Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kultur av Piglet Intestinal 3D Organoids fra kryopreserverte epitelkrypter og etablering av cellemonolayers

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64917
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 4, 1, 1
1GenPhySE, Université de Toulouse, INRAE, ENVT, 2Lallemand Animal Nutrition, 3Institut NuMeCan, INRAE, INSERM, Université de Rennes, 4FG 16: Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch-Institute

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å dyrke gris intestinal 3D-organoider fra kryopreserverte epitelkrypter. Vi beskriver også en metode for å etablere cellemonolag avledet fra 3D-organoider, noe som gir tilgang til den apikale siden av epitelceller.

Abstract

Intestinale organoider blir i økende grad brukt til å studere tarmepitelet for modellering av fordøyelsessykdommer, eller for å undersøke interaksjoner med legemidler, næringsstoffer, metabolitter, patogener og mikrobiota. Metoder for å dyrke intestinale organoider er nå tilgjengelige for flere arter, inkludert griser, som er en art av stor interesse både som husdyr og som en translasjonsmodell for mennesker, for eksempel for å studere zoonotiske sykdommer. Her gir vi en grundig beskrivelse av en prosedyre som brukes til å dyrke gris intestinal 3D-organoider fra frosne epitelkrypter. Protokollen beskriver hvordan man kryokonserverer epitelkrypter fra gristarmen og de påfølgende prosedyrene for å dyrke 3D-intestinale organoider. De viktigste fordelene ved denne metoden er (i) den tidsmessige dissosiasjonen av isoleringen av krypter fra kulturen av 3D-organoider, (ii) utarbeidelse av store lagre av kryopreserverte krypter avledet fra flere tarmsegmenter og fra flere dyr samtidig, og dermed (iii) reduksjonen i behovet for å prøve ferskt vev fra levende dyr. Vi beskriver også en protokoll for å etablere cellemonolag avledet fra 3D-organoider for å gi tilgang til den apikale siden av epitelceller, som er stedet for interaksjoner med næringsstoffer, mikrober eller legemidler. Samlet sett er protokollene beskrevet her en nyttig ressurs for å studere tarmepitelet gris i veterinær og biomedisinsk forskning.

Introduction

Tarmepitelet dannes av et monolag av celler som dekker fordøyelsesslimhinnen ved grensesnittet med luminalmiljøet. Denne posisjonen er forbundet med ulike funksjoner, som næringsopptak og barrierefunksjon, som støttes av tilstedeværelsen av stamceller og flere differensierte epitelcelletyper (absorberende, enteroendokrine, Paneth og begerceller)1. Immortaliserte cellelinjer som tradisjonelt brukes til å studere epitelceller har store begrensninger, siden de ikke reflekterer tarmepitelets cellulære kompleksitet og presenterer genomiske abnormiteter2. Utviklingen av tredimensjonale (3D) organoider av Sato et al.3 ga en ny modell for å studere tarmepitelet med en forbedret fysiologisk relevans. Faktisk er intestinale organoider avledet fra ikke-transformerte stamceller, består av flere celletyper og rekapitulerer funksjonaliteten til tarmepitelet. Intestinale organoider blir i økende grad brukt til å forstå utviklingen og funksjonene til tarmepitelet og dets interaksjoner med patogener, næringsstoffer, toksiner, legemidler, mikrobiota og dets metabolitter2.

Opprinnelig utviklet for mennesker og mus, har metodene som brukes til å dyrke intestinale organoider nylig blitt tilpasset andre arter, inkludert griser4. Gonzales et al.5 var de første til å dyrke grisorganoider fra jejunum ; Siden da har svineorganoider blitt beskrevet for andre tarmsegmenter (duodenum, ileum og colon)6,7,8, og har vist seg å beholde en stedsspesifikk fenotype 9,10,11. Gris intestinal 3D organoider er nå ofte brukt til å studere effekten av næringsstoffer 12,13 eller enteriske infeksjoner 6,8,14.

De fleste studiene har beskrevet kulturen av intestinale organoider med utgangspunkt i ferskt isolerte epitelkrypter. Dette er imidlertid ikke alltid mulig av logistiske årsaker, spesielt når du arbeider med store dyr som griser. Faktisk kan dyrefasiliteter for griser ligge langt fra laboratoriet der organoider dyrkes, noe som kompliserer arbeidsorganisasjonen. Dessuten er organoidkultur tidkrevende; Dermed er det ikke praktisk å samtidig dyrke flere organoide linjer, for eksempel fra forskjellige tarmsegmenter eller flere dyr. For å omgå disse problemene har noen få studier på mennesker, hester og griser beskrevet metoder for å dyrke organoider fra frosne tarmvev (eller biopsier) eller fra isolerte epitelkrypter 4,15,16,17. Disse metodene tillater kryopreservering av tarmepitelstamceller fra flere tarmsegmenter av et enkelt dyr, som deretter kan brukes til å dyrke organoider når det trengs. Videre tillater dette en sterk reduksjon i antall levende dyr som brukes som donorer av stamceller, siden store lagre av kryopreserverte krypter kan opprettes (prinsipper for 3R). En annen fordel med denne metoden er veksten av intestinale organoider bare fra dyr av interesse etter å ha oppnådd fenotypiske eller genotypiske resultater, noe som er svært kostnadseffektivt.

In vivo er intestinale epitelceller polariserte, med den apikale siden rettet mot lumen. In vitro, i 3D-organoider, vender den apikale siden av epitelceller også mot lumen (dvs. inne i organoidene)4. Denne organisasjonen forhindrer tilgang til den apikale siden, noe som er et problem når man studerer effekten av luminale komponenter (f.eks. Næringsstoffer, mikrober, metabolitter) på epitelceller. For å omgå denne ulempen har flere metoder blitt utviklet, for eksempel kulturen av organoide celler som 2D-monolag, mikroinjeksjon og polaritetsreversering ("apical-out organoids")18,19. Kulturen av organoidcellemonolayers fremstår som det mest effektive og håndterbare systemet. Prinsippet er å dissosiere 3D-organoider til enkeltceller og frø dem på et cellekulturfartøy som tidligere var belagt med et tynt lag ekstracellulær matriks (ECM)20. Ved disse kulturbetingelsene vender epitelcellenes apikale side oppover, og er dermed tilgjengelig for eksperimentell behandling20. Kulturen av organoidcellemonolag ble nylig tilpasset gristarmen21,22; cellemonolag avledet fra gris 3D-organoider har blitt brukt til flere applikasjoner, inkludert studiet av enteriske infeksjoner 6,23,24,25, transport av næringsstoffer9 og modellering av fordøyelsessykdommer 26.

Her presenterer denne studien først en detaljert protokoll for dyrkning og vedlikehold av 3D-organoider fra gris intestinal avledet fra kryopreserverte epitelkrypter (figur 1). Deretter beskrives en protokoll for å etablere cellemonolayers fra gris intestinal 3D-organoider. Metodene beskrevet her gir eksperimentelle verktøy som kan brukes til å studere grisens tarmepitel for næringstransport, barrierefunksjon og vertsmikroorganismeinteraksjoner.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av den lokale etiske komiteen (nr. TOXCOM/0136/PP) i samsvar med det europeiske direktivet om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål (2010/63/EU). Denne protokollen er beskrevet for jejunum som et eksempel, men den kan brukes for hvert segment av tynn- og tyktarmen (tolvfingertarmen, jejunum, ileum, colon).

1. Isolering av epitelkrypter fra gristarmen

MERK: Forbered et lager av komplett Dulbecco's modifisert ørnemedium (DMEMc) med DMEM supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (P / S). Tilbered 50 ml alikoter og oppbevar dem ved 4 °C i 1 måned.

  1. Forberedelse av løsninger (som skal gjøres på dagen for kryptisolasjonen)
    1. Klargjør dissosiasjonsoppløsningen som inneholder fosfatbufret saltvann (PBS), 3 mM dithiothreitol (DTT), 9 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 10 μM Y27632 ROCK-hemmer og 1% penicillin-streptomycin (P/S) og oppbevares på is.
    2. Forbered fryseoppløsningen som inneholder DMEMc, 10% FBS, 10% dimetylsulfoksid (DMSO) og 10 μM Y27632 ROCK-hemmer og oppbevar på is (den endelige FBS-konsentrasjonen er 18%).
    3. Klargjør transportløsningen med kald PBS supplert med 1 % P/S og oppbevar den på is.
  2. Isolering av epitelkrypter
    1. Slakt en gris ved elektronarkose etterfulgt av ekssanguinering.
    2. Umiddelbart etter slakting, åpne magen til smågrisen med en skalpell og fjern hele tarmen.
    3. Samle ca. 2 cm av et tarmsegment og oppbevar det i kaldtransportløsning. Hold segmentet på is til kryptisolasjon (opptil 2 timer).
    4. Legg vevet i en petriskål. Åpne tarmsegmentet i lengderetningen og vask vevet forsiktig i kald PBS supplert med 1% P/S for å fjerne tarminnholdet.
    5. Overfør vevet til en ny petriskål fylt med 10 ml kald PBS tilsatt 1% P/S.
    6. Hold vevet med pinsett og fjern villi og gjenværende slim ved å skrape med et mikroskopglass.
      MERK: Fjerningen av villi (den tungeformede strukturen) kan kontrolleres ved mikroskopisk observasjon av supernatanten.
    7. Overfør vevet til et 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml iskald dissosiasjonsløsning og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur (RT) på en roterende shaker (15 rpm).
    8. Overfør vevet til en ny petriskål og tilsett 10 ml kald PBS tilsatt 1 % P/S.
    9. Isoler kryptene mekanisk ved å skrape slimhinnen fast med et mikroskoplysbilde.
      MERK: Under et mikroskop, kontroller tilstedeværelsen av epitelkrypter i PBS (figur 2A) .
    10. Aspirer kryptløsningen med en serologisk pipett og filtrer gjennom en 100 μm cellesil i et 50 ml konisk rør.
    11. Pipet 10 μL av løsningen og verifisere tilstedeværelsen av krypter under et mikroskop. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    12. Under et sterilt biosikkerhetsskap, kast supernatanten og resuspender pelleten av krypter i 10 ml kald DMEMc supplert med 10 μM Y27632 ROCK-hemmer.
    13. Pipet 10 μL av kryptløsningen inn i en 48-brønnsplate. Telle antall krypter manuelt under et mikroskop med en 10x forstørrelse, og beregne konsentrasjonen av krypter per ml løsning.
      MERK: De isolerte kryptene kan brukes direkte til å dyrke tarmorganoider. Imidlertid er det ofte mer praktisk å kryobevare en stor mengde krypter fra hver gris og bruke dem senere til organoidkultur.
  3. Frysing av epitelkrypter
    1. Overfør et volum tilsvarende 900 krypter i et 15 ml konisk rør. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    2. Kast supernatanten og resuspender pelleten av krypter i 1 ml av fryseoppløsningen. Overfør til et kryorør og legg hetteglasset i en cellefrysebeholder.
    3. Oppbevar cellefrysebeholderen ved -80 °C i 24 timer og overfør deretter hetteglassene til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.

2. Etablering av smågris intestinal 3D-organoider fra frosne epitelkrypter

MERK: Piglet intestinal 3D-organoider dyrkes i et kommersielt kulturmedium formulert for vekst av humane organoider, supplert med 1% P / S og 100 μg / ml av et antimikrobielt middel for primære celler, og lagres ved 4 ° C i opptil 1 uke. En tumoravledet ekstracellulær matrise (ECM) brukes til kulturen av 3D-organoider. Alle referanser til kommersielle produkter er presentert i materialfortegnelsen.

  1. Forberedelse av materialer
    1. Plasser pipettespissene ved -20 °C (minst over natten).
    2. Plasser de frosne alikotene i ECM (500 μL) ved 4 °C minst 1 time på forhånd.
    3. Forvarm en 48-brønns plate i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator.
    4. Plasser kulturmediet på RT.
    5. Forvarm et vannbad ved 37 °C.
    6. Plasser en liten isbøtte under panseret under aseptiske forhold.
  2. Tining av frosne epitelkrypter
    1. Tine et hetteglass med 900 frosne krypter raskt i vannbad ved 37 °C (mindre enn 5 minutter).
    2. Overfør kryptløsningen til et 15 ml konisk rør.
    3. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved RT. Fjern supernatanten
    4. Tilsett 150 μL av ECM med avkjølte spisser for å oppnå en endelig konsentrasjon på 150 krypter per 25 μL ECM. Pipett opp og ned 10 ganger for å oppnå en homogen suspensjon av krypter i ECM.
      MERK: Hold alltid ECM på is for å unngå polymerisering. Bruk alltid forkjølte pipetspisser ved -20 °C for å manipulere ECM. Pipett sakte for å unngå å lage luftbobler i ECM. En ufortynnet ECM brukes på dette trinnet for å forhindre at de små dråpene kollapser.
    5. Frø seks brønner med 25 μL fall per brønn med avkjølte spisser i en forvarmet 48-brønnsplate.
      MERK: Hold spissen vertikal, i midten av brønnen, og pipe sakte uten å introdusere luft for å få en kuppel. Her brukes 48-brønnsplater, siden organoidnummeret vanligvis er lavt når man starter fra frosne krypter.
    6. Inkuber i 30 minutter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for polymerisering av ECM.
    7. Tilsett 250 μL per brønn kulturmedium ved RT. Inkuber i en 37 ° C, 5% CO 2 -inkubator og bytt kulturmedium hver2-3 dager
      MERK: Kryptene er vanligvis ikke synlige etter tineprosedyren, og de fleste cellene dissosieres i ECM (figur 2B).

3. Passasje av smågris intestinal 3D-organoider avledet fra frosne krypter

MERK: Tiden for å skaffe organoider fra frosne krypter er vanligvis lengre enn når du starter fra ferske krypter. Organoider er vanligvis klare for splitting 10 dager etter tining (figur 2B).

  1. Forberedelse av materialer
    1. Plasser de frosne alikotene i ECM (500 μL) ved 4 °C i minst 1 time.
    2. Forvarm 24-brønnsplatene ved 37 °C.
    3. Forvarm PBS og enzymdissosiasjonsreagenset tilsatt 10 μM Y27632 ROCK-hemmer i vannbad ved 37 °C.
    4. Plasser kulturmediet på RT.
    5. Plasser en liten isbøtte under panseret under aseptiske forhold.
  2. Passasje av 3D-organoider avledet fra frosne krypter
    1. Fjern dyrkningsmediet og vask med 250 μL forvarmet PBS ved 37 °C.
    2. Tilsett 250 μL forvarmet enzymdissosiasjonsreagens tilsatt 10 μM Y27632 ROCK-hemmer ved 37 °C i hver brønn.
      MERK: På grunn av det lave antallet organoider utføres dissosiasjonen av organoider direkte i hver brønn.
    3. Løsne organoidene i ECM ved å skrape med en P1000-pipet, og homogeniser forsiktig ved å pipettere fem ganger.
    4. Inkuber i 5 minutter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Dissosiere cellene ved å pipettere opp og ned 10 ganger med en P1000-pipet.
      MERK: Målet er å oppnå isolerte celler eller småcelleklynger (<10 celler). Bekreft dissosiasjonen under et mikroskop. Hvis store fragmenter av organoider fortsatt observeres, gjenta trinn 3.2.4.
    5. Tilsett 500 μL DMEMc i hver brønn som inneholder dissosierte celler, og basseng opptil 12 brønner i et 15 ml konisk rør inneholdende 3 ml kald DMEMc.
    6. Sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml kald DMEMc.
    7. Tell cellene med en fortynning på 1:2 i Trypan-blått med en celleteller.
      MERK: Den automatiserte celletelleren kan telle cellene i små klynger, hvis de finnes.
    8. Sentrifuge det nødvendige volumet av celleløsningen for å ha 3000 levende celler per kuppel (en kuppel per brønn på 24-brønnplaten) ved 500 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
    9. Resuspender cellene med 17 μL kald DMEMc per 3000 levende celler på is. Juster volumet til ønsket antall brønner.
    10. Tilsett sakte 33 μL kald ECM med avkjølte spisser per 3000 levende celler og homogeniser på is uten å lage bobler. Juster volumet til ønsket antall brønner.
      MERK: Cellene resuspenderes i en oppløsning som inneholder 1/3 DMEMc og 2/3 ECM. For hver kuppel er det nødvendig med 50 μL av denne løsningen. Fortynnet ECM er billigere og enklere å pipe.
    11. Frø brønnene med 50 μL ECM-cellesuspensjon per brønn med avkjølte spisser i en forvarmet 24-brønnplate.
    12. Inkuber i 30 minutter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for polymerisering av ECM.
    13. Tilsett 500 μL av kulturmediet per brønn. Inkuber i en 37 ° C, 5% CO 2 -inkubator og bytt kulturmedium hver2-3 dager
      MERK: Organoidene kan enten brukes direkte til i) eksperimenter, ii) vedlikehold av 3D-organoidkulturen, iii) frysing eller iv) såing av organoidcellemonolagene (figur 1). Kontroller veksten av organoider med et mikroskop hver dag for å velge den optimale timingen for splitting av organoider. Organoidene må ha et klart og tomt lumen og veldefinerte kanter. Modne organoider med svart rusk i lumen bør ikke brukes til spalting (figur 3).

4. Vedlikehold av organoidkultur i 3D

MERK: For passasje skal organoider vises klare med et tomt lumen. Svart rusk vises i lumen ca. 5 dager etter splittelse og indikerer tilstedeværelsen av døde celler. Begrensning av antall døde celler på tidspunktet for passering er å foretrekke for optimalt vedlikehold av kulturen. Tidsplanen bør derfor tilpasses for å unngå å nå dette modenhetsstadiet.

  1. Forberedelse av materiale
    1. Plasser alikotene i ECM (500 μL) ved 4 °C for tining i minst 1 time.
    2. Forvarm en 24-brønns plate ved 37 °C.
    3. Forvarm enzymdissosiasjonsreagenset tilsatt 10 μM Y27632 ROCK-hemmer i vannbad ved 37 °C.
    4. Plasser kulturmediet på RT.
    5. Plasser en liten isbøtte under panseret under aseptiske forhold.
  2. Passasje av intestinale 3D-organoider
    1. Løsne organoidene med ECM ved å skrape med en P1000-pipet. Homogeniser forsiktig ved pipettering i kulturmediet, og overfør til et 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml kald DMEMc på is.
      MERK: Ett 15 ml konisk rør er nødvendig for et basseng med 12 brønner av organoider dyrket i 50 μL kupler i 24-brønnsplater.
    2. Sentrifuger de oppsamlede organoidene ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      MERK: Organoidene danner en hvit pellet i bunnen av røret. Hvis organoidene fortsatt er i suspensjonen i ECM etter sentrifugering, aspirer den øvre supernatanten forsiktig (uten å berøre ECM-laget), homogeniser ved å pipettere 10 ganger med en P1000-pipet, og gjenta sentrifugeringstrinnet. ECM-laget skal ikke være synlig etter denne prosedyren.
    3. Suspirer supernatanten forsiktig og resuspender cellepelleten i 1 ml forvarmet enzymdissosiasjonsreagens tilsatt 10 μM Y27632 ROCK-hemmer. Pipett opp og ned 10 ganger for å initiere dissosiasjon av organoider.
    4. Bløt i 5 minutter i et vannbad på 37 °C for enzymatisk fordøyelse.
    5. Forstyrr organoidene mekanisk ved å pipettere 10 ganger med en P1000-pipet. Kontroller cellesuspensjonen under mikroskopet.
      MERK: Målet er å oppnå isolerte celler eller småcelleklynger. Hvis store organoidfragmenter fortsatt observeres, gjenta inkubasjonen (trinn 4.2.4) og den mekaniske forstyrrelsen (trinn 4.2.5).
    6. Tilsett 4 ml iskald DMEMc. Sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C
    7. Kast supernatanten og resuspender organoidcellepelleten i 1 ml DMEMc.
    8. Fortsett som beskrevet ovenfor (trinn 3.2.7 til 3.2.13) for å telle cellene og frø organoidcellene i 50 μL ECM-kupler som inneholder 3000 levende celler i forvarmede 24-brønnsplater.

5. Frysing av 3D-organoider

  1. Forbered det nødvendige volumet (1 ml for et basseng med to kupler) fryseoppløsning inneholdende DMEMc supplert med 10% FBS, 10% DMSO og 10 μM Y27632 ROCK-hemmer og oppbevar på is (den endelige FBS-konsentrasjonen er 18%).
  2. Fjern dyrkningsmediet fra brønnene som skal fryses.
  3. Tilsett 1 ml fryseløsning til den første brønnen som skal fryses, løsne ECM ved å skrape og homogeniser med pipetspissen.
  4. Overfør organoidsuspensjonen fra den første brønnen til den andre brønnen som skal fryses.
  5. Overfør bassenget av de to brønnene til et kryorør og legg hetteglasset i en cellefrysebeholder.
  6. Oppbevar cellefrysebeholderen ved -80 °C i 24 timer, og overfør deretter hetteglassene til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.

6. Kultur av cellemonolayers avledet fra 3D-organoider

MERK: Monolayers av grisorganoidceller dyrkes i et 2D-medium sammensatt av kulturmediet som brukes til 3D-organoider supplert med 20% FBS.

  1. Forberedelse av materialer
    1. Forbered 2D-mediet og hold det på RT.
    2. Forvarm enzymdissosiasjonsreagenset tilsatt 10 μM Y27632 ROCK-hemmer i vannbad ved 37 °C.
  2. Belegg av kulturinnsatsen
    1. Steriliser en pinsett og overfør dem til biosikkerhetsskapet.
    2. Plasser cellekulturinnsatsene (0,33 cm2) i en 24-brønnsplate med pinsetten.
    3. Klargjør beleggoppløsningen som inneholder kollagen IV fortynnet ved 50 μg/ml i kald PBS. Pipet opp og ned for å blande
    4. Tilsett 150 μL av den fortynnede kollagen IV-oppløsningen til hver cellekulturinnsats, noe som tilsvarer 22,7 μg/cm2.
      MERK: Orienter pipetten forsiktig vertikalt inn i midten av den permeable membranen og kontroller at kollagenoppløsningen dekker hele membranen.
    5. Plasser platen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator og la stå over natten (eller i minst 3 timer).
  3. Såing av 3D-organoide celler i cellekulturinnsatser
    1. Forbered en cellesuspensjon fra 3D-organoidene, som beskrevet i trinn 4.2.1 til 4.2.7.
    2. Tell cellene med en fortynning på 1:2 i Trypanblått med en celleteller, og beregn nødvendig volum til frø 2,5 x 10 5 celler per dyrkningsinnsats, tilsvarende 7,6 x 105 celler/cm2.
    3. Sentrifuger nødvendig volum av cellesuspensjonen ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    4. Under sentrifugering, aspirer beleggløsningen forsiktig fra kulturinnsatsene, og la den tørke ved RT under hetten uten lokket i 5 minutter.
    5. Etter sentrifugering skal supernatanten kastes og cellepelleten resuspenderes i nødvendig volum av 2D-medium tilsatt 10 μM Y27632 ROCK-hemmer. Et volum på 200 μL 2D-medium som inneholder cellene er nødvendig for hver innsats.
    6. Frø 200 μL av cellesuspensjonen (2,5 x 105 celler) på den belagte permeable membranen (apikal side) (figur 4A).
      MERK: Pipett sakte i midten av membranen og hold spissen loddrett.
    7. Tilsett 500 μL av 2D-mediet supplert med 10 μM Y27632 ROCK-hemmer til underrommet (basalsiden). Inkubere i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
    8. En dag etter såing, erstatt apikale og basale medier med ferskt 2D-medium uten Y27632 ROCK-hemmer.
    9. Bytt 2D-medium hver dag. Monolaget blir konfluent 1 dag etter såing, og kan deretter brukes til eksperimenter.
      MERK: En verdi for transepitelial elektrisk motstand (TEER) over tomme verdier (sett inn uten celler) bekrefter at konfluens er nådd (figur 4B).

7. Immunostaining av organoidcellemonolayers

  1. Forberedelse av løsninger
    MERK: Juster volumet av løsninger i henhold til antall brønner som skal farges; 200 μL av løsningen er nødvendig i hvert trinn for en brønn. Referanser til alle kommersielle produkter er gitt i materialfortegnelsen.
    1. Forbered en 4% paraformaldehyd (PFA) løsning under en kjemisk hette ved å tilsette 5 ml 32% PFA til 35 ml PBS. Tilbered 10 ml alikoter og oppbevares ved -20 °C.
      FORSIKTIG: Manipuler alltid PFA under den kjemiske hetten mens du bruker nitrilhansker.
    2. Forbered en oppløsning på 0,2% Triton X100-PBS, ved å tilsette 2 μL Triton X100 til 1 ml PBS umiddelbart før bruk. Hold på RT.
    3. Lag en 10% bovint serumalbumin (BSA)-PBS-løsning ved å tilsette 100 mg BSA til 1 ml PBS. Hold på RT.
    4. Forbered en 1% BSA-PBS-løsning ved å tilsette 10 mg BSA til 1 ml PBS. Hold på RT.
    5. Klargjør en oppløsning av okkludins primære antistoff fortynnet ved 1:200 ved å tilsette 5 μL primærantistoff til 995 μL 1% PBS BSA. Hold løsningen på is.
    6. Forbered en oppløsning av det sekundære antistoffet fortynnet ved 1:1 000 ved å tilsette 1 μL sekundært antistoff til 999 μL 1% BSA-PBS. Hold løsningen på is, beskyttet mot lys.
    7. Lag en oppløsning av falloidin TRITC ved 10 μg/ml ved å tilsette 10 μl TRITC ved 1 mg/ml til 990 mikrol PBS. Hold på is, beskyttet mot lys.
  2. Immunfarging
    MERK: Med mindre annet er angitt, utføres alle inkubasjonene ved RT, under langsom omrøring på en gyngeplattform (30 o / min). Immunfargingen utføres direkte i cellekulturinnsatsen.
    1. Fjern det basale og apikale mediet. Plasser platen under kjemikaliehetten.
    2. Vask monolagene to ganger med 200 μL PBS ved RT og inkuber i 5 minutter.
    3. Fest cellemonolagene med 200 μL 4% PFA ved RT og inkuber i 20 minutter ved RT.
    4. Vask monolagene to ganger med 200 μL PBS ved RT og inkuber i 5 minutter.
      MERK: Etter fikserings- og vasketrinnene kan monolaget oppbevares ved 4 °C i PBS i 1 uke.
    5. Fjern PBS, permeabiliser med 200 μL av 0,2% Triton X100-PBS, og inkuber i 20 minutter.
    6. Vask monolagene to ganger med 200 μL PBS ved RT og inkuber i 5 minutter.
    7. Tilsett 200 μL primær antistoffløsning i 1 % BSA-PBS og inkuber over natten ved 4 °C, under langsom omrøring på en gyngeplattform. Inkluder en negativ kontrollbrønn ved å legge til bare 1% BSA-PBS uten det primære antistoffet.
    8. Vask monolayers tre ganger med 200 μL PBS ved RT og inkuber i 5 minutter.
    9. Tilsett 200 μL sekundært antistoff i 1% BSA-PBS og inkuber ved RT i 2 timer, beskyttet mot lyset.
    10. Vask monolayers tre ganger med 200 μL PBS ved RT og inkuber i 5 minutter.
    11. Tilsett 200 μl falloidin TRITC ved 10 μg/ml og inkuber i 10 minutter.
    12. Vask monolagene to ganger med 200 μL PBS ved RT og inkuber i 5 minutter.
    13. Fjern PBS og kutt membranen med en skalpell.
    14. Gjenopprett membranen med en pinsett og legg den på et mikroskoplysbilde, med den apikale siden vendt oppover.
    15. Tilsett 15 μL av monteringsmediet supplert med DAPI ved 1:1 000 direkte på membranen. Plasser en deksel og forsegling.
    16. Oppbevares ved 4 °C, beskyttet mot lys, inntil avbildning.

Representative Results

Etter protokollen beskrevet ovenfor oppnås epitelkrypter fra gristarmen og kryopreservert for langtidslagring i flytende nitrogen (figur 1 og figur 2A). Etter tining blir kryptstamcellene sådd i ECM (figur 2B). Kryptstrukturen går vanligvis tapt etter dette trinnet, på grunn av oppløsningen av kryptstrukturen i ECM. Organoidene kan observeres innen 3-4 dager, og deretter vokse raskt og utvikle spirende strukturer (figur 2B). Vi oppnådde organoider etter tining av frosne krypter i >80% av forsøkene. Ca. 10 dager etter tining (i henhold til organoiders veksthastighet) utføres en passasje av organoider for å utvide kulturen (figur 3). Organoidene vokser raskere etter splitting, og de presenterer forskjellige morfologier, med noen cystiske og et flertall av spirende organoider. For optimal vedlikehold av kulturen må organoidene som brukes til passasjering presentere et klart og tomt lumen og veldefinerte kanter (eksempler indikert med grønne piler) uten svart rusk i lumen (indikert med røde piler), som observert i modne organoider (figur 3). Vi fant at svart celleavfall begynner å samle seg rundt dag 6 etter passasje. Det anbefales derfor å splitte eller fryse organoidene på dag 4-5 etter passasje.

Modenhetsstadiet av organoider er også et viktig punkt i å oppnå cellemonolag. Organoider med avansert modenhet (indikert ved tilstedeværelse av svartcelleavfall i lumen) er ikke optimale for frømonolag. Vi dissosierer vanligvis 3D-organoider 4 dager etter passering for å samle celler til 2D-kultur. Omtrent en til tre brønner av 3D-organoider dyrket ved 3000 celler per 50 μL kuppel av ECM er nødvendig for såing av en kulturinnsats med 2,5 x 105 celler. Celler fester seg og danner et fullt konfluent monolag innen 1 dag (figur 4A), som bekreftes av den høye TEER på rundt 700 Ω · cm2 (figur 4B). Cellekantene er imidlertid vanskelige å visualisere ved lysfeltmikroskopi på dette tidlige tidspunktet, sannsynligvis på grunn av et lavt differensieringsnivå. TEER forblir høy i 3 dager (figur 4B).

Aktinfarging indikerer at den apikale siden av epitelcellene er orientert mot lumen i 3D-organoider (figur 5A). Organoidceller sådd i kulturinnsats danner et konfluent enkeltlag av epitelceller, med den apikale siden orientert mot det øvre rommet (figur 4B,C). Okkludinfarging avslører tilstedeværelsen av tette kryss på den apikale siden av epitelcellene i 3D-organoider og i cellemonolag (figur 5A-C).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av metodene som brukes til å dyrke 3D-organoider og cellemonolag avledet fra organoider. Epitelkrypter er isolert fra gristarmen. Disse kryptene kan i) brukes umiddelbart til å dyrke 3D-organoider eller ii) fryses og lagres i en biobank i flytende nitrogen. Kryopreserverte krypter kan tines og brukes til å dyrke 3D-organoider. 3D-organoidkulturen kan opprettholdes med suksessiv splitting, eller fryses og lagres i biobanken. Cellemonolag kan fås fra 3D-organoidkulturen for å gi tilgang til den apikale siden av cellene og studere epitelbarrierefunksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Dyrkning av grisetarm 3D-organoider fra kryopreserverte epitelkrypter. (A) Representativt mikroskopisk bilde av nylig isolerte jejunale krypter. (B) Representative mikroskopiske bilder av 3D-organoider oppnådd etter tining av jejunalkryptene. Organoidene ble dyrket i en 25 μL kuppel av ECM i en 48-brønns plate. Figuren viser bilder av 3D-organoidene ved 4, 7, 8, 9 og 10 dager etter såing. Skalastangen representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Morfologi av grisetarm 3D-organoider avledet fra kryopreserverte epitelkrypter etter første passasje. Representative mikroskopiske bilder som viser utviklingen av organoider avledet fra kryopreserverte jejunumkrypter etter første passasje fra dag 4 til dag 7. Grønne piler indikerer klare organoider som passer for passasje eller såing av monolag. Røde piler indikerer modne organoider som ikke er egnet for splitting eller såing av monolag; Dermed bør brønner brukes før åpenbaringen av denne morfologien. Skalastangen representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kjennetegn ved cellemonolag avledet fra 3D-organoider fra gris . (A) Representative mikroskopiske bilder av monolagsmorfologien over 3 dager. Jejunum organoide celler ble sådd ved 2,5 x 105 celler til 0,33 cm2 cellekulturinnsatser belagt med kollagen IV ved 50 ng/ml. Skalastangen representerer 500 μm. (B) Transepitelial elektrisk motstand (TEER) av organoidcellemonolag over 3 dager. Prikker forbundet med en linje tilsvarer den samme brønnen til forskjellige tider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Avbildning av gris jejunum organoider dyrket i 3D eller 2D. Konfokalmikroskopiavbildning av (A) 3D-organoider 5 dager etter splitting og (B,C) organoidcellemonolag 3 dager etter sådd (B: XZ seksjon; C: XY-delen). DNA (blått) ble farget med DAPI. Aktin (rød) ble farget med falloidin. Okkludin (grønn) ble farget med et polyklonalt antistoff. Hvite piler indikerer okkludin lokalisert ved det stramme krysset. Skalastangen representerer 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Denne protokollen beskriver en metode som brukes til å kryobevare epitelkrypter fra gristarmen for langtidslagring og påfølgende kultur av 3D-organoider. Denne protokollen bruker en fryseløsning som inneholder DMSO, FBS, Y27632 ROCK-hemmeren, DMEM og antibiotika. En annen studie hos griser oppnådde organoider fra krypter kryopreservert i en lignende fryseløsning, men uten ROCK-hemmeren15. Y27632 ROCK-hemmeren ble inkludert for å forhindre apoptose og opprettholde stamcellebassenget siden epitelkryptceller dissosieres etter tining, noe som kan føre til celledød ('anoikis')27,28. Interessant nok har hesteenteroider blitt hentet fra epitelkrypter frosset i et kulturmedium som bare inneholder DMEM og DMSO16; Denne enkle metoden er ikke testet for grisepitelkrypter ennå. Andre metoder har blitt publisert for å dyrke humane og grisorganoider fra frosne vev eller biopsier i stedet for epitelkrypter 4,17. Fordelen med denne metoden er evnen til direkte kryokonservering av tarmvevet uten å utføre kryptisolasjonsprosedyren, noe som krever tid og laboratorieutstyr. Dette kan være praktisk når vevet må samles langt fra laboratoriet. Men når man isolerer kryptene umiddelbart etter slakting, kan store tarmsegmenter behandles for å oppnå et meget høyt antall krypter, noe som ikke er tilfelle når man starter fra små frosne vevfragmenter. Etter tining av epitelkrypter ble organoider observert fra 3-4 dager etter såing og splittet etter 10 dager. Dette er en langsommere vekstrate enn når man starter kulturen fra ferske epitelkrypter, hvor organoidene ble oppnådd fra dag 1 etter såing, og kan vanligvis splittes rundt dag 511. Khalil et al. rapporterte også en forsinket vekst av grisenteroider når de startet fra frosne krypter15, noe som tyder på at stamceller kan trenge tid til å gjenopprette sin proliferative kapasitet. Vi fikk også et lavere antall organoider når vi startet fra frosne krypter sammenlignet med ferske krypter, noe som kan skyldes død av stamceller under fryseprosessen. I noen forsøk på opptining av krypter (<20 %) fikk vi ikke organoider fra frosne krypter, sannsynligvis på grunn av en suboptimal kryopreserveringsprosedyre (f.eks. forsinket frysing etter kryptisolering på sannsynligvis mer enn 1 time). Derfor anbefaler vi å holde kryptene på is til du teller, og fryse dem så raskt som mulig.

For 3D-organoider valgte vi å bruke et kommersielt organoid kulturmedium formulert for mennesker. Faktisk har tidligere rapporter vist at gristarmorganoider vokser effektivt med dette mediet 8,11,14,19,25,26,29,30. Det er av interesse for dette kulturmediet å være klar til bruk og ha en standardisert konsentrasjon av vekstfaktorer i en batch. Imidlertid er dette kulturmediet kostbart, dets sammensetning er ikke avslørt, og det er derfor ikke mulig å modulere sammensetningen. I motsetning til dette har andre studier dyrket gristarmorganoider i tilpassede medier som inneholder farmakologiske hemmere, rekombinant vekstfaktor og / eller betinget media 5,6,7,21. Selv om den er svært fleksibel og billigere, er denne metoden tidkrevende for produksjon av betingede medier og kan mangle reproduserbarhet på grunn av potensiell variabilitet i konsentrasjonen av vekstfaktorer i betingede medier. Dermed bør kvaliteten på hver batch av betingede medier valideres ved å måle organoid vekst eller markørgenuttrykk31.

En studie har vist at gris jejunale organoider dyrket i samme kommersielle organoid kultur medium som brukes her vokste raskere og virket mindre differensiert, sammenlignet med enteroider dyrket med medier som inneholder rekombinant vekstfaktor og / eller betinget media23. En høy proliferativ tilstand letter kulturen til 3D-organoider, men kan kreve indusering av differensiering for å være mer representativ for intestinale fysiologiske egenskaper. I denne protokollen, for passering av 3D-organoider, er cellene fullstendig dissosiert for telling, slik at man kan kontrollere antall celler som er sådd i ECM. Dette øker reproduserbarheten av fenotypen av organoider, som er sterkt påvirket av deres tetthet. Videre unngår telling av cellene å få for lav eller en overbefolket kultur, som krever tilpasning av kulturplanen. De fleste andre studier forberedte organoide fragmenter som ikke var fullstendig dissosiert til enkeltceller, og brukte et fortynningsforhold for passering. Denne metoden er enklere, men kan indusere variabilitet i henhold til kulturens organoide tetthet.

For kulturen i monolayers blir organoide celler sådd i kulturinnsatser forhåndsbelagt med et tynt lag ECM, som tillater vedlegg av celler, men unngår veksten av organoider i 3D. Denne protokollen brukte kollagen type IV som et ECM-protein, som beskrevet tidligere hos gris23. Andre studier med grisorganoide monolayers brukte samme tumoravledede ECM som brukes her til å dyrke 3D-organoider 6,8,9,21,25,30. Fordelen med å bruke kollagen er evnen til å standardisere proteinkonsentrasjonen med en fullt definert sammensetning, noe som ikke er tilfelle i tumoravledet ECM. Et kritisk skritt for suksessen til kulturen av cellemonolayers er å være oppmerksom på det visuelle utseendet til forløperen 3D-organoider, som skal ha veldefinerte kanter og et tomt lumen uten svart rusk. Faktisk er organoider med høyt modningsnivå og lav proliferativ hastighet ikke en passende kilde til celler for 2D-kultur. Dermed er tidspunktet for dissosiasjon av 3D-organoider i enkeltceller avgjørende for suksessen til dette trinnet.

Kulturen av 2D-monolayers fra enkeltceller tillater standardisering av antall frøede celler, noe som er vanskeligere når man starter fra organoidfragmenter, som utført i noen andre metoder. Vi sådde 7,6 x 10 5 celler per cm 2, noe som er høyt sammenlignet med de fleste andre studier 21,22,23 hos griser som brukte en lavere celletetthet, fra0,25 x 10 5 celler per cm 2 til 1,78 x 10 5 celler per cm2. Kravet om et høyt antall organoidceller utgjør en begrensning av denne protokollen, men det tillot oss raskt å oppnå et sammenflytende monolag som dekker kulturinnsatsen fullt ut etter 1 dag. I kontrast oppnådde Vermeire et al.23 sammenløp etter 4-7 dager med en lavere tetthet av celler som ble sådd (fra 0,25 x 10 5 celler / cm 2 til 0,4 x 105 celler / cm2). Noen studier har også brukt grisorganoidcellemonolag som ikke fullt ut dekket kulturoverflaten for infeksjoner med virus 8,30. Under disse forholdene er den apikale siden av epitelceller tilgjengelig for behandlinger, men fullt konfluente monolayers er nødvendig hvis målet er å studere næringsopptak eller epitelpermeabilitet.

For organoidcellemonolag ble et kommersielt organoidkulturmedium supplert med 20% FBS brukt, basert på en nylig studie på bovine enteroid-avledede monolayers32. I våre tester var tilskuddet med 20% FBS nødvendig for å oppnå fullt konfluente monolayers, sannsynligvis på grunn av et høyt vekstfaktorkrav. Tvert imot har andre studier som bruker samme kommersielle medium etablert monolayers uten ytterligere FBS 8,25,30, men uten å nå full sammenløp. Andre studier har også brukt tilskudd med 20% FBS i et tilpasset medium for kulturen av grisorganoidcellemonolag21,22. I våre eksperimenter er TEER høy 1 dag etter såing (rundt 700 Ω · cm 2), og forblir høy til dag 3 (rundt 1,500 Ω · cm2; dette er konsistent med dannelsen av tette kryss, som indikert ved uttrykket av okkludin. Van der Hee et al. oppnådde lignende TEER-verdier over 72 timer for jejunum organoid cellemonolag21. De viste også at monolayers kan opprettholdes til dag 12-15 med daglige medieendringer. I motsetning til dette har andre studier rapportert mye lavere TEER-verdier (rundt 200 Ω · cm2) for grisorganoidcellemonolag 6,22. Disse forskjellene mellom studier kan være relatert til tarmsegmentet som studeres eller til mediet som brukes som påvirker epiteldifferensiering.

Avslutningsvis letter ovennevnte protokoll for å dyrke gristarm 3D-organoider fra frosne epitelkrypter organisasjonen av kulturarbeidet. Det reduserer behovet for friskt vev som skal hentes fra levende dyr. Vi forklarer også hvordan man etablerer fullt konfluente cellemonolag avledet fra grisorganoider på mindre enn 3 dager. Dermed kan protokollene våre være nyttige ressurser for forskere som studerer tarmepitelet hos gris for veterinær eller biomedisinsk forskning.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig" -prosjektet) og av INRAE HOLOFLUX ("Holopig" -prosjektet). Forfatterne er takknemlige for Genotouls kjernefasiliteter (TFI). Vi anerkjenner Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) for nøye korrekturlesing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G Store at room temperature.
15 mL conical tube Sarstedt 62.554.502
24-well cell culture plate Corning 003526
48-well cell culture plate Corning 003548
50 mL polypropylene conical tube Falcon 352070
Bovine Serum Albumine (BSA) Euromedex A6003 Store at 4 °C.
Centrifuge Universal 320 R Hettich 1406
Collagene type IV from human placenta Sigma C5533 Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C.
CoolCell LX Cell Freezing Container Corning 432003 Used to cryopreserve crypts and organoids.
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific 16842556
Coverslips, 22 mm x 50 mm VWR 630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL Clear line 390706 Used to cryopreserve crypts and organoids.
DAPI Invitrogen D1306 Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C
Dithiothreitol (DTT) Merck 10197777001 Store at 4 °C.
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 31966047 Store at 4 °C.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25-950-CQC Store at room temperature.
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide VWR 631-9483
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106 Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Fisherbrand Sterile Cell Strainers Thermo Fisher Scientific 22363549 Used for crypt isolation.
Fixed Tilt 3D Platform Rotator VWR 97025-564 Used for incubations in the immunostaining protocol.
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010015 Store at 4 °C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher Scientific 12605-010 Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell Technology 6010 Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week.
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Corning 353095
Inverted microscope Nikon Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C.
Mounting medium for fluorescence with DAPI Vectashield H1250 Store at 4 °C.
Occludin polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 71-1500 Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200.
Paraformaldehyde 32% Electron microscopy science 15714 Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Phalloidin TRITC Sigma P1951 Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C.
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C.
ROCK Inhibitor (Y27632) ATCC ACS-3030 Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C.
Rotating shaker mix XL Clear line 062646CL Used for crypt isolation.
Stripette Serological Pipets 10 mL Corning 4488
Tissue Culture Dish TPP 93100
Triton X100 Sigma 8787 Store at room temperature.
Trypan Blue stain 0.4% Thermo Fisher Scientific T10282 Store at room temperature.
Vacuum system Vacusip Integra 159000 Used to remove the medium of organoid wells.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).
  5. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).
  6. Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).
  7. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  8. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).
  9. vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).
  10. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
  11. Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).
  12. Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  13. Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
  14. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
  15. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
  16. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
  17. Tsai, Y. -H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  18. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  19. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  20. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  21. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  22. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).
  23. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).
  24. Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).
  25. Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).
  26. Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
  29. Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).
  30. Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).
  31. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  32. Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).

Tags

Biologi utgave 192
Kultur av Piglet Intestinal 3D Organoids fra kryopreserverte epitelkrypter og etablering av cellemonolayers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mussard, E., Lencina, C., Boudry,… More

Mussard, E., Lencina, C., Boudry, G., Achard, C. S., Klotz, C., Combes, S., Beaumont, M. Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (192), e64917, doi:10.3791/64917 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter