Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 ved korrelativ lyselektronmikroskopi på snittet

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/65067
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Center for Molecular Medicine-Cell Biology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for optimalisert korrelativ lyselektronmikroskopi basert på endogen, fluorescerende merking som et verktøy for å undersøke lokalisering av sjeldne proteiner i forhold til cellulær ultrastruktur. Kraften i denne tilnærmingen er demonstrert ved ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 i sultede celler uten Bafilomycin-behandling.

Abstract

Visualisering av autofagiske organeller på ultrastrukturelt nivå ved elektronmikroskopi (EM) er avgjørende for å etablere sin identitet og avsløre detaljer som er viktige for å forstå den autofagiske prosessen. Imidlertid mangler EM-metoder ofte molekylær informasjon, noe som hindrer korrelasjonen mellom ultrastrukturell informasjon oppnådd av EM til fluorescensmikroskopibasert lokalisering av spesifikke autofagiproteiner. Videre hemmer sjeldenheten av autofagosomer i uendrede cellulære forhold undersøkelse av EM, noe som krever høy forstørrelse, og gir dermed et begrenset synsfelt.

Som svar på begge utfordringene ble en korrelativ lyselektronmikroskopi (CLEM) -metode basert på fluorescerende merking anvendt for å korrelere en vanlig autofagosomal markør, LC3, til EM-ultrastruktur. Metoden ble brukt til raskt å screene celler i fluorescensmikroskopi for LC3-merking i kombinasjon med andre relevante markører. Deretter ble de underliggende ultrastrukturelle egenskapene til utvalgte LC3-merkede flekker identifisert av CLEM. Metoden ble brukt på sultede celler uten å tilsette hemmere av lysosomal surgjøring.

Under disse forholdene ble LC3 funnet hovedsakelig på autofagosomer og sjelden i autolysosomer, hvor LC3 raskt nedbrytes. Disse dataene viser både gjennomførbarheten og sensitiviteten til denne tilnærmingen, og viser at CLEM kan brukes til å gi ultrastrukturell innsikt i LC3-mediert autofagi under opprinnelige forhold - uten medikamentell behandling eller genetiske endringer. Samlet sett presenterer denne metoden et verdifullt verktøy for ultrastrukturelle lokaliseringsstudier av autofagiproteiner og andre knappe antigener ved å bygge bro mellom lysmikroskopi og EM-data.

Introduction

Autofagi er en nøkkelprosess for rensing og resirkulering av cytoplasmatiske proteiner og organeller. Prosessen med makro-autofagi (heretter kalt autofagi) involverer dannelsen av dobbeltmembranorganeller, autofagosomer, som gjør det mulig for celler å omslutte cytoplasmatiske molekyler og organeller for lysosomal nedbrytning. Autofagi forekommer på basalnivå i de fleste celler og oppreguleres som respons på cellulære forhold, som sult eller cellulær stress. Autofagi forekommer enten på en substratspesifikk måte, rettet mot spesifikke strukturer eller proteiner for nedbrytning, eller som en ikke-selektiv bulkprosess som omfatter deler av cytosolen. I selektiv autofagi dannes autofagosomer ved konjugering av proteiner i Atg8-familien (mikrotubuliassosierte proteiner 1A/B lettkjede 3A/B/C [LC3] og GABARAPs) til membraner avledet fra resirkulering av endosomer, Golgi, og/eller endoplasmatisk retikulum (ER)1. LC3 gjenkjenner autofagisk last i cytosolen direkte eller via selektive autofagiadaptere som P62/SQSTM. Nye autofagiske membraner kan deretter konjugeres til LC3, utvide seg og smelte sammen for å danne en fullført dobbeltmembran som omslutter lasten kalt autofagosomet. Autofagosomet modnes og smelter til slutt sammen med et endosom eller lysosom, hvoretter den autofagiske lasten og adapterne brytes ned2.

Studier av autofagosomdannelse, modning og fusjon benytter ofte lysmikroskopiteknologier. Fluorescensmikroskopi av LC3 brukes vanligvis til å vurdere antall og cellulær lokalisering av autofagosomer under forskjellige forhold. Videre, ved å koble LC3 til pH-sensitiv GFP og pH-stabil RFP i en såkalt tandemprobe, kan den totale fluksen av autofagi måles i levende celler som en funksjon av GFP-fluorescenstap3. Disse tilnærmingene er verdifulle verktøy for forskere for å forstå autofagiens rolle og mekanisme under forskjellige forhold. Et annet uvurderlig verktøy er elektronmikroskopi (EM), som avslører ultrastrukturen til autofagiske organeller på forskjellige stadier av autofagi 4,5,6,7,8. Til dags dato er EM fortsatt den valgte metoden for å identifisere de nøyaktige stadiene av autofagosomdannelse ved å diskriminere forskjellige autofagiske membraner ved morfologi: fagofor (dobbeltmembran ikke helt lukket), autofagosom (lukket dobbeltmembran rundt cytosolisk last) og autolysosom ([delvis] tap av den indre autofagiske membranen). Morfologi uten molekylær informasjon kan imidlertid være utsatt for feilidentifikasjon eller tvetydighet. Immuno-EM er den mest omfattende metoden for samtidig molekylær karakterisering og morfologisk klassifisering av autofagiske organeller. For eksempel tillater immungullmerking av LC3 på tinte kryoseksjoner ultrastrukturell lokalisering av LC3 og presis identifisering av LC3-merkede organeller9.

En ulempe med EM er det lille synsfeltet som følger med den høye forstørrelsen som kreves for å observere den fine ultrastrukturen av autofagiske membraner og, når det gjelder immuno-EM, for å finne etiketten som markerer proteinet av interesse. På grunn av deres knapphet og lave proteinnivåer, hemmer dette generelt den kvantitative EM-analysen av autofagosomer. For å øke antall autofagosomer, blir celler ofte sultet og behandlet med Bafilomycin A1 (BafA1), en hemmer av lysosomal forsuring og nedbrytning. Uten BafA1-behandling er søket etter autofagosomer ved EM tidkrevende, på grunn av mangelen på disse organellene. Metoden som presenteres i dette manuskriptet løser dette problemet gjennom fluorescerende merking og avbildning av endogent LC3 på tinte kryoseksjoner i et fluorescensmikroskop før videre forberedelse til EM. De fluorescerende bildene styrer deretter søket etter LC3-merkede strukturer i EM. Etter innsamling er EM-bilder korrelert med fluorescensbildene for å legge til molekylær informasjon - tilstedeværelsen av LC3 - til cellens ultrastruktur. Denne "on-section CLEM"-metoden øker i stor grad evnen til å finne LC3-merkede strukturer, spesielt under ubehandlede forhold, for senere identifisering og klassifisering av EM.

Denne metoden ble brukt på sultet hepatoblastom-avledet HEPG210-celler for å finne autofagosomer i uendrede (dvs. ingen BafA1 ble brukt) forhold. Relativt få fluorescerende puncta (mindre enn en per celleprofil i en 90 nm seksjon) ble funnet, noe som er i samsvar med den høye omsetningen av LC311. Denne sparsomheten av LC3-puncta understreket verdien av CLEM; Ved å velge regioner med flere fluorescerende puncta for avbildning i EM, ble LC3-positive organeller funnet og karakterisert på en mye mer effektiv måte enn gjennom konvensjonell immun-EM. Dette viste at flertallet av LC3-positive organeller var autofagosomer, som definert av deres morfologi, som er i motsetning til resultatene oppnådd i BafA1-behandlede celler, hvor autolysosomer er vanligere9. Disse dataene viser at med CLEM, kan autofagi studeres på ultrastrukturelt nivå uten å måtte hemme autofagisk strømning.

Protocol

1. Klargjøring av verktøy og reagenser

MERK: For nødvendige reagenser, buffere og løsninger, se tilleggsfil 1 eller 12 for mer informasjon. For detaljer relatert til alle materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen, se materialfortegnelsen.

  1. Fikseringsmidler
    1. Forbered 0,2 M fosfatbuffer (PB) eller 0,2 M RØR, HEPES, EGTA, MgSO4 (PHEM) buffer, som beskrevet i tilleggsfil 1, til bruk som base for fikseringsløsninger.
      MERK: Fikseringsmidler bufres rutinemessig i 0,1 M PB- eller PHEM-buffer for å bufre mot forsuring forårsaket av aldehydreaksjonen med det biologiske materialet.
    2. Siden kvaliteten på paraformaldehydet (PFA) er nøkkelen til pålitelig fiksering av prøvenes ultrastruktur, bruk EM-grad PFA. For å følge denne protokollen må du bruke 16 % lagerløsninger, fremstilt av PFA-priller av høy kvalitet (se tilleggsfil 1).
      FORSIKTIG: Paraformaldehyd er et farlig kjemikalie (faresetninger H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). Når du arbeider med PFA, bruk verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) og arbeid i en kjemisk hette. Avfall som inneholder PFA skal samles inn og destrueres i henhold til instituttenes retningslinjer og forskrifter.
    3. Kombiner 10 ml 0,2 M PB, 5 ml 16% PFA (i demineralisert vann [dH 2 O]) og 5 ml dH2Ofor å fremstille en fikseringsløsning på 4% PFA.
    4. Valgfritt: Tilsetning av 0,02%-0,5% glutaraldehyd (GA) til fikseringsløsningen fra trinn 1.1.3 forbedrer bevaringen av ultrastrukturen, men reduserer prøvens antigenisitet mot mange antistoffer.
      MERK: Når GA-fiksering er ønsket, bruk EM-grade GA fra en egnet leverandør.
      FORSIKTIG: Glutaraldehyd er et farlig kjemikalie (faresetninger H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Arbeid i en kjemisk hette og bruk verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) når du manipulerer GA. Avfall som inneholder GA skal samles inn og kastes i henhold til instituttenes retningslinjer og forskrifter.
  2. Verktøy og materialer
    1. Skrap overflaten av aluminiumsprøveholderpinner og sonicate dem i etanol 3 x 10 minutter for å fjerne metallrester og sikre optimal overholdelse når gelatin-innebygde celleblokker er montert på pinnene.
    2. Bruk en lagringsbeholder som er egnet til å lagre aluminiumsprøveholderpinnene med prøvene i flytende nitrogen (LN2).
    3. Lag en manipulator ved å feste et enkelt hår eller øyenvippe til enden av et trespyd ved hjelp av neglelakk.
    4. Lag en hentesløyfe. Bøy en 0,3 mm tykk ståltråd i rustfritt stål rundt en 3 mm diameter rund stang og vri endene sammen og danner en løkke i den ene enden. Sett de vridde endene inn i en pipettespiss. Sett inn et trespyd fra den andre enden og fest med lim eller harpiks.
      MERK: En hentesløyfe er også kommersielt tilgjengelig (se Materialfortegnelse).
    5. For å forberede tørkesløyfene, følg de samme trinnene for å lage pickup-sløyfer: Lag en rustfritt ståltråd i en 4 mm sløyfe og fest på en stor pipettespiss med lim eller harpiks.
    6. Belegg ristene med en tynn støttefilm som formvar (protokoll i tilleggsfil 1). Før bruk, belegg ristene med et tynt lag karbon.
      MERK: Rutenett som er klare til bruk, er kommersielt tilgjengelige (se Materialfortegnelse). Formvar-belagte rister kan lagres på ubestemt tid ved romtemperatur (RT); karbonbelagte rister kan lagres i flere måneder ved RT.
    7. Forbered rene glassglass og store dekkslips (24 mm x 24 mm er ideelt med 25 mm brede glasslysbilder), som i 13.

2. Fiksering og prøveklargjøring

  1. Fiksering
    1. Bruk fikseringsmiddelet fremstilt i trinn 1.1.3 (4% PFA i 0,1 M PB). For adherente cellelinjer, kultur 1-5 × 10 6 celler i6 cm retter. Legg fiksativet til kulturmediet i forholdet 1: 1 og inkuber prøven i 5 minutter ved RT. Deretter erstattes den mediumfikserende blandingen med fikseringsmiddel og inkuberes i 2 timer ved RT.
      MERK: Eksakte celletall, sammenløp og kulturforhold kan variere i henhold til modellsystemet som brukes.
    2. Oppbevar prøvene over natten eller i opptil 3-4 uker i 0,5% PFA i 0,1 M PB ved 4 °C.
      MERK: GA kan legges til fikseringen (se trinn 1.1.4) og fikseringslengden kan endres for å finne en optimal balanse mellom bevaring av morfologi og antigenisitet, som varierer per prøve og merking. For mer informasjon, se14.
  2. Eksempel på innebygging
    1. Vask fatet med faste celler 3x med PBS på RT. Deretter erstattes med PBS som inneholder 0,15% glycin og inkuberes i 10 minutter ved RT.
    2. Bytt ut PBS inneholdende 0,15% glycin med 1% gelatin i PBS forvarmet til 37 ° C, og skrap og overfør cellene i 1% gelatin til et mikrosentrifugerør. Pellet cellene ved 6000 × g i 1 min ved RT i en mikrosentrifuge. Fjern deretter 1% gelatin uten å forstyrre pelleten og tilsett 12% gelatin oppvarmet til 37 °C. Resuspender cellepelleten ved å pipettere forsiktig opp og ned med pipettespisser eller glasspasteurpipetter forvarmet til 37 °C.
    3. Inkuber ved 37 °C i 10 minutter; Deretter pelleterer du cellene ved 6000 × g i 1 min. Stivn gelatinen på is i 30 min.
    4. For å fjerne de gelatininnebygde cellene fra røret, kutt rørenden som inneholder pelleten av fra resten av røret med et barberblad. Deretter, vinkelrett på det første kuttet, kutt rørenden med cellepelleten i to.
    5. Inkuber de to rørendehalvdelene som inneholder den gelatininnebygde cellepelleten i 2,3 M sukrose i 10 minutter ved 4 °C. Dette fører til at de gelatininnebygde cellepelletshalvdelene krymper litt og løsner fra plastrøret.
      MERK: De gelatininnebygde cellepellets bør holdes ved 4 °C eller iskalde så mye som mulig for å unngå at 2,3 M sukrose blir for tyktflytende og gelatinen for myk. Under manipulering av de gelatininnebygde cellepellets i de neste trinnene, arbeid med bare en prøve om gangen og hold de andre på is, eller arbeid i et kaldt (~ 4 ° C) rom. Unngå overoppheting av de gelatininnebygde cellepellets ved sollys, varme mikroskoplamper eller andre varmekilder.
    6. Fjern rørhalvdelene med den gelatininnebygde cellepelleten fra 2,3 M sukrose. Fjern deretter de gelatininnebygde cellepelletshalvdelene fra plastrørhalvdelene med pinsett. Klipp pelleten manuelt til blokker av passende størrelse (~1 mm3) med et barberblad. Bruk et stereodissekerende mikroskop for å forstørre motivet under skjæringen.
    7. Tilsett de gelatininnebygde celleblokkene med 2,3 M sukrose i 3-16 timer, snu ende-over-ende i en rotor ved 4 ° C.
    8. Plasser en gelatininnebygd celleblokk på en aluminiumsprøveholderpinne (se trinn 1.2.1). La det være nok 2,3 m sukrose rundt kantene på blokken slik at den danner en tynn "krage" mellom blokken og tappen. Unngå for mye 2,3 M sukrose som dekker toppen av blokken. Snap-frys og lagre i LN2.

3. Seksjonering

  1. Trimming (se også12)
    1. Ta en pinne med en blokk med gelatin-innebygde celler ut av LN2-lagring og plasser den inne i et kryomikrotomsett satt til -80 ° C.
    2. Trim fronten av blokken for å flate overflaten og oppnå ~ 250 nm seksjoner. Dypp den 3 mm sløyfen i pickup-løsningen (1:1 2,3 M sukrose og 2 % metylcellulose), sett sløyfen inn i kryokammeret til mikrotomen, og vent til det begynner å danne seg is i dråpen (typisk 5-7 s). Deretter tar du straks opp seksjonen ved å trykke dråpen raskt, men forsiktig mot dem. Fjern sløyfen fra kryokammeret, vent til dråpen har tint helt, og trykk dråpen på et glassglass.
    3. Kontroller celleorienteringen ved toluidinblå farging av seksjonene.
      1. Legg en dråpe toluidinblå oppløsning (se tilleggsfil 1) på toppen av seksjonene på et glassglass og tørk på en varmeplate på 80 °C til kantene på dråpen er tørre.
      2. Fjern glassglasset fra varmeplaten og skyll forsiktig toluidinblått bort med dH2O, og samle det i en egnet avfallsbeholder.
      3. Tørk glassglasset og sjekk celleretningen i seksjonene gjennom et enkelt, benkaktig lysmikroskop.
    4. Trim sidene av blokken ved å seksjonere 50-100 μm inn i siden av prøveblokkflaten med knivhjørnet. Trim fire sider av prøveblokkflaten ved å dreie prøveholderen 90° etter å ha trimmet hver side for å lage et utstikkende ~250 μm x 375 μm rektangel. Merk det utstikkende området basert på celleretningen som ble bestemt i forrige trinn.
  2. Seksjonering og henting
    1. Avkjøl kryomikrotomet til -100 °C. Seksjon et bånd fra det utstikkende rektangelet, seksjonene er 70-90 nm tykke og med en sølvfarget gylden glans. Før seksjonene bort fra diamantknivens kant med et hår på en pinne (se pkt. 1.2.3) for å lage et langt (2-5 mm) bånd.
    2. Når et passende bånd har dannet seg, stopper du seksjoneringen for å plukke opp båndet. Dypp 3 mm pickup-sløyfen i 2,3 M sukrose og 2 % metylcellulose blandet 1:1, sett sløyfen inn i kryokammeret til mikrotomen, og vent til dråpen begynner å fryse (vanligvis 5-7 s). Deretter tar du straks opp seksjonene ved å trykke dråpen raskt men forsiktig mot dem. Fjern sløyfen fra kryokammeret, vent til dråpen har tint helt, og trykk dråpen på et forberedt rutenett (trinn 1.2.6).
      MERK: Rister med seksjoner kan oppbevares ved 4 °C i flere måneder.

4. Merking og lysmikroskopi

  1. Merking
    1. Plasser ristene med seksjoner (figur 1A) med seksjonssiden ned på ~ 1 ml PBS i en liten tallerken eller flerbrønnsplate. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
      MERK: Dette trinnet fjerner gelatinen som er mellom cellene; Gelatin er ikke nødvendig etter seksjonering og forstyrrer den gjenværende protokollen.
    2. Behandle rutenettene med snittsiden ned på ~75 μL dråper på parafilm (se figur 1B). Start med PBS + 0,15% glycinvask (3 x 2 min) ved RT. Deretter inkuberer ristene med 0,1% bovint serumalbumin (BSA)-c + 0,5% fiskeskinngelatin (FSG) i PBS i 10 min ved RT som blokkeringstrinn. Fortynn primære antistoffer i 0,1% BSA-c + 0,5% FSG i PBS og inkuber ristene på ~ 10 μL dråper av denne løsningen i 1 time ved RT (figur 1C).
    3. Vask ristene i 0,1% BSA i PBS 5x ved RT. Deretter fortynnes sekundære antistoffer og 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; 10 μg / ml) i 0,1% BSA-c + 0,5% FSG i PBS og inkuberer ristene på ~ 10 μL dråper av denne løsningen i 30+ min ved RT (figur 1C). Vask ristene i PBS 5x ved RT.
      MERK: Eventuelt kan et sekundært antistoff merkes med 5, 10, 15 eller 20 nm kolloidale gullpartikler konjugert til protein A (PAG) for lokalisering av proteinet av interesse i EM. Hvis dette er ønskelig, inkuber ristene med PAG i 20 minutter ved RT etter trinn 4.1.3. Vask deretter 5x med PBS ved RT. Unngå samtidig bruk av flere primære antistoffer og legg merke til reaktiviteten til PAG til forskjellige arters IgG for å forhindre uønskede kryssreaksjoner. For mer informasjon, se12.
  2. Monteringsprøver for lysmikroskopi
    1. Senk ristene i 50% glyserol i dH 2 O2x 5 min ved RT. Sandwich ristene mellom en glasslip og coverslip i 50% glyserol, ett rutenett per coverslip, med seksjoner mot dekselet (figur 1D).
      MERK: Kvaliteten på merkingen kan forringes når rister holdes montert i 50% glyserol i mer enn 30 minutter. Det anbefales derfor å montere og avbilde to eller tre rister om gangen og la de andre stå på den sekundære merkeløsningen.
  3. Lysmikroskopi
    1. Ta et glassglass med klemte rister til et bredfeltmikroskop med et automatisert stadium. Velg et oljemål med høy forstørrelse (63x eller 100x). Opprett et bildeflissett av (deler av) båndet med inndelinger (figur 1E).
      MERK: Noen sekundære antistoffer kan danne fluorescerende aggregater på rister, spesielt rundt folder eller rifter i seksjonene. I tillegg inneholder noen celletyper og vev autofluorescerende strukturer. Hvis slike problemer forventes, anbefales det å inkludere et negativt kontrollgitter som ikke inkuberes med primært antistoff.
  4. Avmontering og EM-kontrast
    1. Tilsett 10 μL dH2O på siden av glassdekselsandwichen og vent på kapillærvirkning for å fylle glassdekselets sandwichgrensesnitt. Fjern forsiktig dekselet uten å blande nedsenkningsolje i glyserol. Hent ristene med pinsett og senk ned i dH2O 3x ved RT for å vaske av 50% glyserol.
      MERK: Olje kan forstyrre uranylfarging og forringe EM-kontrast.
    2. Tørk forsiktig baksiden av rutenettet med lofritt silkepapir.
      MERK: Hvis prøven også ble merket med kolloidale gullpartikler, utfør følgende trinn: plasser rutenettet med seksjoner med seksjonssiden ned på PBS-dråper og vask 2x ved RT. Postfix i 1% GA i 5 min ved RT (se forsiktighetsmerknad under 1.1.4). Vask i PBS 2x på RT.
    3. Plasser ristene med seksjonssiden ned på dH2O dråper og vask 8x på RT.
    4. For å farge seksjonene for kontrast i EM, inkuber med uranylacetat (UA), pH 7, i 5 minutter ved RT (figur 1F).
    5. Før du plasserer ristene, avkjøl UA:metylcellulose, pH 4, ved å plassere dråper på parafilm på en metallplate på is. Vask deretter ristene med iskald UA: metylcellulose, pH 4, 2x og inkuber med iskald UA: metylcellulose, pH 4, i 10 minutter (figur 1F).
      FORSIKTIG: Uranylacetat er et farlig kjemikalie (faresetninger H300, H330, H373, H411). I trinn som krever UA, arbeid i en kjemisk hette og bruk verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker og vernebriller). Samle inn og deponere UA-holdig avfall i henhold til instituttenes retningslinjer og forskrifter.
    6. Sløyfe ristene ved å sette inn en rutenetttørkesløyfe i UA:metylcellulosedråpen under gitteret og løft den forsiktig til gitteret trekkes av dråpen12. Fjern overflødig UA: metylcellulose ved å berøre sløyfen i en ~ 60 ° vinkel (seksjoner vendt ned) på lofritt filterpapir (se materialfortegnelse) og dra det sakte langs papiret til ikke mer UA: metylcellulose absorberes. Plasser deretter sløyfen med risten i et passende stativ og la tørke i >10 min ved RT (figur 1G).

5. EM

  1. Bruk oversikten fra lysmikroskopi til å lokalisere et interesseområde (ROI) for avbildning i transmisjonselektronmikroskopet (TEM; Figur 1H). Kommenter avkastningen på lysmikroskopidatasettet. Når et område er valgt, får du et bildeflissett ved 20 000x-50 000x forstørrelse i TEM. Rekonstruer bildeflissettet i etterbehandlingsprogramvare15,16.

6. Korrelasjon og analyse

  1. Last inn lysmikroskopien og EM-datasettet i egnet bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ/Fiji17, ec-CLEM-plugin-modulen i Icy18 eller Photoshop. Beskjær og roter lysmikroskopidatasettet slik at det samsvarer med EM-flissettet.
    1. Utfør korrelasjonen basert på DAPI-signal i fluorescens og nukleære konturer i EM (figur 1I). Skift bildene for å legge dem nøyaktig og utfør den manuelle korrelasjonen nøyaktig. For å gjøre tilnærmingen mer nøyaktig, bruk landemerkebasert korrelasjon gjennom for eksempel ec-CLEM-plugin i Icy eller BigWarp-plugin i ImageJ, for å korrelere bildene gjennom manuelt valg av tilsvarende punkter. En detaljert, trinnvis protokoll for korrelasjon med ec-CLEM er tilgjengelig19.
      MERK: Denne tilnærmingen fungerer også godt med bruk av bimodale fiducial prober20,21.
  2. Analyser de korrelerte bildene ved å velge avkastning basert på fluorescerende signal i et passende program (f.eks. ImageJ). For kvantitativ analyse, opprett en samling avkastning for alle merkede organeller. Deretter inspiserer du den tilsvarende ultrastrukturen til de enkelte avkastningene og klassifiserer dem basert på morfologiske elementer.

Representative Results

En optimalisert immuno-EM-protokoll for immun-gullmerking av LC3 på ultratynne kryoseksjoner ble nylig publisert av De Maziere et al.9. Denne studien inkluderte utsultede tilstander uten BafA1, der LC3 var til stede, men relativt sjelden og vanskelig å finne ved EM. En CLEM-metode på seksjonen ble introdusert i en egen studie, som bruker følsomheten til fluorescensmerking for å visualisere relativt sjeldne og lavt uttrykte endogene proteiner og korrelere dette til EM-ultrastruktur14. Her kombineres disse to tilnærmingene ved bruk av den optimaliserte LC3-merkingsprotokollen som en del av en CLEM-tilnærming.

HEPG2-celler, leveravledede celler med relativt høye nivåer av basal autofagi22, ble sultet i minimalt medium (Earles balanserte saltløsning [EBSS]) i 2 timer før fiksering i 4% PFA. Dette ble etterfulgt av prøvepreparering ved Tokuyasu-metoden for ultratynn kryoseksjonering (seksjon 1-3; se Slot og Geuze12), som er svært kompatibel med CLEM 14,23 på seksjonen. Tinte kryoseksjoner ble fluorescerende merket (protokoll pkt. 4 og figur 1) ved bruk av musens anti-LC3 primære antistoff9. I tillegg ble kaninanti-LAMP1 brukt til å indikere endo-lysosomer, etterfulgt av anti-mus AlexaFluor488 og antikanin AlexaFluor568 sekundære antistoffer. Rutenett ble klemt mellom en coverslip og glass lysbilde og avbildet på RT på et widefield mikroskop (100x 1.47 NA olje objektiv, sCMOS kamera).

En fordel med fluorescensmerking av tynne seksjoner over konvensjonell helcelle IF er den økte oppløsningen i Z, siden den fysiske tykkelsen på seksjonen er 60-90 nm. Med denne forbedrede Z-oppløsningen avslører fluorescensmerkingen av LC3 og LAMP1 på tynne seksjoner svært lite samlokalisering (figur 2A). I celler behandlet med lysosomale hemmere, som BafA1, oppstår høy kolokalisering, siden lysosomalt lukket LC3 forblir udegradert9. I ubehandlede celler nedbrytes LC3 raskt ved kontakt med enzymatisk aktive, LAMP1-positive lysosomer, og derfor er samlokalisering sjelden ved disse tilstandene. Generelt ble mindre enn én LC3-punctum per celleprofil observert. Dette indikerer at selv i sultede forhold er omsetningen av autofagosomer rask, og holder autofagosomtallene lave. Det understreker også viktigheten av å bruke CLEM for å finne de sjeldne LC3-merkede strukturene, ved hjelp av det store synsfeltet som lysmikroskopi gir. Videre gjør den høyere følsomheten for fluorescensmerking i forhold til gullmerking det mulig å identifisere flere LC3-positive organeller enn i konvensjonell immuno-EM, noe som ytterligere hjelper deres karakterisering.

Etter å ha anskaffet et fullt flissett av båndet av seksjoner, ble ristene hentet fra mikroskopet og etterfarget for EM ved hjelp av UA og loop-out-metoden (protokolltrinn 4.4-4.6; Figur 1F,G). Denne "loop-out" -metoden sikrer at et tynt lag UA: metylcellulose forblir på rutenettet, noe som skaper ønsket kontrast i EM. Tykkelsen på laget avhenger av hastigheten og vinkelen som UA:metylcellulosen skylles av på filterpapiret. Hvis du drar sløyfen for raskt, kan det bli for mye UA:metylcellulose på rutenettet og gjøre utseendet til seksjonene i EM mørkere. Å dra for sakte kan trekke bort for mye UA:metylcellulose, noe som resulterer i for lite flekker og dårlig morfologi, og risikerer at rutenettet faller ut av sløyfen. 'Oil slick' coloring (figur 1G) på tørre rister indikerer en passende UA: metylcelluloselagtykkelse.

Etter loop-out og tørking ble ristene avbildet i en TEM ved ROI valgt av fluorescens. IF- og EM-datasettene ble korrelert ved å legge DAPI-signalet til konturene av kjerner som er synlige i EM, og generere et integrert bilde som inneholder informasjon om begge modaliteter.

Å finne samme område i EM som valgt i IF kan være utfordrende. Det anbefales derfor å ha et oversiktsbilde av IF-flisen for hånden når du søker i EM. Brukere bør se etter gjenkjennelige funksjoner i begge modaliteter, for eksempel bretter eller rifter i seksjonene, rutenettstengene eller arrangementet av kjerner. Det er også viktig å huske på at prøven kan vises rotert og speilet i EM. 'Finder-rutenett' med spesifikke funksjoner for å identifisere områder kan brukes til å lette korrelasjonen (se Materialfortegnelse).

Korrelasjon mellom LC3-positive organeller og EM-ultrastruktur viste at de forskjellige punctaene representerte forskjellige stadier av autofagi (figur 2B). Selv om bevaring av autofagosomal ultrastruktur er utfordrende i kryoseksjoner, ble organeller med cytoplasmatisk innhold og doble membraner ofte observert (figur 2C, piler i organeller 1-5; Tilleggsfigur S1), som definerer morfologiske trekk ved autofagosomer. Interessant nok ble ganske svake fluorescerende flekker identifisert av EM som LC3-positive autolysosomer (figur 2C, organelle 6; autofagisk innhold er merket *), preget av tett innhold og intraluminale vesikler. Dette viste at svært små mengder LC3 er synlige i IF av ultratynne kryoseksjoner, og indikerte at til tross for det nedbrytende miljøet, er noen LC3 detekterbare i steady-state autolysosomer. Imidlertid representerte flertallet av LC3-positive puncta autofagosomer, mens autolysosomer var svært sjeldne. Dette i motsetning til BafA1-behandlede celler, som primært akkumulerer autolysosomer og ikke autofagosomer9.

Oppsummert beskriver denne protokollen en CLEM-metode på seksjonen for å koble molekylær informasjon oppnådd ved fluorescensmikroskopi til ultrastrukturen til EM. Denne metoden øker følsomheten til immuno-EM, siden bare fluoroforer brukes til merking, og disse gir generelt mer signal enn EM-sonder. Metoden er spesielt egnet for bruk av ultratynne kryoseksjoner, hvor høye nivåer av spesifikk fluorescens over ubetydelig bakgrunnsfarging kan oppnås. Ved å bruke fluorescens for å screene for sjeldne strukturer eller hendelser og korrelere utvalgte avkastninger til EM, kan EM-driftstiden og tilhørende kostnader reduseres kraftig. Sensitiviteten og gjennomførbarheten av metoden er demonstrert ved visualisering av LC3 i ubehandlede, sultne celler, som viser at LC3 hovedsakelig assosierer med autofagosomer under disse forholdene, med svært lave nivåer synlige i autolysosomer.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over CLEM . (A) Kryoseksjoner fra gelatin-innebygde celler samles på et formvarbelagt kobbergitter. (B) Rister behandles seksjon ned på dråper av de aktuelle løsningene. (C) Rister er merket med primære og fluorescerende sekundære antistoffer. (D) Rister er klemt mellom et deksel og glassglass i 50% glyserol. (E) Fluorescensbilder samles i et bredfeltsmikroskop. (F) Rister hentes fra glassglasset og behandles videre ved uranylfarging for EM. (G) Etter tørking kan ristene avbildes av TEM. (H) Høy forstørrelse TEM-bildeflissett er hentet fra et område valgt fra fluorescensdata. (I) Bilder fra fluorescensmikroskopi og EM er korrelert og overlagt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: CLEM av LC3 og LAMP1 i sultede HEPG2-celler. HEPG2-celler ble sultet i 2 timer i EBSS før fiksering med 4% PFA i 2 timer. (A) IF-avbildning av LC3 (grønn) og LAMP1 (rød) på seksjoner viser relativt få LC3-puncta og liten samlokalisering med LAMP1. (B) Kobling av molekylær informasjon fra IF (venstre panel) til den ultrastrukturelle informasjonen oppnådd i EM (midtpanel) ved å legge over de to avbildningsmodalitetene basert på DAPI og nukleære konturer (stiplede linjer, høyre panel). Ultrastrukturen til de enkelte LC3-merkede rommene, som eksemplifisert ved boks 1 (høyre panel), er vist i C. (C) Ultrastruktur av LC3-positive rom. CLEM-bilder vises til venstre og pseudofargede (beige) EM-bilder til høyre (ufargede EM-bilder vises i tilleggsfigur S1). Indre og ytre autofagosomale membraner er indikert med henholdsvis hvite og svarte pilehoder. Det autofagiske innholdet inne i autolysosomet i eksempel 6 er indikert med *. Skalastenger = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Ufargede EM-bilder av LC3-positive organeller. (VG Nett) Ufargede EM-bilder av pseudofargede eksempler 1-6 vist i figur 2C. Organellene ble selektert ved LC3-fluorescens, som beskrevet for figur 2. Indre og ytre autofagosomale membraner er indikert med henholdsvis hvite og svarte pilehoder. Det autofagiske innholdet inne i autolysosomet i eksempel 6 er indikert med *. Skalastenger = 200 nm. Forkortelser: AL = autolysosom; AP = autofagosom; M = mitokondrion. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Buffere og løsninger brukt i denne studien. Denne tilleggsfilen inneholder oppskriftene og protokollene som trengs for å lage bufferne og løsningene som brukes i denne studien. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Metoden som presenteres her utnytter nylige fremskritt innen kryoseksjonsbasert CLEM på seksjonen - den høye følsomheten til IF-merking og nøyaktig (<100 nm feil) korrelasjon mellom FM og EM14,24. Dette resulterer i en metode med følsomhet for fluorescerende etikettknappe, endogene proteiner og evnen til å legge dette med høy presisjon til EM-ultrastrukturen. Dermed unngår denne metoden behovet for (over) ekspresjon av eksogent merkede proteiner og bruk av mindre følsomme EM-etiketter. Gjennomførbarheten av metoden er vist ved eksempler på CLEM på endogen LC3 i sultede celler, uten bruk av lysosomale hemmere.

Tinte kryoseksjoner oppnådd med Tokuyasu-metoden er ideelle prøver for immun-EM, da de i motsetning til harpiksseksjoner er gjennomtrengelige for antistoffer. Kombinert med milde fikserings- og kontrasteringsprosedyrer, gir dette generelt suveren merkeeffektivitet i forhold til andre metoder uten at det går ut over den detaljerte ultrastrukturen, og visualiserer cellemembraner på en utmerket måte 12,25,26. Videre er kryoseksjoner svært kompatible med fluorescensmikroskopi, noe som gjør dem til verdifulle substrater for CLEM. Både klassisk immungullmerking og CLEM på kryoseksjoner har gitt banebrytende innsikt i å forstå subcellulær organisasjon 14,27,28,29,30.

For tiden blir anvendelser av CLEM på tinte kryoseksjoner stadig mer utbredt, som et resultat av kontinuerlig utvikling og optimalisering 14,20,24,31,32,33,34 som har forbedret kvaliteten, anvendeligheten og nøyaktigheten av tilnærmingen. Nå, ved nøyaktig korrelasjon av store IF- og EM-bildefliser, letter teknikken screening for ultrastrukturen til fluorescerende merkede endogene cellulære komponenter 14,32,33. Dette er en fordel i forhold til klassisk immuno-EM, hvor søket etter gullmerkede strukturer vanligvis krever høy forstørrelse og derfor er mer arbeidskrevende og tidkrevende. Det er av denne grunn at lokalisering av LC3 til ultrastrukturen har stor nytte av CLEM. LC3-positive organeller er vanlige når autofagisk clearance er blokkert (dvs. når celler behandles med BafA1 eller pH-hevende midler), mens autofagiske organeller raskt ryddes i uendrede eller sultede celler, noe som resulterer i svært lave stabile nivåer. Under slike forhold kan det være utfordrende å finne LC3-merkede organeller ved hjelp av klassisk immun-EM, og CLEM gir en klar fordel.

Tidligere ble CLEM på harpiksseksjoner brukt i studier ved bruk av ektopisk uttrykk av LC3-GFP eller en LC3-GFP-RFP tandemsonde 35,36,37,38,39. I disse studiene ble fluorescensavbildning utført før embedding eller direkte i akrylharpiksseksjon40, og prøver ble deretter screenet av EM. Det er flere fordeler med harpiksinnebygging; Den autofagosomale ultrastrukturen er generelt godt bevart, spesielt hvis materialet er høytrykksfrosset40. Videre er kontrasten av tungmetallfarget harpiksinnebygd materiale generelt mer uttalt enn for uranylfargede kryoseksjoner. Harpiks-innebygde seksjoner er kompatible med volumetriske EM-metoder, for eksempel array-tomografi, FIB-SEM eller seriell blokkeringsflate SEM, mens kryoseksjoner ikke er det. I tilnærminger som utfører avbildning før innebygging, er levende celleavbildning et alternativ41 som ikke er tilgjengelig i CLEM på kryoseksjoner. Den viktigste fordelen med CLEM på kryoseksjoner over disse alternativene er det høye IF-signalet, noe som muliggjør immunlokalisering av sjeldne proteiner uten behov for membranpermeabilisering eller overekspresjon. Dette unngår potensiell membranekstraksjon, overekspresjonsartefakter42 og genetisk modifisering av motivet, som kombinert med muligheten til å korrelere store områder i IF og EM, gjør det til et utmerket verktøy for å studere LC3 og autofagi.

Her viste anvendelsen av CLEM på seksjonen til sultede HEPG2-celler at LC3 overveiende lokalisert til strukturer identifisert som autofagosomer. I tillegg ble det funnet noen få svakt fluorescerende flekker i autolysosomer. Dette står i direkte kontrast til celler behandlet med BafA19 og reflekterer den raske nedbrytningen av autofagosomale proteiner når autofagosomet smelter sammen med lysosomer. Samlet sett viste dataene at CLEM av tinte kryoseksjoner kan gi innsikt i LC3-mediert autofagi under opprinnelige forhold. Dataene fremhever også følsomheten til teknologien, siden LC3 ble oppdaget selv i autolysosomer som bare inneholder lave nivåer av intakte LC3-epitoper. Videre anvendelse av denne teknikken ved avbildning av LC3 i forskjellige modeller og forhold vil forbedre vår forståelse av autofagi og andre LC3-medierte biologiske prosesser, som LC3-assosiert fagocytose eller konjugering av ATG8 til enkeltmembraner.

Utover autofagi kan CLEM på snitt brukes på andre sjeldne hendelser eller strukturer, som celledeling, infeksjon, sjeldne celletyper i vev, kinetokorer, primære flimmerhår eller celletypespesifikke organeller. Effektiv screening for emnet av interesse av IF kan i stor grad lette den ultrastrukturelle studien av disse sjeldenhetene. Videre ble det vist14 at teknikken kan brukes til å lokalisere proteiner på en mer sensitiv måte enn klassisk immun-EM. Justering av fikseringslengden kan ytterligere forlenge denne følsomheten, noe som muliggjør ultrastrukturell lokalisering av svært lite rikelig eller dårlig antigene proteiner. Endelig letter CLEM-metoden på seksjonen raskt utvalg av et kvantitativt antall organeller, noe som letter en mer robust analyse av den ultrastrukturelle fordelingen av et gitt protein.

CLEM på kryoseksjoner krever utstyr og ekspertise for kryoseksjonering. I grupper med tilgang til disse verktøyene (f.eks. kryomikrotomer), er implementeringen av CLEM på seksjonen enkel og krever bare tilgjengeligheten av et automatisert bredfeltmikroskop, et oppsett de fleste laboratorier har tilgang til. Videre er metoden tilgjengelig i EM-anlegg over hele verden. Siden CLEM på seksjon kombinerer anvendelse av etablerte IF- og EM-metoder, er metoden lett tilpasset og kan kombineres med for eksempel tomografi 20,33,43, seriesnittvolum EM av et begrenset antall seksjoner 44, eller superoppløsningsmikroskopi 45. Denne allsidigheten av metoden støtter applikasjoner til et bredt spekter av biologiske spørsmål.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker våre kolleger ved Senter for molekylær medisin ved University Medical Center Utrecht for fruktbare diskusjoner og tilbakemeldinger. Vi takker tidligere og nåværende kolleger fra Klumperman-laboratoriet for å gjøre kontinuerlige forbedringer i våre mikroskopiteknologier. EM-infrastrukturen som brukes til dette arbeidet er en del av forskningsprogrammet National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI) finansiert av det nederlandske forskningsrådet (NWO), prosjektnummer 184.034.014 til JK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and reagents
Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488 Life Technologies #A21202 use 1:250
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 Life Technologies A#10042 use 1:250
Antibody mouse anti-LC3 Cosmo Bio CTB-LC3-2-IC use 1:100
Antibody rabbit anti-LAMP1 Cell Signaling 9091 use 1:250
Bovine serum Albumin, fraction V Sigma-Aldrich A-9647
BSA-c Aurion 900.099
BSA-conjugated gold Cell Microscopy Core, UMC Utrecht BSAG 5 nm
Water-free Chloroform Merck 1.02447.0500
DAPI Invitrogen 10184322 Use at end concentration of 10 µg/ml
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fish-skin Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Food-grade gelatin Merck G1890
Formvar, Vinylec E SPI 02492-RA
Gluteraldehyde Serva 23115.01 See CAUTION note
Glycerol Boom MBAK 7044.1000
Glycine Merck 1042010250
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Methylcellulose, 25 centipoises Sigma-Aldrich M-6385
MgSO4 Riedel-de Haen 12142
Na2HPO4 (PB component A) Merck 106580-0500
NaBH4 Merck 806373
NaH2PO4 (PB component B) Merck 106346
NH4OH Sigma-Aldrich 221228-0025
Oxalic acid Merck 100495
Paraformaldehyde prills Sigma-Aldrich 441244 See CAUTION note
PIPES Merck 110220
Protein-A conjugated gold Cell Microscopy Core, UMC Utrecht PAG 5, 10, 15 or 20 nm
Sucrose D(+) VWR 27483294
Uranyl acetate SPI 020624-AB See CAUTION note
Tools and consumables
Pick-up loop Electron Microscopy Sciences 70944
Filter paper, qualitative, medium-fast LLG 6.242 668
Finder grids Ted Pella G100F1
Grids Cell Microscopy Core, UMC Utrecht CU 100 mesh
Microscopes
Leica Thunder widefield microscope Leica Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;
Leica UC7 ultracryomicrotome Leica
Tecnai T12 FEI Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software
Software
ec-CLEM in icy open source Paul-Gilloteaux et al., 2017
Fiji open source Schindelin et al., 2012
IMOD open source Mastronarde et al., 2017
Photoshop Adobe
SerialEM open source Mastronarde et al., 2018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, Y., Reggiori, F. Molecular regulation of autophagosome formation. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 55-69 (2022).
  2. Reggiori, F., Ungermann, C. Autophagosome maturation and fusion. Journal of Molecular Biology. 429 (4), 486-496 (2017).
  3. Kimura, S., Noda, T., Yoshimori, T. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy. 3 (5), 452-460 (2007).
  4. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. The Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  5. Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).
  6. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28, 435-492 (1966).
  7. Arstila, A. U., Trump, B. F. Studies on cellular autophagocytosis. The formation of autophagic vacuoles in the liver after glucagon administration. The American Journal of Pathology. 53 (5), 687-733 (1968).
  8. Eskelinen, E. L., Reggiori, F., Baba, M., Kovács, A. L., Seglen, P. O. Seeing is believing: The impact of electron microscopy on autophagy research. Autophagy. 7 (9), 935-956 (2011).
  9. De Mazière, A., et al. An optimized protocol for immuno-electron microscopy of endogenous LC3. Autophagy. 18 (12), 3004-3022 (2022).
  10. López-Terrada, D., Cheung, S. W., Finegold, M. J., Knowles, B. B. Hep G2 is a hepatoblastoma-derived cell line. Human Pathology. 40 (10), 1512-1515 (2009).
  11. Tanida, I., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Lysosomal turnover, but not a cellular level, of endogenous LC3 is a marker for autophagy. Autophagy. 1 (2), 84-91 (2005).
  12. Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nature Protocols. 2 (10), 2480-2491 (2007).
  13. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Current Protocols in Cell Biology. 13 (1), (2001).
  14. vander Beek, J., de Heus, C., Liv, N., Klumperman, J. Quantitative correlative microscopy reveals the ultrastructural distribution of endogenous endosomal proteins. The Journal of Cell Biology. 221 (1), e202106044 (2022).
  15. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  16. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Paul-Gilloteaux, P., et al. EC-CLEM: Flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nature Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
  19. Heiligenstein, X., Paul-Gilloteaux, P., Raposo, G., Salamero, J. eC-CLEM: A multidimension, multimodel software to correlate intermodal images with a focus on light and electron microscopy. Methods in Cell Biology. 140, 335-352 (2017).
  20. Fermie, J., et al. Bimodal endocytic probe for three-dimensional correlative light and electron microscopy. Cell Reports Methods. 2 (5), 100220 (2022).
  21. Fokkema, J., et al. Fluorescently labelled silica coated gold nanoparticles as fiducial markers for correlative light and electron microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 13625 (2018).
  22. Czaja, M. J., et al. Functions of autophagy in normal and diseased liver. Autophagy. 9 (8), 1131 (2013).
  23. Robinson, J. M., Takizawa, T., Pombo, A., Cook, P. R. Correlative fluorescence and electron microscopy on ultrathin cryosections: Bridging the resolution gap. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (7), 803-808 (2001).
  24. Mohammadian, S., et al. High accuracy, fiducial marker-based image registration of correlative microscopy images. Scientific Reports. 9 (1), 3211 (2019).
  25. Tokuyasu, K. T. A study of positive staining of ultrathin frozen sections. Journal of Ultrasructure Research. 63 (3), 287-307 (1978).
  26. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. European Journal of Cell Biology. 38 (1), 87-93 (1985).
  27. Klumperman, J., Raposo, G. The complex ultrastructure of the endolysosomal system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (10), a016857 (2014).
  28. Geuze, H. J., Slot, J. W., Strous, G. J., Lodish, H. F., Schwartz, A. L. Intracellular site of asialoglycoprotein receptor-ligand uncoupling: Double-label immunoelectron microscopy during receptor-mediated endocytosis. Cell. 32 (1), 277-287 (1983).
  29. Biazik, J., Ylä-Anttila, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. Ultrastructural relationship of the phagophore with surrounding organelles. Autophagy. 11 (3), 439-451 (2015).
  30. Fahimi, H. D., Reich, D., Völkl, A., Baumgart, E. Contributions of the immunogold technique to investigation of the biology of peroxisomes. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 105-114 (1996).
  31. Vicidomini, G., et al. A novel approach for correlative light electron microscopy analysis. Microscopy Research and Technique. 73 (3), 215-224 (2010).
  32. Vicidomini, G., et al. High data output and automated 3D correlative light-electron microscopy method. Traffic. 9 (11), 1828-1838 (2008).
  33. Cortese, K., et al. 3D HDO-CLEM: cellular compartment analysis by correlative light-electron microscopy on cryosection. Methods in Cell Biology. 111, 95-115 (2012).
  34. van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (CLEM) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nature Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  35. Razi, M., Chan, E. Y. W., Tooze, S. A. Early endosomes and endosomal coatomer are required for autophagy. The Journal of Cell Biology. 185 (2), 305-321 (2009).
  36. Ligeon, L. A., Barois, N., Werkmeister, E., Bongiovanni, A., Lafont, F. Structured illumination microscopy and correlative microscopy to study autophagy. Methods. 75, 61-68 (2015).
  37. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: An ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  38. Gudmundsson, S., Kahlhofer, J., Baylac, N., Kallio, K., Eskelinen, E. L. Correlative light and electron microscopy of autophagosomes. Methods in Molecular Biology. 1880, 199-209 (2019).
  39. Kriel, J., et al. Correlative light and electron microscopy (CLEM): bringing together the best of both worlds to study neuronal autophagy. Imaging and Quantifying Neuronal Autophagy. 171, 135-147 (2022).
  40. Largeau, C., Legouis, R. Correlative light and electron microscopy to analyze LC3 proteins in Caenorhabditis elegans embryo. Methods in Molecular Biology. 1880, 281-293 (2019).
  41. Fermie, J., et al. Single organelle dynamics linked to 3D structure by correlative live-cell imaging and 3D electron microscopy. Traffic. 19 (5), 354-369 (2018).
  42. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: Caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  43. Ladinsky, M. S., Howell, K. E. Electron tomography of immunolabeled cryosections. Methods in Cell Biology. 79, 543-558 (2007).
  44. Oorschot, V., Lindsey, B. W., Kaslin, J., Ramm, G. TEM, SEM, and STEM-based immuno-CLEM workflows offer complementary advantages. Scientific Reports. 11 (1), 899 (2021).
  45. Franke, C., et al. Correlative single-molecule localization microscopy and electron tomography reveals endosome nanoscale domains. Traffic. 20 (8), 601-617 (2019).

Tags

Biologi utgave 193 korrelativ lyselektronmikroskopi autofagiske organeller elektronmikroskopi fluorescensmikroskopi autofagiproteiner autofagosomer CLEM LC3-merking lysosomal forsuring autolysosomer
Ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 ved korrelativ lyselektronmikroskopi på snittet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Beek, J., Veenendaal, T., de … More

van der Beek, J., Veenendaal, T., de Heus, C., van Dijk, S., ten Brink, C., Liv, N., Klumperman, J. Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (193), e65067, doi:10.3791/65067 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter