Summary
대동맥판막협착증(AVS)의 기저에 있는 병리학적 기전을 이해하고 치료적 개입의 효능을 평가하기 위해서는 적절한 동물 모델이 필요하다. 본 프로토콜은 생체 내에서 직접 풍선 손상을 통해 AVS 토끼 모델을 개발하기 위한 새로운 절차를 설명합니다.
Abstract
동물 모델은 질병에 걸린 인간 대동맥 판막의 신뢰할 수 있는 출처에 대한 접근이 부족하기 때문에 대동맥 판막 협착증(AVS)의 기저에 있는 병리학적 메커니즘을 이해하는 중요한 도구로 부상하고 있습니다. 다양한 동물 모델 중에서 AVS 토끼 모델은 대형 동물 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델 중 하나입니다. 그러나 기존의 AVS 토끼 모델은 대동맥 판막에 심각한 협착을 유발하기 위해 장기간 식이 보충제와 유전자 조작이 필요하므로 실험 연구에서 사용이 제한됩니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 대동맥 판막에 대한 직접적인 풍선 손상으로 협착이 유발되는 새로운 AVS 토끼 모델이 제안되었습니다. 본 프로토콜은 뉴질랜드 흰토끼(NZW)에서 AVS를 유도하기 위한 성공적인 기술을 준비, 수술 절차 및 수술 후 관리를 위한 단계별 절차와 함께 설명합니다. 이 간단하고 재현 가능한 모델은 AVS의 시작과 진행을 연구하기 위한 유망한 접근 방식을 제공하며 질병의 근본적인 병리학적 메커니즘을 조사하기 위한 귀중한 도구를 제공합니다.
Introduction
대동맥 협착증(AS)의 진행과 관련된 병든 인간 대동맥 판막의 신뢰할 수 있는 출처에 대한 접근이 부족하기 때문에 적절한 동물 모델을 사용하면 대동맥 판막 협착증(AVS)의 기저에 있는 병리학적 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 기여할 수 있다는 사실이 점점 더 인식되고 있습니다. AVS를 연구하기 위한 다양한 동물 모델 중에서 토끼는 가장 일반적으로 사용되는 대동물 AVS 모델 중 하나이며, AVS 토끼 모델은 콜레스테롤/비타민 D2 보충 또는 유전자 조작을 통해 유도됩니다 1,2,3,4.
토끼 AVS 모델은 AVS의 개발 및 진행에 대한 중요한 통찰력을 제공했지만, 예비 실험에서 볼 수 있듯이 AVS를 일관되고 재현 가능하게 유도하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.
식이요법 유도 및 유전적으로 감수성 동물 모델 외에도 마우스 5,6에서 직접적인 기계적 손상을 통해 AVS의 새로운 모델이 확립되었습니다. 기계적 손상 모델은 대동맥 협착증을 성공적으로 유도하고 야생형 마우스에서 간단하고 재현 가능한 AVS 모델을 나타냅니다. 우리가 아는 한, 토끼 모델에서 대동맥 판막에 대한 기계적 손상의 영향을 조사한 선행 연구는 없었습니다. 따라서 본 연구는 대동맥판막에 대한 직접적인 풍선 손상을 통해 수컷 뉴질랜드 흰토끼에게 AVS를 유도하는 새로운 절차를 제공하며, 이는 판막성 대동맥 협착증의 상태를 정확하게 모방할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 준비, 수술 절차 및 수술 후 관리에 대한 단계별 설명이 포함되어 있어 재현 가능한 AVS 토끼 모델을 유도하는 데 유용합니다.
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Protocol
모든 동물연구절차는 실험동물복지법, 실험동물의 관리 및 이용에 관한 지침, 가톨릭대학교 의과대학 동물관리이용위원회(IACUC)에서 제공하는 동물실험에 대한 지침 및 방침(승인번호: CUMC-2021-0176-05)를 참조하십시오. 본 연구는 3.5-4.0kg의 3개월 된 수컷 뉴질랜드 흰토끼(NZW)를 활용했으며, 이 토끼는 개별 케이지에서 표준 조건 하에서 유지되었습니다. 토끼는 일반 식단 또는 50,000U의 비타민 D2가 보충된 0.5% 콜레스테롤이 풍부한 식단을 먹였습니다( 재료 표 참조). AVS 토끼 모델의 유도를 위한 실험 설계 및 분석 방법은 그림 1에 나와 있습니다.
1. 수술 준비
- 수술 시작 시 모든 의료 및 수술 기구( 재료 표 참조)가 멸균되었는지 확인하십시오.
- 아래 단계에 따라 확장 풍선 카테터 세트를 준비합니다.
- 식염수와 시중에서 판매되는 조영제(1:1)의 혼합물로 채워진 수축 장치를 풍선 카테터의 루어 잠금 부분에 연결합니다( 재료 표 참조).
- 풍선에 팽창 용액을 채우고 풍선 카테터에서 공기를 제거합니다.
참고: 본 연구의 경우 팽창 용액은 30% 요오드릭산올과 0.9% 식염수로 구성되었습니다( 재료 표 참조). - 팽창 용액으로 풍선 루멘을 퍼지하여 적절한 풍선 팽창을 확인합니다.
2. 대동맥 판막 손상에 대한 수술 절차
- 동물을 마취시키기 위해 틸레타민 & 졸라제팜(15mg/kg) 및 자일라진(5mg/kg)( 재료표 참조)을 근육 주사한다.
참고: 마취제를 투여하기 전에 토끼를 마취 전 항콜린제로 피하 글리코피롤레이트 주사(0.05mg/kg)로 전처리했습니다. 적절한 마취 수준은 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족과 꾸준한 호흡수를 포함한 기준의 조합에 의해 결정되었습니다. - 24G 정맥 주사(IV) 카테터를 가장자리 귓바퀴 정맥에 삽입하고 헤파린화 식염수(100U/kg 헤파린)로 주입 세트를 연결합니다.
- 토끼를 다중 매개변수 수의학 모니터( 재료 표 참조)와 연결하여 산소 포화도 신호(SpO2), 체온 및 혈압과 같은 활력 징후를 지속적으로 모니터링합니다.
알림: SpO 2 모니터링을 위해 SpO2 센서를 토끼의 혀에 부착하십시오. 체온 모니터링을 위해 토끼의 직장에 프로브를 삽입합니다. 혈압 모니터링을 위해 커프를 앞다리에 놓습니다. - 토끼를 C-arm 형광투시가 장착된 수술대에 누운 자세로 놓고 동물 이발기를 사용하여 복부 목 부위의 털을 제거합니다(그림 2A).
- 절개 부위를 요오드로 소독하고 수술용 수건으로 토끼를 덮습니다.
- 토끼의 심장을 C-arm 이미지의 중앙에 배치합니다.
참고: 모든 연구원은 C-arm 유도 수술을 수행하는 동안 방사선 노출을 줄이기 위해 열발광 선량계(TLD)가 부착된 보호 장비를 착용해야 합니다.- C-arm을 켜고 심장 이미징을 위한 형광 투시 모드를 선택합니다.
- 심장이 이미징 필드의 중앙에 오도록 토끼의 위치를 조정합니다.
- 목의 피부를 약 3cm의 세로로 절개하고 수술 용 가위를 사용하여 근막과 지방 조직을 자릅니다.
- LCCA의 약 3-3.5cm가 노출될 때까지 근육을 조심스럽게 분리하여 좌측 총경동맥(LCCA)을 노출시킵니다(그림 2B).
- 노출된 LCCA의 상단과 끝에 3-0 실크 봉합사( 재료 표 참조)로 LCCA를 결찰하여 혈류를 멈춥니다.
- 22G IV 카테터를 LCCA에 삽입하고 가이드 와이어(0.016인치, 재료 표 참조)를 IV 카테터를 통해 좌심실(LV)에 도입하여 카테터 끝이 C-arm의 이미징 필드에 적절하게 위치하도록 합니다.
알림: IV 카테터를 삽입할 때 카테터가 전진할 수 있도록 대동맥 판막으로 내려가는 길에 합자 봉합사를 조심스럽게 풉니다. - IV 카테터를 빼내고 가이드 와이어를 남겨두고 가이드 와이어 위에 4-F 덮개( 재료 표 참조)를 LCCA에 배치하여 풍선 카테터를 도입합니다(그림 2C).
알림: IV 카테터를 피복으로 교체한 후 갇힌 공기를 피복 장치에서 제거해야 합니다. - C-arm 형광 투시 유도 하에 가이드와이어 위의 8mm 풍선 카테터를 대동맥 판막에 조심스럽게 삽입합니다(그림 2D).
- 풍선 카테터 팁을 대동맥 판막에서 약 1-2cm 떨어진 곳에 놓고 6기압의 압력 팽창기로 팽창 용액을 퍼지하여 풍선을 팽창시킵니다.
- 풍선을 LV 정점으로 전진시키고 다시 LV 배출구로 당깁니다. 이 절차를 다섯 번 반복한 다음 풍선을 수축시킵니다(그림 2E, F).
- 적절한 밸브 손상을 보장하기 위해 2.8-2.9단계를 세 번 반복합니다.
- 풍선 카테터와 가이드와이어를 빼냅니다. LCCA에서 칼집을 천천히 제거하고 즉시 대동맥 판막으로 내려가는 길에 LCCA를 봉합사와 묶습니다.
- 절개 부위를 식염수로 세척하여 혈전을 제거하고 천공 부위에 동맥출혈이 있는지 검사합니다.
- 근육과 피부를 3-0 비흡수성 봉합사로 봉합하고 상처의 모든 면을 요오드로 살균합니다.
3. 수술 후 관리
- 모니터링 패치와 클립을 제거하고 토끼를 중환자실 인큐베이터에 보관합니다.
참고: 수술 후 토끼는 중환자실 인큐베이터에서 1일 동안 면밀히 관찰한 후 가정용 케이지로 옮겼습니다. - 트라마돌 5mg, 케토프로펜 3mg/kg으로 수술 후 통증을 관리하고, 항생제(4mg/kg)를 피하주사를 통해 3일간 하루 2회 투여한다( 자료표 참조).
참고: 수술 후 통증 관리는 수의학 및 IACUC 지침(예: 오피오이드, NSAID, 국소 마취제 또는 병용)을 준수해야 합니다. - 콜레스테롤이 0.5% 풍부한 식단에 50,000U의 비타민 D2(HC + VitD2)를 8주 동안 먹이십시오.
4. 심장 초음파
- 풍선에 부상을 입은 지 8주가 지나면 2.1단계에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 토끼를 마취합니다.
- 2차원 경흉부 보기를 사용하여 대동맥 판막을 시각화하고 단축 및 장축 보기에서 M 모드 이미지를 기록합니다.
- 토끼를 에코 테이블 위에 누운 자세로 놓습니다.
- 클리퍼와 제모 크림을 사용하여 가슴 부위를 면도하십시오.
- 초음파 변환기 젤( 재료 표 참조)을 흉부에 바릅니다.
- 변환기를 조정하여 대동맥 판막의 parasternal long-axis view 및 parasternal short-axis view를 얻습니다.
- M 모드 이미징을 사용하여 장축 및 단축 보기 모두에서 대동맥 판막의 이미지를 기록하고 나중에 분석할 수 있도록 이미지를 저장합니다.
5. 조직학적 분석
- 심장 초음파 검사 후 염화칼륨(KCl, 3g/20mL, 1mL)을 정맥 주사하여 토끼를 안락사시킵니다.
- 흉강을 열고 상행 대동맥7로 심장을 적출한 후 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣어 얼음 위에 놓습니다.
- 즉시 심장을 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액에 담그고 파라핀 블록에 넣습니다( 재료 표 참조).
- 마이크로톰을 사용하여 파라핀이 포함된 심장 블록을 4μm 두께의 절편으로 자르고 Masson의 삼색(MT), Alizarin Red 및 von Kossa(재료 표 참조)로 절편을 염색하여 콜라겐 침착 및 판막 석회화를 각각평가합니다 8,9.
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Representative Results
대동맥 판막 손상으로 인한 토끼 AVS 모델
토끼 AVS 모델을 유도하기 위해 이 연구에는 3.5-4.0kg의 수컷 NZW 토끼가 사용되었습니다. 2단계(그림 2)에서 설명한 수술 절차에 따르면, AVS 모델은 기계적 대동맥 판막 변성 및 석회화를 초래한 대동맥 판막 손상에 의해 확립되었습니다. 대조군에는 0.5% 콜레스테롤이 풍부한 식단(고콜레스테롤, HC)과 50,000U의 비타민 D2(VitD2)를 먹인 토끼가 포함되었는데, 이는 식이 유도 AVS 모델로 알려져 있습니다.
대동맥 판막 평가
대동맥 판막의 구조적 변화를 평가하기 위해 심장 초음파 단축 및 장축 보기를 사용하여 소엽 이동성 및 두께를 평가했습니다. 대동맥 판막 손상 후 8주가 지났을 때, 심장 초음파 검사 결과 야생형(WT) 토끼를 포함한 대조군 토끼와 판막 손상 없이 HC + VitD2 식단을 먹인 토끼에 비해 HC + VitD2 식단을 먹인 부상당한 토끼에서 교두가 두꺼워지고 움직임이 제한되었습니다(그림 3).
조직학적 분석
대동맥 판막의 조직학적 변화를 평가하기 위해 대동맥 판막 손상 후 8주에 토끼를 희생하고 절제된 심장으로 조직학적 분석을 수행했습니다(그림 4). 그림 4A에서 볼 수 있듯이 Masson's trichrome(MT)으로 염색된 대동맥 판막은 WT 및 HC + VitD2 식이 유도 그룹에 비해 부상 그룹에서 대동맥 판막 교두의 두께가 증가한 것으로 나타났습니다. 또한, 판막 칼슘 침착의 정도를 비교하기 위해, 그림 4B,C와 같이 Alizarin Red 염색 및 von Kossa 염색을 수행하였다. HC + VitD2 식이요법 유도 그룹은 판막 전단에 무시할 수 있는 칼슘 침전물을 보인 반면, 풍선 손상 그룹에서는 상당한 석회질 침전물이 관찰되었습니다.
그림 1: 실험 타임라인 구성표. 대동맥 판막 협착증의 토끼 모델은 수컷 뉴질랜드 흰토끼(NZW)의 대동맥 판막에 대한 직접적인 풍선 손상(3.5-4.0kg)에 이어 고콜레스테롤/비타민 D2 식단(0.5% 콜레스테롤이 풍부한 식단 + 50,000U의 비타민 D2; HC + VitD2)를 8주 동안 투여합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수술 절차의 개요. (A) 마취 하에 토끼를 수술대 위에 누운 자세로 눕혔다. (B) 좌측 총경동맥(LCCA)은 피부와 근육을 조심스럽게 분리하여 노출되었습니다. (C) 4-F 피복과 가이드 와이어를 LCCA에 삽입했습니다. 빨간색 화살표: 칼집; 노란색 화살표: 가이드 와이어. (D) 풍선 카테터를 가이드 와이어를 통해 대동맥 판막으로 도입했습니다. 빨간색 화살표: 풍선 카테터. (E,F) 풍선 카테터는 C-arm 형광 투시 유도에 따라 좌심실 정점과 출구 사이에서 팽창되고 전진/뒤로 당겨졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대동맥 판막 협착증의 심장 초음파 분석. 심장 초음파에서 장축(상부 패널) 및 단축(중간 패널) 보기의 대표 이미지와 판막 손상(n=3), HC + VitD2-다이어트(n = 3) 그룹이 있는 WT(n = 3), HC + VitD2-다이어트(n = 3) 그룹의 판막 협착증(하단 패널) 정도에 대한 개략도. 점선 원: 대동맥 판막; 빨간 화살촉: 두꺼워진 전단지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대동맥 판막의 조직학적 분석. 판막 손상 그룹이 있는 WT, HC + VitD2 다이어트 및 HC + VitD2 다이어트에서 (A) Masson의 삼색, (B) Alizarin Red 및 (C) von Kossa 염색의 대표 이미지. 파란색 화살촉 : 두꺼운 전단지; 빨간 화살촉: 석회화된 전단지. 축척 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
동물 AVS 모델은 일반적으로 AVS의 시작 및 진행을 포함하여 AVS의 병리학적 측면을 연구하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 대동맥 판막의 직접적인 풍선 손상으로 인한 새로운 토끼 AVS 모델을 소개합니다. 이 연구에서 대동맥 판막 손상 모델은 상당한 소엽 두꺼움 및 석회화를 보여주었습니다. 식이 보충제에 의해 유도된 경증 AVS 모델과 비교했을 때, 직접 풍선 손상 모델의 대동맥 판막은 선택적으로 손상되어 교두가 두꺼워지고 움직임이 제한되며 전단이 두꺼워지고 석회화되었습니다. 이러한 결과는 AVS10,11의 일반적인 특성과 일치합니다.
식이 보충제 및 유전자 조작에 의해 유도된 일반적으로 사용되는 AVS 토끼 모델은 실험 연구에서 몇 가지 한계가 있습니다12,13,14. 토끼 모델에서 심각한 협착증이 발생하면 생쥐보다 더 긴 수유 기간이 필요한 경우가 많으며, 이는 심각한 염증과 간 독성을 유발할 수 있습니다. 또한, 이러한 모델에서 고콜레스테롤혈증 식이 요법 및 VitD2와 같은 식이 보충제가 항상 일관되고 유의한 판막 협착증을 유발하는 것은 아닙니다. 이에 비해, 본 프로토콜에 기술된 직접적인 풍선 손상은 작동된 대동맥 판막 전단에 기계적 손상을 일으킬 수 있으며, 이에 따라 특이적으로 재현 가능한 리모델링 반응을 유도할 수 있다. 또한 이 프로토콜을 사용하면 부상 강도를 조정하여 AVS의 심각도를 조작할 수 있습니다. 우리가 아는 한, 토끼 모델에서 대동맥 판막에 대한 기계적 손상의 영향이 생체 내에서 검증된 것은 이번이 처음입니다.
이러한 장점에도 불구하고 이 프로토콜은 일관되고 재현 가능한 AVS 모델을 유도하는 데 한계가 있습니다. 첫째, 수술 절차는 동물 모델에 대한 많은 수술 경험이 필요합니다. 둘째, AVS 중증도를 최적화하기 위한 세부 조건(예: 부상 강도 및 식이 보충제 지속 기간)을 설정해야 합니다. 셋째, 이 연구는 콜레스테롤이 풍부한 식이요법과 함께 풍선 손상의 효과만을 조사했기 때문에 이 프로토콜은 풍선 손상이 대동맥 판막 협착증에 미치는 영향에 대한 정보를 제공하는 데 한계가 있습니다. 콜레스테롤이 풍부한 식단 없이 풍선 부상을 입은 그룹을 포함시키는 것은 유익할 것이며, 향후 연구를 위해 고려할 것입니다. 그럼에도 불구하고 이 연구는 토끼 모델에서 대동맥 판막의 직접적인 풍선 손상에 대한 새로운 프로토콜을 보여주며, 이는 AVS의 기저에 있는 병리학적 메커니즘을 연구하는 데 유용하며 잠재적으로 치료 옵션을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이 저작물에 대해 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
본 연구는 한국산업통상자원부(MSIT)가 지원하는 한국연구재단(NRF) 보조금(제2020R1A4A3079570호), 교육부(제2021R1I1A1A01051425호), 산업통상자원부가 지원하는 산업전략기술개발사업(제20014873호)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
References
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