Summary
Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol til dissekering af uterosacral ledbånd og andre bækkenbundsvæv, herunder livmoderhalsen, endetarmen og blæren hos mus, for at udvide undersøgelsen af kvindelige reproduktive væv.
Abstract
Bækkenorganprolaps (POP) er en tilstand, der påvirker bækkenbundens integritet, struktur og mekaniske støtte. Organerne i bækkenbunden understøttes af forskellige anatomiske strukturer, herunder muskler, ledbånd og bækkenfascia. Det uterosakrale ledbånd (USL) er en kritisk bærende struktur, og skade på USL resulterer i en højere risiko for at udvikle POP. Denne protokol beskriver dissektionen af murine USL'er og bækkenbundsorganerne sammen med erhvervelsen af unikke data om USL's biokemiske sammensætning og funktion ved hjælp af Raman-spektroskopi og evaluering af mekanisk adfærd. Mus er en uvurderlig model for præklinisk forskning, men dissekering af murine USL er en vanskelig og indviklet proces. Denne procedure præsenterer en tilgang til at styre dissektionen af murin bækkenbundsvæv, herunder USL, for at muliggøre flere vurderinger og karakterisering. Dette arbejde har til formål at hjælpe dissektion af bækkenbundsvæv af grundforskere og ingeniører og dermed udvide tilgængeligheden af forskning i USL og bækkenbundsforhold og den prækliniske undersøgelse af kvinders sundhed ved hjælp af musemodeller.
Introduction
Ca. 50% af kvinderne er ramt af bækkenorganprolaps (POP)1,2. Omkring 11% af disse kvinder passer til kriterierne for at gennemgå kirurgisk reparation, hvilket har en dårlig succesrate (~ 30%)3,4. POP er kendetegnet ved nedstigningen af nogle eller alle bækkenorganerne (dvs. blære, livmoder, livmoderhals og endetarm) fra deres naturlige position på grund af USL's og bækkenbundsmusklernes manglende evne til at yde tilstrækkelig støtte5. Denne tilstand involverer anatomisk dysfunktion og forstyrrelse af bindevævet såvel som neuromuskulær skade ud over prædisponerende faktorer 3,6. POP er forbundet med flere faktorer såsom alder, vægt, paritet og leveringstype (dvs. vaginale eller kejsersnit). Disse faktorer menes at påvirke den mekaniske integritet af alle bækkenbundsvæv, med graviditet og paritet menes at være de vigtigste drivkræfter for POP 5,7,8.
De uterosakrale ledbånd (USL'er) er vigtige understøttende strukturer for livmoderen, livmoderhalsen og vagina og binder livmoderhalsen til korsbenet4. Skader på USL'erne sætter kvinder i øget risiko for at udvikle POP. Det menes, at graviditet og fødsel pålægger USL yderligere belastning, hvilket potentielt fremkalder skade og øger chancerne for POP. USL er et komplekst væv sammensat af glatte muskelceller, blodkar og lymfeknuder fordelt heterogent langs ledbåndet, som kan opdeles i tre forskellige sektioner: cervikal, mellemliggende og sakral region9. USL's mekaniske integritet er afledt af ekstracellulære matrixkomponenter (ECM) som kollagener, elastin og proteoglycaner 5,9,10. Type I kollagenfibre er kendt for at være en vigtig bærende trækkomponent i ligamentvæv og er derfor sandsynligvis involveret i USL-svigt og POP11.
Der mangler viden om årsagerne, forekomsten og virkningerne af POP hos kvinder. Udviklingen af en passende dyremodel af POP er nødvendig for at fremme vores forståelse af den kvindelige bækkenbund. Mus og mennesker har lignende anatomiske landemærker i bækkenet, såsom urinlederne, endetarmen, blæren, æggestokkene og runde ledbånd9, samt lignende skæringspunkter mellem USL og livmoderen, livmoderhalsen og korsbenet. Desuden tilbyder mus let genetisk manipulation og har potentialet til at være en let tilgængelig, omkostningseffektiv model til undersøgelse af POP9.
Denne undersøgelse udviklede en metode til at få adgang til og isolere USL og de forskellige bækkenbundsvæv fra nulliparøse (dvs. aldrig gravide) mus. De ekstraherede USL'er blev udsat for enzymatisk fordøjelse (dvs. for at fjerne kollagener og glycosaminoglycaner), testet for at bestemme det mekaniske respons under trækbelastning og evalueret for biokemisk sammensætning i en proof-of-concept-undersøgelse. Evnen til at isolere intakt væv vil lette yderligere mekaniske og biokemiske karakteriseringer af bækkenbundskomponenterne, hvilket er et afgørende første skridt i retning af at forbedre vores forståelse af skadesrisici i forbindelse med fødsel, graviditet og POP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg og procedurer blev udført i henhold til protokol # 2705, godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of Colorado Boulder. Seks uger gamle C57BL/6J-hunmus blev anvendt til nærværende undersøgelse. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Tilberedning af dyr
- Aflive dyret efter den institutionelt godkendte metode.
BEMÆRK: Den foreliggende undersøgelse anvendte CO 2 -indånding i overensstemmelse med American Veterinary Medical Association's retningslinjer (en forskydningshastighed på 30% til 70% af kammervolumenet med CO2 pr. Minut) efterfulgt af cervikal dislokation for at sikre vellykket aflivning.- Arbejd under en hætte, hvis det er muligt, for at minimere spredningen af museallergener. Når musen holder op med at bevæge sig og trække vejret, skal du tillade 2 minutter eller mere at kontrollere manglen på respons.
BEMÆRK: Hvis musen er drægtig eller efter fødslen, skal ungerne aflives individuelt. Hvalpe E15.5 og ældre skal halshugges under dissektionen.
- Arbejd under en hætte, hvis det er muligt, for at minimere spredningen af museallergener. Når musen holder op med at bevæge sig og trække vejret, skal du tillade 2 minutter eller mere at kontrollere manglen på respons.
- Forbered dissektionsopsætningen med en dissektionspude, en 11-bladet skalpel, buet tynd skarp saks, to par tang, buet tang, 5-0 polyglactinsutur, et dissekerende mikroskop og seks stifter (figur 1, se materialetabel).
- Placer musen på puden, og fastgør forbenene ned (figur 2A). Lav et snit på ca. 1-1,5 cm i maven med en saks (figur 2B). Brug forsigtigt saksen til at adskille huden på snittets kraniale, kaudale og laterale sider (figur 2C, D).
- Vend musen til rygsiden, og træk forsigtigt huden tilbage mod bagbenene for at fjerne huden væk fra dissektionsstedet (figur 2E-H).
- Fastgør musen ved lemmerne (figur 2I), og lav et snit på ca. 1 cm i maven fra brystkassen til bækkenet (figur 2J).
BEMÆRK: Sørg for ikke at beskadige de underliggende organer. - Skub forsigtigt organerne mod brystkassen for at rydde synsfeltet (figur 2K).
BEMÆRK: Skyl vævene med 1x PBS for at opretholde hydrering. - Ryd alt fedtvæv fra bækkenbunden (figur 2L-N).
BEMÆRK: Brug tang til forsigtigt at trække og fjerne fedt fra organer og væv af interesse.
Figur 1: Et rent arbejdsområde med alle de nødvendige værktøjer til at udføre dissektionerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fjernelse af huden og åbning af musens bækken- og brysthulrum. (A) Fastgørelse af alle lemmer. (B) Indledende snit. (C) Adskillelse af huden fra underliggende fascia ved hjælp af en saks. (D) Skæring af huden og forberedelse til fjernelse. (E-G) Træk huden af ved at gå rundt om musen. (H) Huden fjernes helt fra den dorsale side. (I) Fuldstændig fjernelse af huden fra torsoen og genfastgørelse af muselemmerne. (J) Åbning af maven. (K) Udsigt over den åbne mave. (L) Flytning af organerne ud af synsfeltet. (M) Fjernelse af fedtet. (N) Udsigt over den ryddede bækkenbund. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. USL-høst
- Skær livmoderhornene fra æggestokkene (figur 3B), træk væk fra synsfeltet og afskær ved livmoderhalsforbindelsen (figur 3C).
BEMÆRK: Livmoderhornene kan identificeres ved at følge skemaet i figur 3A. Skyl vævene med 1x PBS for at opretholde hydrering. - Skær urinlederne væk fra blæreforbindelsen (figur 3D).
BEMÆRK: Dette er for at undgå forveksling med USL. - Skær tyktarmen så tæt på livmoderhalsen som muligt (figur 3E, F).
BEMÆRK: Skyl vævene med 1x PBS for at opretholde hydrering. - Placer musen sammen med dissektionspuden under dissekeringsområdet for at visualisere USL'erne (figur 3G).
- Brug forsigtigt tangen til at rense det omgivende fedt fra USL'erne.
BEMÆRK: Brug et andet par tang til at holde livmoderhalsen op i en lille vinkel for at forbedre visualiseringen af, hvor USL skærer livmoderhalsen. Skyl vævene med 1x PBS for at opretholde hydrering. - Bind en 5-0 polyglactinsutur omkring den cervikale ende af begge USL'er (figur 4B, C).
BEMÆRK: USL'erne kan identificeres ved hjælp af skematiske og forstørrelsesbilleder (figur 4I-K) - I denne undersøgelse anvendes en USL til morfologiske eller biokemiske analyser (dvs. Ramanmikroskopi, immunhistokemi, histologi). Skær den cervikale ende af USL, lad et stykke af livmoderhalsen være fastgjort, og skær et stykke muskel fra bunden af USL (figur 4D). Placer det dissekerede væv i et bad med 1x PBS for at holde vævet hydreret (figur 4G, H).
- Brug den resterende USL til mekanisk test og billeddannelse. Skær den cervikale ende af USL, og lad et stykke livmoderhalsen være fastgjort for at lette den mekaniske opsætning (figur 4D).
BEMÆRK: Det cervikale væv vil fungere som et anker for at sikre USL under den mekaniske test. - Når alle væv af interesse er høstet (trin 3-5), skal du forskyde lårbenene fra bækkenet (figur 4E).
BEMÆRK: Man bør høre en svag kliklyd, når lårbenshovedet er disartikuleret fra acetabularkoppen. - Skær bækkenbenet fra de distale og proksimale ender af bækkenbenet, hvilket efterlader ca. 10 mm totalt væv (figur 4F). Placer det dissekerede væv i 1x PBS.
Figur 3: Ryddet bækkenbund til USL-dissektion . (A) Skematisk af anatomien. (B) Skæring af livmoderhornene ved ovarieforbindelsen. (C) Afskæring af livmoderhorn. (D) Skæring af urinlederne. (E) Skæring af tyktarmen. (F) Et klart udsyn til endetarmen og USL'erne. (G) Placering af musen og dissektionspuden under dissekeringsomfanget. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Udsigt over USL og omgivende væv og dissektion af USL'erne. (A) Skematisk oversigt over anatomiske landemærker omkring USL. (B) Binding af en sutur omkring livmoderhalsenderne. (C) Afskæring af de cervikale ender af USL. (D) Udskæring af USL til brug for de biokemiske analyser ved den sakrale forbindelse. (E) Skæring af lårbenene fra bækkenbenet. (F) Afskæring af den proksimale ende af bækkenet. (G) Dissekering af USL i en 35 mm petriskål. (H) USL med det fastgjorte bækken i en 35 mm petriskål. (I) USL og endetarmen ved 0,75x forstørrelse. (J) Fjernelse af fedt fra USL. (K) Rengøring af USL'erne ved 1,0x forstørrelse. Vægtstang = 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Blære høst
- Når fedtet er ryddet, skal du holde blæren med tangen og forsigtigt løfte den i en vinkel på ca. 40 ° (figur 5A).
- Brug saksen til at skære blæren af fra den distale side lige over livmoderhalsen (figur 5B).
- Placer vævet i et bad med 1x PBS for at holde vævet hydreret (figur 5H).
4. Høst af endetarm
- Når USL'erne er afbrudt fra livmoderhalsen, og blæren er dissekeret, løftes livmoderhalsen i en vinkel på ca. 40 ° med tangen. Der er den rektovaginale fascia, der forbinder endetarmen og livmoderhalsen. Skær forsigtigt denne forbindelse med skalpellen (figur 5C, D).
- Skær skambenet ved skamsymfysen ved hjælp af en saks. Udvid forsigtigt arbejdsområdet for at øge den visuelle adgang til vævsindsættelserne.
- Med tangen skal du forsigtigt trække endetarmen mod brystkassen og bruge saksen til at følge endetarmen fra dens bageste side til anus. Skær endetarmen ved anus (figur 5E).
- Anbring vævet i 1x PBS for at holde vævet hydreret (figur 5I).
5. Høst af livmoderhals-vagina kompleks
- Når USL'erne er fjernet fra livmoderhalsen, skal du bruge tangen til at holde livmoderhalsen. Skær livmoderhalsen så tæt på vulva som muligt ved hjælp af en saks (figur 5F, G).
BEMÆRK: Sørg for at skære pubic symphysis for at se den distale ende af vagina visuelt. - Placer vævet i 1x PBS for at holde vævet hydreret (figur 5J).
Figur 5: Blære, endetarm og livmoderhals / vagina dissektioner . (A) Hold blæren skråt. (B) Afskæring af blæren. (C) Skæring af senen, der forbinder livmoderhalsen og endetarmen. (D) Senen ved 1,0x forstørrelse. (E) Skæring af endetarmen. (F) Hold fast i livmoderhalsen med tang. (G) Skæring i den distale ende af vagina. (H) Blæren i en 35 mm petriskål. (I) Endetarmen i en 35 mm petriskål. (J) Livmoderhalsen-vagina vævskomplekset i en 35 mm petriskål. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Prøveforberedelse til vævskarakterisering
- Mekaniske og visuelle analyser af USL
- Placer USL med bækkenfastgørelsen over en T-formet væg i en brugerdefineret farvningsbrønd for at sikre fuld nedsænkning i farvningsopløsningen (CAD-tegninger af brønden findes i supplerende kodningsfil 1 og supplerende kodningsfil 2).
BEMÆRK: Brug sutur og tang til at hjælpe med placeringen. - Fortynd et kommercielt tilgængeligt farvestof, der pletter frie amingrupper (5 μL, se materialetabellen) i 2,5 ml 1x PBS, tilsæt opløsningen til den brugerdefinerede farvningsbrønd, og pletter vævet i 2 timer på en vippe ved 4 ° C.
BEMÆRK: Vortex opløsningen, før du tilføjer den til farvningsbrønden. - I løbet af de sidste 15 minutters farvning tilsættes 2,5 μL af en kommercielt tilgængelig død cellekerne plet (se materialetabellen) til opløsningen.
BEMÆRK: Vortex opløsningen, inden den tilsættes til farvningsbrønden.
- Placer USL med bækkenfastgørelsen over en T-formet væg i en brugerdefineret farvningsbrønd for at sikre fuld nedsænkning i farvningsopløsningen (CAD-tegninger af brønden findes i supplerende kodningsfil 1 og supplerende kodningsfil 2).
- Raman-analyse af USL'erne
- Fastgør USL i en lige linje på en polydimethylsiloxan (PDMS) blok, der er indeholdt i en brugerdefineret brønd.
BEMÆRK: PDMS bruges som et blødt substrat for at muliggøre fastgørelse af prøven i den ønskede konfiguration. Blokke af varierende dimensioner kan fremstilles ved at blande de to komponenter efter producentens anvisninger (se materialetabel), støbe i en petriskål og efter polymerisation skære PDMS i den krævede geometri med et skalpelblad. - Pin med insektstifter ved sutursløjfen og ved bækkenmusklen. Hydrat vævet med 1x PBS.
- Fastgør USL i en lige linje på en polydimethylsiloxan (PDMS) blok, der er indeholdt i en brugerdefineret brønd.
- Resterende væv
- De resterende væv snapfryses med flydende nitrogen eller i en passende indlejringsforbindelse, afhængigt af de ønskede analyser.
- Vævene opbevares ved -80 °C indtil efterfølgende analyser (f.eks. immunohistokemiske eller biokemiske assays).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvert trin i dissektionen af en vildtypemus er detaljeret i den tilhørende video og figurer relateret til protokollen. Til dette studie blev der anvendt 6 uger gamle C57BL/6J-hunmus (supplerende tabel 1). Tre prøvegrupper med USL'er behandlet med forskellige enzymer blev analyseret: kontrol (ingen behandling), collagenase-behandlede og chondroitinase-behandlede grupper. Den glatte muskel, nerver og lymfeknuder i USL er omgivet af en ECM rig på fibrillære kollagener og glycosaminoglycaner (GAG'er)5, som menes at give vævet mekanisk integritet. Enzymbehandlingerne blev valgt for at forstyrre disse ECM-komponenter og demonstrere muligheden for at løse de biokemiske og mekaniske forskelle ved hjælp af Raman-spektroskopi og mekanisk (træk) test.
Til fordøjelsen blev alle USL'erne anbragt i en termomixer i 3 timer i en opløsning på 1 ml ved 37 °C og 300 omdr./min. Kontrol-USL'erne blev anbragt i en opløsning af 1x PBS, de kollaganasebehandlede USL'er blev anbragt i en opløsning af 1,0 E/ml collagenase type I, og de chondroitinase-behandlede USL'er blev anbragt i en opløsning af 2,0 E/ml chondroitinase ABC (se materialetabel).
USL'erne til mekanisk test blev udarbejdet baseret på trin 6.1. Prøverne blev anbragt i et brugerdefineret lastekammer (en CAD-tegning af kammeret findes i supplerende kodningsfil 3) til den mekaniske testprotokol12. Bækkenet blev fastgjort i en stationær konfiguration, og den cervikale ende af USL blev fastgjort til en bøjeaktuator, som var baseret på designet beskrevet i Jimenez et al.12 (figur 6B; Supplerende kodningsfil 4), under et opretstående konfokalmikroskop og fastgjort til en 100 mN vejecelle (figur 6A). Bøjesystemet reducerer støjen fra aktuatorens arm ved måling af kraft12. En forspænding på ca. 500 μN blev brugt til at indstille referencekonfigurationen af USL, og hver USL blev afbildet, mens den var i denne position. Derefter blev en global forskydning på 750 μm påført og holdt i 5 minutter, før billeddannelse igen. USL blev derefter bragt tilbage til referencekonfigurationen, og denne proces blev gentaget for en global forskydning på 1.000 μm. Denne protokol blev fulgt for alle tre prøvegrupper (n = 1/gruppe) for at opnå spændingsafslapningskurverne (figur 7), og top- og ligevægtsspændingerne, der modstod hver USL, blev bestemt (tabel 1). Spændingen blev beregnet ved at dividere den målte kraft med det gennemsnitlige tværsnitsareal (supplerende tabel 2 og supplerende tabel 3).
Figur 6: Opsætning af mekanisk test . A) Lasterum under konfokalmikroskopet og forbundet med aktuatoren. B) USL i lastekammeret Bækkenet forbliver stationært, mens den cervikale ende er bundet til et sammenkoblet bøjesystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Makroskopisk aksial stress-afslapning plot af murine USL'er udsat for forskellige enzymbehandlinger. Enzymbehandlingen syntes at reducere den gennemsnitlige aksiale top og afslappede spændinger, som USL oplever ved foreskrevne globale forskydninger. (*) angiver afslappede stressværdier, som blev målt 200 s efter maksimal stress. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Prøve | Global forskydning (μm) | Peak stress (kPa) | Afslappet ligevægtsspænding (kPa) |
| Kontrol | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| Collagenase- behandlet | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| Chondroitinase-behandlede | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
Tabel 1: Effekten af enzymbehandling på stressmålinger af USL'erne.
Fra de billeder, der blev taget (figur 8), blev belastningsfelterne estimeret ved hjælp af en kombination af manuel og automatisk ("imregdemons" -funktion i MATLAB) tekstursporing af ledbåndet mellem referencetilstanden (ubelastet) og deformeret tilstand13. Manuel sporing blev udført ved at vælge de samme cellekerner i reference- og deformerede billeder. Green-Lagrange-belastningsfelter blev beregnet ud fra de estimerede forskydningsfelter (figur 9). De gennemsnitlige aksiale stammer (E11) blev beregnet for den mellemliggende del af hver prøve (tabel 2).
Figur 8: Billeder af deformerede og referencetilstande for en kontrolprøve (ubehandlet) efter globale forskydninger . (A) En global forskydning på 750 μm. (B) En global forskydning på 1.000 μm. Grøn repræsenterer referencetilstanden, og lilla er den deformerede tilstand (skalabjælke = 500 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Estimering af belastningsfelter. De estimerede belastningsfelter for prøverne i hver behandlingsgruppe viser, at de aksiale (E11), tværgående (E22) og forskydningsstammer (E12) var rumligt inhomogene, og den aksiale belastning steg med stigende anvendt forskydning (δ). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Global forskydning (μm) | Kontrol | Collagenase-behandlede | Chondroitinase-behandlede |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
Tabel 2: Gennemsnitlige aksiale stammer. De gennemsnitlige aksiale stammer for hver mekanisk testet prøve indikerer, at den globale aksiale stamme i de enzymbehandlede prøver var lig med eller større end i kontrolprøven, hvilket tyder på, at reduktionen i makroskopisk stress skyldtes enzymbehandling snarere end mindre stammer.
Konfokal Raman-spektroskopi (785 nm laser, 1,06 μm spotstørrelse) blev udført på USL'erne fremstillet som beskrevet i trin 6.2 og efter O'Brien et al.14 for semikvantitativt at evaluere vævsbiokemien. Kosmiske stråler blev identificeret og fjernet, den lineære baseline blev trukket fra, og intensiteten blev normaliseret for hvert spektrum. De samme behandlingsgrupper blev sammenlignet (n = 3/gruppe). Repræsentative spektre for mellemsektionen af hver USL (figur 10) samt cervikale og sakrale ender (supplerende figur 1 og supplerende figur 2) vises.
Figur 10: Enzymbehandlingens indflydelse på USL-sammensætningen. Raman-spektroskopi af USL-mellemsektionen antyder, at enzymbehandlinger ændrede den biokemiske sammensætning af murine USL. Klik her for at se en større version af denne figur.
Toppene blev korreleret med forskellige biologiske komponenter baseret på in vivo Raman-spektroskopi af den menneskelige livmoderhals udført af O'Brien et al.15. Vores data blev normaliseret ved hjælp af toppen af phosphatidylethanolamin (1.769 nm), et phospholipid, der findes i cellemembraner, som bør forblive uændret efter enzymatiske behandlinger. Sammenligning på tværs af repræsentative spektre afslørede, at vandindholdet, kollagenerne, hyaluronsyre, proteoglycaner og GAG'er blev reduceret i både de kollaganasebehandlede og chondroitinase-behandlede USL'er (figur 10, supplerende figur 1 og supplerende figur 2).
Supplerende figur 1: Enzymbehandlingens indflydelse på USL-sammensætningen. Raman-spektroskopi af USL-livmoderhalssektionen antyder, at enzymbehandlingerne ændrede den biokemiske sammensætning af murine USL. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Enzymbehandlingens indflydelse på USL-sammensætningen. Raman-spektroskopi af USL-sakralsektionen antyder, at enzymbehandlingerne ændrede den biokemiske sammensætning af murine USL. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Vægt, alder og USL-analyse af de mus, der blev brugt i undersøgelsen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: Enzymbehandlingens indflydelse på USL-kraftmålinger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 3: Tværsnitsarealberegninger af de mekanisk testede USL'er. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 1: CAD-fil til farvning af brønden. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 2: CAD-fil til farvning af brøndlåget. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 3: CAD-fil af lastekammeret. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 4: CAD-fil af bøjesystemet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effekten af strukturelle skader på kvindeligt reproduktionsvæv er underundersøgt, og der er behov for en let tilgængelig dyremodel til POP-forskning. Musen er en omkostningseffektiv model, der kan efterligne humane reproduktionsstudier16. På grund af den stigende interesse for undersøgelsen af det kvindelige reproduktive system er der behov for metoder, der hjælper undersøgelsen af disse væv. For at imødekomme dette behov etableres der i dette arbejde en metode til at dissekere og forberede murin bækkenbundsvæv til strukturelle og funktionelle analyser.
For dissektionens succes er der brug for tilstrækkelig tid og pleje. Murine reproduktive væv er små og skrøbelige. Opmærksomhed på detaljer er påkrævet, især mens du rydder fedtet omkring USL og bækkenorganerne, for at undgå at beskadige USL eller andre væv, når fedtet fjernes. Det er vigtigt at bruge dissekeringsmikroskopet til at hjælpe med at identificere forskelle mellem USL og fedt, som det utrænede øje let kan forvirre. Fjernelse af urinlederne kan være nyttigt for at undgå forvirring med USL, da indsættelsespunkterne til blæren og livmoderhalsen er tæt på hinanden. Når du binder suturen omkring USL, skal du sørge for at undgå at punktere noget væv ved at bruge tang til forsigtigt at løfte USL'erne for at gøre plads til nålen. For at udtrække USL'erne kan identifikationen af den rigtige vævsstruktur og vigtige anatomiske landemærker være vanskelig, men med denne metode og praksis vil dissektionsresultaterne kunne gentages.
Den foreslåede metode skitserer en detaljeret procedure til dissekering af bækkenbundsvæv fra en enkelt prøve. En begrænsning er, at det ikke er muligt at holde alle væv helt intakte, da et stykke af livmoderhalsen forbliver fastgjort til den dissekerede USL for at fungere som et anker under den mekaniske test og hjælpe med at identificere orienteringen. En anden begrænsning er, at musens anatomi og menneskets anatomi har forskelle i vævets form, størrelse og orientering9. POP er blevet undersøgt ved hjælp af flere dyremodeller, såsom gnavere 17,18, kaniner19,20 får 20,21, svin5,22,23,24 og ikke-menneskelige primater 25,26 samt i humane kadavere24,26,27, og nogle af disse modeller har fokuseret på USL's rolle. Mens hver af disse modeller er gavnlige for undersøgelsen af POP, er en yderligere fordel ved musen, at det er let at manipulere genetisk for at skabe nye sygdomsmodeller, hvilket ikke er muligt hos større dyr27.
For at drage fordel af musen som model er denne metode udviklet til at hjælpe med en vellykket dissektion af USL'erne og forberedelsen af vævene til forskellige analyser, herunder mekanisk testning, Ramanmikroskopi, immunhistokemi og biokemiske assays. Med denne metode er det muligt at udtrække USL med sin anatomiske forbindelse for at identificere dens orientering, for at binde USL og mekanisk teste USL under forhold svarende til dem, der findes in vivo.
USL's mekaniske integritet er afledt af ECM-komponenterne, herunder kollagener, proteoglycaner og GAG'er. Type I kollagen er et vigtigt trækbærende protein, og skader på denne ECM-komponent menes at bidrage til USL-svigt og POP. I denne procedure blev to forskellige enzymbehandlinger sammenlignet for at teste, hvordan varierende ECM-sammensætningen påvirker USL's mekaniske respons og sammensætning. Den mekaniske analyse antydede, at kollagen og GAG'er bidrog til USL's aksiale stivhed og sænkede den gennemsnitlige aksiale top og ligevægtsspændinger (figur 7). De enzymbehandlede USL'er oplevede en lignende eller større gennemsnitlig aksial stamme (tabel 2). Raman-spektroskopi viste, at den kollaganasebehandlede USL havde nedsat kollagenindhold samt nedsat vand og hyaluronsyre, mens den chondroitinase-behandlede USL havde mindre hyaluronsyre samt lavere vand- og kollagenindhold. For disse resultater validerede Raman-spektroskopien, at komponenterne blev fjernet på grund af fordøjelsen. Denne metode forventes at gøre bækkenbundsbaserede undersøgelser mere tilgængelige og øge antallet af efterforskere, der fokuserer på dette understuderede område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) -tilskuddet (CB), NSF Graduate Research Fellowship (LS), Schmidt Science Fellowship (CL), University of Colorado Research &; Innovation Seed Grant Program (2020-pris til V.F., S.C. og K.C.) og Anschutz Boulder Nexus Seed Grant ved University of Colorado (til VF og K.C.). Særlig anerkendelse går til Dr. Tyler Tuttle for hjælp med lastekammerets design samt Calve-laboratoriemedlemmerne for nyttige diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y.
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D.
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O'Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
