Summary
Vi presenterer en grafenmatrisebasert hjernekartleggingsprosedyre for å redusere invasiviteten og forbedre spatiotemporal oppløsning. Graphene array-baserte overflateelektroder utviser langsiktig biokompatibilitet, mekanisk fleksibilitet og egnethet for hjernekartlegging i en kronglete hjerne. Denne protokollen gjør det mulig å konstruere flere former for sensoriske kart samtidig og sekvensielt.
Abstract
Kortikale kart representerer den romlige organiseringen av stedsavhengige nevrale responser på sensorimotoriske stimuli i hjernebarken, noe som muliggjør prediksjon av fysiologisk relevant atferd. Ulike metoder, som penetrerende elektroder, elektroencefalografi, positronemisjonstomografi, magnetoencefalografi og funksjonell magnetisk resonansavbildning, har blitt brukt til å oppnå kortikale kart. Imidlertid er disse metodene begrenset av dårlig spatiotemporal oppløsning, lavt signal-støyforhold (SNR), høye kostnader og ikke-biokompatibilitet eller forårsake fysisk skade på hjernen. Denne studien foreslår en grafenmatrisebasert somatosensorisk kartleggingsmetode som en funksjon av elektrokortikografi som gir overlegen biokompatibilitet, høy spatiotemporal oppløsning, ønskelig SNR, og minimert vevskader, overvinne ulempene ved tidligere metoder. Denne studien demonstrerte muligheten for en grafenelektrodegruppe for somatosensorisk kartlegging hos rotter. Den presenterte protokollen kan brukes ikke bare på den somatosensoriske cortexen, men også til andre cortices som den auditive, visuelle og motoriske cortex, og gir avansert teknologi for klinisk implementering.
Introduction
Et kortikalt kart er et sett med lokale flekker som representerer responsegenskaper til sensorimotoriske stimuli i hjernebarken. De er en romlig dannelse av nevrale nettverk og muliggjør prediksjon for oppfatning og kognisjon. Derfor er kortikale kart nyttige for å evaluere nevrale responser på ytre stimuli og behandle sensorimotorisk informasjon 1,2,3,4. Invasive og ikke-invasive metoder er tilgjengelige for kortikal kartlegging. En av de vanligste invasive metodene innebærer bruk av intrakortikale (eller penetrerende) elektroder for kartlegging 5,6,7,8.
Vurdering av kortikale kart med høy oppløsning ved hjelp av penetrerende elektroder har møtt flere hindringer. Metoden er for arbeidskrevende til å få et anstendig kart og for invasiv til å implementeres for klinisk bruk, og forbyr videre utvikling. Nyere teknologier som elektroencefalografi (EEG), positronemisjonstomografi (PET), magnetoencefalografi (MEG) og funksjonell magnetisk resonansavbildning (fMRI) har vunnet popularitet fordi disse er mindre invasive og reproduserbare. Men gitt deres uoverkommelige kostnader og dårlig oppløsning, brukes de i et begrenset antall tilfeller 9,10,11. Nylig har fleksible overflateelektroder med overlegen signalpålitelighet tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet. Grafenbaserte overflateelektroder demonstrerer langsiktig biokompatibilitet og mekanisk fleksibilitet, og gir stabile opptak i en kronglete hjerne 12,13,14,15,16. Vår gruppe har nylig utviklet et grafenbasert flerkanalsarray for høyoppløselig opptak og stedsspesifikk nevrostimulering på kortikal overflate. Denne teknologien lar oss holde styr på de kortikale representasjonene av sensorisk informasjon i en lengre periode.
Denne artikkelen beskriver trinnene som er involvert i å skaffe seg et hjernekart over den somatosensoriske cortex ved hjelp av en 30-kanals grafen multielektrodematrise. For å måle hjernens aktivitet plasseres en grafenelektrodegruppe på cortexens subdurale område, mens forpoten, forbenet, bakpoten, bakbenet, bagasjerommet og værhårene stimuleres med en trepinne. De somatosensorisk fremkalte potensialene (SEP) registreres for somatosensoriske områder. Denne protokollen kan også brukes på andre hjerneområder, for eksempel den auditive, visuelle og motoriske cortex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrehåndteringsprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Incheon National University (INU-ANIM-2017-08).
1. Dyr forberedelse til kirurgi
MERK: Bruk Sprague Dawley Rat (8-10 uker gammel) uten kjønnsskjevhet for dette eksperimentet.
- Bedøv rotta med 90 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazincocktail intraperitonealt. For å opprettholde ønsket anestesidybde gjennom hele operasjonen, gi en supplerende 45 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazincocktail når rotta viser tegn på å våkne opp.
- Bekreft at rotta er under dyp anestesi og sjekk regelmessig kroppsrefleksjoner som tåklemme, haleklype og hornhinnerefleks.
- Barber pelsen mellom øynene og baksiden av ørene ved hjelp av en trimmer.
- Påfør en oftalmisk salve på øynene for å forhindre at de tørker ut.
2. Kirurgi for kortikal overflateeksponering
- Fest rottehodet på det stereotaksiske apparatet med en stereotaksisk adapter. For å opprettholde kroppstemperaturen på 37 °C under operasjonen, plasser rotta på en temperaturkontrollert varmepute.
- Steriliser det barberte området med vekslende skrubber av alkohol og povidon-jod tre ganger.
- Bruk tang til å ta et godt tak i hodebunnen og injiser 0,1 ml lidokain (2%) med en sprøyte direkte inn i hodebunnen for å indusere lokalbedøvelse i operasjonsområdet.
- Lag et 2-3 cm langt midtlinjesnitt med en skalpell og trekk fra hverandre hodebunnen for å avsløre skallen.
- Klem hodebunnen med myggtang for å avsløre skallen.
- Skrap overflaten av skallen med tang for å fjerne periosteum.
- Blunt dissekere musklene over occipital skallen for å avsløre cisterna magna over aksen på toppen av ryggmargen.
- Snitt cisterna magna med bladet for å drenere cerebrospinalvæsken og sett en steril gasbind inne i snittet av cisterna magna for å absorbere cerebrospinalvæsken konstant for å forhindre hjerneødem og minimere betennelse.
- Bruk en blyant, merk på skallen et rektangulært vindu som måler 3 mm i anteroposterior akse og 6 mm i høyre sideretning fra bregma på høyre halvkule.
MERK: Merking må sikre en 1 mm avstand fra midtlinjen for å unngå overlegen sagittale sinusbrudd. - Bor det markerte området i henhold til den stereotaktiske koordinaten og fjern skallen med en beinrongeur.
- For å fjerne dura materen, bøy spissen av 26 G nålen til 90 °, lag et hull i dura materen, løft dura materen, sett tang inn i hullet og riv den med tang.
- Plasser saltvannsfuktet gasbind på den somatosensoriske cortex for å forhindre at den tørker ut.
3. Fremstilling av grafenelektrodearray koblet til opptakssystemet
- Forbered en grafenelektrodegruppe med en omnetics-kontakt.
- Løsne grafenmultielektrodematrisen uten å forårsake skade ved å påføre saltoppløsningen.
- Fjern det ytre dekselet på referansen og jordledningene fra kontakten.
- Koble hovedtrinnet med grafenelektrodematrisen til kontakten.
- Koble grensesnittkabelen som er koblet til hovedtrinnet, til opptakssystemet.
- Fest grafenelektrodearraykomplekset inn i den stereotaktiske armen.
- For å fange nevrale signaler fra alle kanaler, plasser matrisen på den somatosensoriske cortex uten bøyning, etter de forhåndsbestemte stereotaktiske koordinatene.
- Plasser en referanseledning under vevet bak oksipitalbenet og koble jordledningen til det jordede optiske bordet.
4. Fysisk stimulering og registrering av sprøytebytteprogrammer for kartlegging
- Åpne programvaren for opptak av nevrale signaler.
- Still inn opptaksprogramvaremiljøet: (1) still inn samplingsfrekvensen for SEP-er og hakkfilter (60 eller 50 Hz, en frekvens for husholdningsstrøm) for å fjerne støyen fra strømledningen.
- For whisker-kartlegging, bøy værhåret med en fin pinne.
- Stikk hele tiden forpoten, forbenet, bakpoten, bakbenet og stammen med en trepinne for kroppskartlegging.
- Ta opp nevrale signaler i datainnsamlingssystemet for den angitte tiden.
5. Avliving av dyr
- Etter alle opptaksprosedyrene, ofre rotter med anestesi ved hjelp av >5% isofluran og utfør cervikal disseksjon.
6. SEP-måling for kortikal kartlegging
- Åpne MATLAB kodenavn read_Intan_RHS2000_file.m for signalanalyse.
MERK: read_Intan_RHS2000_file.m kan lastes ned fra "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software". - Klikk på Kjør-knappen , velg opptaksfilen med filtypen ".rhs", og vent til filen blir behandlet og lest.
- Skriv inn kommandoen "plott (t, amplifier_data("kanalnummer",:))" for å lage et 2D-linjeplott av opptaksdataene, finne SEP-ene og beregne amplituden til SEP-er i alle kanaler.
MERK: Skriv inn kanalnummeret på «kanalnummer». "plott(t, amplifier_data(1,:))" oppretter for eksempel 2D-linjeplottet for kanal 1. I tillegg, når eksperimentøren beregner amplituden til svaret, velger du svaret som er registrert fra hver kanal. - Skaff data ved å fargelegge rutenettet med en annen nyanse i henhold til amplituden til SEP-ene.
MERK: MATLAB-kommandoen "imagesc" bidrar til å få et topografisk kart raskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver hvordan en grafen flerkanals array er montert på overflaten av hjernen. Det somatosensoriske kartet ble konstruert ved å skaffe nevrale responser på fysiske stimuli og beregne amplituden av responsen. Figur 1 viser skjemaet for dette eksperimentet.
Figur 2A viser de strukturelle egenskapene til en grafenelektrodematrise. Det er gjennomgående hull på underlaget mellom elektrodene. Disse hullene hjelper elektroden til å komme i kontakt med den kortikale overflaten (figur 2B). Den sterke vedheft av elektroden til cortex bidrar til å registrere nevrale signaler med mindre støy.
Figur 2C (venstre) viser de stedsavhengige nevrale responsene som er oppnådd ved å stimulere værhårene, bagasjerommet, potene og lemmene kodet i forskjellige farger. En rotte homunculus, rottens miniatyrkropp, tegnes med det faktiske forholdet mellom hver fargestørrelse i det somatosensoriske cortex-kartet (figur 2C, høyre).
Figur 2D viser stimulispesifikke responser med farger knyttet til hver kroppsdel. Svarene registreres gjennom en grafenelektrodegruppe plassert på overflaten av cortex. Ved å bruke dataene som er registrert fra grafenmatrisen, beregnes amplituden til SEP for å oppnå det amplitudeavhengige somatosensoriske kartet.
Sensoriske stimulusindusinduserte lokale feltpotensialer muliggjør konstruksjon av det somatosensoriske kartet. Responsstørrelsen på hver kroppsstimulus utgjør gnager homunculus. Hver farge representerer en annen kroppsdel (figur 3).
Det ervervede cortex-kartet ved hjelp av denne protokollen avslører de spesifikke områdene i den somatosensoriske cortex som reagerer på whiskers, forepaws, forben, bakpoter, bakre lemmer og trunker. Det gir innsikt i omfanget av involvering av det kortikale området i behandling av fysisk stimulusinformasjon for hver kroppsdel.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av eksperimentoppsettet. Den grafenbaserte elektrodegruppen er festet til den somatosensoriske cortex, og whiskers eller andre kroppsdeler stimuleres ved mild berøring. Den tykke røde linjen representerer kabelen, og de tynne røde og blå linjene representerer bakken og referanseledningene. Den svarte prikken indikerer bregma. Datainnsamlingssystemet er koblet til datamaskinen via USB. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Grafenbasert mikroelektrodegruppe for hjernekartlegging på kortikal overflate . (A) Skjematisk fremstilling av den grafenbaserte elektrodematrisen. (B) Optisk bilde av grafenelektrodematrisen på den kortikale overflaten. (C) Rottens auditive og somatosensoriske cortices. To kart over auditive og somatosensoriske områder som reagerer på auditive stimuli med forskjellige frekvenstoner og fysiske stimuli påført hver kroppsdel. (D) 30-kanals (unntatt referanse- og jordelektrodene) registrering av grafen-elektrode-arrayet på den kortikale overflaten. Boksfarger korrelerer med de geografiske stedene til den kortikale overflaten. Figurene er tilpasset og modifisert fra Lee et al. (2021). 4Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Somatosensorisk kart. (A) Plassering av nevrale opptak på tvers av kortikale lag (venstre). Et kortikal overflatekart bestemt ved hjelp av en grafenelektrodematrise. Et fargekodet somatosensorisk kart konstruert ved hjelp av responsamplitudene og overlappet med homunculus (høyre). (B) Registrerte kortikale SEP og kart etter stimulering av hver kroppsdel. Denne figuren er tilpasset og modifisert fra Lee et al. (2021). 4Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen gir en grundig, trinnvis prosess som forklarer hvordan du får tilgang til og kartlegger de somatosensoriske responsene til rotter ved hjelp av en grafenelektrodematrise. De protokollervervede dataene er SEP-er som gir somatosensorisk informasjon som er synaptisk knyttet til hver kroppsdel.
Flere aspekter ved denne protokollen bør vurderes. Når du ekstraherer cerebrospinalvæske for å forhindre hjerneødem og redusere betennelse, er det avgjørende for eksperimentøren å ikke skade hjernestammen som ligger foran cisterna magna.
Ansiktsværhår gir taktil sensorisk informasjon om omgivelsene, for eksempel et mørkt og smalt miljø. Følgelig er gnagerværhår godt utviklet nok til å fornemme et objekt gjennom avbøyningsretningene, stimulusintensiteten og plasseringen av de stimulerte værhårene. Den somatosensoriske cortex reagerer på bøyeretningen, intensiteten og plasseringen av hver whisker forskjellig18,19. Derfor stimuleres alle whiskers med konstant intensitet og retning i denne protokollen.
Denne protokollen kan ikke registrere signaler fremkalt i dype hjernestrukturer som vår grafenelektrodegruppe er montert på den kortikale overflaten. Dermed kan eksperimentøren ikke identifisere hvordan det kolonnerte nettverket er hierarkisk organisert angående nevrale responser.
Denne protokollen er overlegen tidligere opptaksmetoder fordi grafenelektrodematrisen er mindre invasiv, tilpasningsdyktig og biokompatibel 12,13,14,15,16. Videre har grafenelektrodematrisen >30 kanaler for opptak av signaler, noe som muliggjør raskere kortikal kartlegging enn en enkelt eller tetrodeelektrode. Denne protokollen kan videre brukes på andre kortikale områder når det er nødvendig15,20. Eksperimentøren kan plassere elektrodeoppstillingen på den hørbare eller visuelle cortex for å trekke ut auditiv og visuell informasjon som de auditive eller visuelle kartene. Endelig kan denne metoden implementeres for kronisk implantasjon og diagnostisering av nevrale sykdommer, som hjerneslag, epilepsi, tinnitus og Parkinsons sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Incheon National University (International Cooperative) for Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
- Leergaard, T. B., et al. Rat somatosensory cerebropontocerebellar pathways: spatial relationships of the somatotopic map of the primary somatosensory cortex are preserved in a three-dimensional clustered pontine map. Journal of Comparative Neurology. 422 (2), 246-266 (2000).
- Craner, S. L., Ray, R. H. Somatosensory cortex of the neonatal pig: I. Topographic organization of the primary somatosensory cortex (SI). Journal of Comparative Neurology. 306 (1), 24-38 (1991).
- Benison, A. M., Rector, D. M., Barth, D. S. Hemispheric mapping of secondary somatosensory cortex in the rat. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 200-207 (2007).
- Lee, M., et al. Graphene-electrode array for brain map remodeling of the cortical surface. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
- Yang, S. C., Weiner, B. D., Zhang, L. S., Cho, S. J., Bao, S. W. Homeostatic plasticity drives tinnitus perception in an animal model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (36), 14974-14979 (2011).
- Yang, S., Zhang, L. S., Gibboni, R., Weiner, B., Bao, S. W. Impaired development and competitive refinement of the cortical frequency map in tumor necrosis factor-alpha-deficient mice. Cerebral Cortex. 24 (7), 1956-1965 (2014).
- Miyakawa, A., et al. Tinnitus correlates with downregulation of cortical glutamate decarboxylase 65 expression but not auditory cortical map reorganization. Journal of Neuroscience. 39 (50), 9989-10001 (2019).
- Yang, S., Su, W., Bao, S. Long-term, but not transient, threshold shifts alter the morphology and increase the excitability of cortical pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (6), 1567-1574 (2012).
- Beniczky, S., Schomer, D. L. Electroencephalography: basic biophysical and technological aspects important for clinical applications. Epileptic Disorders. 22 (6), 697-715 (2020).
- Kim, S. G., Richter, W., Uğurbil, K. Limitations of temporal resolution in functional MRI. Magnetic Resonance Medicine. 37 (4), 631-636 (1997).
- Cho, Z. H., et al. A fusion PET-MRI system with a high-resolution research tomograph-PET and ultra-high field 7.0 T-MRI for the molecular-genetic imaging of the brain. Proteomics. 8 (6), 1302-1323 (2008).
- Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature Neuroscience. 14 (12), 1599-1605 (2011).
- Masvidal-Codina, E., et al. High-resolution mapping of infraslow cortical brain activity enabled by graphene microtransistors. Nature Materials. 18 (3), 280-288 (2019).
- Blaschke, B. M., et al. Mapping brain activity with flexible graphene micro-transistors. 2D Materials. 4 (2), 025040 (2017).
- Park, S. W., et al.
- Lim, J., et al. Hybrid graphene electrode for the diagnosis and treatment of epilepsy in free-moving animal models. NPG Asia Materials. 15 (1), 7 (2023).
- Hermanns, H., et al. Molecular mechanisms of action of systemic lidocaine in acute and chronic pain: a narrative review. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 335-349 (2019).
- Tchoe, Y., et al. Human brain mapping with multithousand-channel PtNRGrids resolves spatiotemporal dynamics. Science Translational Medicine. 14 (628), (2022).
- Wilent, W. B., Contreras, D. Dynamics of excitation and inhibition underlying stimulus selectivity in rat somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 8 (10), 1364-1370 (2005).
- Insanally, M. N., Köver, H., Kim, H., Bao, S. Feature-dependent sensitive periods in the development of complex sound representation. Journal of Neuroscience. 29 (17), 5456-5462 (2009).
