Summary
在这里，我们描述了一种基于免疫荧光的方法来量化细胞中单链DNA的水平。这种高效且可重复的方法可用于检查复制应激，这是几种卵巢癌的共同特征。此外，该检测与自动分析管道兼容，进一步提高了其效率。
Abstract
复制应激是几种卵巢癌的标志。复制应激可能来自多种来源，包括双链断裂、转录-复制冲突或扩增的癌基因，不可避免地导致单链 DNA （ssDNA） 的产生。因此，量化ssDNA为评估不同细胞类型和各种DNA损伤条件或治疗下的复制应激水平提供了机会。新出现的证据还表明，ssDNA可以预测对靶向DNA修复的化疗药物的反应。在这里，我们描述了一种详细的基于免疫荧光的方法来量化ssDNA。该方法涉及用胸苷类似物标记基因组，然后在非变性条件下基于抗体检测染色质的类似物。ssDNA的片段可以在荧光显微镜下可视化为病灶。病灶的数量和强度与细胞核中存在的ssDNA水平直接相关。我们还描述了一种用于量化ssDNA信号的自动化管道。该方法快速且可重复。此外，该方法的简单性使其适用于药物和遗传筛选等高通量应用。
Introduction
基因组DNA经常受到来自各种内源性和外源性的多次攻击1。内源性损伤的频率与代谢副产物（如活性氧或醛）的水平直接相关，在包括卵巢癌在内的多种癌症类型中，代谢副产物本质上更高2，3。必须有效地解决DNA损伤;否则，它会促进遗传毒性病变，从而诱变。细胞修复遗传毒性病变的能力依赖于无差错DNA修复途径的功能以及响应DNA损伤的细胞周期进程的有效调节。值得注意的是，许多卵巢癌在p53中具有功能失活突变，因此具有有缺陷的G1 / S检查点，导致细胞启动DNA复制，尽管存在未修复的基因组病变4，5。超过50%的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）在BRCA1和BRCA2介导的同源重组（无差错DNA修复途径）中存在缺陷，并且约20%在基因CCNE1中具有扩增，从而过早地将G1细胞推入S期6，从而使卵巢癌的DNA损伤程度进一步复杂化。.内源性DNA损伤的高频率，有缺陷的检查点和故障的修复途径共同成倍地增强了卵巢癌中基因组病变的积累。这些病变可以阻碍关键细胞过程的进展，例如DNA复制和转录。如下所述，这些障碍催化细胞中单链DNA（ssDNA）的产生。
DNA的双螺旋对于保护基因组免受多种诱变过程的影响至关重要，例如自发脱嘌呤和去嘧啶，胞嘧啶脱氨酶的活性和氧化DNA损伤1，7。相比之下，ssDNA极易受到这些突变事件的影响。细胞中的多个过程可导致ssDNA的产生（图1）。其中包括以下内容：
（i）DNA复制机制的停滞：这导致DNA解旋酶和聚合酶解耦，留下ssDNA8，9的片段。
（ii）转录机制的停滞：RNA聚合酶的持续停滞导致产生称为R环的三链杂交DNA/RNA结构。R环形成将置换的，未转录的DNA暴露为单链10。
（iii）DNA末端切除：同源定向修复的开始需要产生3'ssDNA以催化寻找同源序列11。
（iv）D环：同源重组过程中的链侵入可导致非模板互补链的位移，从而产生ssDNA12。
（v）复制耦合间隙：在DNA复制过程中，滞后链合成以不连续的方式发生，首先产生冈崎片段，然后连接。处理冈崎片段的延迟或缺陷也可能导致ssDNA形成。最后，如果前导链上的复制叉遇到停滞的病变、DNA 聚合酶和灵长酶，PRIMPOL 可以在下游重新启动合成，从而在13，14 后面留下 ssDNA 间隙。
显然，这些事件中的大多数要么发生在DNA复制机制面临基因组病变时，要么发生在复制偶联修复期间，这表明更高的DNA损伤导致ssDNA水平增加。由于许多这些事件与复制相关，因此ssDNA的形成被认为是细胞15，16中“复制应激”的标志物。
在这里，我们描述了一种可用于可靠地定量细胞中ssDNA的测定方法。这种方法的简单性、可重复性和成本效益使其适合用于评估细胞中的复制应激反应。新兴研究表明，ssDNA的水平也可以预测对化疗的反应，例如PARP1 / 2酶，ATR和Wee1激酶17，18，19，20，21的抑制剂。这些抑制剂正在几种HGSOCs的治疗方案中进行研究22。因此，该测定也可以成为预测卵巢癌细胞化疗反应的有用工具。
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Protocol
注意：卵巢癌细胞系OVCAR3用于这些步骤，但该协议广泛适用于多种其他细胞系，包括来自非卵巢来源的细胞系。该协议的原理图如图 2所示。
1. 电镀细胞
- 制作聚-L-赖氨酸涂层盖玻片。
- 将高压灭菌的 12 mm 直径盖玻片加入含有聚-L-赖氨酸溶液的 50 mL 锥形管中，并放在摇臂上 15 分钟。
- 在组织培养罩中吸出溶液。通过加入无菌水清洗盖玻片，并将装有盖玻片的管放回摇杆上5分钟。重复此洗涤步骤三次。
- 将涂层的盖玻片铺在无菌培养皿上，并吸出任何剩余的水。让盖玻片在组织培养罩中干燥1小时或直到没有水滴残留。干燥后，用封口膜密封盘子，并置于4°C。
- 将一个聚-L-赖氨酸包被的盖玻片放入24孔板的每个孔中。使用聚赖氨酸盖玻片对于防止细胞在预提取步骤中从盖玻片上分离至关重要。
- 一旦OVCAR3细胞达到70%-80%汇合度，就将其胰蛋白酶消化。
- 为了胰蛋白酶消化70%-80%汇合的10cm培养皿，从平板中吸出培养基，并用5-7mL的PBS洗涤。
- 吸出PBS，加入1mL的0.25%胰蛋白酶，并将培养皿置于37°C培养箱中8-10分钟，或直到细胞从板底部升起。
- 用5-10 mL培养基收集细胞，并加入锥形管中。
- 使用标准程序用血细胞计数器手动计数细胞。
- 稀释 25，000 个细胞/mL，并在放置在 24 孔板孔中的聚-L-赖氨酸盖玻片上加入 1 mL 细胞。对于任何其他细胞系，确定一个数字，使细胞在三次群体倍增后约70%-80%汇合。
- 在标准条件下在培养基中培养细胞。
2. 带 IdU 的脉冲电池
- 为了使细胞正确扩散到盖玻片上，一个群体加倍就足够了。在一次群体倍增后，用10μM 5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）（参见有关如何重建IdU 的材料表 ）脉冲细胞以进行两次随后的群体倍增。
注意：我们尝试了不同的胸苷类似物，包括溴脱氧尿苷（BrdU），5-氯-2′-脱氧尿苷（CIdU）和IdU。在三种类似物中，IdU 提供了最佳的信噪比。用三种不同类似物脉冲的细胞的比较图像如图 3所示。我们建议使用两种阴性对照：（i）无IdU脉冲样品和（ii）无一抗对照。如果由于给定的治疗而需要评估ssDNA的形成，我们建议在第一轮IdU加倍后添加药物。 - 用IdU脉冲两次群体倍增后，收获细胞进行成像。
- 用冰冷的0.5%PBSTx（PBS + 0.5%Triton X-100）在冰上替换培养基5分钟。该预提取步骤有助于释放细胞质和非染色质结合蛋白，使染色质结合蛋白完整。某些细胞系在预提取过程中很容易剥落。在这种情况下，可以使用0.5%CSK缓冲液（10 mM PIPES （pH 6.8），100 mM NaCl，300 mM蔗糖，3 mM MgCl2，1 mM EGTA和0.5%Triton X-100）。
3. 固定
- 吸出PBSTx，并在室温下用3%PFA（材料表）孵育15分钟，然后用1x PBS洗涤三至四次。固定细胞可以保持在4°C，直到进一步的步骤。
注意：PFA具有剧毒和致癌性。避免接触皮肤、眼睛和粘膜。在通风橱中使用PFA执行所有步骤，并正确处理材料。
4. 透化和封闭
- 固定后，使用0.5%PBSTx在冰上透化细胞5分钟。使用足够的体积覆盖整个盖玻片（通常在 500 μL 和 1 mL 之间）。
- 在室温下用0.2%PBST（1X PBS + 0.2%吐温-20）洗涤细胞三到四次。一毫升PBST足以清洗每个孔。在没有任何孵育的情况下背靠背洗涤。
- 吸出PBST，并使用在1x PBS（封闭缓冲液）中制成的5%BSA（材料表）在室温下封闭样品30分钟。
5. 用 IdU 抗体进行免疫染色
- 对于免疫染色，准备一个加湿室（平底特百惠上的湿纸巾）。用封口膜盖住24孔板的盖子，放入加湿室中，然后将盖玻片放在板盖上。
- 通过在步骤4.2的封闭缓冲液中以1：200稀释来制备抗BrdU小鼠一抗（材料表）。
- 在盖玻片顶部加入 60 μL IdU 抗体稀释液。将盖玻片在37°C孵育1小时。
- 或者，如果将盖玻片翻转到移液到封口膜上的一滴（20-25 μL）1：200抗体稀释液上，则使用较少的抗体溶液。这也降低了溶液在孵育过程中变干的可能性。
- 孵育1小时后，吸出一抗。将盖玻片放回 24 孔板中，并用 0.2% PBST 洗涤四次。
- 对于二抗，使用与步骤5.1中描述的相同的加湿室。在封闭缓冲液中稀释抗小鼠偶联二抗（材料表）（1：200）。向盖玻片中加入60μL二抗，并在室温下在黑暗中孵育1小时。
- 抽吸二抗。将盖玻片放回 24 孔板，并用 0.2% PBST 洗涤四次。
- 标记显微镜载玻片，并使用DAPI封片介质将盖玻片安装在载玻片上（材料表）。将载玻片在室温下在黑暗中储存24小时。如果封片剂需要固化或硬化，建议进行24小时孵育。
注意：载玻片可以储存在4°C下，然后在荧光显微镜上成像。代表性图像如图 4所示。
6. 自动定量 IdU 病灶
注意：该测定的强大之处在于能够自动分析以实现快速有效的定量。我们在这里提出了一个自动分析管道，可用于量化给定图像场中的IdU焦点。重要的是，给定实验中的所有图像都是使用相同的曝光设置拍摄的;否则，定量将不可靠。至少在首次进行该实验时，将未染色的对照作为阴性对照也可能是有价值的（图5）。以下协议特定于NIS通用分析软件，但相同的原则也可以应用于其他商业软件。
- 在“ 视图 ”选项卡中，转到 “分析控件 |分析浏览器。这将打开一个名为 “分析浏览器”的新侧窗口。点击 新建 |一般分析 3.这将打开分析资源管理器流程图创建软件。
- 转到 “源 ”选项卡，然后将 “通道” 命令从左侧菜单拖到工作区中。DAPI 和 IdU 焦点的两个通道将自动弹出为二进制框（ 图 5 中显示为带有红色轮廓的框）。
- 转到“ 预处理 ”选项卡，然后将 “局部对比度” 命令从左侧菜单拖动到工作区。将 本地对比度 与 IdU 焦点通道连接。从 “分段 ”选项卡中，拖动 “阈值 ”命令（每个通道一个）。
- 将每个通道连接到 阈值 命令。要消除图像边界处的任何核，请转到“ 二进制处理 ”选项卡，拖动“ 触摸边框 ”命令，然后连接到 DAPI 阈值。
- 使用“测量”选项卡中的“聚合子项”命令合并来自两个通道的数据。将 DAPI 通道定义为父通道 （A），将焦点通道定义为子通道 （B）。在“聚合子项”命令的下拉菜单中，选择“子项位于父项内”选项。此步骤有助于计算每个细胞核（亲本）的病灶（子级）数量。
- 要以表格格式导出数据，请单击“数据管理”选项卡中的“修改列”命令。在“修改列”命令的下拉菜单中，选择 DAPI-ID（这有助于为给定图像中的每个细胞核分配唯一编号）和 IdU 计数（提供每个细胞核中的 IdU 焦点数）。要以 CSV 格式导出数据，请使用“引用”选项卡中的“表到 CSV”命令。GA3 现在可以使用描述性标题保存。
- 要进行分析，请在软件中打开图像。
- 按照步骤 6.1 中的操作打开“ 分析资源管理器 ”选项卡，然后找到新制作的 GA3。双击 GA3 文件，这将打开一个名为 GA3 向导 的新窗口，您可以在其中设置 DAPI 和 IdU 通道的阈值。
- 使用窗口中的滑块为每个通道设置最小和最大阈值，从而定义信号。一个好的阈值是明确定义每个细胞核和 IdU 焦点的边界的地方。对阈值满意后，保留这些数字以分析给定实验中的所有文件。
- 单击 “运行 ”按钮以获取每个细胞核的 IdU 病灶计数。
注意：该软件生成每个细胞核的焦点表，此后可用于任何绘图目的（图5）。
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Representative Results
代表性图像和来自未处理细胞和用0.5mM羟基脲处理24小时的细胞核的IdU病灶的定量如图 4所示。两个细胞核均在DAPI通道中染色并可识别。对这些图像的分析包括量化每个细胞核中的病灶数量。病灶的数量与复制应激的程度成正比。
图1：ssDNA生成的机制。 示意图显示了在细胞中产生ssDNA的不同机制。这包括（A）复制机制的停滞，（B）转录机制的停滞，导致R环，（C）DNA末端切除，（D）D环的形成，或（E）复制偶联间隙。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：IdU 标记原理图。用IdU脉冲细胞进行两次群体倍增。如果需要任何药物治疗，应在存在 IdU 的情况下，在第一个人群翻倍后进行。请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用 IdU、BrdU 或 CldU 脉冲后获得的病灶信号比较。 用三种不同的胸苷类似物脉冲的细胞的代表性图像。显示DAPI，GFP（代表Alexa-488标记的IdU焦点）和合并的频道。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：由复制应激引起的 OVCAR3 细胞中 IdU 病灶增加 。 （A）代表性的IdU和DAPI染色的细胞核图像和（B）用0.5mM羟基脲处理24小时的细胞的 定量< 。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：具有代表性的自动分析 GA3 管道。 GA3 自动分析可以通过生成一个管道来实现，以基于 DAPI（以橙色显示）和 IdU 病灶（以黄色显示）对细胞核进行阈值设置阈值。聚合这两个阈值会填充每个细胞核的 IdU 病灶数量。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
正如协议中提到的，包括一些实验对照以确保测定有效是有价值的。这些包括未经IdU处理的样品以及未经一抗处理的样品。两种阴性对照都应产生被DAPI染色但不含IdU信号的细胞。
根据实验条件和所使用的细胞系，可能需要不同的抗体稀释度才能获得最佳荧光信号。信号过多可能导致无法量化单个病灶，而信号太少可能意味着无法识别样品之间的实验差异。如果背景信号过多，调整预提取和透化时间也可能有所帮助，这可能是由未提取的核质内容物引起的。
由于该协议要求IdU掺入两次群体倍增，因此重要的是要考虑每个细胞系的倍增时间。当比较具有不同倍增时间的两个细胞系时，必须根据每个细胞系的倍增时间调整IdU脉冲的长度。但是，这可能会引入一定程度的变化。因此，当比较具有相似倍增时间的细胞系时，该测定的应用是最有效的。如果倍增时间未知，这可能需要事先进行实验优化。
此外，该测定可能低估了在任何给定时间存在于细胞中的ssDNA的数量。ssDNA只有在相反的链被IdU标记时才能被识别为病灶。因此，如果与ssDNA相反的链没有被标记，它就不会被检测到。例如，如果亲本未标记的DNA具有引起间隙的病变，则不会检测到这些病变（图2）。对于更灵敏的分析，另一种方法是探测细胞中的复制蛋白A（RPA）。RPA 是一种 DNA 结合蛋白，可优先包被 ssDNA，以防止其形成二级结构并防止核酸酶活性23，24。在复制耦合损伤期间，RPA在丝氨酸33处磷酸化，因此pRPA S33可用作复制应激的标志物。在过度损伤的条件下，pRPA S33通过DNA-PK25在S4/S8上进一步磷酸化。因此，通过探测与染色质结合的不同形式的RPA，可以评估细胞中的各种复制应激反应。这两种互补的方法（IdU病灶和RPA染色）可以并行进行，以使用不同的方法验证ssDNA的水平。
该测定提供了一种易于遵循、高度可重复且有效的方法来定量给定细胞类型的 ssDNA。它可以进行调整，以允许应用不同的药物治疗，各种细胞类型和多种分析工具。它适用于各种自动定量方法，包括NIS分析软件。与其他量化ssDNA的技术（例如基于COMET的测定）不同，IdU病灶测定对于高通量应用更可行。
该测定可用于多种应用。ssDNA存在的增加可以用作复制应激的标志物，并用于预测各种卵巢癌的化疗反应。此外，已知会破坏复制或细胞周期调节的癌基因的扩增会导致病变的积累，从而导致ssDNA增加。因此，该测定也可用于检查癌基因扩增对ssDNA积累的影响。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
PV得到了Alvin J. Siteman癌症中心通过巴恩斯犹太医院基金会的首届踏板事业资助，Marsha Rivkin卵巢癌研究中心的试点研究资助，Mary Kay Ash基金会和V基金会的癌症研究资助。NR得到了圣路易斯华盛顿大学NIH细胞和分子生物学培训T32资助的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
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