Summary
Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.
Abstract
Otofaji, proteinler ve hasarlı organeller de dahil olmak üzere sitoplazmik bileşenleri seçici olarak bozan özel bir katabolik süreçtir. Otofaji, hücrelerin stres uyaranlarına fizyolojik olarak yanıt vermelerini ve böylece hücresel homeostazı korumalarını sağlar. Kanser hücreleri, hipoksi, besin eksikliği veya kemoterapinin neden olduğu hasar gibi olumsuz koşullara uyum sağlamak için otofaji seviyelerini modüle edebilir. Duktal pankreatik adenokarsinom en ölümcül kanser türlerinden biridir. Pankreas kanseri hücreleri, otofaji proteinlerinin transkripsiyonel upregülasyonu ve post-translasyonel aktivasyonu nedeniyle yüksek otofaji aktivitesine sahiptir.
Burada, PANC-1 hücre hattı pankreas insan kanseri hücrelerinin bir modeli olarak kullanıldı ve AR42J pankreas asinar hücre hattı, oldukça farklılaşmış memeli hücrelerinin fizyolojik bir modeli olarak kullanıldı. Bu çalışmada, otofaji aktivasyonunun durumunun bir göstergesi olarak mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir 3'ün (LC3) immünofloresansı kullanılmıştır. LC3, bazal koşullarda, sitoplazmada yaygın bir dağılım paterni gösteren bir otofaji proteinidir (bu durumda LC3-I olarak bilinir). Otofaji indüksiyonu, LC3'ün yeni oluşan otofagozomların yüzeyindeki fosfatidiletanolamine konjugasyonunu tetikler ve otofagozomların oluşumuna ve genişlemesine yardımcı olan zara bağlı bir protein olan LC3-II'yi oluşturur. Etiketli otofajik yapıların sayısını ölçmek için, açık kaynaklı yazılım FIJI, "3D Nesneler Sayacı" aracının yardımıyla kullanıldı.
Hem fizyolojik koşullarda hem de kanser hücrelerinde otofajik seviyelerin ölçülmesi, hipoksi, kemoterapi tedavisi veya belirli proteinlerin yıkılması gibi çeşitli koşullar altında otofajinin modülasyonunu incelememizi sağlar.
Introduction
Makrootofaji (genellikle otofaji olarak adlandırılır), proteinler ve hasarlı organeller 1,2 dahil olmak üzere sitoplazmik bileşenleri seçici olarak parçalayan özel bir katabolik süreçtir. Otofaji, hücrelerin stres uyaranlarına fizyolojik olarak yanıt vermelerini ve böylece hücresel homeostazı korumalarını sağlar3. Otofaji sırasında, çift zarlı bir vezikül oluşur: otofagozom. Otofagozom kargo moleküllerini içerir ve onları bozunma için lizozoma götürür 1,4.
Otofagozomlar, otofajik protein mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir 3 (LC3)5 tarafından dekore edilmiştir. Otofaji indüklenmediğinde, LC3, LC3-I konformasyonundaki sitoplazmada ve çekirdekte yayılır. Öte yandan, otofaji indüklendiğinde, LC3, otofajik yapıların zarında bir fosfatidiletanolamin ile konjuge edilir6. Bu yeni LC3 konformasyonu LC3-II1 olarak bilinir. LC3 konformasyon kayması, hücresel lokalizasyonunda ve dodesil sodyum sülfat-poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) migrasyonunda değişikliklere neden olur ve bu da immünofloresan ve batı lekesi 5,7 gibi tekniklerle tespit edilebilir. Bu şekilde, LC3 konjugasyonu, otofajik aktiviteyi ölçmek için kullanılabilecek otofajik süreçte önemli bir olaydır.
Pankreatik asinar hücre, sağlıklı koşullar altında düşük otofaji oranına sahip oldukça farklılaşmış bir hücredir. Bununla birlikte, farklı fizyolojik koşullarda veya farmakolojik stimülasyon altında, otofajiyi aktive edebilirler. Bu nedenle, bu hücre hattındaki otofajik seviyelerin belirlenmesi, farklı farmakolojik veya biyolojik ajanların otofaji üzerindeki potansiyel doğrudan veya dolaylı etkilerini incelemek için yararlıdır 8,9.
Duktal pankreatik adenokarsinom, geç tanısı ve yüksek kemoterapi direnci nedeniyle en ölümcül kanser türlerinden biridir10. Pankreas kanseri hücreleri, otofaji ile ilişkili proteinlerin transkripsiyonel upregülasyonu ve post-translasyonel aktivasyonu nedeniyle yüksek otofaji aktivitesine sahiptir11. Pankreas kanseri hücreleri, hipoksi, besin yoksunluğu veya kemoterapiye bağlı hasar gibi olumsuz koşullara yanıt olarak otofaji seviyelerini ayarlayabilir11. Bu nedenle, pankreas kanseri hücrelerindeki otofaji seviyelerini analiz etmek, değişen ortamlara nasıl adapte olduklarını anlamaya ve otofaji modüle edici tedavilerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olabilir.
Bu çalışma, iki ayrı pankreas hücresel modelinde LC3 immünofloresansını gerçekleştirmek için bir yöntem göstermektedir. İlk model olan PANC-1 hücreleri, pankreatik duktal adenokarsinom için bir model olarak görev yaptı. Bu hücreler, daha önce otofajiyi indüklediği gösterilen bir kemoterapi ajanı olan gemsitabin ile, özellikle onkojenik Kirsten sıçan sarkom virüsü genini (KRAS) taşıyan pankreas kanseri hücrelerinde12,13 ile tedavi edildi. İkinci model olan AR42J hücreleri, ekzokrin pankreas hücrelerinin daha fizyolojik bir modeli olarak hizmet etti. Bu hücreler, asinar pankreas hücrelerine daha benzer hale gelmek için deksametazon ile farklılaştırıldı14. Bu hücrelerde, otofaji, güçlü bir mTOR inhibitörü olan PP24215 kullanılarak farmakolojik olarak indüklendi. Bu çalışmada, iki farklı pankreas modeli ile tanımlanan protokolün uygulanabilirliğini ve düşük ve yüksek otofaji durumlarını ayırt edebilme yeteneğini gösterdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre hazırlığı
- 12 mm'lik yuvarlak kapakları mutlak etanol içine batırın ve dikey olarak 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.
- Kapağı çıkarın ve çok kuyucuklu plakayı 15 dakika boyunca ultraviyole radyasyona maruz bırakın.
- Kapakları yatay olarak konumlandırın ve Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile yıkayın.
- Pankreas hücrelerinin düşük geçiş sayısını tohumlayın. Miktar, fiksasyon gününde% 50 -% 75 akıcılık elde etmek için ayarlanmalıdır16.
NOT: 3 gün sonra hücreleri sabitlemek için kuyucuk başına 2,5 × 10 4 PANC-1 veya4 × 104 AR42J hücresinin tohumlanması önerilir. - DMEM'deki hücreleri, %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren hücreleri, %5 karbondioksit (CO2) ile nemlendirilmiş bir atmosfer altında 37 °C'de bir inkübatörde kültüre alın.
NOT: PANC-1 hücreleri için, hücre tohumlaması ile aşağıdaki adımlar arasında hücrelerin 2 gün boyunca inkübe edilmesi önerilir. Bu süreden sonra, hücreler transfekte edilebilir, tedavi edilebilir veya sabitlenebilir. Bu protokol, transfekte olmayan PANC-1 hücrelerinde gemsitabin ile tedaviyi ve transfekte olmayan AR42J hücrelerinde farklılaşma ve PP242 tedavisini örneklemektedir.
2. Hücrelerin tedavisi
- PANC-1 hücreleri için gemsitabin tedavisi
- Tohumlamadan 2 gün sonra DMEM'de 1 μg / μL gemsitabin çözeltisi hazırlayın. 20 μM'lik nihai seyreltme elde etmek için her bir kuyucuğa 1 μg / μL gemsitabin çözeltisinden 2,6 μL ile muamele edin.
- Hücreleri inkübatörde 24 saat boyunca inkübe edin.
- AR42J farklılaşması ve PP242 tedavisi
- DMEM'de 4 μg / mL deksametazon çözeltisi hazırlayın.
- 100 nM'lik nihai bir seyreltme elde etmek için her bir kuyucuğu 4.9 μL 4 μg / mL deksametazon çözeltisi ile tedavi edin.
- Hücreleri inkübatörde 48 saat boyunca inkübe edin.
- Ortamı çıkarın ve 1 μM'lik nihai bir seyreltme elde etmek için her bir kuyucuğa 0,5 μL 1 mM PP242 ile muamele edin.
- Hücreleri inkübatörde 2 saat boyunca inkübe edin.
3. Hücrelerin sabitlenmesi ve geçirgenleştirilmesi
- Soğuk metanol içeren 24 delikli bir plaka ve soğuk fosfat tamponlu salin içeren 6 delikli bir plaka hazırlayın (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH2PO4). Onları buz üzerinde tutun.
- Her bir kapak parçasını cımbızla alın, PBS'de iki kez yıkayın ve metanol içinde 6 dakika inkübe edin.
4. Hücrelerin bloke edilmesi
- Her bir kapak kapağını PBS'de iki kez yıkayın ve PBS'de% 10 fetal sığır serumunda 1 saat inkübe edin (bloke edici solüsyon).
Not: Bu adımda, iletişim kuralı duraklatılmış olabilir. Kapak fişleri gece boyunca blokaj çözeltisindeki buzdolabında saklanabilir ve protokole ertesi gün devam edilebilir.
5. Kapakların birincil antikor ile inkübe edilmesi
- Blokaj çözeltisinde 1: 1.000'lik bir anti-LC3 çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
- Çok kuyucuklu kapağın üzerine bir parça laboratuvar sızdırmazlık filmi yerleştirin.
- Sızdırmazlık filmi üzerine anti-LC3 çözeltisinin kapak kayması başına bir damla (25 μL) yerleştirin.
- Her bir kapak parçasını cımbızla alın ve hücre tarafının çözelti ile temas halinde olmasına dikkat ederek birincil antikor damlasının üzerine yerleştirin.
- Nemli bir kağıt parçasını düz tabanlı bir plastik kutuya yerleştirerek nemli bir oda hazırlayın.
- Çok kuyucuklu plakayı nem odasına yerleştirin, folyo ile örtün ve gece boyunca buzdolabında inkübe edin.
6. Kapakların ikincil antikor ile inkübe edilmesi
- Çok kuyucuklu plakayı nem odasından çıkarın ve kapak kapaklarını tekrar çok kuyucuklu plakaya yerleştirin.
- PBS ile üç yıkama yapın.
- Blokaj çözeltisinde 1:800 seyreltme ile floresan olarak etiketlenmiş bir anti-tavşan çözeltisi hazırlayın ve ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
- Çok kuyucuklu kapağın üzerine bir sızdırmazlık filmi parçası yerleştirin.
- Sızdırmazlık filmi üzerine tavşan önleyici çözeltinin kapak kayması başına bir damla (25 μL) yerleştirin.
- Her bir kapak parçasını cımbızla alın ve hücre tarafının çözelti ile temas halinde olmasına dikkat ederek birincil antikor damlasının üzerine yerleştirin.
- Çok kuyucuklu plakayı nem odasında, ışıktan korunan oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca inkübe edin.
7. Hücrelerin 4′ ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyanması
- Çok kuyucuklu plakayı nem odasından çıkarın ve kapak kapaklarını tekrar çok kuyucuklu plakaya yerleştirin.
- PBS ile üç yıkama yapın.
- PBS'de (ışıktan korumalı) 300 nM'lik bir DAPI çözeltisi hazırlayın.
- Her bir kapak fişini DAPI çözeltisi ile 10 dakika boyunca inkübe edin.
- PBS ile üç yıkama yapın. Çok kuyucuklu plakayı ışıktan koruyun.
8. Montaj
- Su ve bir parça kağıt ile iki beher hazırlayın.
- Bir polivinil alkol-Bis (trimetilaluminum)-1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan addukt (PVA-DABCO) çözeltisinin kapak kayması başına bir damla (10 μL) bir slayt üzerine yerleştirin.
NOT: PVA-DABCO, 0,25 M DABCO, %10 W/V PVA, %20 gliserol ve %50 Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) ultra saf suda birleştirilerek hazırlanır. - Her bir kapak parçasını cımbızla alın, her su kabında yıkayın, kağıtta kurutun ve PVA-DABCO damlasının üzerine yerleştirin (çözelti ile temas eden hücrelerle).
- Gece boyunca kurumasını bekleyin, ışıktan koruyun.
9. Konfokal mikroskopi görüntüleme ve görüntü yakalama
- Yaklaşık63x17'lik bir hedef kullanarak ters çevrilmiş bir konfokal mikroskopta kapak kaymalarını görselleştirin.
- Etiketli hücrelerin temsili görüntülerini yakalayın.
10. LC3 noktalarının ölçülmesi
- Açmak için ".czi" gibi yakalanan kanalları içeren her görüntü dosyasını ImageJ (FIJI) ekranına sürükleyip bırakın. İletişim kutusunda Tamam'a tıklayın ve Konsol penceresini kapatın.
- Görüntü sekmesinden, Renk > Kanalları Böl'ü seçin.
- LC3 görüntüsü dışındaki kanallara karşılık gelen görüntüleri kapatın.
- Image (Görüntü) sekmesinden Adjust > Color Balance (Renk Dengesi Ayarla) seçeneğini belirleyin
- Hücre hatlarını görselleştirmek için görüntü doygun hale gelene kadar Maksimum kaydırıcıyı sola hareket ettirin.
- Serbest Seçim aracıyla hücre anahattını çizin.
- Renk ayarını sıfırlamak için Sıfırla düğmesine tıklayın.
- Düzenle sekmesinden, seçili öğeyi kesmek için Kes'i seçin.
- Görüntüyü kaydetmeden kapatın.
- Düzenle sekmesinden Yapıştır'ı seçin.
- Analiz menüsünde, 3B Nesneler Sayacı aracını seçin.
- Eşiği ayarlayın. Bu çalışmada verilen örnekte, eşik 2.000 olarak ayarlanmıştır.
- Boyut filtresini ayarlayın. Bu çalışmada 50 ile 500 arasında ayarlanmıştır.
- Nesneler ve Özet kutularının işaretli olduğundan emin olun.
- Tamam'a tıklayın. Noktaların sayısı, Özet'te Algılanan Nesneler olarak açıklanacaktır.
Şekil 1: LC3 immünofloresan protokolünün şematik diyagramı. LC3 immünofloresan için sağlanan genel protokolü temsil eden şematik diyagram. Şekil BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, farklı koşullarda otofaji seviyelerini belirlemek için pankreas hücre hatlarında LC3'ün immünofloresansını gerçekleştirir. Bu deneyin sonucu, LC3 ve DAPI'ye karşılık gelen kırmızı ve mavi kanallardan hücresel görüntülerin gizlenmesiydi. LC3 görüntüleri bu proteinin hücresel dağılımını gösterirken, DAPI nükleer lokalizasyonu gösterir. Şekil 2A , LC3'ün immünofloresansının temsili bir görüntüsünü ve bazal veya gemsitabin tedavi koşulları altında PANC-1 hücrelerinde DAPI boyaması ile birleşmesini göstermektedir. LC3 boyama görüntülerinin bir kümesi, FIJI'deki 3D Nesneler Sayacı aracı kullanılarak analiz edildi. Bu yazılım kullanılarak, hücre başına LC3 nokta miktarı ölçüldü. Şekil 2B'deki çubuk grafik, bazal ve gemsitabin tedavi koşulları altında PANC-1 hücrelerinde LC3 nokta niceliğinin sonuçlarını göstermektedir. Bu grafikte, LC3 noktaları gemsitabin tedavisi altında önemli ölçüde artmıştır ve LC3 noktalarının sayısı doğrudan otofajik aktiviteyi göstermektedir. Ayrıca daha önce gemsitabinin pankreas kanseri hücrelerinde otofajiyi tetiklediğini gösterdik12. Genel olarak, bu makalede sunulan yöntem, bu hücrelerde gemsitabin tarafından indüklenen otofaji aktivasyonundaki artış seviyesinin tespit edilmesini sağlar.
Bu protokol, pankreas kanseri hücrelerinde otofajik aktiviteyi belirlemek için LC3 immünofloresansının kullanılmasına odaklanırken, fizyolojik olarak daha alakalı modeller de dahil olmak üzere potansiyel olarak diğer hücre hatlarına uygulanabilir. Yöntemin fizyolojik yanıtları değerlendirmedeki etkinliğini test etmek için, AR42J hücre hattı kullanıldı. Bu hücreler bir sıçan ekzokrin pankreas tümöründen türetilmiş olsalar da, glukokortikoid stimülasyonu ile ekzokrin hücrelere ayrılabilirler, böylece onları uygun bir pankreas modelihaline getirirler 8,14,18. AR42J hücreleri, 48 saat boyunca 100 nM deksametazon tedavisi ile farklılaştırıldı, ardından otofajiyi indüklemek için mTOR inhibitörü PP242 ile tedavi edildi15. Elde edilen sonuçlar, PP242 tedavisi altında hücre başına LC3 nokta sayısında önemli bir artış gösteren Şekil 3'te sunulmuştur.
Şimdiye kadar, sunulan yöntemin hem kanser hücrelerinde hem de daha fizyolojik bir modelde otofajik aktiviteyi değerlendirmek için etkili olduğunu gösterdik. Bununla birlikte, sunulan protokolden küçük sapmaların yorumlanamaz sonuçlara yol açabileceğini belirtmek önemlidir.
Şekil 4A , kapak fişleri üzerine çok fazla hücrenin ekildiği ve aşırı birleşmenin elde edildiği suboptimal bir deneyden temsili bir görüntü göstermektedir. Bu tür bir deney çeşitli nedenlerden dolayı yorumlanamayabilir. İlk olarak, bu çalışmada bahsedilen hücresel tipler, hücrelerin acini'de gruplandırıldığı ekzokrin pankreastan türetilmiştir. Aşırı bir birleşme altında, bu hücreler yığılır ve birbirlerinin üzerine yığılır ve büyür ( Şekil 4A'daki hücre 3 ve hücre 4'ün üzerinde bulunan hücre 1 ve hücre 2 gibi). Bu fenomen, LC3 noktalarının hangi hücreye ait olduğunu bilmeyi neredeyse imkansız kılar, böylece hücre başına nokta sayısını tahmin etmeyi çok zorlaştırır. Öte yandan, yüksek akıcılıktaki hücreler stresli olma eğilimindedir, bu da otofajiyi tetikler. Sonuç olarak, kontrol ve tedavi edilen hücreler arasındaki otofajik seviyelerdeki farklılıklar, arka plan otofajik aktivitesindeki bir artışa bağlı olarak azalabilir.
Şekil 4B'de, hücrelerin metanol yerine paraformaldehit ile sabitlendiği başka bir tür suboptimal deneyden temsili bir görüntü gösterilmiştir. Bu fiksasyon yöntemi genellikle çeşitli proteinleri korumak için etkili olsa da, elde edilen görüntü gerçek dağılımını doğru bir şekilde yansıtmadığı için LC3 için uygun değildir. Bu teknik hata, düşük ve yüksek otofajik seviyeler arasındaki farkları bulmayı imkansız hale getirebilir.
Genel olarak, hücre hatları tohumlamadan 1 gün sonra tedavi edilebilir, transfekte edilebilir veya sabitlenebilir. Bununla birlikte, PANC-1 hücreleri söz konusu olduğunda, deneyin sonraki adımlarına geçmeden önce hücrelerin cam örtülere tam olarak yapışmasını sağlamak için tohumlamadan sonra 2 gün beklemenin gerekli olduğunu belirtmek çok önemlidir. Şekil 4C , hücrelerin tohumlamadan sadece 1 gün sonra gemsitabin ile muamele edildiği bir deneyden temsili bir görüntü göstermektedir. Şekilden, bu deneydeki hücrelerin yuvarlak bir şekle sahip olduğu gözlemlenebilir. Bu morfoloji, sitoplazma ve çekirdek arasındaki ilişkiyi azaltarak, LC3'ün hücre içi dağılımını anlamayı ve düşük ve yüksek otofajik seviyeler arasında ayrım yapmayı zorlaştırdı. AR42J'nin bu soruna sahip olmadığını ve tohumlamayı takip eden gün tedavi edilmeye veya sabitlenmeye hazır olduklarını belirtmek önemlidir.
Metanol fiksasyon zamanı değiştiğinde başka bir suboptimal sonuç elde edilebilir. Daha kısa fiksasyon süreleri, hücrelerin 3 dakika boyunca sabitlendiği Şekil 4D'de gösterildiği gibi eksik fiksasyona neden olabilir. Eksik fiksasyon, uygun LC3 immün etiketlemesine müdahale ederek net olmayan görüntülere ve yetersiz nicelemeye neden olabilir.
Resim 2: Bazal veya gemsitabin koşulları altında PANC-1 hücrelerinde LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü. PANC-1 hücreleri ya 24 saat boyunca 20 μM gemsitabin ile tedavi edildi ya da tedavi edilmeden bırakıldı ve daha sonra anti-LC3 ile immüno-etiketlendi. (A) Her koşulun temsili görüntüleri gösterilir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (B) Çubuk grafik, her koşul için hücre başına LC3 noktalarının araçlarının (SEM) araçlarını ve standart hatalarını temsil eder. N = üç bağımsız deneyden koşul başına 10 hücre. p < 0.001 bir Öğrencinin t-testi ile. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bazal veya PP242 koşulları altında AR42J hücrelerinde LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü . AR42J hücreleri 48 saat boyunca 100 nM deksametazon ile ayırt edildi ve daha sonra 2 saat boyunca 1 μM PP242 ile tedavi edildi veya tedavi edilmeden bırakıldı, ardından anti-LC3 ile immüno-etiketleme yapıldı. (A) Her koşulun temsili görüntüleri gösterilir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (B) Çubuk grafik, her koşul için hücre başına LC3 noktalarının araçlarının (SEM) araçlarını ve standart hatalarını temsil eder. N = üç bağımsız deneyden koşul başına 10 hücre. ** p < 0.01 bir Öğrencinin t-testi ile. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Optimal olmayan deneyler. Suboptimal deneylerde LC3 immünofloresansının temsili görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (A) Aşırı birleşim: 7 × 104 PANC-1 hücresi tohumlandı, gemsitabin ile muamele edildi ve anti-LC3 ile immün olarak etiketlendi. Hücre 1 ve hücre 2'nin hücre 3 ve hücre 4'ün üzerinde olduğunu göstermek için dört hücre işaretlenir. (B) PFA fiksasyonu: PANC-1 hücreleri gemsitabin ile tedavi edildi, PFA ile sabitlendi ve anti-LC3 ile immün olarak etiketlendi. (C) Tamamlanmamış gerilme: PANC-1 hücreleri, tohumlamadan sonraki gün gemsitabin ile muamele edildi ve anti-LC3 ile immün olarak etiketlendi. (D) Tamamlanmamış fiksasyon: PANC-1 hücreleri gemsitabin ile muamele edildi, 3 dakika boyunca metanol ile sabitlendi ve anti-LC3 ile immüno-etiketlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde açıklanan yöntem, hücredeki endojen LC3 dağılımının görselleştirilmesine ve farklı koşullar altında otofajik seviyelerin ölçülmesine izin verir. LC3 dağılımını analiz etmek ve otofaji aktivasyonunu belirlemek için kullanılan bir başka benzer yöntem, floresan etiketli LC3 transfeksiyonunu (RFP-LC3 gibi) içerir19. RFP-LC3 transfeksiyonu, fiksasyona ihtiyaç duymama (bu yöntemin canlı hücre görüntüleme20'de uygulanmasına izin verir), daha ucuz olma ve LC3 antikor reaktivitesine bağlı olmama avantajlarına sahiptir. Öte yandan, LC3'ün immünofloresansı, endojen LC3'ün bir görüntüsünü sağlama avantajına sahiptir, böylece otofaji21'den bağımsız protein agregalarının oluşumu gibi LC3 aşırı ekspresyonu ile ilgili olası sorunlardan kaçınır. Dahası, bu yöntem hücrelerin transfekte edilmesinin kolaylığına bağlı değildir, yani çeşitli hücre hatlarına uygulanabilir. Bununla birlikte, kullanılan LC3 antikoruna ve reaktivitesine bağlı olarak, çalışmayabileceği bazı hücresel hatlar vardır. Bazı antikorlar belirli türler için iyi çalışabilir, ancak teorik olarak farklı türlerle uyumlu olsalar bile diğerleri için çalışmayabilir. Bu protokolde kullanılan antikor (LC3B D11) durumunda, insan hücreleri (PANC-1, HEK293T, HeLa) ve sıçan hücreleri (AR42J) için mükemmel çalıştığını bulduk. Bununla birlikte, spesifik olmayan nükleer boyama gözlemlediğimiz için fare hücreleri (MEF hücreleri) için çalışmaz. LC3 lekelerinin miktarının, endojen veya aşırı eksprese edilmiş olsun, LC3-II'nin artan üretimini gösterebilecek otofaji aktivasyonundaki değişiklikler ile otofajik bir akı durumunu gösterebilecek LC3-II bozulmasındaki değişiklikler arasında ayrım yapmada sınırlamalara sahip olduğunu belirtmek gerekir. Otofaji aktivitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için ek yöntemler kullanılabilir. Örneğin, RFP-GFP-LC3 ekspresyonunun kullanılması, lizozom22,23'ün içindeki veya dışındaki LC3-II arasında ayrım yaparak doğru bir değerlendirme sağlayabilir.
Şekil 4'te gösterildiği gibi, protokolde, modifikasyonlarının optimal olmayan sonuçlara yol açabileceği göz önüne alındığında, değiştirilmemesi gereken bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, tohumlanacak doğru hücre sayısını ayarlamak önemlidir. Yeterli hücre tohumlanmadığında, transfeksiyona veya tedavilere direnmeme eğilimindedirler ve yuvarlak kalırlar. Aksine, hücreler aşırı miktarda tohumlandığında, komşu hücrelerin üstünde büyüme eğilimindedirler, bu da bireysel hücrelere odaklanmayı ve LC3 noktaları arasında ayrım yapmayı zorlaştırır. Özellikle, hücrelerin birbirine yakın olduğu ancak Şekil 4A'da gösterildiği gibi örtüşmediği durumlarda, her hücreye ait pozitif belirteçleri ayırt etmek için EGFR gibi spesifik membran belirteçleri ile immün boyama kullanmak yararlı olabilir24. Bununla birlikte, E-kadherin ve EpCAM gibi bazı belirteçlerin, bu hücre tipi25,26,27 ile ilişkili tipik epitelyal-mezenkimal geçiş sürecinden kaynaklanan azalmış membran ekspresyonu nedeniyle PANC-1 hücrelerinde bu amaç için uygun olmadığını belirtmek önemlidir. İkincisi, özellikle PANC-1 hücreleri ile çalışırken, tohumlama ile deneyin sonraki adımları arasında en az 1 gün beklemek önemlidir. Tersine, doğru zaman için beklemediğinde, hücreler yuvarlanabilir ve bu da sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Üçüncüsü, fiksasyon bu protokolde kritik bir adımdır. Gösterdiğimiz gibi, yöntem sadece yeterli bir metanol fiksasyonu ile çalışır. Paraformaldehit fiksasyonu, LC3 immünoetiketlemesi için doğru şekilde çalışmazken, daha kısa sürelerin eksik bir fiksasyona yol açabileceği göz önüne alındığında, metanol fiksasyon süresi değiştirilmemelidir. Metanol fiksasyon sürelerini 1 saate kadar test ettik ve LC3 etiketlemesinde farklılıklar gözlemlemedik. Bununla birlikte, metanol fiksasyonu çözünür hücresel proteinlerin ve serbest floresan moleküllerinin kaybına yol açabileceğinden, uzun fiksasyon sürelerinin kullanılmamasını tavsiye ederiz28. Bu nedenle, kesin ve güvenilir sonuçlar elde etmek için standart sabitleme süresine uyulması önerilir.
Açıklanan protokolde bazı değişiklikler kabul edilebilir. Örneğin, 24 delikli plaka yerine 12 delikli bir plaka kullanılabilir, ayrıca hücreler 12 mm'lik kapak kaymaları yerine 15 mm'lik yuvarlak kapaklar üzerinde büyütülebilir. Bu durumda, tohumlanacak hücre sayısının ve kullanılan reaktiflerin hacimlerinin bu protokolde açıklananlardan daha fazla olacağı düşünülmelidir. Bu durumda, 4 × 104 PANC-1 ve 6.5 × 104 AR42J tohumlanmalıdır. Ek olarak, kullanılan blokaj çözeltisi, PBS'de% 1 BSA gibi diğerleriyle değiştirilebilir ve bu da benzer sonuçlara yol açacaktır. Aynı şekilde, blokaj süresi, sonuçları önemli ölçüde değiştirmeden 24 saate kadar arttırılabilir. Antikor inkübasyon süreleri ve konsantrasyonu ayarlanabilir ve örneğin başka bir LC3 antikoru kullanıldığında değişebilir. Bu çalışmada PVA-DABCO çözümü hazırlanmakla birlikte ticari montaj çözümleri de kullanılabilir. Öte yandan, niceleme yöntemi değiştirilebilir. Örneğin, görüntülere bazı filtreler veya maskeler uygulamak mümkündür ve nokta ölçümü için alternatif bir araç kullanılabilir.
Bu çalışmada, pankreas kanseri hücrelerinin davranışını incelemek için LC3'ün immünofloresansının uygulanmasını yönlendirdik. Bu hücrelerde, otofaji temel olarak aktive edilir ve kemoterapi, hipoksi veya besin eksikliği gibi çeşitli stresli durumlara yanıt olarak modüle edilebilir11,12. Bu hücrelerde otofajinin belirlenmesi, kemoterapi, radyoterapi veya otofajiyi modüle eden diğer tedavilere hücresel yanıtı incelemek için geçerli olabilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, sunulan yöntem fizyolojik modellerde uygulanabilir. Bu çalışmada, otofajik seviyelerin nicelleştirilmesine odaklanmış olsak da, LC3'ün immünofloresansı, LC3 ve çeşitli proteinler arasındaki kolokalizasyonun değerlendirilmesine de izin verebilir. Örneğin, otofajik sürecin farklı noktalarındaki proteinleri işaretlemek ve LC3 ile kolokalizasyonun bazı tedavilerden mi yoksa bazı proteinlerin aşağı regülasyonundan mı etkilendiğini değerlendirmek için mekanik bir yaklaşım olarak hizmet edebilir. Bu şekilde, örneğin, bazı otofaji inhibitörlerinin LC3 konjugasyonundan önce veya sonra otofajik akıyı kesip kesmediği belirlenebilir. Son olarak, yöntem hayvan modellerinde veya insan biyopsi örneklerinde otofaji aktivasyonunu belirlemek için doku örneklerine de uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması ilan edilmedi.
Acknowledgments
Bu çalışma, Buenos Aires Üniversitesi (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Ulusal Bilimsel Araştırma ve Teknoloji Konseyi (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; ve PUE 22920170100033) ve Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Tanıtım Ajansı (PICT 2019-01664) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A.
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E.
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T.
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N.
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
