Summary
Neste estudo, uma série de métodos são apresentados para preparar amostras de DESI-MSI de plantas, e um procedimento de instalação de montagem de DESI, aquisição de dados MSI e processamento é descrito em detalhes. Este protocolo pode ser aplicado em diversas condições para aquisição de informações do metaboloma espacial em plantas.
Abstract
O uso medicinal da medicina tradicional chinesa deve-se principalmente aos seus metabólitos secundários. A visualização da distribuição desses metabólitos tornou-se um tópico crucial na ciência vegetal. A espectrometria de massa pode extrair grandes volumes de dados e fornecer informações de distribuição espacial sobre eles por meio da análise de fatias de tecido. Com a vantagem de alto rendimento e maior precisão, a imagem por espectrometria de massa por ionização por eletrospray de dessorção (DESI-MSI) é frequentemente usada em pesquisas biológicas e no estudo da medicina tradicional chinesa. No entanto, os procedimentos utilizados nesta pesquisa são complicados e pouco acessíveis. Neste estudo, otimizamos os procedimentos de corte e imagem DESI e desenvolvemos um método mais custo-efetivo para identificar a distribuição de metabólitos e categorizar esses compostos em tecidos vegetais, com foco especial na medicina tradicional chinesa. O estudo promoverá a utilização do DESI na análise de metabólitos e padronização da medicina tradicional chinesa/medicina étnica para tecnologias relacionadas à pesquisa.
Introduction
A visualização da distribuição de metabólitos tornou-se um tópico crucial na ciência vegetal, especialmente na medicina tradicional chinesa, pois revela o processo de formação de metabólitos específicos dentro da planta. Com referência à medicina tradicional chinesa (MTC), fornece informações sobre os componentes ativos e orienta a aplicação de partes de plantas em aplicações farmacêuticas. Normalmente, a visualização dos metabólitos é obtida por hibridização in situ, microscopia de fluorescência ou imunohistoquímica, porém o número de compostos detectados por esses experimentos transmite informações químicas limitadas. Combinada com a coloração tecidual, a imagem por espectrometria de massa (MSI) pode fornecer uma grande quantidade de dados e fornecer informações de distribuição espacial de compostos por meio da varredura e análise de cortes de tecidono nível 1 da mícron. O MSI usa analitos para dessorção e ionização da superfície da amostra, seguido de análise de massa dos íons de fase vapor resultantes e aplicação de software de imagem para integrar as informações e plotar uma imagem bidimensional registrando uma abundância específica de íons. Essa tecnologia pode determinar moléculas exógenas e endógenas por meio da detecção da distribuição característica de fármacos e seus metabólitos induzidos em tecidos e órgãos-alvo 2,3,4,5.
Várias modalidades de imagem da EM foram desenvolvidas nas últimas décadas; os mais proeminentes entre eles são o MSI BASEADO EM IONIZAÇÃO POR ELETROSPRAY DE DESSORÇÃO (DESI-MSI), dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) e espectrometria de massa de íons secundários (SIMS)6. O DESI-MSI é frequentemente utilizado em pesquisas biológicas devido à sua operação atmosférica, alto rendimento e maior precisão7. O MALDI tem sido aplicado para identificar um fragmento de transtirretina como potencial biomarcador nefrotóxico para gentamicina e para analisar a distribuição do metabólito neurotóxico 1-metil-4-fenilpiridínio após o manejo de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina em cérebros de camundongos 8,9. MALDI e DESI têm sido usados para determinar a composição de estruturas cristalinas induzidas por drogas no rim de coelhos dosados; Essas estruturas são compostas principalmente por metabólitos formados devido à desmetilação e/ou oxidação do fármaco10. Adicionalmente, o MSI tem sido aplicado na localização da distribuição metabólica da toxicidade de drogas em órgãos-alvo. No entanto, as células do tecido vegetal variam e são diferentes dos animais e requerem procedimentos especiais de seccionamento.
Em plantas, utilizando imagens MALDI, até o momento, foi analisada a distribuição de diferentes compostos em caule de trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), sementes de arroz (Oryza sativa), flores e raízes de Arabidopsis thaliana e sementes de cevada (Hordeum vulgare)11,12,13,14,15,16,17,18 . Estudos recentes relatam que o DESI-MSI está emergindo na análise de metabólitos de drogas e produtos naturais, especialmente em MTCs como Ginkgo biloba, Fuzi e Artemisia annua L 19,20,21. Nesses estudos, os protocolos para a preparação de amostras de material vegetal diferem e alguns requerem equipamentos mais complexos, como um micrótomo de congelamento. O DESI-MSI tem requisitos rigorosos para a planicidade superficial da amostra detectada. Ao analisar o órgão ou tecido de um animal, a amostra geralmente é feita por criossecção22. No entanto, o procedimento para criosseccionamento é complicado e mais caro, e o método de temperatura de corte ótima (OCT) comumente usado com adesivo tem um forte sinal durante a obtenção de imagens. Além disso, os tecidos medicinais da MTC variam; por exemplo, a raiz de Salvia miltiorrhiza, conhecida como Danshen em chinês, é usada medicinalmente, enquanto em Zisu (Perilla frutescens), a folha é usada23,24. Portanto, é necessário melhorar os procedimentos de preparação da amostra para promover a utilização do DESI na análise de metabólitos para MTC.
Como uma erva perene e uma MTC comumente usada, S. miltiorrhiza foi inicialmente registrada na monografia de medicina mais antiga, Shennong's Classic of Materia Medica (conhecido como Shennong Bencao Jing em chinês). Neste estudo, otimizamos os procedimentos de corte e imagem DESI e desenvolvemos um método mais custo-efetivo para identificar a distribuição e categorizar os compostos nos tecidos de S. miltiorrhiza. Este método também pode superar as desvantagens associadas aos tecidos secos - que geralmente fraturam facilmente sob o golpe de nitrogênio - e promover o desenvolvimento da MTC. O estudo promoverá a padronização da MTC/medicina étnica para tecnologias relacionadas à pesquisa.
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Protocol
1. Preparação da amostra
- Coletar raízes e folhas limpas de uma planta de Salvia miltiorrhiza de 2 anos de idade (Figura 1A) e cortar diretamente em uma espessura transversal de aproximadamente 3-5 mm manualmente. Em seguida, cole a amostra em uma lâmina de vidro do microscópio de adesão com fita dupla face (Figura 1B).
NOTA: Verifique se o tamanho da fita dupla face é maior que a amostra. Se os tecidos estiverem secos, mergulhe-os em água ou paraformaldeído a 4% durante a noite antes de fatiar. - Coloque outra lâmina de vidro do microscópio acima da amostra e envolva as duas lâminas de vidro com uma película selante como um sanduíche (Figura 1C). Congelar a amostra de sanduíche a -80 °C durante, pelo menos, 4 h e, em seguida, submetê-la a um vácuo de ar durante 2 h (Figura 1D) com os seguintes parâmetros de regulação: temperatura de armadilha a -75 a -82 °C e manómetro de vácuo a 2,5 a 3,7 Pa.
NOTA: Certifique-se de que as duas lâminas de vidro estejam paralelas ao envolver a película de vedação para manter a superfície da amostra intacta. Se os tecidos vegetais tiverem um alto teor de umidade, estenda o tempo de ar-vácuo para 3 h. Não exceda 5 h, caso contrário, os tecidos irão facilmente fraturar. - Conservar as amostras de sanduíche a -80 °C até à análise. Levar as amostras à temperatura ambiente num exsicador para evitar a condensação na superfície da amostra. Em seguida, sujeite a amostra à aplicação matricial.
2. Instalação da unidade de ionização por eletrospray de dessorção (DESI)
- Configuração do detector de implementos e calibração de massa do instrumento no modo ESI; realizar a configuração do detector usando Leucina Encefalina (LE) em solução de água-acetonitrila (1:1 v/v) e realizar calibração de massa com formiato de sódio (NaFA) em solução de isopropanol (1:1 v/v) em água.
- Retire a fonte ESI e monte a unidade DESI no espectrômetro de massa. Conecte a fonte de gás N2 à unidade DESI e ajuste a pressão do gás para cerca de 0,5 MPa (Figura 2A). Não há necessidade de desabafar o instrumento na troca de fontes.
- Encher a seringa de 5 ml com LE e ácido fórmico em solução de água-metanol (1:9 v/v) e ligar a seringa à bomba de seringa de alto desempenho para fornecer solvente para ionização dos produtos químicos na amostra (Figura 2B).
- Fixar um solvente que forneça capilar à seringa e ao pulverizador DESI (Figura 2C). O capilar que fornece solvente é um capilar padrão de 75 μm de diâmetro interno e 375 μm de diâmetro externo; é bastante estreito e facilmente é bloqueado por impurezas, portanto, os solventes usados nos processos de digitalização devem ser de grau MS e filtrados antes do uso para reduzir o risco de bloqueio.
- Ligue a bomba da seringa e ajuste a taxa de infusão em 2 μL/min para obter um fluxo constante e pulverização do solvente (Figura 2B). Desligue a válvula de gás N2 e, após cerca de 15 s, ligue-a; Uma pequena gota de solvente será soprada para o palco, e o spray pode ser visto se o fluxo de solvente estiver em um estado constante.
- Ajuste a posição do pulverizador em termos do ângulo de pulverização, eixo XYZ, protrusão e altura (Figura 2D). Utilizar marcadores vermelhos e pretos como referências para otimizar o sinal de espectrometria de massa, para obter uma intensidade de sinal acima de 1 x 105 no modo de sensibilidade (Figura 2E).
- A protrusão do pulverizador é o fator mais significativo que afeta a intensidade do sinal; ajustar a saliência trocando o protetor de gás N2 com uma chave de 5 mm. A direção do spray influencia a qualidade da imagem de massa; gire o pulverizador até que o pulverizador esteja reto. Uma vez que a protrusão esteja ajustada para a melhor posição de intensidade de sinal, tente não alterá-la ao trocar de fonte.
- Após todas as etapas acima, a configuração está pronta para experimentos, e a configuração é normalmente estável por >3 semanas de usabilidade, observadas após a configuração inicial.
3. Aquisição de imagens do DESI-MS
- Para DESI-MSI, não realizar pré-tratamento da amostra. Para amostras que já possuem pré-tratamento, minimize ao máximo as etapas de pré-tratamento. Por exemplo, algumas amostras só podem ser feitas com mídia de montagem, portanto, remova o excesso de mídia nas lâminas, se possível.
- Pegue uma imagem da amostra no slide (Figura 3A). Não toque na superfície da amostra para evitar qualquer absorção de impurezas.
- Coloque a lâmina na posição da placa no palco DESI. O palco tem duas posições de placa, A e B; É importante lembrar a posição certa. Use slides padrão (75 mm x 25 mm) ou um slide completo, caso contrário, o slide não caberá na posição e não poderá ser mantido de forma estável. Uma lâmina completa (120 mm x 80 mm) pode acomodar até quatro lâminas e, portanto, tem uma área muito maior para experimentos.
- Abra o software de processamento de imagem em massa de alta definição, defina uma nova placa na guia Adquirir e selecione a posição correta da placa (A ou B) e o tipo de placa. Na página de seleção de imagem, selecione os quatro cantos do slide e, em seguida, a imagem é ajustada automaticamente para a orientação correta (Figura 3A).
- Definir os parâmetros MS; o tipo de experimento comumente usado é o modo DESI-MS, no qual apenas o íon pai será detectado. O instrumento pode usar apenas uma polaridade em um experimento; Portanto, selecione a polaridade como positiva ou negativa. Para obter mais informações sobre produtos químicos em pequenas quantidades, aplique o modo de sensibilidade (Figura 3B).
- Desenhe um retângulo para definir a área de digitalização na guia Padrão e defina o tamanho do pixel. Geralmente, para o modo DESI-MS, mantenha os tamanhos X e Y do pixel iguais. Defina a taxa de varredura para no máximo 5x o tamanho do pixel (Figura 3C).
- Salve o projeto e exporte uma planilha para o software de aquisição de espectrometria de massa.
- Abra o software de aquisição de espectrometria de massa, importe a planilha e salve-a como uma nova lista de amostras. Pressione Iniciar Executar para iniciar a verificação MSI. Várias imagens podem ser adicionadas à fila de experimentos importando mais planilhas.
4. Processamento de dados DESI-MSI e visualização
- Carregue o arquivo de dados da amostra no software de processamento de imagens em massa e defina os parâmetros para o processamento de imagens DESI (Figura 3D). Como a Leucina Encefalina foi utilizada para a massa da trava interna, e a massa da trava é o único ponto a identificar a polaridade do experimento, é de grande importância definir a massa da trava correta. Defina os seguintes valores: para o modo positivo: 556,2772; para o modo negativo: 554,2620.
- É possível construir uma lista de produtos químicos alvo, caso em que o resultado do processamento se concentrará nos produtos químicos na lista de alvo. Carregue o arquivo de dados processado para visualizar a imagem DESI da amostra. Clique no botão "Normalização" para normalizar os dados por cromatografia de íons totais (TIC) para obter a intensidade relativa de um produto químico específico para a referência, então diferentes amostras podem ser comparadas entre si (Figura 3E).
- Desenhar uma região de interesse (ROI) e copiar várias cópias na imagem de amostra; As ROIs podem ser feitas em diferentes imagens. Selecione todas as ROIs e exporte a análise multivariada (MVA) para extrair informações de SM de todas as ROIs para MVA (Figura 3F).
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Representative Results
Este protocolo pode levar à identificação e distribuição de compostos em amostras de plantas. Na imagem MS de um m/z específico, a cor de cada pixel representa a intensidade relativa do m/z, portanto, pode ser associada à distribuição natural e à abundância do íon metabólito ao longo da amostra. Quanto maior a abundância do produto químico na posição de coleta, mais brilhante é a cor. A barra na figura (Figura 4A-D) mostra o gradiente das cores. Aqui, selecionamos dois compostos que são valiosos no uso medicinal de S. miltiorrhiza. Como mostrado na Figura 4A-D, a distribuição dos compostos alvo, Tanshinone IIA (m/z: 333,0893, M+H) e ácido rosmarínico (m/z: 705,1848, 2M+H-O), é visível em diferentes áreas da raiz. Enquanto isso, o composto Danshenol A (m/z: 297,1127, M+H; m/z: 335,0686, M+K) foi detectado na folha, como mostra a Figura 4E-H. A distribuição dos compostos pode ser usada para orientar o uso da parte vegetal em aplicações médicas; além disso, os dados MVA exportados podem ser aplicados para fazer análises metabolômicas adicionais.
Figura 1: Método de preparação da amostra. (A) A planta (Salvia miltiorrhiza) utilizada nesta pesquisa. A seta vermelha indica o tecido coletado como amostra. (B,C) Esquema mostrando como fazer uma amostra de sanduíche. (D) Ar-vácuo das amostras. A temperatura definida é de -83,1 ± 3 °C, e a faixa de vácuo é de 3-5 Pa.
Figura 2: Equipamentos e aparelhos da unidade DESI-MSI . (A) Vista frontal do conjunto DESI. (B) Bomba de seringa. (C) Pulverizador capilar. (D) Vista superior da montagem do DESI. (E) Otimização do sinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aquisição, análise e visualização dos dados pelo DESI-MSI. (A) Carregue a imagem no software de processamento de imagens em massa e selecione os cantos do slide para ajustar a imagem à orientação correta. (B) Defina os parâmetros MS, defina o intervalo de varredura m/z e selecione o modo positivo ou negativo. (C) Defina a área de digitalização, a resolução da imagem e a taxa de digitalização. (D) Defina os parâmetros de processamento: número de massas-alvo, massa de bloqueio, frequência da amostra e duração. (E) Carregue o resultado e normalize os dados. Selecione o m/z esperado na lista de massas para exibir a imagem MS do m/z. (F) Desenhe regiões de interesse (ROIs) na imagem MS e exporte MVA para análise metabolômica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem por espectrometria de massa dos cortes da raiz e da folha inteira. (A-D) Imagens mostrando a distribuição espacial de dois compostos selecionados na raiz. (E-H) Imagens mostrando a distribuição espacial de dois compostos selecionados na folha. A cor de cada pixel representa a intensidade relativa do m/z e, portanto, pode ser associada à distribuição natural e à abundância do íon metabólito em toda a amostra. Quanto maior a abundância do produto químico na posição de coleta, mais brilhante é a cor. A barra nas imagens mostra o gradiente das cores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O surgimento da tecnologia MS abriu uma nova visão na pesquisa de produtos naturais em nível molecular durante os últimos anos24. O instrumento MS, com sua alta sensibilidade e alto rendimento, permite a análise direcionada e não direcionada de metabólitos em produtos naturais, mesmo com traços de concentração25. Portanto, a EM é atualmente amplamente utilizada no campo da química da medicina tradicional chinesa (MTC). A pesquisa qualitativa e quantitativa sobre a composição química da MTC pode fornecer informações sobre os ingredientes do medicamento e seu composto associado, que não só fornecem uma referência adequada para a pesquisa farmacológica, mas também fornecem a base para a construção de um sistema de padrão de qualidade para a MTC26. Além disso, em produtos naturais, as assinaturas metabólicas geralmente estão relacionadas às características morfológicas e histológicas27; Portanto, é de grande valia realizar análises in situ para identificar o mecanismo e a resposta das plantas a diversas condições de estresse biótico e abiótico28. No entanto, como as amostras para análise tradicional de EM são soluções de extratos de um determinado produto natural ou de suas partes específicas, a EM não obtém informações com relação à distribuição espacial ou temporal dos metabólitos nas amostras. A técnica MSI, uma tecnologia relativamente nova desenvolvida há apenas duas décadas, obtém metabólitos das amostras de produtos naturais, analisa a informação molecular qualitativa e quantitativamente e registra a informação espaço-temporal. A partir daí, com o auxílio de ferramentas de mapeamento, as coordenadas 2D ou 3D de moléculas específicas podem ser simuladas29.
A técnica DESI-MSI utilizada neste estudo é uma nova técnica de MSI desenvolvida em 2004 pelo grupo de Cooks da Universidade de Purdue (EUA)30. Em comparação com outras técnicas de MSI usadas no início, incluindo espectrometria de massa de íons secundários (SIMS)31, ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI)32 e ionização por eletrospray de ablação a laser (LAESI)33, o DESI tem várias vantagens. O SIMS e o MALDI precisam de um ambiente de alto vácuo para ionizar as amostras e, para o MALDI, as amostras precisam ser montadas em uma superfície condutora7. Além disso, o preparo da amostra para todas essas três técnicas envolve várias etapas complicadas. O DESI, como uma nova técnica de ESI, é baseado em um princípio de ionização suave semelhante à ionização por eletrospray (ESI) em cromatografia líquida por espectrometria de massas (LC-MS)30. Portanto, os íons detectados são, em sua maioria, íons quase moleculares, e a fragmentação também pode ser realizada se necessário, o que supera o inconveniente da ionização dura na técnica SIMS, gerando íons secundários que podem insultar a perda deinformação7. O DESI trabalha em condições ambientais, por isso não precisa de muito tempo para atingir a condição de trabalho após a colocação de amostras no aparelho. Devido ao princípio de ionização destrutiva minimizada, é possível executar experimentos repetidamente em uma amostra, portanto, nenhuma amostra adicional é necessária para um segundo modo (negativo ou positivo).
Este artigo descreve principalmente um método custo-efetivo de preparação de amostras de plantas e imagens usando a técnica DESI-MSI. Nesse método, a espessura transversal da amostra não desempenha nenhum papel fundamental; Em vez disso, a superfície plana da amostra é crucial, o que é garantido pelo sanduíche ar-vácuo. No caso das plantas, a preparação de amostras de DESI pode ser obtida de diferentes maneiras e desempenhar um papel fundamental na imagem de EM. As folhas são frequentemente problemáticas, pois mostram uma superfície irregular, macia e com cutícula de cera, o que pode resultar em um baixo sinal durante a imagem, enquanto a raiz contém alto conteúdo de lignina e é fácil de fraturar durante a imagem. Trabalhos anteriores mostraram que a raiz de S. miltiorrhiza foi criosseccionada em micrótomo criostato quando analisada pelo DESI-MSI, enquanto a folha foi preparada por impressão34. No entanto, o método de impressão pode induzir uma perda de intensidade de sinal durante a imagem MSI devido à rápida dissolução de metabólitos depositados na superfície do vidro. Com este protocolo (passo 1.2), como esperado, os cortes de raiz (Figura 4A,B) e folha (Figura 4E,F) permanecem intactos durante a imagem de EM. Além disso, o método de preparo das amostras, por citsecção com micrótomo criostato, é de alto custo devido ao custo da máquina.
Embora nosso método tenha muitas vantagens em comparação com outras técnicas, ainda existem algumas limitações. Primeiro, o corte manual de amostras (etapa 1.1) requer prática para manter a espessura da seção transversal adequada. Além disso, a resolução espacial e o pico de intensidade do DESI são relativamente baixos em comparação com o MALDI. Apesar da imperfeição, todas as vantagens fazem da técnica DESI um método rápido e econômico para investigar a distribuição espaço-temporal de metabólitos em plantas. Além disso, o DESI-MSI já foi utilizado no campo da medicina, microbiologia e química de produtos naturais35. Com o aumento da popularidade e rápida melhoria em várias dimensões desta técnica, ela terá cada vez mais aplicações em todos os campos relativos no futuro7.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da província de Sichuan (No. 2022NSFSC0171) e pelo Programa de Talentos Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (No. 030058042).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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