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 | For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors. |
References
- Dubin, A. E., Patapoutian, A.
- Serra, J., et al. Microneurographic identification of spontaneous activity in C-nociceptors in neuropathic pain states in humans and rats. Pain. 153 (1), 42-55 (2012).
- Serra, J., et al.
- Namer, B., et al. Specific changes in conduction velocity recovery cycles of single nociceptors in a patient with erythromelalgia with the I848T gain-of-function mutation of Nav1.7. Pain. 156 (9), 1637-1646 (2015).
- Kleggetveit, I. P., et al. High spontaneous activity of C-nociceptors in painful polyneuropathy. Pain. 153 (10), 2040-2047 (2012).
- Orstavik, K., et al. Abnormal function of C-fibers in patients with diabetic neuropathy. Journal of Neuroscience. 26 (44), 11287-11294 (2006).
- Orstavik, K., et al. Pathological C-fibres in patients with a chronic painful condition. Brain. 126, 567-578 (2003).
- Raja, S. N., Ringkamp, M., Guan, Y., Campbell, J. N., John, J. Bonica Award Lecture: Peripheral neuronal hyperexcitability: The "low-hanging" target for safe therapeutic strategies in neuropathic pain. Pain. 161, S14-S26 (2020).
- Middleton, S. J., et al. Studying human nociceptors: From fundamentals to clinic. Brain. 144 (5), 1312-1335 (2021).
- Marshall, A., Alam, U., Themistocleous, A., Calcutt, N., Marshall, A. Novel and emerging electrophysiological biomarkers of diabetic neuropathy and painful diabetic neuropathy. Clinical Therapeutics. 43 (9), 1441-1456 (2021).
- Themistocleous, A. C., et al. Axonal excitability does not differ between painful and painless diabetic or chemotherapy-induced distal symmetrical polyneuropathy in a multicenter observational study. Annals of Neurology. 91 (4), 506-520 (2022).
- Bostock, H., Cikurel, K., Burke, D. Threshold tracking techniques in the study of human peripheral nerve. Muscle Nerve. 21 (2), 137-158 (1998).
- Kiernan, M. C., et al. Measurement of axonal excitability: Consensus guidelines. Clinical Neurophysiology. 131 (1), 308-323 (2020).
- Sauer, S. K., et al. Can receptor potentials be detected with threshold tracking in rat cutaneous nociceptive terminals. Journal of Neurophysiology. 94 (1), 219-225 (2005).
- Vallbo, A. B. Microneurography: How it started and how it works. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1415-1427 (2018).
- Torebjork, H., Hallin, R. A new method for classification of C-unit activity in intact human skin nerves. Advances in Pain Research and Therapy. 1, 29-34 (1976).
- Brown, G. L., Holmes, O. The effects of activity on mammalian nerve fibres of low conduction velocity. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 144 (918), 1-14 (1956).
- Obreja, O., et al. Patterns of activity-dependent conduction velocity changes differentiate classes of unmyelinated mechano-insensitive afferents including cold nociceptors, in pig and in human. Pain. 148 (1), 59-69 (2010).
- Serra, J., Campero, M., Ochoa, J., Bostock, H. Activity-dependent slowing of conduction differentiates functional subtypes of C fibres innervating human skin. Journal of Physiology. 515, 799-811 (1999).
- Weidner, C., Schmidt, R., Schmelz, M., Torebjork, H. E., Handwerker, H. O. Action potential conduction in the terminal arborisation of nociceptive C-fibre afferents. Journal of Physiology. 547, 931-940 (2003).
- Siegle, J. H., et al. Open Ephys: An open-source, plugin-based platform for multichannel electrophysiology. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045003 (2017).
- Sanders, J. I., Kepecs, A. A low-cost programmable pulse generator for physiology and behavior. Frontiers in Neuroengineering. 7, 43 (2014).
- Zimmermann, K., et al. Phenotyping sensory nerve endings in vitro in the mouse. Nature Protocols. 4 (2), 174-196 (2009).
- Dunham, J. P., Sales, A. C., Pickering, A. E. Ultrasound-guided, open-source microneurography: Approaches to improve recordings from peripheral nerves in man. Clinical Neurophysiology. 129 (11), 2475-2481 (2018).
- Levitt, H.
- Turnquist, B., RichardWebster, B., Namer, B. Automated detection of latency tracks in microneurography recordings using track correlation. Journal of Neuroscience Methods. 262, 133-141 (2016).
- Kiernan, M. C., Burke, D., Andersen, K. V., Bostock, H. Multiple measures of axonal excitability: A new approach in clinical testing. Muscle Nerve. 23 (3), 399-409 (2000).
