Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir die technischen Verfahren zur Erzeugung von braunem Fettgewebe (BAT)-spezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems. Die beschriebenen Schritte umfassen das Design der sgRNAs, die Herstellung der AAV-sgRNA-Partikel und die Mikroinjektion von AAV in die BAT-Lappen.
Abstract
Braunes Fettgewebe (BAT) ist ein auf Energiedissipation spezialisiertes Fettdepot, das über die Sekretion bioaktiver Moleküle auch als endokrines Organ dienen kann. Die Züchtung von BVT-spezifischen Knockout-Mäusen ist einer der populärsten Ansätze, um den Beitrag eines Gens von Interesse zur BVT-vermittelten Energieregulation zu verstehen. Die konventionelle Gen-Targeting-Strategie unter Verwendung des Cre-LoxP-Systems war der Hauptansatz, um gewebespezifische Knockout-Mäuse zu erzeugen. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändig und mühsam. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für den schnellen und effizienten Knockout eines Gens, das für BAT von Interesse ist, unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Single-Guide-RNA (sgRNA)-Systems. Die BAT interscapularis befindet sich in der tiefen Schicht zwischen den Muskeln. Daher muss die BVT freigelegt werden, um die AAV präzise und direkt in die BVT innerhalb des Gesichtsfeldes zu injizieren. Eine angemessene chirurgische Behandlung ist entscheidend, um Schäden an den sympathischen Nerven und Gefäßen zu vermeiden, wie z. B. der Sultzer-Vene, die mit dem BAT verbunden ist. Um Gewebeschäden zu minimieren, ist es von entscheidender Bedeutung, die dreidimensionale anatomische Lage des BVT und die chirurgischen Fähigkeiten, die in den technischen Schritten erforderlich sind, zu verstehen. Dieses Protokoll hebt die wichtigsten technischen Verfahren hervor, einschließlich des Designs von sgRNAs, die auf das interessierende Gen abzielen, der Herstellung von AAV-sgRNA-Partikeln und der Operation für die direkte Mikroinjektion von AAV in beide BAT-Lappen zur Erzeugung von BVT-spezifischen Knockout-Mäusen, die breit angewendet werden können, um die biologischen Funktionen von Genen in BAT zu untersuchen.
Introduction
Adipositas nimmt weltweit deutlich zu und führt zu einem breiten Spektrum von Stoffwechselerkrankungen 1,2,3. Das Fettgewebe ist der Schlüssel zu diesen Pathologien. Die beiden funktionell unterschiedlichen Arten von Fettgewebe, die es gibt, sind weißes Fettgewebe (WAT), das überschüssige Kalorien speichert, und braunes Fettgewebe (BAT) und das damit verbundene beige/britische Fett, das Energie für die Thermogenese abführt. Während BAT für seine energieableitende Funktion anerkannt ist, hat es auch endokrine Funktionen durch die Produktion bioaktiver Moleküle, die den Stoffwechsel in distalen Organen regulieren 4,5. Zahlreiche Studien an Nagetieren haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Menge oder Aktivität von braunem oder beigem Fett zu einem erhöhten Energieverbrauch und einer verbesserten Insulinsensitivität führt. Beim Menschen haben Menschen mit nachweisbarer BAT eine signifikant geringere Prävalenz von kardiometabolischen Erkrankungen6. Somit birgt BAT ein ausgezeichnetes therapeutisches Potenzial für Adipositas-bedingte metabolische Folgeerkrankungen 7,8,9.
Um die Physiologie und Pathophysiologie der BAT-Entwicklung und -Funktion zu untersuchen und die molekularen Mechanismen aufzuklären, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist das BVT-spezifische transgene Mausmodell eine Methode der Wahl10. Das Cre-LoxP-Rekombinationssystem ist die am häufigsten verwendete Methode, um bedingte Knockout-Mäuse durch Editierung des Mausgenoms zu erzeugen. Dieses System hat die Modifikation (Überexpression oder Knockout) von Genen von Interesse auf gewebe-/zellspezifische Weise ermöglicht11. Es kann auch verwendet werden, um einen bestimmten Zelltyp zu markieren, indem ein selektives fluoreszierendes Reportergen exprimiert wird.
In jüngster Zeit wurde der Cre-LoxP-Systemansatz durch die Kombination der CRISPR-Cas9-Technologie und des Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems weiterentwickelt12. Das CRISPR-Cas9-System ist ein spezifisches und effizientes Werkzeug zur Genom-Editierung, um bestimmte Regionen des Genoms zu modifizieren, zu regulieren oder gezielt anzusprechen13. Die CRISPR-Cas9-basierte Genom-Editierung ermöglicht eine schnelle genetische Manipulation genomischer Loci, da sie keine homologe Rekombination mit einem Gen-Targeting-Vektor erfordert. Kombinierte Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und AAV-sgRNA-Techniken ermöglichen es Forschern, Genfunktionen genauer zu verstehen, indem sie die Untersuchung der Rolle von Genen von Interesse zu gewünschten Zeitpunkten in Geweben/Zellen ermöglichen. Darüber hinaus reduzieren diese kombinierten Techniken den Zeit- und Arbeitsaufwand für die Erzeugung transgener Mäuse und ermöglichen die zeitliche Kontrolle der CRISPR-Cas9-Aktivität für die induzierbare Genom-Editierung in Mäusen, wenn eine induzierbare Cre-Linie verwendet wird14.
AAV-Vektoren sind sichere und effektive In-vivo-Gentransfersysteme. AAVs, die auf Fettgewebe abzielen, hinken jedoch der Anwendung in anderen Geweben wie Gehirn, Herz, Leber und Muskel hinterher15. Aufgrund der relativ geringen Transduktionseffizienz und des Tropismus mit natürlich vorkommenden Serotyp-Vektoren ist der AAV-gesteuerte Gentransport in das Fettgewebe nach wie vor eine Herausforderung15. In den letzten 5 Jahren haben wir und andere erfolgreich effektive und minimalinvasive Wege etabliert, um AAV-gesteuerte Gene in das Fettgewebe einzuschleusen, und Mausmodelle erstellt, die es uns ermöglichen, ein Verständnis der Gene zu erlangen, die an der Regulation der BAT-Funktion beteiligt sind16,17,18,19. Zum Beispiel haben wir durch die Verwendung von AAV8 zur Einschleusung von sgRNA, die auf Alox12 abzielt, die für 12-Lipoxygenase (12-LOX) kodiert, in die BAT der Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse entdeckt, dass aktivierte BAT 12-LOX-Metaboliten produziert, nämlich 12-Hydroxy-Eicosapentaensäure (12-HEPE) und 13R, 14S-Dihydroxydocosahexaensäure (Maresin 2), um den Glukosestoffwechsel zu regulieren bzw. Adipositas-assoziierte Entzündungen zu beheben16. 17. Der Teufel Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zu den technischen Verfahren zur Verfügung, insbesondere zur Operation zur direkten Mikroinjektion von AAV-sgRNA in die BAT-Lappen, um BAT-spezifische Knockout-Mäuse mit dem kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und AAV-sgRNA-System zu erzeugen.
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Protocol
Alle Tierversuche und Pflegeverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Joslin Diabetes Center genehmigt.
1. Screening effektiver sgRNAs in kultivierten Zellen
HINWEIS: Um den Assay kostengünstig zu gestalten, empfehlen wir, vor dem Verpacken der sgRNAs in AAV-Partikel verschiedene sgRNAs in kultivierten Zellen über ein Lentivirus-basiertes System auf Cas9/sgRNA-Expression zu testen (Abbildung 1) und die sgRNAs auszuwählen, die die höchste Knockdown-Effizienz für In-vivo-Experimente bieten.
- CRISPR-Cas9 sgRNA-Design
- Entwerfen Sie sgRNAs mit Online-Werkzeugen, wie z. B. dem Broad sgRNA-Design-Tool (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, dem CRISPOR-Online-Tool (http://crispor.tefor.net/)22 und anderen verfügbaren Tools.
- Geben Sie Gennamen oder DNA-Zielsequenzen in das Feld Genname ein und wählen Sie NGG als Protospacer-benachbartes Motiv (PAM) für SpCas9 aus, um potenzielle sgRNA-Sequenzen zu generieren.
- Wählen Sie die sgRNAs mit hoher vorhergesagter On-Target-Effizienz und geringer Off-Target-Aktivität aus. So werden beispielsweise sgRNAs mit einem Spezifitätswert von mindestens 50 auf dem CRISPOR-Output empfohlen. Wählen Sie unter den spezifischen sgRNAs, die den Filter passieren, diejenigen mit hohen Effizienzwertenaus 23.
HINWEIS: Im Allgemeinen werden drei oder vier sgRNAs ausgewählt, um die Identifizierung effektiver sgRNAs zu gewährleisten.
- Aufbau des CRISPR-Cas9 sgRNA-Plasmids
- Synthese von sgRNA-Oligopaaren, die für 20 Nukleotide (nt) mit Überhängen (sowohl 5' als auch 3') von der BsmBI-Restriktionsstelle (Tabelle 1) kodieren, über eine DNA-Syntheseplattform.
- Ligatgeglühte Oligopaare mit BsmBI-linearisiertem lentiCRISPR v2-Vektor.
- Transformieren Sie das Ligationsprodukt in den Stbl3 E. coli-Stamm und bestätigen Sie die sgRNA-Insertionen durch Sanger-DNA-Sequenzierung unter Verwendung des U6-Forward-Primers.
HINWEIS: Siehe das detaillierte Klonierungsverfahren im Addgene-Protokoll mit dem Titel LentiCRISPRv2 und lentiGuide-Puro: lentivirales CRISPR/Cas9 und Single Guide RNA24.
- Produktion von lentiviralen Partikeln
- Ca. 24 h vor der Transfektion 7 x 105 HEK-293-Zellen in 4 ml komplettem Nährmedium in eine 6 cm große Gewebekulturplatte legen.
- Fügen Sie 15 μl LT1-Transfektionsreagenz zu 250 μl serumfreiem Medium hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie für jede sgRNA einen Transfektionscocktail gemäß Tabelle 2 in 250 μl serumfreiem Medium vor. Das in Schritt 1.3.2 hergestellte Transfektionsreagenz wird mit dem Plasmidcocktail vermischt und 20-30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
- Ersetzen Sie das gesamte Nährmedium durch 3,5 ml frisches Nährmedium für HEK-293-Zellen und geben Sie dann die DNA-Transfektionsreagenzmischung tropfenweise zu den HEK-293-Zellen, die in den 3,5 ml frischem Nährmedium kultiviert wurden.
- Wechseln Sie nach 12-15 Stunden Transfektion das Medium, um das Transfektionsreagenz zu entfernen, und ersetzen Sie es durch 4 ml frisches Nährmedium.
- Sammeln Sie nach 24 Stunden Inkubation das Zellkulturmedium, das lentivirale Partikel enthält, und filtern Sie das Medium durch einen 0,45-μm-Filter, um alle HEK-293-Zellen zu entfernen. Die Viren können einige Tage bei 4 °C gelagert werden. Für die Langzeitlagerung sollten die Viren bei −80 °C eingefroren werden.
HINWEIS: Befolgen Sie bei der Herstellung von lentiviralen Partikeln die Biosicherheitsrichtlinien und arbeiten Sie in einer Umgebung (z. B. BL2+), die für den Umgang mit Lentiviren geeignet ist. Siehe das detaillierte Verfahren zur Herstellung von Lentiviren im Protokoll von Addgene mit dem Titel pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
- Infektion brauner Präadipozyten und Bestimmung des sgRNA-vermittelten Knockdowns
- Platte 1 x 10: 6 Maus-immortalisierte braune Präadipozyten in 1 ml frischem Medium mit 8 μg/ml Polybren pro Well in einer 6-Well-Platte.
HINWEIS: In dieser Studie wurden die immortalisierten braunen Präadipozyten mit SV40 T-Antigen25 erzeugt. Braune Präadipozyten werden in DMEM mit hohem Glukosegehalt und 10% FBS kultiviert. - Fügen Sie 1 ml lentivirale Partikellösung aus Schritt 1.3 hinzu, um die Zellen zu infizieren. Halten Sie parallel einen nicht infizierten Zelltopf bereit, der als Kontrolle der Antibiotikaauswahl dient.
- 24 Stunden nach der Infektion auf frisches Medium umstellen. Geben Sie die entsprechenden Antibiotika (z. B. Puromycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml) in das Medium, um die nicht infizierten Zellen abzutöten, und wählen Sie die infizierten Zellen aus. Wechseln Sie jeden zweiten Tag zu frischem Medium, das das ausgewählte Antibiotikum enthält, bis alle nicht infizierten Kontrollzellen abgestorben sind.
- Sammeln Sie Protein aus den virusinfizierten Zellen und bestimmen Sie die Knockdown-Effizienz der sgRNAs durch Western-Blot-Analyse. Befolgen Sie die detaillierte Western-Blotting-Prozedur in Eslami und Lujan26. Aufgrund der unterschiedlichen Fluktuationsrate zwischen Proteinen sollten Sie mehrere Zeitpunkte testen (z. B. von Tag 6 bis Tag 12 nach der Virusinfektion), um den Verlust des Proteinsignals zu beobachten.
HINWEIS: Wenn kein Antikörper verfügbar ist, der das von dem interessierenden Gen kodierte Protein erkennt, kann alternativ die Sanger-Sequenzierung verwendet werden, um die Genom-Editing-Effizienz jeder sgRNA zu bestimmen. Kurz gesagt, amplifizieren Sie die genomische DNA mit Primern, die die sgRNA-Zielregion flankieren, um PCR-Amplikons mit einer Länge von ~700 bp zu erzeugen. Die projizierte Bruchstelle sollte vorzugsweise ~200 bp stromabwärts von der Startstelle der Sequenzierung liegen. Anschließend wird das PCR-Produkt einer Sanger-Sequenzierung unterzogen. Analysieren Sie die Sequenzierungsergebnisse mit den Online-Werkzeugen, wie z. B. Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), um die Häufigkeit kleiner Indels zu bestimmen, die von jeder sgRNA in einem Zellpool erzeugtwerden 27.
- Platte 1 x 10: 6 Maus-immortalisierte braune Präadipozyten in 1 ml frischem Medium mit 8 μg/ml Polybren pro Well in einer 6-Well-Platte.
2. Aufbau des AAV-sgRNA-Plasmids
HINWEIS: In diesem Schritt werden die effektiven sgRNAs, die im obigen Screening identifiziert wurden, in den pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP-Vektor28 kloniert (Abbildung 2). In der Zwischenzeit wird auch eine nicht-zielgerichtete sgRNA (z. B. TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29), die keine Sequenz im Mausgenom erkennt, in denselben Vektor kloniert, um als nicht-editierte Kontrolle zu dienen.
- Linearisieren Sie das pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP-Rückgrat unter Verwendung von BbsI, das identische Überhänge mit synthetisierten sgRNA-Oligos erzeugt.
- Ligatieren Sie die getemperten Oligopaare mit linearisiertem pAAV-Vektor und bestätigen Sie die sgRNA-Insertionen, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
HINWEIS: Das Klonierungsverfahren für lentiCRISPRv2-sgRNA wird auch für die AAV-sgRNA-Plasmidkonstruktion angewendet.
3. AAV-Verpackungen
- Packen Sie die in Abschnitt 2 generierten AAV-Vektoren in den AAV-Serotyp 8. Bereiten Sie AAV mit hohem Titer gemäß einem früheren Protokoll30 vor oder fordern Sie einen AAV-Verpackungsservice von viralen Kernen oder kommerziellen Diensten an. Verdünnen Sie den Virustiter auf 1 x 1013 Genomkopien/ml.
HINWEIS: Das modifizierte AAV2-Genom, das eine sgRNA exprimiert, wird in den AAV-Serotyp 8 verpackt. Dieser Serotyp wurde aufgrund seiner hohen Effizienz für Fettgewebe ausgewählt18,31. Um eine Immunantwort zu verhindern, die durch Verunreinigungen wie Zelltrümmer und kleine Mengen mittlerer Komponenten induziert wird, wird hochgereinigtes AAV für die In-vivo-Injektion benötigt. Die Ultrareinigung kann durch Iodixanolgradienten und Ultrazentrifugation30 erreicht werden.
4. Präparation von Ucp1 Cre/Cas9 Mäusen
- Kaufen Sie den Mausstamm Ucp1-Cre (siehe Materialtabelle), der die Cre-Rekombinase exprimiert, unter der Kontrolle des Ucp1-Promotors. Homozygote Rosa26-floxed STOP-Cas9 knock-in Mäuse32 (siehe Materialtabelle), in denen die Expression von Cas9 Cre-Rekombinase-abhängig reguliert ist.
- Kreuzen Sie diese Stämme, um Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse zu erzeugen, wie zuvor beschrieben16,17. Halten Sie alle Mäuse in einem Raum mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit (23 °C, 30 % Luftfeuchtigkeit) in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an um 6:30 Uhr; Licht aus um 18:30 Uhr) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
- Die resultierenden Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse werden mit AAVs behandelt, die entweder Kontroll-sgRNA oder sgRNA tragen, die auf das interessierende Gen abzielt, und zwar mit der unten beschriebenen Methode. In dieser Studie wurden 12-15 Wochen alte männliche Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 30 g verwendet.
5. Operation zur AAV-Injektion in die BVT bei Mäusen
- Betäuben Sie die Mäuse mit kontinuierlicher Inhalation von 2,5 % Isofluran zur Induktion und Erhaltung.
- Schmieren Sie beide Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Anschließend werden den Mäusen Analgetika (Banamin, 2,5 mg/kg Körpergewicht [KG], subkutane Injektion, siehe Materialtabelle) verabreicht, um postoperative Schmerzen und Leiden zu minimieren und zu verhindern.
- Rasieren Sie das Mausfell im Zwischenkappelbereich mit einem Rasierer und sterilisieren Sie den Operationsbereich mit mindestens drei abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis, gefolgt von 70% Ethanol. Legen Sie dann sterile chirurgische Abdecktücher um die Einschnittstelle an.
- Schneiden Sie die Haut zwischen den Schulterblättern mit einem Skalpell ein (Abbildung 3A-B) und ziehen Sie dann die rasierte Haut ab, um das Fettgewebe am Hals mit einer chirurgischen Schere freizulegen (Abbildung 3C-D). Die Größe des Schnittes hängt von der Körpergröße ab, aber im Allgemeinen sollte der Schnitt etwa 2 cm betragen, um das Fettgewebe im Zwischenkreisblatt freizulegen.
- Schneiden Sie das Fettgewebe an der Grenze zwischen der distalen Region des Fettgewebes und den Muskeln mit einem einzigen Schnitt ab (Abbildung 3E-F). Die Größe des Schnittes sollte ca. 1 cm betragen, um nur den Eingang für das Einführen der chirurgischen Schere zum stumpfen Peeling des Fettgewebes zu öffnen.
- Ziehen Sie mit der dominanten Hand das Fettgewebe stumpf und vertikal mit einer chirurgischen Schere ab, um die BVT freizulegen, während Sie das Fettgewebe, einschließlich der BVT, mit der nicht dominanten Hand einklemmen (Abbildung 3G). Verwenden Sie die Sultzer-Ader als Orientierungspunkt, um die genaue BAT-Position anzugeben.
ANMERKUNG: Die BVT in Abbildung 3H wurde zum Zwecke einer Bilddemonstration vollständig belichtet. Eine übermäßige Dissektion kann zu einer Schädigung der Nerven des umgebenden BVT führen. Eine falsche Ausrichtung der Schere kann die umliegenden Muskeln und die Sultzer-Vene verletzen und die BVT entleeren und zu übermäßigen Blutungen führen. - Injizieren Sie für jede Maus langsam 40 μl AAV in beide BAT-Lappen (20 μl pro Lappen des BVT) mit einer scharfen Nadel (32 G, siehe Materialtabelle), die mit einer Hamilton-Spritze verbunden ist (100 μl, siehe Materialtabelle; Abbildung 3I). Überprüfen Sie, ob die Injektion erfolgreich war, da während der AAV-Verabreichung keine Leckagen aus der injizierten Stelle vorhanden sind.
ANMERKUNG: Die Fledermaus in Abbildung 3I wurde zum Zwecke einer Bilddemonstration vollständig belichtet. Das Volumen der AAV-Lösung, die in einen BAT-Lappen verabreicht werden soll, wird durch die Größe des BVT der Empfängermaus bestimmt. Wir haben festgestellt, dass 20 μl AAV-Lösung für einen BAT-Lappen mit einem Gewicht von ca. 0,05 g in einer normalen C57BL6/J-Maus mit einem Gewicht von 30 g geeignet sind. Falls erforderlich, muss die virale Lösung möglicherweise konzentriert werden, um das gewünschte Volumen zu erreichen. - Vergewissern Sie sich, dass keine Blutung aus dem injizierten BVT oder dem umgebenden Gewebe erfolgt. Mit Wasserstoffperoxidlösung getränkte Gaze (siehe Materialtabelle) zur Hämostase auf eine Blutungsstelle drücken.
- Bringen Sie das freiliegende Fettgewebe wieder in seine normale Position. Nähen Sie den Rand des Fettgewebes und der Muskeln mit einem resorbierbaren 5-0-Monofilamentfaden (Abbildung 3J). Vernähen Sie die offene Haut mit 5-0 beschichteten ungefärbten geflochtenen Fäden (Abbildung 3K-L).
Anmerkungen: Abbildung 4 beschreibt die Schritte zum Nähen des geschälten Fettgewebes und der Muskeln. - Halten Sie die Tiere nach der Operation bis zur vollständigen Genesung auf einem Heizkissen. Bieten Sie den Tieren Zugang zu Futter, Wasser und ausreichend Einstreu zum Nisten. Überwachen Sie sie regelmäßig auf Anzeichen von Stress oder Krankheit für 7 Tage der Genesung vor Beginn des Experiments.
- Bestätigen Sie die Effizienz der gezielten Gendeletion durch Western-Blot-Analyse in der von Mäusen präparierten BAT, wie in Sugimoto et al.16.
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Representative Results
Bei den oben genannten Verfahren ist die präzise Abgabe von AAV-sgRNA an die BVT entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Um die Wirkung der AAV-sgRNA zu maximieren und die Gewebeschädigung während der Operation zu minimieren, ist es wichtig, die dreidimensionale (3D) anatomische Lage des BVT zu verstehen. Wie in Abbildung 3E dargestellt, ist es schwierig, die genaue Position der BVT zu identifizieren, ohne das Gewebe freizulegen. Eine übermäßige BVT-Exposition kann jedoch das Gewebe schädigen (Abbildung 3H, I). Daher sollte das Verfahren durchgeführt werden, um die AAV-Lösung innerhalb eines begrenzten anatomischen Raums zu injizieren (Abbildung 3G). Abbildung 5A ist entscheidend, um den Erfolg der AAV-Injektion und die schnelle Genesung der Mäuse nach der Operation zu gewährleisten. Abbildung 5B-D zeigt mögliche Fehler, die zu erfolglosen Injektionen führen können. Dazu gehören die Injektion der AAV-Lösung in die falsche Region (Abbildung 5B), das Eindringen der Nadel durch das Gewebe (Abbildung 5C) und das Aufblähen des Gewebes aufgrund eines übermäßigen Volumens der AAV-Lösung (Abbildung 5D). Schließlich muss die Knockdown-Effizienz des interessierenden Gens anhand der Proteinkonzentrationen in der BVT überprüft werden, die von den injizierten Mäusen seziert wurde16. So zeigen beispielsweise die Proteinkonzentrationen von 12-LOX in der BAT, gemessen mittels Western Blot, einen effizienten Knockdown, da AAV8 sgRNA, die auf Alox12 (das Gen, das für 12-LOX kodiert) abzielt, in die BAT von Ucp1-Cre/Cas9-Mäusen einschleust (siehe Abbildung 7b in der zuvor veröffentlichten Studie16).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des lentiviralen Plasmids, das Cas9 und sgRNA exprimiert. Lentiviraler Expressionsvektor für Cas9 und sgRNA (lentiCRISPRv2). Abkürzungen: Puro = Puromycin-Selektionsmarker; psi+ = psi-Verpackungssignal; RRE = Element der Drehzahlantwort; cPPT = zentraler Polypurintrakt; EFS = Elongationsfaktor-1α kurzer Promotor; P2A = 2A selbstspaltendes Peptid; WPRE = posttranskriptionelles regulatorisches Element; LTR = lange Terminalwiederholung. LentiCRIPSRv2 kann mit BsmBI verdaut werden, und ein Paar getemperter sgRNA-Oligos kann in das Single-Guide-RNA-Gerüst kloniert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des AAV-Plasmids, das sgRNA exprimiert. Der AAV-Vektor für sgRNA. Abkürzungen: ITR = I terminal repeat; CB = hybrider CMV-Enhancer/β-Aktin-Promotor. pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP kann mit Hilfe von BbsI verdaut werden, und ein Paar getemperter sgRNA-Oligos kann in das Single-Guide-RNA-Gerüst kloniert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Sequenzielle Chirurgie zur AAV-Injektion in die bilateralen BAT-Lappen bei Mäusen. Eine anästhesierte Maus wurde den folgenden Verfahren unterzogen: (A-B) Schneiden der rasierten Haut, (C-D) stumpfes Abziehen der rasierten Haut, (E-F) Schneiden des Fettgewebes, (G) stumpfes Abschälen des Fettgewebes, (H-I) Injektion der AAV-Lösung in die BAT-Lappen mit einer Hamilton-Spritze, (J) Nähen zwischen Fettgewebe und Muskel und (K-L) zwischen beiden Hautlappen. Hinweis: In den Tafeln (H) und (I) ist der Sultzer-Erzgang ein Orientierungspunkt, der die genaue Position des BVT bestätigt. Die BVT in diesen beiden Tafeln wurde zur Bilddemonstration vollständig belichtet. Die gelb gestrichelten Linien zeigen die Grenze zwischen Fettgewebe und Muskeln in Tafel E und der Nadelspitze (d.h. der Injektionsstelle) in Tafel I. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Schritte zum Nähen des geschälten Fettgewebes und der Muskeln . (A) Führen Sie einen Nadelfaden in das geschälte Fettgewebe ein, um es zu injizieren, (B) dringen Sie in das Fettgewebe ein, (C) haken Sie einen Muskel ein, (D) ziehen Sie einen Faden nach oben, um das geschälte Fettgewebe und den geschälten Muskel zu nähen, und ligieren Sie dann die Fäden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5. Repräsentative Bilder von geeigneten und ungeeigneten Methoden der AAV-Injektion in die BAT-Lappen bei Mäusen. (A) Diese Abbildung stellt die vorgeschlagene AAV-Injektion dar, bei der ein einseitiger BVT-Lappen eine Injektion von 20 μl AAV-Lösung erhält. (B-D) Die folgenden Methoden der AAV-Injektion können zum Scheitern führen. (B) Falsche Injektionsstelle (d. h. Fehlen der BVT-Lappen); (C) die Nadel dringt durch das Gewebe ein; und (D) Gewebeballbildung aufgrund einer großen Menge AAV-Lösung, bei der ein einseitiger BAT-Lappen eine 80-μl-Injektion von AAV-Lösung erhält. Die gelb gepunkteten Kreise zeigen die Nadelspitze (d.h. die Injektionsstelle) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Vorwärts-Oligo: 5' CACC-20bp gRNA-Sequenz-3' |
| Reverses Oligo: 5' AAAC-20bp gRNA Reverse-Komplement-Sequenz-3' |
| Wenn die Zielsequenz z. B. TCTGATAGCGTAGGAGTGAT ist, wären die Oligos: |
| Vorwärts-Oligo: 5' CACC TCTGATAGCGTAGGAGTGAT 3' |
| Umgekehrtes Oligo: 5' AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3' |
Tabelle 1: Beispiel für sgRNA-Design. Beispiel für eine sgRNA-Sequenz mit Überhängen, die der BsmBI-Restriktionsstelle entsprechen.
| Name des Materials | Firma | Katalognummer | Menge |
| lentiCRISPER v2 Plasmid | Addgene | #52961 | 5 μg |
| psPAX2-Verpackungsplasmid | Addgene | #12260 | 3,75 μg |
| pMD2.G Hüllplasmid | Addgene | #12259 | 1,5 μg |
| OPTI-MEM serumfreies Medium | Invitrogen | #31985 | 250 μl |
Tabelle 2: LentiCRISPR. Plasmidcocktail für die Transfektion der sgRNA mit dem LentiCRISPRv2-Plasmid in HEK-293-Zellen zur Herstellung des CRISPR-sgRNA-Lentivirus.
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Discussion
Die existierenden veröffentlichten Methoden für den AAV-vermittelten Gentransfer in den interscapularären BAT enthalten keine detaillierten Bilder und Videos, die die Operationstechniken und den Ansatz für die direkte AAV-Injektion in den BVT beschreiben. Bei den meisten publizierten Methoden33,34 wird das AAV in das Fettgewebe injiziert, das die interscapularäre BAT umgibt, und nicht in die BVT selbst. Daher gibt es mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, die den Erfolg der Studie bestimmen. Dazu gehören das Design der sgRNA, die AAV-Verpackung und -Konzentration, die Generierung der BAT-spezifischen Cas9-Mäuse und die chirurgischen Eingriffe. Sorgfältige und hervorragende chirurgische Fähigkeiten sind erforderlich, um die In-vivo-Verfahren durchzuführen. Insbesondere die Minimierung der Gewebeschädigung bei der Freilegung der BVT und der Verabreichung der AAV ist von entscheidender Bedeutung. Aufgrund mehrerer genetischer und umweltbedingter Faktoren, wie z. B. Haltungstemperatur, Bewegungstraining und Ernährung, kann die Menge an weißem Fett, die die BVT umgibt, und die Zusammensetzung der BVT selbst von Tier zu Tier variieren. Zum Beispiel zeigen fettleibige Mäuse ein riesiges weißes Fettgewebe, das den BAT umgibt, und Mäuse, die bei Thermoneutralität (30 °C) untergebracht sind, weisen eine aufgehellte BAT auf. Daher ist es schwierig, die 3D-Position des BVT genau zu bestimmen, ohne die Haut zu öffnen. Die minimale Aufdeckung der BVT ist ein schwieriger, aber entscheidender Schritt für die AAV-Injektion. Eine übermäßige Exposition der BVT während dieses Verfahrens kann zu schweren Schäden an den sympathischen Nerven und Gefäßen führen, insbesondere an der Sultzer-Vene, die mit dem BVT verbunden ist.
Bemerkenswert ist, dass auch das Volumen des in das Gewebe injizierten AAV ein limitierender Faktor für den Erfolg ist. Ein übermäßiges Volumen der Lösung kann für die Zellen schädlich sein und eine effiziente Virusinfektion beeinträchtigen, um die sgRNA in die Adipozyten einzuschleusen. Da die BVT-Größe mit Alter, Geschlecht und genetischem Hintergrund der Empfängermäuse variiert, können Optimierungsexperimente erforderlich sein16,17. Neben dem Ausschalten von Genen von Interesse kann diese Technik auch auf die Überexpression von Genen von Interesse angewendet werden.
Ein potenzieller Fallstrick dieser Technik ist die geringe Effizienz des Gen-Knockouts mit einer sgRNA in vivo, selbst bei sgRNAs, die in vitro einen effizienten Knockout bieten. Als mögliche Lösung kann die Kombination von zwei oder mehr einzigartigen sgRNAs in einer einzigen Injektion die Effizienz des Gen-Knockdowns in vivo verbessern.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die kombinierten Ucp1-Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und AAV-sgRNA-Technologien ein robustes und effizientes System zur Erzeugung von Mäusen mit BAT-spezifischer Genmanipulation bieten. Diese Methode kann unter Verwendung ausgewählter Cre-Linien und modifizierter AAV-Injektion in verschiedene Gewebe für andere Gewebe angepasst werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Zuschüsse der U.S. National Institutes of Health (NIH) R01DK122808, R01DK102898 und R01DK132469 (an Y.-H.T.) sowie P30DK036836 (an das Diabetes Research Center des Joslin Diabetes Center) unterstützt. T. T. wurde durch das SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Stipendium, Sunstar Foundation, Japan) und das Stipendium der American Heart Association 903968 unterstützt. Y. Z. wurde durch das Charles A. King Trust Fellowship unterstützt. Wir danken Sean D. Kodani für das freundliche Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
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