Summary
大動脈弁狭窄症(AVS)の根底にある病理学的メカニズムを理解し、治療的介入の有効性を評価するには、適切な動物モデルが必要である。本プロトコルは、in vivoでの直接バルーン損傷を介してAVSウサギモデルを開発するための新しい手順を説明しています。
Abstract
動物モデルは、大動脈弁狭窄症(AVS)の根底にある病理学的メカニズムを理解するための重要なツールとして浮上しています。さまざまな動物モデルの中で、AVSウサギモデルは、大動物実験で最も一般的に使用されるモデルの1つです。しかし、従来のAVSウサギモデルでは、大動脈弁に著しい狭窄を誘発するために長期間の栄養補助食品と遺伝子操作が必要であり、実験的研究での使用が制限されています。これらの制限に対処するために、狭窄が大動脈弁への直接バルーン損傷によって誘発される新しいAVSウサギモデルが提案されています。本プロトコルは、ニュージーランドの白ウサギ(NZW)でAVSを誘発するための成功した技術を、準備、外科的処置、および術後ケアの段階的な手順で説明しています。このシンプルで再現性のあるモデルは、AVSの開始と進行を研究するための有望なアプローチを提供し、疾患の根本的な病理学的メカニズムを調査するための貴重なツールを提供します。
Introduction
大動脈弁狭窄症(AS)の進行に関連する罹患したヒト大動脈弁の信頼できる情報源へのアクセスがないため、適切な動物モデルの使用が大動脈弁狭窄症(AVS)の根底にある病理学的メカニズムのより良い理解に貢献できることがますます認識されています。AVSを研究するためのさまざまな動物モデルの中で、ウサギは最も一般的に使用される大型動物のAVSモデルの1つであり、AVSウサギモデルはコレステロール/ビタミンD2の補給または遺伝子操作のいずれかによって誘導されます1,2,3,4。
ウサギAVSモデルは、AVSの発達と進行に関する重要な洞察を提供してきましたが、私たちの予備実験で見られるように、AVSを一貫して再現性よく誘導することは依然として困難です。
食餌誘発性および遺伝的に感受性のある動物モデルに加えて、マウスの直接的な機械的損傷によってAVSの新しいモデルが確立されました5,6。機械的損傷モデルは、大動脈弁狭窄症の誘導に成功し、野生型マウスにおける単純で再現性のあるAVSモデルを表しています。私たちの知る限り、ウサギモデルにおける大動脈弁に対する機械的損傷の影響を調べた先行研究はありません。したがって、この研究は、大動脈弁への直接バルーン損傷を介して雄のニュージーランド白ウサギにAVSを誘発するための新しい手順を提供します 弁膜症の状態を正確に模倣することができます。このプロトコルには、準備、外科的処置、および術後ケアの段階的な説明が含まれており、再現性のあるAVSウサギモデルを誘導するのに役立ちます。
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Protocol
すべての動物実験手順は、実験動物福祉法、実験動物の飼育および使用に関するガイド、および韓国カトリック大学医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)が提供した動物実験に関するガイドラインとポリシーに従って承認および実施されました(承認番号: CUMC-2021-0176-05)です。本研究では、体重3.5〜4.0kgの生後3ヶ月齢のオスのニュージーランドホワイト(NZW)ウサギを使用し、個々のケージで標準条件下で維持しました。ウサギには、通常の食事または50,000UのビタミンD2を補給した0.5%コレステロールが豊富な食事のいずれかが与えられました( 材料表を参照)。AVSウサギモデルを誘導するための実験計画法と解析方法を 図1に示します。
1.手術の準備
- 手術の開始時に、すべての医療器具および手術器具( 材料表を参照)が滅菌されていることを確認してください。
- 以下の手順で拡張バルーンカテーテルセットを準備します。
- 生理食塩水と市販の造影剤(1:1)の混合物で満たされた収縮装置をバルーンカテーテルのルアーロック部分に接続します( 材料表を参照)。
- バルーンをインフレーション溶液で満たし、バルーンカテーテルから空気を取り除きます。
注:本研究では、インフレーション溶液は30%のイオジキサノールと0.9%の生理食塩水で構成されていました( 材料表を参照)。 - バルーンルーメンをインフレーション溶液でパージすることにより、バルーンの適切なインフレーションを確認します。
2.大動脈弁損傷に対する外科的処置
- チレタミンとゾラゼパム(15 mg/kg)およびキシラジン(5 mg/kg)( 材料表参照)の筋肉内注射を行い、動物に麻酔をかけます。
注:麻酔を投与する前に、ウサギは麻酔前抗コリン薬として皮下グリコピロレート注射(0.05 mg / kg)で前処理されました。.適切な麻酔レベルは、つま先のつまみに対する反応の欠如や安定した呼吸数などの基準の組み合わせによって決定されました。 - 24 G の静脈内 (IV) カテーテルを辺縁耳介静脈に挿入し、輸液セットをヘパリン化生理食塩水 (100 U/kg ヘパリン) で接続します。
- ウサギをマルチパラメータ獣医モニター( 材料表を参照)に接続して、酸素飽和度信号(SpO2)、体温、血圧などのバイタルサインを継続的に監視します。
注意: SpO2 モニタリングの場合は、SpO2 センサーをウサギの舌に取り付けます。温度モニタリングのために、プローブをウサギの直腸に挿入します。血圧モニタリングのために、前肢にカフを置きます。 - Cアーム透視検査を備えた手術台にウサギを仰臥位に置き( 材料表を参照)、動物のバリカンを使用して腹側頸部から毛を取り除きます(図2A)。
- 切開部をヨウ素で滅菌し、ウサギを手術用タオルで覆います。
- ウサギの心臓をCアーム画像の中央に配置します。
注:すべての研究者は、Cアームガイド下手術を行う際に放射線被曝を減らすために、熱ルミネッセンス線量計(TLD)が取り付けられた保護具を着用する必要があります。- Cアームの電源を入れ、心臓画像の 透視モード を選択します。
- ウサギの位置を調整して、心臓がイメージング野の中心にあることを確認します。
- 首の皮膚を縦方向に約3cm切開し、手術用ハサミを使用して筋膜と脂肪組織を切断します。
- LCCAの約3〜3.5cmが露出するまで筋肉を慎重に分離することにより、左総頸動脈(LCCA)を露出させます(図2B)。
- 露出したLCCAの上部と端に3-0シルク縫合糸( 材料表を参照)でLCCAを結紮し、血流を止めます。
- 22 G IVカテーテルをLCCAに挿入し、ガイドワイヤー(0.016インチ、 資料表を参照)をIVカテーテルを介して左心室(LV)に挿入し、カテーテルの先端がCアームのイメージング野に適切に配置されるようにします。
注意: IVカテーテルを挿入するときは、カテーテルが前進できるように、大動脈弁に向かう途中で結紮縫合糸を慎重に緩めます。 - IVカテーテルを引き出し、ガイドワイヤーを残し、ガイドワイヤーの上に4-Fシース( 資料表を参照)をLCCAに配置して、バルーンカテーテルを導入します(図2C)。
注意: IVカテーテルをシースに交換した後、閉じ込められた空気をシースデバイスから取り除く必要があります。 - 8 mmのバルーンカテーテルをガイドワイヤーからCアーム透視ガイド下で大動脈弁に慎重に挿入します(図2D)。
- バルーンカテーテルの先端を大動脈弁から約1〜2cm離れた場所に置き、6気圧の圧力インフレータでインフレーション溶液をパージしてバルーンを膨らませます。
- バルーンをLV頂点に進め、LV出口に引き戻します。この手順を5回繰り返してから、バルーンを収縮させます(図2E、F)。
- 手順2.8〜2.9を3回繰り返して、適切な弁損傷を確認します。
- バルーンカテーテルとガイドワイヤーを引き出します。LCCAからシースをゆっくりと取り外し、すぐにLCCAを大動脈弁まで下降する縫合糸で結びます。
- 切開部を生理食塩水で洗浄して血栓を取り除き、穿刺部位に動脈出血がないか検査します。
- 3-0の非吸収性縫合糸で筋肉と皮膚を閉じ、傷口のすべての側面をヨウ素で殺菌します。
3. 術後のケア
- モニタリングパッチとクリップを取り外し、ウサギを集中治療用インキュベーターに保管します。
注:手術後、ウサギは集中治療室の保育器で1日間綿密に観察され、その後、自宅のケージに移されました。 - 5 mg / kgのトラマドールと3 mg / kgのケトプロフェンで術後の痛みを管理し、皮下注射で抗生物質(4 mg / kgゲンタマイシン)を1日2回3日間投与します( 材料表を参照)。
注:術後の疼痛管理は、獣医およびIACUCガイドライン(例:オピオイド、NSAID、局所麻酔薬または併用)に準拠する必要があります。 - 0.5%コレステロールが豊富な食事に50,000UのビタミンD2(HC + VitD2)を8週間与えます。
4.心エコー検査
- バルーン損傷の8週間後、ステップ2.1で説明したのと同じ手順でウサギに麻酔をかけます。
- 2次元経胸壁図を用いて大動脈弁を可視化し、Mモード画像を短軸図と長軸図で記録します。
- ウサギをエコーテーブルの仰臥位に置きます。
- バリカンと脱毛クリームを使用して胸の部分を剃ります。
- 超音波トランスデューサージェル( 材料表を参照)を胸部に塗布します。
- トランスデューサーを調整して、大動脈弁の胸骨傍長軸図と胸骨傍短軸図を取得します。
- Mモードイメージングを使用して、大動脈弁の画像を長軸と短軸の両方で記録し、後で分析するために画像を保存します。
5.組織学的分析
- 心エコー検査後、塩化カリウム(KCl、3 g / 20 mL、1 mL)の静脈内注射を投与してウサギを安楽死させます。.
- 胸腔を開き、上行大動脈7で心臓を採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で氷の上に置きます。
- 直ちに心臓を4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に浸し、パラフィンブロックに埋め込みます( 材料表を参照)。
- パラフィンが埋め込まれた心臓ブロックをミクロトームを使用して厚さ4 μmの切片に切断し、その切片をMassonのトリクローム(MT)、Alizarin Red、およびvon Kossa(材料表を参照)で染色して、コラーゲンの沈着と弁の石灰化をそれぞれ評価します8,9。
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Representative Results
大動脈弁損傷によるウサギAVSモデル
ウサギAVSモデルを誘導するために、体重3.5〜4.0kgの雄のNZWウサギをこの研究に使用しました。ステップ2(図2)で説明した外科的処置によると、AVSモデルは大動脈弁損傷によって確立され、その結果、機械的大動脈弁の変性と石灰化が起こりました。対照群には、0.5%コレステロールが豊富な食事(高コレステロール、HC)と50,000UのビタミンD2(VitD2)を与えられたウサギが含まれていました。
大動脈弁の評価
大動脈弁の構造変化を評価するために、弁尖の可動性と厚さを心エコー検査の短軸図と長軸図を使用して評価しました。大動脈弁損傷から8週間後、心エコー検査の結果、HC + VitD2飼料を給餌した傷ついたウサギは、野生型(WT)ウサギを含む対照ウサギと、弁損傷のないHC + VitD2飼料を与えられたウサギと比較して、尖頭が肥厚し、運動が制限されていることが明らかになりました(図3)。
組織学的分析
大動脈弁の組織学的変化を評価するために、大動脈弁損傷後8週間でウサギを屠殺し、切除した心臓で組織学的解析を行いました(図4)。 図4Aに示すように、マッソントリクローム(MT)で染色された大動脈弁は、WTおよびHC + VitD2食事誘発群と比較して、損傷群の大動脈弁尖の厚さの増加を示しました。さらに、バルブラカルシウム沈着の程度を比較するために、 図4B、Cに示すように、Alizarin Red染色とvon Kossa染色を実施しました。HC + VitD2ダイエット誘発群は弁尖にごくわずかなカルシウム沈着を示しましたが、バルーン損傷群では有意な石灰沈着が観察されました。
図1:実験タイムラインのスキーム。 大動脈弁狭窄症のウサギモデルは、ニュージーランド白(NZW)の雄ウサギ(3.5〜4.0 kg)の大動脈弁の直接バルーン損傷によって確立され、続いて高コレステロール/ビタミンD2食(0.5%コレステロールが豊富な食餌+ 50,000 UのビタミンD2;HC + VitD2)を8週間投与します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:手術手順の概要 。 (A)麻酔下で、ウサギを手術台の上で仰臥位にしました。(B)左総頸動脈(LCCA)は、皮膚と筋肉を慎重に分離して露出させた。(C)4-FシースとガイドワイヤーをLCCAに挿入しました。赤い矢印:シース;黄色の矢印:ガイドワイヤー。(D)バルーンカテーテルをガイドワイヤーを介して大動脈弁に導入した。赤い矢印:バルーンカテーテル。(E、F)バルーンカテーテルを膨らませ、Cアーム透視ガイド下で左心室頂点と出口の間を前進/引き戻しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:大動脈弁狭窄症の心エコー検査。 心エコー図における長軸(上段)と短軸(中段)の代表画像、およびWT(n = 3)、HC + VitD2ダイエット(n = 3)、および弁損傷を伴うHC + VitD2ダイエット(n = 3)群における弁狭窄症(下段)の程度の概略図。点線の円:大動脈弁;赤い矢じり:厚くなったリーフレット。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:大動脈弁の組織学的分析。 弁損傷群のWT、HC + VitD2-ダイエット、およびHC + VitD2-ダイエットにおける(A)Massonのトリクローム、(B)Alizarin Red、および(C)von Kossa染色の代表的な画像。青い矢じり:厚くなったリーフレット。赤い矢じり:石灰化したリーフレット。スケールバー = 1 mm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
動物AVSモデルは、AVSの開始と進行を含むAVSの病理学的側面を研究するために一般的に使用されます。このプロトコルは、大動脈弁への直接バルーン損傷によって誘発される新しいウサギAVSモデルを導入します。この研究では、大動脈弁損傷モデルで有意な弁尖肥厚と石灰化が示されました。栄養補助食品によって誘発された軽度のAVSモデルと比較して、直接バルーン損傷モデルの大動脈弁は選択的に損傷し、尖端の肥厚と運動の制限、および肥厚と石灰化の原因となりました。これらの結果は、AVS10,11の一般的な特性と一致しています。
栄養補助食品と遺伝子操作によって誘発される一般的に使用されるAVSウサギモデルには、実験的研究でいくつかの制限があります12,13,14。ウサギモデルにおける著しい狭窄の発症は、マウスよりも長い給餌期間を必要とすることが多く、重大な炎症や肝毒性を引き起こす可能性があります。さらに、これらのモデルにおける高コレステロール血症食やVitD2などの栄養補助食品は、常に一貫した有意な弁狭窄症を誘発するわけではありません。比較すると、このプロトコルに記載されている直接バルーン損傷は、操作された大動脈弁尖に機械的損傷を引き起こし、それによって再現性のあるリモデリング応答を特異的に誘発する可能性があります。さらに、このプロトコルは、傷害強度を調整することにより、AVSの重症度を操作することを可能にします。私たちの知る限り、ウサギモデルにおける大動脈弁に対する機械的損傷の影響がin vivoで検証されたのはこれが初めてです。
これらの利点にもかかわらず、このプロトコルには、一貫性と再現性のあるAVSモデルを誘導する上で制限があります。まず、外科的処置には、動物モデルでの多くの手術経験が必要です。第二に、傷害の強さや栄養補助食品の期間など、AVSの重症度を最適化するための詳細な条件を確立する必要があります。第三に、このプロトコルは、バルーン損傷のみの効果に関する情報を提供する能力が限られています 大動脈弁狭窄症に対するバルーン損傷のみ この研究は、コレステロールが豊富な食事と組み合わせたバルーン損傷の影響のみを調査しました。コレステロールを多く含む食事をとらずにバルーン損傷を受けたグループを含めることは有益であり、今後の研究のために検討します。それにもかかわらず、この研究は、ウサギモデルにおける大動脈弁の直接バルーン損傷のための新しいプロトコルを示しており、AVSの根底にある病理学的メカニズムの研究に有用であり、治療オプションの開発に使用できる可能性があります。
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Disclosures
著者は、この作品で宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
本研究は、韓国政府(MSIT)の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)(No.2020R1A4A3079570)、教育部(No.2021R1I1A1A01051425)、大韓民国の産業通商資源部が資金提供する産業戦略技術開発計画(No.20014873)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
References
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