Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Культура 3D-органоидов кишечника поросенка из криоконсервированных эпителиальных крипт и создание клеточных монослоев

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64917
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 4, 1, 1
1GenPhySE, Université de Toulouse, INRAE, ENVT, 2Lallemand Animal Nutrition, 3Institut NuMeCan, INRAE, INSERM, Université de Rennes, 4FG 16: Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch-Institute

Summary

Здесь мы описываем протокол культивирования 3D-органоидов кишечника свиньи из криоконсервированных эпителиальных крипт. Мы также описываем метод создания клеточных монослоев, полученных из 3D-органоидов, позволяющих получить доступ к апикальной стороне эпителиальных клеток.

Abstract

Кишечные органоиды все чаще используются для изучения эпителия кишечника для моделирования заболеваний пищеварительной системы или для исследования взаимодействия с лекарствами, питательными веществами, метаболитами, патогенами и микробиотой. Методы культивирования кишечных органоидов в настоящее время доступны для нескольких видов, включая свиней, которые представляют большой интерес как для сельскохозяйственных животных, так и в качестве трансляционной модели для людей, например, для изучения зоонозных заболеваний. Здесь мы даем подробное описание процедуры, используемой для культивирования 3D-органоидов кишечника свиньи из замороженных эпителиальных крипт. В протоколе описывается, как криоконсервировать эпителиальные крипты из кишечника свиньи и последующие процедуры культивирования 3D-органоидов кишечника. Основными преимуществами этого метода являются: (i) временная диссоциация выделения крипт из культуры 3D-органоидов, (ii) получение больших запасов криоконсервированных крипт, полученных из нескольких сегментов кишечника и сразу от нескольких животных, и, таким образом, (iii) снижение потребности в отборе проб свежих тканей у живых животных. Мы также подробно описываем протокол создания клеточных монослоев, полученных из 3D-органоидов, чтобы обеспечить доступ к апикальной стороне эпителиальных клеток, которая является местом взаимодействия с питательными веществами, микробами или лекарствами. В целом, описанные здесь протоколы являются полезным ресурсом для изучения эпителия кишечника свиньи в ветеринарных и биомедицинских исследованиях.

Introduction

Кишечный эпителий образован монослоем клеток, покрывающих слизистую оболочку пищеварительного тракта на границе с просветной средой. Эта позиция связана с различными функциями, такими как поглощение питательных веществ и барьерная функция, которые поддерживаются присутствием стволовых клеток и нескольких дифференцированных типов эпителиальных клеток (абсорбционные, энтероэндокринные, панетские и бокаловидные клетки)1. Иммортализированные клеточные линии, традиционно используемые для изучения эпителиальных клеток, имеют серьезные ограничения, поскольку они не отражают клеточную сложность кишечного эпителия и представляют геномные аномалии2. Разработка трехмерных (3D) органоидов Sato et al.3 предоставила новую модель для изучения кишечного эпителия с улучшенной физиологической значимостью. Действительно, кишечные органоиды получены из нетрансформированных стволовых клеток, состоят из нескольких типов клеток и повторяют функциональность кишечного эпителия. Кишечные органоиды все чаще используются для понимания развития и функций кишечного эпителия и его взаимодействия с патогенами, питательными веществами, токсинами, лекарствами, микробиотой и ее метаболитами2.

Первоначально разработанные для людей и мышей, методы, используемые для культивирования кишечных органоидов, недавно были адаптированы к другим видам, включая свиней4. Gonzales et al.5 были первыми, кто культивировал органоиды свиньи из тощей кишки; С тех пор органоиды свиньи были описаны для других сегментов кишечника (двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки и толстой кишки)6,7,8, и было показано, что они сохраняют специфический для местоположения фенотип 9,10,11. 3D-органоиды кишечника свиньи в настоящее время широко используются для изучения влияния питательных веществ 12,13 или кишечных инфекций 6,8,14.

В большинстве исследований описана культура кишечных органоидов, начиная со свежевыделенных эпителиальных крипт. Однако это не всегда возможно по логистическим причинам, особенно при работе с крупными животными, такими как свиньи. Действительно, животноводческие помещения для свиней могут располагаться далеко от лаборатории, где культивируются органоиды, что усложняет организацию работы. Кроме того, культивирование органоидов отнимает много времени; Таким образом, нецелесообразно одновременно выращивать несколько органоидных линий, например, из разных сегментов кишечника или нескольких животных. Чтобы обойти эти проблемы, в нескольких исследованиях на людях, лошадях и свиньях были описаны методы культивирования органоидов из замороженных тканей кишечника (или биопсий) или из изолированных эпителиальных крипт 4,15,16,17. Эти методы позволяют криоконсервировать эпителиальные стволовые клетки кишечника из нескольких сегментов кишечника одного животного, которые затем могут быть использованы для выращивания органоидов при необходимости. Более того, это позволяет сильно сократить количество живых животных, используемых в качестве доноров стволовых клеток, поскольку могут быть созданы большие запасы криоконсервированных крипт (принципы 3R). Еще одним преимуществом этого метода является выращивание кишечных органоидов только у интересующих животных после получения фенотипических или генотипических результатов, что является высокорентабельным.

In vivo эпителиальные клетки кишечника поляризованы, апикальная сторона направлена к просвету. In vitro в 3D-органоидах апикальная сторона эпителиальных клеток также обращена к просвету (т.е. внутри органоидов)4. Эта организация предотвращает доступ к апикальной стороне, что является проблемой при изучении воздействия компонентов просвета (например, питательных веществ, микробов, метаболитов) на эпителиальные клетки. Чтобы обойти этот недостаток, было разработано несколько методов, таких как культивирование органоидных клеток в виде 2D-монослоев, микроинъекция и смена полярности («апикальные органоиды»)18,19. Культура монослоев органоидных клеток становится наиболее эффективной и управляемой системой. Принцип состоит в том, чтобы диссоциировать 3D-органоиды на отдельные клетки и помещать их в сосуд для клеточной культуры, предварительно покрытый тонким слоем внеклеточного матрикса (ECM)20. В этих условиях культивирования апикальная сторона эпителиальных клеток обращена вверх и, таким образом, доступна для экспериментальных методов лечения20. Культура монослоев органоидных клеток была недавно адаптирована для кишечника свиньи21,22; клеточные монослои, полученные из 3D-органоидов свиньи, использовались для различных применений, включая изучение кишечных инфекций 6,23,24,25, транспорта питательных веществ9 и моделирования заболеваний пищеварительной системы 26.

Здесь в этом исследовании впервые представлен подробный протокол культивирования и поддержания 3D-органоидов кишечника свиньи, полученных из криоконсервированных эпителиальных крипт (рис. 1). Затем описывается протокол для создания клеточных монослоев из 3D-органоидов кишечника свиньи. Описанные здесь методы предоставляют экспериментальные инструменты, которые могут быть использованы для изучения кишечного эпителия свиньи на предмет транспорта питательных веществ, барьерной функции и взаимодействия хозяина и микроорганизма.

Protocol

Этот протокол был одобрен местным комитетом по этике (N°TOXCOM/0136/PP) в соответствии с Европейской директивой о защите животных, используемых в научных целях (2010/63/EU). Этот протокол описан для тощей кишки в качестве примера, но его можно использовать для каждого сегмента тонкой и толстой кишки (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, толстая кишка).

1. Выделение эпителиальных крипт из кишечника поросенка

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте запас полной модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEMc) с DMEM, дополненным 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином (P/S). Приготовьте 50 мл аликвот и храните их при температуре 4 ° C в течение 1 месяца.

  1. Приготовление растворов (делается в день выделения крипты)
    1. Приготовьте диссоциационный раствор, содержащий фосфатный буферный физиологический раствор (PBS), 3 мМ дитиотреитол (DTT), 9 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 10 мкМ ингибитор Y27632 ROCK и 1% пенициллин-стрептомицин (P/S), и храните на льду.
    2. Приготовьте замораживающий раствор, содержащий DMEMc, 10% FBS, 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK, и храните на льду (конечная концентрация FBS составляет 18%).
    3. Приготовьте транспортный раствор, содержащий холодный PBS с добавлением 1% P/S, и храните его на льду.
  2. Выделение эпителиальных крипт
    1. Забивают поросенка электронаркозом с последующим обескровливанием.
    2. Сразу после забоя вскройте брюшко поросенка скальпелем и удалите весь кишечник.
    3. Соберите примерно 2 см сегмента кишечника и храните его в холодном транспортном растворе. Держите отрезок на льду до выделения крипты (до 2 ч).
    4. Поместите салфетку в чашку Петри. Откройте продольный сегмент кишечника и тщательно промойте ткань в холодном PBS с добавлением 1% P/S для удаления содержимого кишечника.
    5. Перенесите ткань в новую чашку Петри, заполненную 10 мл холодного PBS с добавлением 1% P/S.
    6. Зажмите ткань пинцетом и удалите ворсинки и оставшуюся слизь, соскоблив предметным стеклом микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление ворсинок (язычкообразной структуры) можно проверить с помощью микроскопического наблюдения надосадочной жидкости.
    7. Перенесите ткань в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл ледяного диссоциационного раствора, и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) на вращающемся шейкере (15 об/мин).
    8. Перенесите ткань в новую чашку Петри и добавьте 10 мл холодного PBS с добавлением 1% P/S.
    9. Изолируйте крипты механически, плотно соскабливая слизистую оболочку предметным стеклом микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Под микроскопом проверьте наличие эпителиальных крипт в PBS (рис. 2A).
    10. Аспирируют криптовый раствор серологической пипеткой и фильтруют через клеточный фильтр 100 мкм в конической пробирке объемом 50 мл.
    11. Пипетят 10 мкл раствора и проверяют наличие крипт под микроскопом. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    12. В стерильном шкафу биобезопасности откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте гранулу крипт в 10 мл холодного DMEMc с добавлением 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK.
    13. Пипетка 10 мкл раствора крипты в 48-луночную пластину. Вручную подсчитайте количество крипт под микроскопом с 10-кратным увеличением и рассчитайте концентрацию крипт на мл раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные крипты можно использовать непосредственно для культивирования кишечных органоидов. Однако часто удобнее криоконсервировать большую партию крипт от каждого поросенка и использовать их позже для культивирования органоидов.
  3. Замораживание эпителиальных крипт
    1. Перенесите объем, соответствующий 900 криптам, в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    2. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу крипт в 1 мл замораживающего раствора. Переложите в криотрубку и поместите флакон в контейнер для замораживания клеток.
    3. Храните контейнер для замораживания клеток при температуре -80 °C в течение 24 часов, а затем переведите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.

2. Создание 3D-органоидов кишечника поросят из замороженных эпителиальных крипт

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-органоиды кишечника поросенка культивируют в коммерческой питательной среде, разработанной для роста органоидов человека, с добавлением 1% P/S и 100 мкг/мл противомикробного агента для первичных клеток и хранят при 4 °C до 1 недели. Внеклеточный матрикс, полученный из опухоли (ECM), используется для культивирования 3D-органоидов. Все наименования товарной продукции представлены в Таблице материалов.

  1. Подготовка материалов
    1. Поместите наконечники пипеток при температуре -20 °C (по крайней мере, на ночь).
    2. Поместите замороженные аликвоты ECM (500 мкл) при температуре 4 °C не менее чем за 1 час.
    3. Предварительно разогрейте 48-луночную тарелку в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 .
    4. Поместите питательную среду в RT.
    5. Предварительно разогрейте на водяной бане до 37 °C.
    6. Поместите небольшое ведро со льдом под капот в асептических условиях.
  2. Размораживание замороженных эпителиальных крипт
    1. Быстро разморозьте флакон, содержащий 900 замороженных крипт, на водяной бане при температуре 37 °C (менее 5 минут).
    2. Переведите раствор крипты в коническую пробирку объемом 15 мл.
    3. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость
    4. Добавьте 150 мкл ECM с охлажденными наконечниками для получения конечной концентрации 150 крипт на 25 мкл ECM. Пипетка вверх и вниз 10 раз для получения однородной суспензии крипт в ECM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите ECM на льду, чтобы избежать полимеризации. Всегда используйте предварительно охлажденные наконечники для пипетов при температуре -20 °C для управления ECM. Пипетка медленная, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в ECM. На этом этапе используется неразбавленный ECM, чтобы предотвратить разрушение мелких капель.
    5. Засейте шесть лунок каплей 25 мкл на лунку с охлажденными наконечниками в предварительно разогретую 48-луночную тарелку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите наконечник вертикально, в центре колодца, и медленно пипетите, не вводя воздух, чтобы получить купол. Здесь используются 48-луночные пластины, так как органоидное число обычно низкое при старте из замороженных склепов.
    6. Инкубировать в течение 30 мин в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 для полимеризации ECM.
    7. Добавьте 250 мкл на лунку питательной среды при RT. Инкубируйте в инкубаторе 37 °C, 5% CO 2 и меняйте питательную среду каждые2-3 дня
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крипты, как правило, не видны после процедуры размораживания, и большинство клеток диссоциируют в ECM (рис. 2B).

3. Прохождение кишечных 3D-органоидов поросенка, полученных из замороженных крипт

ПРИМЕЧАНИЕ: Время получения органоидов из замороженных крипт обычно больше, чем при начале из свежих крипт. Органоиды обычно готовы к расщеплению через 10 дней после оттаивания (рис. 2B).

  1. Подготовка материалов
    1. Поместите замороженные аликвоты ECM (500 мкл) при 4 °C не менее чем на 1 час.
    2. Предварительно прогрейте 24-луночные пластины при температуре 37 °C.
    3. Предварительно подогрейте PBS и реагент для диссоциации ферментов с добавлением 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK на водяной бане при 37 °C.
    4. Поместите питательную среду в RT.
    5. Поместите небольшое ведро со льдом под капот в асептических условиях.
  2. Прохождение 3D-органоидов, полученных из замороженных крипт
    1. Удалите питательные среды и промойте 250 мкл предварительно подогретого PBS при 37 °C.
    2. Добавьте в каждую лунку 250 мкл предварительно подогретого реагента для диссоциации ферментов с добавлением 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за малого количества органоидов диссоциация органоидов выполняется непосредственно в каждой лунке.
    3. Отделите органоиды в ECM, соскоблив пипеткой P1000, и осторожно гомогенизируйте, пипетируя пять раз.
    4. Инкубировать в течение 5 минут в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 . Диссоциируйте клетки, пипеткой вверх и вниз 10 раз с помощью пипетки P1000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы получить изолированные клетки или небольшие клеточные кластеры (<10 клеток). Проверьте диссоциацию под микроскопом. Если большие фрагменты органоидов все еще наблюдаются, повторите шаг 3.2.4.
    5. Добавьте 500 мкл DMEMc в каждую лунку, содержащую диссоциированные клетки, и соберите до 12 лунок в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 3 мл холодного DMEMc.
    6. Центрифуга при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл холодного DMEMc.
    7. Посчитайте ячейки с разведением 1:2 в трипановом синем с помощью счетчика клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматический счетчик ячеек может подсчитывать ячейки в небольших кластерах, если они присутствуют.
    8. Центрифугируют необходимый объем клеточного раствора, чтобы иметь 3000 живых клеток на купол (один купол на лунку 24-луночного планшета) при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    9. Ресуспендируют клетки с помощью 17 мкл холодного DMEMc на 3,000 живых клеток на льду. Отрегулируйте объем до необходимого количества скважин.
    10. Медленно добавьте 33 мкл холодного ECM с охлажденными наконечниками на 3,000 живых клеток и гомогенизируйте на льду, не образуя пузырьков. Отрегулируйте объем до необходимого количества скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки ресуспендируют в растворе, содержащем 1/3 DMEMc и 2/3 ECM. Для каждого купола необходимо 50 мкл этого раствора. Разбавленный ECM дешевле и проще пипетать.
    11. Засейте лунки 50 мкл суспензии ECM-ячеек в лунку с охлажденными наконечниками в предварительно разогретую 24-луночную пластину.
    12. Инкубировать в течение 30 мин в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 для полимеризации ECM.
    13. Добавьте 500 мкл питательной среды на лунку. Инкубируют в инкубаторе 37 °C, 5% CO 2 и меняют питательную среду каждые2-3 дня
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут быть использованы непосредственно для: i) экспериментов, ii) поддержания 3D-культуры органоидов, iii) замораживания или iv) засева монослоев органоидных клеток (рис. 1). Проверяйте рост органоидов с помощью микроскопа каждый день, чтобы выбрать оптимальное время для расщепления органоидов. Органоиды должны иметь четкий и пустой просвет и четко очерченные края. Зрелые органоиды с черным мусором в просвете не следует использовать для расщепления (рис. 3).

4. Поддержание органоидной культуры в 3D

ПРИМЕЧАНИЕ: Для прохождения органоиды должны казаться прозрачными с пустым просветом. Черный мусор появляется в просвете примерно через 5 дней после расщепления и свидетельствует о наличии отмерших клеток. Ограничение количества мертвых клеток во время пассажа предпочтительно для оптимального поддержания культуры. Таким образом, график должен быть скорректирован, чтобы избежать достижения этой стадии зрелости.

  1. Подготовка материала
    1. Поместите аликвоты ECM (500 мкл) при 4 °C для оттаивания не менее 1 часа.
    2. Предварительно разогрейте 24-луночную пластину при температуре 37 °C.
    3. Предварительно подогрейте ферментный диссоциативный реагент с добавлением 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK на водяной бане при 37 °C.
    4. Поместите питательную среду в RT.
    5. Поместите небольшое ведро со льдом под капот в асептических условиях.
  2. Прохождение кишечных 3D-органоидов
    1. Отсоедините органоиды с помощью ECM, соскабливая пипеткой P1000. Гомогенизируют осторожно пипеткой в питательной среде и переносят в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодного DMEMc на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для бассейна с 12 лунками органоидов, культивируемых в куполах по 50 мкл в 24-луночных планшетах, требуется одна коническая трубка объемом 15 мл.
    2. Центрифугируют собранные органоиды при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды образуют белую гранулу на дне трубки. Если органоиды все еще находятся в суспензии в ECM после центрифугирования, тщательно аспирируйте верхнюю надосадочную жидкость (не касаясь слоя ECM), гомогенизируйте пипеткой 10 раз пипеткой P1000 и повторите этап центрифугирования. Слой ECM не должен быть виден после этой процедуры.
    3. Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл предварительно подогретого ферментного реагента диссоциации с добавлением 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы инициировать диссоциацию органоидов.
    4. Инкубировать в течение 5 минут на водяной бане при температуре 37 °C для ферментативного сбраживания.
    5. Механически разрушайте органоиды, пипетируя 10 раз пипеткой P1000. Проверьте клеточную суспензию под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы получить изолированные клетки или небольшие клеточные кластеры. Если крупные фрагменты органоидов все еще наблюдаются, повторите инкубацию (этап 4.2.4) и механическое разрушение (этап 4.2.5).
    6. Добавьте 4 мл ледяного DMEMc. Центрифуга при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C
    7. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу органоидной клетки в 1 мл DMEMc.
    8. Действуйте, как описано выше (этапы 3.2.7 - 3.2.13), чтобы подсчитать клетки и засеять органоидные клетки в 50 мкл куполов ECM, содержащих 3000 живых клеток, в предварительно разогретые 24-луночные планшеты.

5. Замораживание 3D-органоидов

  1. Приготовьте необходимый объем (1 мл для бассейна из двух куполов) замораживающего раствора, содержащего DMEMc с добавлением 10% FBS, 10% DMSO и 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK, и храните на льду (конечная концентрация FBS составляет 18%).
  2. Извлеките питательную среду из лунок, подлежащих замораживанию.
  3. Добавьте 1 мл замораживающего раствора в первую лунку, подлежащую замораживанию, отсоедините ECM путем соскабливания и гомогенизируйте наконечником пипетки.
  4. Органоидную суспензию перенести из первой лунки во вторую лунку для замораживания.
  5. Перенесите бассейн из двух лунок в криотрубку и поместите флакон в контейнер для замораживания клеток.
  6. Храните контейнер для замораживания клеток при температуре -80 °C в течение 24 часов, а затем переведите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.

6. Культура клеточных монослоев, полученных из 3D-органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Монослои органоидных клеток свиньи культивируют в 2D-среде, состоящей из питательной среды, используемой для 3D-органоидов, дополненной 20% FBS.

  1. Подготовка материалов
    1. Подготовьте 2D-носитель и держите его при RT.
    2. Предварительно подогрейте ферментный диссоциативный реагент с добавлением 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK на водяной бане при 37 °C.
  2. Покрытие культурного вкладыша
    1. Простерилизуйте пинцет и перенесите их в шкаф биобезопасности.
    2. Поместите вкладыши для клеточных культур (0,33 см2 ) в 24-луночную пластину с помощью пинцета.
    3. Приготовьте раствор для покрытия, содержащий коллаген IV, разбавленный до 50 мкг/мл в холодном PBS. Пипетка вверх и вниз, чтобы перемешать
    4. Добавьте 150 мкл разбавленного раствора коллагена IV в каждую вставку для культивирования клеток, что соответствует 22,7 мкг/см2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно ориентируйте пипетку вертикально в центр проницаемой мембраны и убедитесь, что раствор коллагена покрывает всю мембрану.
    5. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 и оставьте на ночь (или минимум на 3 часа).
  3. Посев 3D органоидных клеток во вставки для клеточных культур
    1. Приготовьте клеточную суспензию из 3D-органоидов, как описано в шагах 4.2.1 - 4.2.7.
    2. Подсчитайте ячейки с разведением 1:2 в трипановом синем с помощью счетчика клеток и рассчитайте необходимый объем для посева 2,5 х 10 клеток 5 на культурный вкладыш, что соответствует 7,6 х 105 клеток/см2.
    3. Центрифугируют необходимый объем ячейки суспензии при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С.
    4. Во время центрифугирования тщательно аспирируйте раствор покрытия из культуральных вкладышей и дайте высохнуть при RT под колпаком без крышки в течение 5 минут.
    5. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в необходимом объеме 2D-среды с добавлением 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK. Для каждой вставки необходим объем 200 мкл 2D-среды, содержащей клетки.
    6. Засейте 200 мкл клеточной суспензии (2,5 х 105 клеток) на проницаемую мембрану с покрытием (апикальная сторона) (рис. 4А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно пипетите в центре мембраны и держите наконечник вертикально.
    7. Добавьте 500 мкл 2D-среды с добавлением 10 мкМ ингибитора Y27632 ROCK в нижний компартмент (базальная сторона). Инкубировать в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 .
    8. Через сутки после посева замените верхушечную и базальную среды свежей 2D-средой без ингибитора Y27632 ROCK.
    9. Меняйте 2D-носитель каждый день. Монослой сливается через 1 день после посева, и затем его можно использовать для экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) над бланком (вставка без ячеек) подтверждает, что слияние достигнуто (рис. 4B).

7. Иммуноокрашивание монослоев органоидных клеток

  1. Приготовление растворов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем растворов в соответствии с количеством лунок, подлежащих окрашиванию; На каждом этапе требуется 200 мкл раствора для одной скважины. Ссылки на всю коммерческую продукцию приведены в Таблице материалов.
    1. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) под химическим колпаком, добавив 5 мл 32% PFA к 35 мл PBS. Приготовьте 10 мл аликвот и храните при температуре -20 °C.
      ВНИМАНИЕ: Всегда манипулируйте PFA под химическим колпаком, надевая нитриловые перчатки.
    2. Приготовьте раствор 0,2% Triton X100-PBS, добавив 2 мкл Triton X100 к 1 мл PBS непосредственно перед использованием. Держитесь на RT.
    3. Приготовьте 10% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA)-PBS, добавив 100 мг BSA к 1 мл PBS. Держитесь на RT.
    4. Приготовьте 1% раствор BSA-PBS, добавив 10 мг BSA к 1 мл PBS. Держитесь на RT.
    5. Готовят раствор первичного антитела окклюдина, разбавленного в соотношении 1:200, добавляя 5 мкл первичного антитела к 995 мкл 1% PBS BSA. Держите раствор на льду.
    6. Готовят раствор вторичного антитела, разбавленного в соотношении 1:1000, добавляя 1 мкл вторичного антитела к 999 мкл 1% BSA-PBS. Держите раствор на льду, в защищенном от света месте.
    7. Приготовьте раствор фаллоидина TRITC в дозе 10 мкг/мл, добавив 10 мкл TRITC в дозе 1 мг/мл к 990 мкл PBS. Держать на льду, защищенном от света.
  2. Иммуноокрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, все инкубации проводят при RT, при медленном перемешивании на качающейся платформе (30 об/мин). Иммуноокрашивание проводится непосредственно во вставке клеточной культуры.
    1. Удаляют прикорневую и верхушечную среду. Поместите пластину под химический колпак.
    2. Промойте монослои дважды 200 мкл PBS при RT и инкубируйте в течение 5 минут.
    3. Зафиксируйте монослои клетки 200 мкл 4% PFA при RT и инкубируйте в течение 20 мин при RT.
    4. Промойте монослои дважды 200 мкл PBS при RT и инкубируйте в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этапов фиксации и стирки монослой можно хранить при температуре 4 °C в PBS в течение 1 недели.
    5. Удалите PBS, наполните 200 мкл 0,2% Triton X100-PBS и инкубируйте в течение 20 минут.
    6. Промойте монослои дважды 200 мкл PBS при RT и инкубируйте в течение 5 минут.
    7. Добавьте 200 мкл раствора первичного антитела в 1% BSA-PBS и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C при медленном перемешивании на качающейся платформе. Включите отрицательный контрольный колодец, добавив только 1% BSA-PBS без первичного антитела.
    8. Промойте монослои три раза 200 мкл PBS при RT и выдержите в течение 5 минут.
    9. Добавьте 200 мкл вторичного антитела в 1% BSA-PBS и инкубируйте при ЛТ в течение 2 ч, в защищенном от света месте.
    10. Промойте монослои три раза 200 мкл PBS при RT и выдержите в течение 5 минут.
    11. Добавьте 200 мкл фаллоидина TRITC в дозе 10 мкг/мл и инкубируйте в течение 10 мин.
    12. Промойте монослои дважды 200 мкл PBS при RT и инкубируйте в течение 5 минут.
    13. Извлеките PBS и разрежьте мембрану скальпелем.
    14. Восстановите мембрану пинцетом и поместите ее на предметное стекло микроскопа апикальной стороной вверх.
    15. Добавьте 15 мкл монтажной среды с добавлением DAPI в соотношении 1:1000 непосредственно на мембрану. Поместите покровное стекло и запечатайте.
    16. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до получения изображения.

Representative Results

В соответствии с протоколом, описанным выше, эпителиальные крипты получают из кишечника свиньи и криоконсервируют для длительного хранения в жидком азоте (рис. 1 и рис. 2А). После размораживания криптовые стволовые клетки высеваются в ECM (рис. 2B). Структура крипты обычно теряется после этого шага из-за распада структуры крипты в ECM. Органоиды можно наблюдать в течение 3-4 дней, а затем быстро растут и развивают почку (рис. 2Б). Мы успешно получили органоиды после размораживания замороженных крипт в >80% попыток. Примерно через 10 дней после оттаивания (по скорости роста органоидов) выполняется пассаж органоидов для расширения культуры (рис. 3). Органоиды растут быстрее после расщепления, и они имеют разнообразную морфологию, с некоторыми кистозными и большинством отпочковывающихся органоидов. Для оптимального поддержания культуры органоиды, используемые для пассажирования, должны иметь четкий и пустой просвет и четко очерченные края (примеры, обозначенные зелеными стрелками) без черного мусора в просвете (обозначены красными стрелками), как это наблюдается у зрелых органоидов (рис. 3). Мы обнаружили, что обломки черных клеток начинают накапливаться примерно на 6-й день после прохождения. Таким образом, рекомендуется расщепление или замораживание органоидов на 4-5 день после пассажа.

Стадия зрелости органоидов также является важным моментом в получении клеточных монослоев. Органоиды с развитой зрелостью (на что указывает наличие черноклеточного мусора в просвете) не оптимальны для засева монослоев. Обычно мы диссоциируем 3D-органоиды через 4 дня после прохождения, чтобы собрать клетки для 2D-культуры. Приблизительно от одной до трех лунок 3D-органоидов, культивируемых при 3000 клетках на купол ECM 50 мкл, необходимы для посева одной культуральной вставки с ячейками 2,5 x 105. Клетки прикрепляются и образуют полностью сливающийся монослой в течение 1 дня (рис. 4A), что подтверждается высоким TEER около 700 Ω·cm2 (рис. 4B). Тем не менее, края клеток трудно визуализировать с помощью светлопольной микроскопии в этот ранний момент времени, вероятно, из-за низкого уровня дифференцировки. TEER остается высоким в течение 3 дней (рис. 4B).

Окрашивание актина указывает на то, что апикальная сторона эпителиальных клеток ориентирована на просвет в 3D-органоидах (рис. 5А). Органоидные клетки, посеянные в культуральную вставку, образуют сливающийся единый слой эпителиальных клеток с апикальной стороной, ориентированной к верхнему компартменту (рис. 4B, C). Окрашивание окклюдином выявляет наличие плотных соединений на апикальной стороне эпителиальных клеток в 3D-органоидах и в клеточных монослоях (рис. 5A-C).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение методов, используемых для культивирования 3D-органоидов и клеточных монослоев, полученных из органоидов. Эпителиальные крипты выделяют из кишечника поросенка. Эти крипты могут i) быть немедленно использованы для культивирования 3D-органоидов или ii) быть заморожены и храниться в биобанке в жидком азоте. Криоконсервированные крипты можно размораживать и использовать для культивирования 3D-органоидов. Культуру органоидов 3D можно поддерживать с помощью последовательного расщепления или замораживать и хранить в биобанке. Клеточные монослои могут быть получены из 3D-органоидной культуры, чтобы обеспечить доступ к апикальной стороне клеток и изучить функцию эпителиального барьера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Культура 3D-органоидов кишечника свиньи из криоконсервированных эпителиальных крипт. (A) Репрезентативное микроскопическое изображение свежеизолированных крипт тощей кишки. (B) Репрезентативные микроскопические изображения 3D-органоидов, полученных после оттаивания крипт тощей кишки. Органоиды культивировали в куполе ECM объемом 25 мкл в 48-луночном планшете. На рисунке показаны изображения 3D-органоидов через 4, 7, 8, 9 и 10 дней после посева. Масштабная линейка представляет 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Морфология 3D-органоидов кишечника свиньи, полученных из криоконсервированных эпителиальных крипт после первого прохождения. Репрезентативные микроскопические изображения, показывающие развитие органоидов, полученных из криоконсервированных крипт тощей кишки после первого прохождения с 4-го по 7-й день. Зелеными стрелками обозначены четкие органоиды, подходящие для прохождения или засева монослоев. Красными стрелками обозначены зрелые органоиды, не пригодные для расщепления или посева монослоев; Таким образом, колодцы следует использовать до появления этой морфологии. Масштабная линейка представляет 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Характеристики клеточных монослоев, полученных из 3D-органоидов кишечника свиньи . (A) Репрезентативные микроскопические изображения морфологии монослоя в течение 3 дней. Органоидные клетки тощей кишки засевали в 2,5 х 105 клеток в 0,33 см2 клеточных культуральных вставки, покрытых коллагеном IV в дозе 50 нг/мл. Шкала представляет собой 500 мкм. (B) Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) монослоев органоидных клеток в течение 3 дней. Точки, соединенные линией, соответствуют одному и тому же колодцу в разное время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Визуализация органоидов тощей кишки свиньи, культивируемых в 3D или 2D. Конфокальная микроскопия (A) 3D-органоидов через 5 дней после расщепления и монослоев органоидных клеток (B, C) через 3 дня после посева (B: XZ; C: XY раздел). ДНК (синий) окрашивали DAPI. Актин (красный) окрашивали фаллоидином. Окклюдин (зеленый) окрашивали поликлональным антителом. Белыми стрелками обозначена окклюдин, локализованный в месте плотного соединения. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

В этом протоколе описывается метод, используемый для криоконсервации эпителиальных крипт из кишечника поросенка для длительного хранения и последующего культивирования 3D-органоидов. В этом протоколе используется замораживающий раствор, содержащий ДМСО, FBS, ингибитор Y27632 ROCK, DMEM и антибиотики. В другом исследовании на свиньях были получены органоиды из криоконсервированных крипт в аналогичном замораживающем растворе, но без ингибитора ROCK15. Ингибитор Y27632 ROCK был включен для предотвращения апоптоза и поддержания пула стволовых клеток, поскольку после размораживания эпителиальные криптовые клетки диссоциируют, что может привести к гибели клеток («анойкис»)27,28. Интересно, что конские энтероиды были получены из эпителиальных крипт, замороженных в питательной среде, содержащей только DMEM и DMSO16; Этот простой метод еще не был протестирован на эпителиальных криптах свиней. Были опубликованы другие методы выращивания органоидов человека и свиньи из замороженных тканей или биопсий вместо эпителиальных крипт 4,17. Преимуществом данного метода является возможность непосредственно криоконсервировать ткани кишечника без проведения процедуры выделения крипты, что требует времени и лабораторного оборудования. Это может быть удобно, когда ткани нужно собирать далеко от лаборатории. Однако при выделении крипт сразу после убоя большие сегменты кишечника могут быть обработаны для получения очень большого количества крипт, чего нельзя сказать, когда речь идет о небольших замороженных фрагментах тканей. После оттаивания эпителиальных крипт органоиды наблюдались через 3-4 дня после посева и расщеплялись через 10 дней. Это более медленная скорость роста, чем при запуске культуры из свежих эпителиальных крипт, для которых органоиды были получены с 1-го дня после посева, и обычно могут быть разделены примерно на 5-й день11. Khalil et al. также сообщили об отсроченном росте энтероидов свиньи при запуске из замороженных крипт15, предполагая, что стволовым клеткам может потребоваться время для восстановления их пролиферативной способности. Мы также получили меньшее количество органоидов при запуске из замороженных крипт по сравнению со свежими криптами, что может быть связано с гибелью стволовых клеток в процессе замораживания. В некоторых попытках размораживания крипт (<20%) мы не получали органоиды из замороженных крипт, вероятно, из-за неоптимальной процедуры криоконсервации (например, отложенное замораживание после выделения крипты, вероятно, более 1 часа). Таким образом, мы рекомендуем хранить склепы на льду до подсчета и замораживать их как можно быстрее.

Для 3D-органоидов мы решили использовать коммерческую среду для культивирования органоидов, разработанную для людей. Действительно, предыдущие отчеты показали, что органоиды кишечника свиньи эффективно растут в этой среде 8,11,14,19,25,26,29,30. Интересно, чтобы эта питательная среда была готова к использованию и имела стандартизированную концентрацию факторов роста в партии. Однако эта питательная среда является дорогостоящей, ее состав не раскрыт, и, таким образом, невозможно модулировать ее состав. Напротив, в других исследованиях культивировались органоиды кишечника свиньи в специализированных средах, содержащих фармакологические ингибиторы, рекомбинантный фактор роста и/или кондиционированные среды 5,6,7,21. Несмотря на высокую гибкость и дешевизну, этот метод требует много времени для производства кондиционированных сред и может не иметь воспроизводимости из-за потенциальной изменчивости концентрации факторов роста в кондиционированных средах. Таким образом, качество каждой партии кондиционированных сред должно быть подтверждено путем измерения роста органоидов или экспрессии маркерных генов31.

Исследование показало, что органоиды тощей кишки свиньи, культивируемые в той же коммерческой среде для культивирования органоидов, которые использовались здесь, росли быстрее и казались менее дифференцированными по сравнению с энтероидами, культивируемыми со средами, содержащими рекомбинантный фактор роста и/или кондиционированные среды23. Высокое пролиферативное состояние облегчает культивирование 3D-органоидов, но может потребовать индуцирования дифференцировки, чтобы быть более репрезентативным для физиологических характеристик кишечника. В этом протоколе для прохождения 3D-органоидов клетки полностью диссоциируют для подсчета, что позволяет контролировать количество клеток, засеянных в ECM. Это повышает воспроизводимость фенотипа органоидов, на что сильно влияет их плотность. Кроме того, подсчет клеток позволяет избежать получения слишком низкой или переполненной культуры, что требует адаптации графика культивирования. В большинстве других исследований были подготовлены фрагменты органоидов, не полностью диссоциированные на отдельные клетки, и использовался коэффициент разбавления для пассажа. Этот метод более прост, но может вызвать изменчивость в зависимости от плотности органоидов культуры.

Для культивирования в монослоях органоидные клетки засеваются в культуральные вставки, предварительно покрытые тонким слоем ECM, что позволяет прикреплять клетки, но позволяет избежать роста органоидов в 3D. В этом протоколе в качестве белка ECM использовался коллаген IV типа, как описано ранее у свиней23. В других исследованиях с монослоями органоидов свиньи использовался тот же ECM, полученный из опухоли, который использовался здесь для культивирования 3D-органоидов 6,8,9,21,25,30. Преимуществом использования коллагена является возможность стандартизировать концентрацию белка с полностью определенным составом, чего нет в ECM, полученном из опухоли. Критическим шагом для успеха культуры клеточных монослоев является обращение внимания на внешний вид 3D-органоидов-предшественников, которые должны иметь четко очерченные края и пустой просвет без черного мусора. Действительно, органоиды с высоким уровнем созревания и низкой скоростью пролиферации не являются подходящим источником клеток для 2D-культивирования. Таким образом, время диссоциации 3D-органоидов на отдельные клетки имеет решающее значение для успеха этого шага.

Культивирование 2D-монослоев из одиночных клеток позволяет стандартизировать количество высеваемых клеток, что сложнее при отталкивании от органоидных фрагментов, как это делается в некоторых других методах. Мы посеяли 7,6 х 10,5 клеток на см 2 , что является высоким показателем по сравнению с большинством других исследований 21,22,23 у свиней, которые использовали более низкую плотность клеток, в диапазоне от 0,25 х 10,5 клеток на см 2 до 1,78 х 10 клеток на см 2 . Требование большого количества органоидных клеток является ограничением этого протокола, но это позволило нам быстро получить сливающийся монослой, полностью покрывающий культуральную вставку через 1 день. Напротив, Vermeire et al.23 получили слияние через 4-7 дней с более низкой плотностью посеянных клеток (от 0,25 x 10,5 клеток/см2 до 0,4 x10,5 клеток/см2). В некоторых исследованиях также использовались монослои органоидных клеток свиньи, которые не полностью покрывали поверхность культуры для инфекций вирусами 8,30. В этих условиях апикальная сторона эпителиальных клеток доступна для лечения, но для изучения абсорбции питательных веществ или проницаемости эпителия требуются полностью сливающиеся монослои.

Для монослоев органоидных клеток использовали коммерческую среду для культивирования органоидов, дополненную 20% FBS, на основе недавнего исследования монослоев крупного рогатого скота, полученных из энтероидов32. В наших тестах добавка с 20% FBS была необходима для получения полностью сливающихся монослоев, вероятно, из-за высокой потребности в факторе роста. Напротив, другие исследования с использованием той же коммерческой среды установили монослои без дополнительных FBS 8,25,30, но без достижения полного слияния. В других исследованиях также использовались добавки с 20% FBS в специализированной среде для культивирования монослоев органоидных клеток свиньи21,22. В наших экспериментах TEER высокий через 1 день после посева (около 700 Ω · см 2 ) и остается высоким до 3 дня (около 1 500 Ω · см2; это согласуется с образованием плотных соединений, на что указывает экспрессия окклюдина. Van der Hee et al. получили аналогичные значения TEER в течение 72 ч для монослоев органоидных клеток тощей кишки21. Они также продемонстрировали, что монослои могут сохраняться до 12-15 дня с ежедневной сменой среды. Напротив, в других исследованиях сообщалось о гораздо более низких значениях TEER (около 200 Ω·см2) для монослоев органоидных клеток свиньи 6,22. Эти различия между исследованиями могут быть связаны с изучаемым сегментом кишечника или с используемыми средами, которые влияют на дифференцировку эпителия.

В заключение, приведенный выше протокол выращивания 3D-органоидов кишечника свиньи из замороженных эпителиальных крипт облегчает организацию работы по выращиванию. Это снижает потребность в свежих тканях, которые можно получить от живых животных. Мы также объясняем, как создать полностью сливающиеся клеточные монослои, полученные из органоидов свиньи, менее чем за 3 дня. Таким образом, наши протоколы могут быть полезными ресурсами для ученых, изучающих эпителий кишечника свиньи для ветеринарных или биомедицинских исследований.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Institut Carnot France Futur Elevage (проект OrganoPig) и INRAE HOLOFLUX (проект Holopig). Авторы выражают благодарность Генотульскому керну (TRI). Выражаем благодарность Кристель Кнудсен (GenPhySE, INRAE, Тулуза) за тщательную корректуру.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G Store at room temperature.
15 mL conical tube Sarstedt 62.554.502
24-well cell culture plate Corning 003526
48-well cell culture plate Corning 003548
50 mL polypropylene conical tube Falcon 352070
Bovine Serum Albumine (BSA) Euromedex A6003 Store at 4 °C.
Centrifuge Universal 320 R Hettich 1406
Collagene type IV from human placenta Sigma C5533 Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C.
CoolCell LX Cell Freezing Container Corning 432003 Used to cryopreserve crypts and organoids.
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific 16842556
Coverslips, 22 mm x 50 mm VWR 630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL Clear line 390706 Used to cryopreserve crypts and organoids.
DAPI Invitrogen D1306 Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C
Dithiothreitol (DTT) Merck 10197777001 Store at 4 °C.
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 31966047 Store at 4 °C.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25-950-CQC Store at room temperature.
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide VWR 631-9483
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106 Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Fisherbrand Sterile Cell Strainers Thermo Fisher Scientific 22363549 Used for crypt isolation.
Fixed Tilt 3D Platform Rotator VWR 97025-564 Used for incubations in the immunostaining protocol.
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010015 Store at 4 °C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher Scientific 12605-010 Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell Technology 6010 Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week.
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Corning 353095
Inverted microscope Nikon Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C.
Mounting medium for fluorescence with DAPI Vectashield H1250 Store at 4 °C.
Occludin polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 71-1500 Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200.
Paraformaldehyde 32% Electron microscopy science 15714 Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Phalloidin TRITC Sigma P1951 Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C.
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C.
ROCK Inhibitor (Y27632) ATCC ACS-3030 Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C.
Rotating shaker mix XL Clear line 062646CL Used for crypt isolation.
Stripette Serological Pipets 10 mL Corning 4488
Tissue Culture Dish TPP 93100
Triton X100 Sigma 8787 Store at room temperature.
Trypan Blue stain 0.4% Thermo Fisher Scientific T10282 Store at room temperature.
Vacuum system Vacusip Integra 159000 Used to remove the medium of organoid wells.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).
  5. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).
  6. Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).
  7. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  8. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).
  9. vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).
  10. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
  11. Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).
  12. Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  13. Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
  14. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
  15. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
  16. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
  17. Tsai, Y. -H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  18. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  19. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  20. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  21. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  22. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).
  23. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).
  24. Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).
  25. Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).
  26. Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
  29. Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).
  30. Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).
  31. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  32. Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).

Tags

Биология выпуск 192
Культура 3D-органоидов кишечника поросенка из криоконсервированных эпителиальных крипт и создание клеточных монослоев
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mussard, E., Lencina, C., Boudry,… More

Mussard, E., Lencina, C., Boudry, G., Achard, C. S., Klotz, C., Combes, S., Beaumont, M. Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (192), e64917, doi:10.3791/64917 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter