Summary
En este trabajo se describe la metodología utilizada para generar cepas de L. panamensis y L . donovani que expresan el gen de eGFP como un transgén integrado estable utilizando el sistema pLEXSY. Los parásitos transfectados se clonaron limitando la dilución, y se seleccionaron los clones con la mayor intensidad de fluorescencia en ambas especies para su posterior uso en ensayos de detección de fármacos.
Abstract
Los parásitos protozoarios del género Leishmania causan leishmaniasis , una enfermedad con manifestaciones clínicas variables que afecta a millones de personas en todo el mundo. La infección por L. donovani puede provocar una enfermedad visceral mortal. En Panamá, Colombia y Costa Rica, L. panamensis es responsable de la mayoría de los casos reportados de leishmaniasis cutánea y mucocutánea. Estudiar un gran número de candidatos a fármacos con las metodologías disponibles hasta la fecha es bastante difícil, dado que son muy laboriosas para evaluar la actividad de compuestos frente a formas intracelulares del parásito o para realizar ensayos in vivo . En este trabajo, describimos la generación de cepas de L. panamensis y L. donovani con expresión constitutiva del gen que codifica para una proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) integrada en el locus que codifica para el ARNr 18S (ssu). El gen que codifica eGFP se obtuvo de un vector comercial y se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para enriquecerlo y agregar sitios de restricción para las enzimas BglII y KpnI. El amplicón de eGFP se aisló mediante purificación en gel de agarosa, se digirió con las enzimas BglII y KpnI, y se ligó en el vector de expresión de Leishmania pLEXSY-sat2.1 previamente digerido con el mismo conjunto de enzimas. El vector de expresión con el gen clonado se propagó en E. coli, se purificó y se verificó la presencia del inserto mediante PCR de colonias. El plásmido purificado fue linealizado y utilizado para transfectar parásitos L. donovani y L . panamensis. La integración del gen se verificó mediante PCR. La expresión del gen eGFP se evaluó mediante citometría de flujo. Los parásitos fluorescentes se clonaron mediante dilución limitante, y los clones con la mayor intensidad de fluorescencia se seleccionaron mediante citometría de flujo.
Introduction
Los parásitos protozoarios del género Leishmania causan leishmaniasis, una enfermedad con una amplia gama de manifestaciones clínicas. Esta enfermedad es prevalente en 98 países y su incidencia anual se estima entre 0,9 y 1,6 millones de casos1. Las especies de Leishmania que son patógenas para los humanos se dividen en dos subgéneros, a saber, L. (Leishmania) y L. (Viannia). Infección con algunas especies pertenecientes a la L. Los subgéneros (Leishmania), como L. donovani y L. infantum, pueden provocar leishmaniasis visceral (LV), que es mortal sino se trata. Especies pertenecientes a la L. (Viannia) se asocian con la mayoría de los casos de leishmaniasis cutánea (LC) y leishmaniasis mucocutánea (LCM) en América Central y del Sur, particularmente en Panamá, Colombia y Costa Rica, siendo L. panamensis el principal agente etiológico de estas presentaciones clínicas 3,4.
La quimioterapia antileishmania existente, que incluye fármacos como los antimoniales pentavalentes, la miltefosina y la anfotericina B, es muy tóxica y costosa. Además, el aumento de la resistencia a los medicamentos durante las últimas décadas se ha sumado a los factores que interfieren con el tratamiento efectivo de los pacientes en todo el mundo5. Se han demostrado diferencias sustanciales entre las especies del género Leishmania en relación con la susceptibilidad a los medicamentos, especialmente entre las especies del Nuevo y el Viejo Mundo 6,7. Por estas razones, es necesario dirigir los esfuerzos a la identificación y desarrollo de nuevos fármacos contra la leishmania, prestando especial atención a los enfoques específicos de cada especie. El estudio de grandes bibliotecas de candidatos a fármacos con metodologías tradicionales es bastante difícil, dado que estas metodologías son muy laboriosas para evaluar la actividad de compuestos frente a amastigotes intracelulares o para realizar experimentos in vivo 8; Por lo tanto, ha sido necesario desarrollar nuevas técnicas que reduzcan estas desventajas, incluyendo la implementación de genes reporteros y el desarrollo de ensayos de cribado fenotípico de alto contenido9.
El uso de genes reporteros ha demostrado el potencial para aumentar la eficiencia del proceso de cribado de fármacos, ya que facilita el desarrollo de ensayos de alto rendimiento e in vivo. Varios grupos de investigación han generado parásitos recombinantes de Leishmania que expresan varios genes reporteros. Los genes reporteros, como la β-galactosidasa, la β-lactamasa y la luciferasa, se han introducido en varias especies de Leishmania utilizando vectores episomales, mostrando una utilidad limitada para el cribado de fármacos en formas extracelulares e intracelulares del parásito 10,11,12,13,14,15. Estos enfoques tienen la limitación de requerir una fuerte presión selectiva en cultivo para evitar la eliminación de la construcción episomal, así como el uso de reactivos adicionales para revelar la actividad del gen reportero. Por el contrario, la proteína verde fluorescente (GFP) y su variante, la proteína verde fluorescente mejorada (eGFP), se han utilizado en la generación de un gran número de cepas transgénicas de Leishmania para ensayos de cribado de fármacos in vitro debido a su flexibilidad y sensibilidad, así como a la posibilidad de automatizar el proceso de cribado mediante citometría de flujo o fluorometría15. 16,17,18,19. A pesar de los resultados prometedores, los cultivos de estas cepas transgénicas fueron muy heterogéneos en sus niveles de fluorescencia, ya que el número de copias del gen GFP no fue el mismo en todos los parásitos. Además, el mantenimiento de la fluorescencia requirió una presión selectiva constante sobre los parásitos en cultivo, ya que el gen GFP se introdujo en una construcción episomal.
Por las razones antes expuestas, muchos esfuerzos se han centrado en el desarrollo de nuevas metodologías para la producción de cepas recombinantes estables. Estos esfuerzos se han basado principalmente en la integración de genes reporteros en loci ribosómicos, aprovechando las mayores tasas de transcripción de los genes ribosómicos20. Se han generado cepas de L. infantum y L. amazonensis que han integrado los genes que codifican para la β-galactocidasa 21, IFP 1.4, iRFP 22 y tdTomato 23, y se ha evaluado su utilidad en ensayos de cribado de fármacos. Varios grupos han desarrollado cepas de L. donovani que expresan GFP de forma constitutiva mediante la integración de su gen codificante en el locus de ARN ribosómico 18S (locus ssu) a través de la recombinación homóloga24,25; mostraron una expresión estable y homogénea de GFP en la población transfectada, incluyendo amastigotes intracelulares 24,25, y se implementaron con éxito en ensayos de cribado de fármacos24,25,26. Bolhassani et al.27 desarrollaron cepas de L. major y L. infantum que expresan GFP como un transgén integrado. Utilizaron el vector de integración pLEXSY, diseñado originalmente para la expresión transgénica de proteínas en un sistema que utilizaba L. tarentolae como huésped28. El vector pLEXSY-GFP ha demostrado ser muy eficiente para la generación de diferentes cepas de Leishmania que expresan constitutivamente GFP 24,25,27,29,30. En estos parásitos, la fluorescencia es homogénea y se mantiene en las formas intracelulares, pudiendo detectarse en las lesiones de las almohadillas de los pies de ratones infectados27.
En este trabajo se describe la metodología utilizada para la generación de cepas de L. panamensis y L . donovani que expresan el gen que codifica para eGFP como un transgén integrado utilizando el sistema pLEXSY. Las cepas generadas a través de este proceso se utilizan en nuestro laboratorio para la realización de ensayos de cribado de fármacos que evalúan la potencial actividad anti-leishmania de moléculas de origen natural y sintético.
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Protocol
Para mantener las muestras estériles, todos los pasos que impliquen el cultivo de parásitos deben realizarse dentro de una campana de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) o de acuerdo con las normas locales de salud y seguridad. Un resumen gráfico de este protocolo se puede encontrar en la Figura 1.
Figura 1: Esquema resumido del protocolo para la generación de parásitos de L. panamensis y L. donovani que expresan eGFP utilizando la familia de vectores pLEXSY-2.1. Las seis secciones principales descritas en el artículo se describen aquí. 1) Amplificación e inserción del gen eGFP en el vector pLEXSY-2.1: se amplifica el gen diana, añadiendo los sitios de reconocimiento para las enzimas KpnI y BglII, y tanto el amplicón eGFP como el plásmido pLEXSY se digieren secuencialmente con ambas enzimas para su posterior ligadura con ligasa T4. 2) Linealización del plásmido de expresión pLEXSY: la construcción pLEXSY + eGFP se digiere con SwaI para la linealización y purificación del casete de expresión de 7-8 kbp. 3) Transfección y 4) selección policlonal: Los promastigotes de Leishmania se transfectan con el casete de expresión por electroporación y se vuelven a poner en cultivo para la selección antibiótica de parásitos recombinantes. La fluorescencia del parásito se confirma mediante citometría de flujo. 5) Confirmación de la integración genómica y 6) clonación por dilución limitada: la integración del casete de expresión pLEXSY-eGFP se confirma mediante PCR diagnóstica, utilizando un cebador directo que hibrida al casete de expresión y un cebador inverso que hibrida a una secuencia cromosómica ausente en el casete de expresión. Los cultivos transfectados podrían enriquecerse para detectar parásitos fluorescentes mediante clonación limitando la dilución, y los clones con las intensidades fluorescentes medias más altas pueden seleccionarse para otras aplicaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Amplificación e inserción del gen eGFP en el vector pLEXSY-2.1
- Amplificación del gen eGFP
NOTA: Dado que este protocolo utiliza la familia de vectores pLEXSY-2.1 (ver Tabla de Materiales) para la expresión constitutiva de proteínas diana tras la integración del casete de expresión en el locus cromosómico 18S rRNA (ssu) de las especies de Leishmania , el primer paso es introducir en el gen eGFP las secuencias que contienen los sitios de restricción que permiten su inserción en los vectores pLEXSY-2.1. En este caso, como solo se requiere que la eGFP se exprese citosólicamente, se agregaron los sitios de restricción para las enzimas BglII y KpnI en los extremos 5' y 3' del gen eGFP, respectivamente. La clonación con KpnI da como resultado la fusión de la proteína diana a una etiqueta de polihistidina C-terminal de seis residuos, seguida de un codón de parada codificado en el plásmido pLEXSY-2.1 para una mayor purificación de la proteína de interés. Por esta razón, la secuencia inversa del cebador no contiene un codón de parada.- Dependiendo de la fuente de plásmidos para eGFP, analice la secuencia diana utilizando una herramienta de análisis de restricción como NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 para asegurarse de que no contiene sitios internos para las enzimas de restricción utilizadas para la clonación (BglII y KpnI) o para SwaI, que es la enzima utilizada para la linealización del vector antes de la transfección.
- Diseño de cebadores directos e inversos para la amplificación de eGFP que contengan las secuencias de restricción BglII y KpnI. A modo de ejemplo, la fuente de eGFP para este protocolo fue el plásmido pEGFP-N1-1X32, y las secuencias de cebadores fueron las reportadas por Bolhassani et al.27:
Cebador directo (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (sitio de restricción BglII en negrita).
Imprimación inversa (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (sitio de restricción KpnI en negrita). - Amplificar el gen diana utilizando una polimerasa de alta fidelidad para garantizar la preservación de la secuencia codificante. A modo de ejemplo, para los cebadores EGFP1 y EGFP2, se ejecuta el protocolo de ciclado de PCR según lo reportado por Bolhassani et al.27. Realice una desnaturalización inicial de 2 min a 94 °C, seguida de 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 57 °C y 1 min a 72 °C. Ejecute un paso de extensión final de 10 minutos a 72 °C. Añadir los cebadores a una concentración final de 0,2 μM.
- Purifique el fragmento utilizando un kit de purificación de productos de PCR convencional o una precipitación estándar de acetato de sodio y etanol, como se describe en otra parte33.
- Inserción de la eGFP en el vector de expresión pLEXSY-2.1
- Recorte los extremos del producto eGFP-PCR con BglII y KpnI, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- En primer lugar, configure la reacción para la enzima que requiere la concentración de sal más baja (en este caso, KpnI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e incube a 37 °C durante 1 h.
- A continuación, añadir 100 mM de NaCl y 10 unidades de BglII e incubar durante 15 min. Purifique la reacción, como se describe en el paso 1.1.4.
- Digiera el vector de expresión pLEXSY con BglII y KpnI, siguiendo el protocolo de digestión secuencial descrito en el paso 1.2.1.
- Ligar el vector pLEXSY y el gen eGFP con ligasa T4 utilizando una relación molar de 1:3 (vector:insertar). Añadir brevemente 100 ng de pLEXSY digerido y 28 ng de producto eGFP digerido a una reacción de 20 μL que contenga tampón ligasa a una concentración final de 1x y 3 unidades de ADN ligasa T4. Incubar durante la noche a 4 °C.
- Transformar células competentes de E. coli , como XL-10, DH5α o DH10B, con el producto de ligadura obtenido en el paso 1.2.3 utilizando protocolos de transformación estándar33. Colocar las células transformadas en agar ampicilina Luira-Bertani (LB) e incubar durante 24 h a 30 °C para seleccionar clones recombinantes (los plásmidos pLEXSY son más estables en E. coli a 30 °C que a 37 °C).
- Cribado de la presencia del inserto en los plásmidos mediante PCR de colonias.
- Recoger colonias individuales, resuspender en 20 μL de agua libre de nucleasas, calentar a 95 °C durante 15 min, y tomar 1 μL del lisado como plantilla de ADN para la PCR de colonias. Utilice el cebador directo para la amplificación de eGFP, descrito en el paso 1.1.2 (en este ejemplo, EGFP1), y el cebador A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') como cebador inverso29.
- El cebador A264 está diseñado para recocer 80 pb después del codón de parada del inserto en vectores de expresión pLEXSY-2.1. A modo de ejemplo, para el par de cebadores EGFP1 + A264, utilice un protocolo de ciclo de PCR que consiste en una desnaturalización inicial de 2 min a 94 °C, seguida de 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 50 °C y 1 min a 72 °C. Ejecute un paso de extensión final de 10 minutos a 72 °C. Los cebadores se añaden a una concentración final de 0,2 μM.
NOTA: El producto esperado con este juego de imprimación es de 859 pb de largo. Los sitios de recocido para los cebadores EGFP1 y A264 se representan en la Figura 2.
- Preparar el ADN plasmídico purificado a partir de un clon positivo para su posterior transfección utilizando un kit comercial de aislamiento de plásmidos o precipitación alcalina estándar33. Utilizar 50 ml de un cultivo nocturno a 30 °C para aislar un mínimo de 10 μg de plásmido/clon positivo.
- Recorte los extremos del producto eGFP-PCR con BglII y KpnI, siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Linealización del plásmido de expresión pLEXSY
- Utilizar al menos 10 μg del plásmido pLEXSY-eGFP purificado para la digestión con SwaI (sitio de reconocimiento: 5'-ATTTAAAT-3'). Digirir durante 3-4 h a 25 °C e inactivar con calor a 65 °C durante 20 min.
- Ejecute el producto de digestión en electroforesis de gel de agarosa para separar los fragmentos resultantes. Esta digestión generará dos fragmentos, un fragmento de 2,9 kbp que representa los elementos necesarios para la replicación y selección en E. coli, y un fragmento de 7-8 kbp que representa el casete de expresión linealizado.
- Purifique el casete de expresión con un kit comercial de extracción de gel de agarosa.
3. Transfección de L. panamensis y L. donovani por electroporación
NOTA: El cultivo de Leishmania se realiza como se describe en otra parte34. En este ejemplo, los promastigotes de L. panamensis y L. donovani se cultivaron en medio de insectos de Schneider, se suplementaron con suero fetal bovino (FBS) al 20% (v/v) y 50 μg/mL de gentamicina, y se incubaron a 26 °C.
- Cultive los cultivos de parásitos hasta que haya suficientes promastigotes en fase logarítmica o en fase estacionaria temprana para usar aproximadamente 4 x 107 parásitos por transfección. La densidad celular máxima por matraz de cultivo antes de llegar a la fase estacionaria puede variar en función de la especie de Leishmania y de la adaptación de las cepas a las condiciones de laboratorio. Agrupe el contenido de varios matraces de cultivo si es necesario.
- Centrifugar el cultivo del parásito a 2.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT).
- Resuspender el pellet en tampón de electroporación a 4 °C (21 mM de HEPES, 137 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,7 mM de Na2HPO4 y 6 mM de glucosa; pH 7,5)27 para obtener unaconcentración de 1x 108 parásitos/mL. Pon hielo durante 10 min.
NOTA: El tampón de electroporación debe esterilizarse filtrando antes de su uso. - Paralelamente, los tubos de preenfriamiento con 2-10 μg de pLEXSY-eGFP linealizado construyen un volumen máximo de 50 μL de agua o 10 mM de tampón tris (pH 8,0) y cubetas de electroporación de d = 2 mm.
- Agregue 350 μL de parásitos preenfriados al tubo con el plásmido linealizado y transfiera los 400 μL completos a la cubeta de electroporación en hielo. Paralelamente, electroporar las células del parásito sin ADN plasmídico como control negativo.
- Electroporar usando uno de estos dos protocolos:
Decaimiento exponencial: 450 V, 450 μF, un pulso.
Constante de tiempo: 450 V, T = 3,5 ms, un pulso.
NOTA: Estos protocolos se ejecutaron utilizando un pulsador de genes comercial (Tabla de Materiales) con módulos PC y CE. - Vuelva a poner la cubeta en hielo durante 10 minutos y transfiera los parásitos electroporados a 5 ml del medio de cultivo adecuado. En este ejemplo se utilizó el medio para insectos de Schneider suplementado con un 20% (v/v) de FBS. Incubar a 26 °C durante 20 h.
4. Selección policlonal en cultivo
- Aproximadamente 20 h después de la electroporación, observe los cultivos bajo un microscopio. Al menos la mitad de la población de parásitos debe mostrar una morfología y motilidad visualmente buenas (promastigotes en forma de gota con flagelo oscilante que se mueven a través del medio y/o forman agregados activos del parásito). Añadir el antibiótico selectivo adecuado en función del plásmido pLEXSY utilizado. En este ejemplo, se utiliza pLEXSY-sat2.1, que contiene estreptotricina acetiltransferasa como marcador de selección. Por lo tanto, utilice nourseotricina como antibiótico selectivo a una concentración de 0,1 mg/ml.
- Seguir los cultivos microscópicamente hasta que se observe una clara diferencia entre los parásitos electroporados con y sin ADN plasmídico.
- Verificar la fluorescencia del parásito mediante citometría de flujo.
- Centrifugar 1 mL del cultivo en fase estacionaria a 2.000 x g durante 3 min en RT. Lavar dos veces en PBS y resuspender el pellet final en 1 mL de PBS.
NOTA: La fluorescencia de eGFP se puede detectar en el canal FL1 de la mayoría de los citómetros comerciales. Los ajustes de ganancia para la dispersión directa y lateral, y el canal FL1 pueden variar entre citómetros. Para este ejemplo, se utilizó un citómetro de espacio CyFlow (Sysmex). - Ejecute las muestras, recopilando 20.000 eventos a una velocidad de 0,5 μL/s, y establezca los valores de ganancia para los canales de dispersión directa (FSC), dispersión lateral (SSC) y fluorescencia 1 (FL-1) como 225,0, 200,0 y 520,0, respectivamente. Ejecute una muestra de control con parásitos no fluorescentes para determinar la población de parásitos en un diagrama de puntos FSC frente a SSC.
- Cree una puerta (G1) que contenga la población de parásitos y filtre el canal FL-1 a través de esa puerta para determinar la autofluorescencia de los promastigotes y establecer una puerta de rango (G2) para el canal FL-1.
- Ejecute los parásitos transfectados para verificar si hay fluorescencia. Registre el porcentaje de parásitos en G1 que son fluorescentes y la media de la intensidad de fluorescencia en G2.
- Centrifugar 1 mL del cultivo en fase estacionaria a 2.000 x g durante 3 min en RT. Lavar dos veces en PBS y resuspender el pellet final en 1 mL de PBS.
5. Confirmación de la integración genómica
NOTA: La integración del casete de expresión pLEXSY-eGFP puede confirmarse mediante PCR diagnóstica, utilizando un cebador directo que hibrida al casete de expresión (varía según el vector pLEXSY-2.1 utilizado) y el cebador inverso F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') que se hibrida con una secuencia cromosómica flanqueante de ssu ausente en el casete de expresión. En este ejemplo, se utiliza el cebador directo F2999 (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') a medida que se hibrida en el casete de expresión pLEXSY-sat2.1. En la Figura 2 se muestra una representación esquemática de los sitios de recocido del casete de expresión integrado y del cebador para la PCR diagnóstica.
- Purificar el ADN genómico a partir de 2-5 mL de un cultivo de parásitos en fase estacionaria mediante extracción convencional de fenol/cloroformo35 o con un kit comercial.
- Realice la PCR diagnóstica para pLEXSY-sat2.1 utilizando un protocolo de ciclo que consiste en una desnaturalización inicial de 2 min a 94 °C, seguida de 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 53 °C y 1 min a 72 °C. Ejecute un paso de extensión final de 10 minutos a 72 °C. Los cebadores se añaden a una concentración final de 0,2 μM.
Figura 2: Representación esquemática del casete de expresión integrado. Las casillas etiquetadas como Chr-S (gris) representan las secuencias cromosómicas adyacentes del locus 18S rRNA (ssu) en el que se integra el casete de expresión. El casete de expresión integrado consta de secuencias 5' y 3' (azul) para la recombinación homóloga en el locus ssu, un promotor ribosómico adicional de Leishmania (rojo) para mejorar la producción de proteínas, el gen eGFP (verde), un gen marcador de selección (amarillo) y tres regiones no traducidas (gris claro), a saber, utr1, 2 y 3, que proporcionan las señales de empalme para el procesamiento postranscripcional del ARNm para optimizar la expresión de eGFP y el marcador de selección en parásitos de Leishmania. Los sitios de recocido de los cebadores directos e inversos utilizados para la verificación de la presencia del inserto mediante PCR de colonias (paso 1.2.5) están marcados con las flechas negras etiquetadas como cpcr-fwd (cebador EGFP1) y cpcr-rev (cebador A264) respectivamente, que delimitan un producto de 859 pb. Los sitios de recocido de los cebadores directos e inversos utilizados para la verificación de la integración genómica mediante PCR diagnóstica (paso 5) están marcados con las flechas negras etiquetadas como sat-fwd (cebador F2999) y ssu-rev (cebador F3002), respectivamente, que delimitan un producto de 2.271 pb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Clonación mediante dilución limitada (opcional)
- Después de la confirmación de la fluorescencia mediante citometría de flujo, preparar una dilución de parásitos recombinantes a una concentración de cinco promastigotes/mL36.
- Agregue 100 μL de esta dilución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. De esta manera, las placas se siembran a una densidad promedio de 0.5 promastigotes/pocillo, lo que asegura que algunos pocillos reciban un solo parásito y minimiza la probabilidad de tener más de un parásito por pocillo36.
- Deje la placa intacta durante al menos 12 h. Siga la placa microscópicamente a un aumento mínimo de 100x hasta que se detecten pocillos con crecimiento de parásitos.
- Cuando un pozo de plato esté lleno de parásitos, use el contenido para inocular un cultivo de 5 mL. Esto tarda de 1 a 2 semanas.
- Cuando los cultivos sembrados con clones alcancen la fase estacionaria, verifique la fluorescencia mediante citometría de flujo, como se describe en el paso 4.3. Seleccionar los clones que se utilizarán para otros ensayos in vitro e in vivo en función del porcentaje de parásitos fluorescentes y de la intensidad media de fluorescencia medida en el canal FL-1. Apunte a clones con 98%-99% de parásitos fluorescentes y seleccione aquellos con la intensidad de fluorescencia media más alta.
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Representative Results
Después de construir la construcción pLEXSY-eGFP y transformar las células competentes de E. coli, las colonias que contienen la construcción con el inserto de eGFP generarán un producto de aproximadamente 859 pb después de ejecutar la PCR de colonias descrita en la sección 1.2 (Figura 3A). La digestión total del plásmido purificado de colonias positivas utilizando SwaI debe dar dos fragmentos característicos en electroforesis en gel, un fragmento de 2,9 kbp que es la porción del vector PLEXSY que contiene todos los elementos necesarios para la replicación y selección en E. coli, y un fragmento de 7-8 kpb que representa el casete de expresión linealizado que se utiliza para la transfección (Figura 3B).
Después de la transfección, la selección policlonal se realiza principalmente de forma cualitativa. El estado de los cultivos de parásitos durante la selección con antibióticos se monitoriza microscópicamente, prestando especial atención a la morfología y motilidad del parásito. Después de la recuperación exitosa de un cultivo de parásitos transfectados, aquellos que expresan eGFP de manera efectiva deben detectarse en el canal FL-1 de un citómetro de flujo (Figura 4A); Las eficiencias de transfección pueden variar entre las diferentes especies de Leishmania . En este trabajo, después de la selección policlonal, el 98,44% de los parásitos de L. donovani analizados por citometría de flujo fueron fluorescentes en comparación con el 82,00% de L. panamensis (Figura 4B). Si el casete de expresión pLEXSY-eGFP se ha integrado correctamente en el locus ssu , se debe observar un producto de 2,3 kbp después de ejecutar la PCR diagnóstica descrita en la sección 5 (Figura 4C). Estos resultados aseguran que se obtienen parásitos recombinantes que expresan constitutivamente eGFP como un transgén integrado y permanecerán estables en los siguientes pasos del cultivo del parásito.
La clonación por limitación de la dilución permite el enriquecimiento de la población de parásitos fluorescentes con menores eficiencias de transfección, como L. panamensis, así como la selección de clones con las mayores intensidades de fluorescencia. Se obtuvieron cuatro clones para cada una de las especies de Leishmania utilizadas en este trabajo (Tabla 1), a saber, Lpan-A7, F11, F12 y H2 para L. panamensis, y Ldon-C1, G4, F2 y H1 para L. donovani. Los clones con mayor porcentaje de parásitos fluorescentes (Lpan-F11 = 95,74%; Ldon-C1 = 99,16%) e intensidad media de fluorescencia (Lpan-F11 = 35,63 unidades fluorescentes relativas [RFU]; Ldon-C1 = 14,12 RFU) se seleccionaron para su uso posterior en ensayos de cribado de fármacos.
Figura 3: Resultados representativos de la preparación del constructo pLEXSY-eGFP para la transfección. (A) Resultados representativos de la PCR de colonias. Carril 1: escalera de 1 kb (unidades en pares de bases); carriles 2, 10 y 12: muestras negativas para la presencia del inserto eGFP; carriles 3-9 y 13-14: muestras positivas para la presencia del inserto eGFP. (B) Resultados de la linealización con SwaI. Carril 1: escalera de 1 kb (unidades en pares de bases); carriles 2-4: reacciones de digestión de plásmidos purificados de tres colonias diferentes positivas para la presencia del inserto de eGFP. Se observa un fragmento de 2,9 kbp que representa los elementos necesarios para la replicación y selección en E. coli, y un fragmento de 7-8 kpb que representa el casete de expresión linealizado. Ambos geles se prepararon a una concentración de agarosa del 1%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la confirmación de la expresión de eGFP y la inserción cromosómica del casete de expresión. (A) Histograma de citometría de flujo en el canal FL-1. Rojo: células de tipo salvaje sin eGFP; Azul: parásitos transfectados de L. panamensis con el 82,00% de la población expresando eGFP. (B) Comparación de los resultados de la transfección entre L. panamensis (Lpan-1) y L. donovani (Ldon-1). Se observó una mayor eficiencia de transfección en L. donovani (98,44%) que en L. panamensis (82,00%) después de la selección policlonal. (C) Resultados de la PCR para confirmación de la integración genómica. L: escalera de 100 pb (unidades en pares de bases); carriles 1-4: muestras de cuatro clones diferentes de L. panamensis que muestran un producto característico de 2,3 kbp para la integración de pLEXSY-sat2.1 en el locus de la SSU. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especie | Código de clonación | Porcentaje de parásitos fluorescentes | Intensidad media de fluorescencia* |
| L. panamensis | LPAN-A7 | 90.00 | 24.70 |
| LPAN-F11 | 95.74 | 35.63 | |
| LPAN-F12 | 92.85 | 34.44 | |
| LPAN-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L. donovani | Ldon-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
Tabla 1: Clones obtenidos por dilución limitante. Se obtuvieron cuatro clones limitando la dilución para cada una de las especies de Leishmania utilizadas en este trabajo. Se informa el porcentaje de parásitos fluorescentes y la intensidad media de fluorescencia para cada clon. *La fluorescencia se expresa en unidades de fluorescencia relativa (RFU).
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Discussion
Se han estudiado las ventajas y desventajas de varios genes reporteros en varios parásitos protozoarios. Entre ellos, GFP y eGFP son intrínsecamente fluorescentes y permiten una fácil cuantificación e imagen. La actividad fluorescente de estas proteínas se puede detectar con una manipulación mínima mediante microscopía de fluorescencia, fluorimetría o citometría de flujo. Se han realizado pocos estudios para generar L que exprese GFP. (Viannia), a pesar de la robustez demostrada de GFP y sus derivados como genes reporteros en especies de Leishmania del Viejo Mundo15,16,18,24. Varela et al.37 desarrollaron cepas de L. panamensis que expresan GFP como un transgén episomal. El análisis por citometría de flujo tanto de promastigotes axénicos como de amastigotes intracelulares mostró la utilidad de estos parásitos para los ensayos de cribado de fármacos. Sin embargo, la fluorescencia fue muy heterogénea y el número de parásitos fluorescentes en la población transfectada dependió de una presión selectiva constante con el antibiótico tunicamicina. Estos hechos restringen el uso de estos parásitos como amastigotes intracelulares para ensayos de tamizaje de fármacos, dado que la tunicamicina no puede ser añadida a macrófagos infectados38, dejando parásitos con baja fluorescencia presentes en la población de amastigotes intracelulares que podrían sesgar la cuantificación de macrófagos infectados.
El uso de vectores como pLEXSY constituye una herramienta poderosa y confiable para la modificación estable de parásitos de especies de Leishmania a través de la integración de transgenes mediante recombinación homóloga28. El casete pLEXSY está integrado en el locus 18S rRNA (ssu), cuya transcripción está bajo el control del promotor fuerte de la ARN polimerasa I, lo que conduce a mayores tasas de transcripción20. El uso de este sistema ha demostrado permitir una expresión estable y homogénea de la proteína diana27. Estas características favorecen la expresión de eGFP y su uso en ensayos intracelulares con niveles homogéneos de fluorescencia en células infectadas, así como su uso para infecciones experimentales en modelos murinos. La familia de vectores pLEXSY-2.1 utilizada en este protocolo ha sido diseñada con un promotor ribosómico adicional de Leishmania delante del casete de expresión, mejorando la producción de proteínas29,30.
En este protocolo, hay varios pasos críticos para obtener resultados óptimos. En primer lugar, la clonación del gen diana debe realizarse utilizando una polimerasa33 de alta fidelidad, y la digestión del ADN diana y del vector de expresión debe realizarse utilizando un protocolo de digestión secuencial cuando se utiliza la combinación BglII/KpnI para la clonación. Esto último se debe a que no existe un tampón en el que tanto BglII como KpnI exhiban una actividad óptima, aunque ambas enzimas son óptimamente activas a la misma temperatura (37 °C). En segundo lugar, la selección de clones recombinantes después de la transformación en E. coli debe realizarse a 30 °C, ya que los plásmidos pLEXSY son más estables a esta temperatura en E. coli28,29. Además, las tasas de crecimiento de L. panamensis y L. donavani podrían ser muy diferentes. Durante la realización de los experimentos descritos en este artículo, L. panamensis generalmente tardó más en alcanzar la fase estacionaria. Las tasas de crecimiento también pueden variar de una cepa a otra en diferentes laboratorios; Por lo tanto, es necesario caracterizar las tasas de crecimiento de las cepas de laboratorio para estimar el tiempo requerido para alcanzar la concentración de parásitos requerida para la electroporación. El uso del tampón reportado por Bolhassani et al.27 para la electroporación es una modificación importante que aumenta significativamente la supervivencia de los parásitos electroporados en comparación con la electroporación directa en un medio de cultivo, como lo sugiere el protocolo original de Jena Bioscience. Durante la selección policlonal, es extremadamente importante no dejar que los cultivos electroporados crezcan demasiado antes de agregar el antibiótico selectivo; de lo contrario, los parásitos no recombinantes superarán a los recombinantes27. Se necesitarán uno o dos pases consecutivos (inóculo 1:10) en medio fresco con el antibiótico adecuado para obtener un cultivo turbio de parásitos recombinantes resistentes a los antibióticos y un claro control negativo. Los pases deben realizarse dentro de los 5 días posteriores a la primera adición de antibióticos. Por último, existen diferencias notables en la eficiencia de la transfección e integración del casete de expresión pLEXSY entre L. panamensis y L. donovani24,37. Mientras que en L. donovani casi el 98% de la población total analizada mediante citometría de flujo después de la selección policlonal muestra fluorescencia, en L. panamesis, el porcentaje de parásitos fluorescentes es de alrededor del 80%. Por esta razón, el paso opcional de clonación mediante la limitación de la dilución es una modificación que se requiere principalmente para obtener una población de L. panamensis donde más del 95% de los parásitos analizados mediante citometría de flujo son fluorescentes. El uso de plásmidos pLEXSY se limita a la modificación genómica de especies de Leishmania, ya que fueron diseñados originalmente para utilizar L. tarentolae como plataformas de producción de proteínas28. Aunque pLEXSY ha demostrado funcionar en varias especies de Leishmania diferentes de L. tarentolae21,24,27, es importante verificar la conservación de la secuencia ssu cuando se trabaja con una nueva especie de Leishmania para asegurarse de que los sitios de recombinación en el plásmido pLEXSY funcionarán.
El método descrito en este artículo permite la producción de parásitos recombinantes de Leishmania con una expresión constitutiva y estable de eGFP o cualquier otro reporte de interés. En estos parásitos, la fluorescencia es homogénea y se mantiene en formas intracelulares. Por lo tanto, las cepas generadas a través de este proceso podrían utilizarse para estandarizar ensayos de cribado de fármacos de alto rendimiento para evaluar la posible actividad anti-leishmania de moléculas de origen natural y sintético.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, número de subvención NI-177-2016, y Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, subvención números SNI-169-2018, SNI-008-2022 y SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
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