Summary
I detta protokoll beskriver vi de tekniska procedurerna för att generera bruna fettvävnadsspecifika knockoutmöss (BAT) som utnyttjar ett kombinerat Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och adenoassocierat virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. De beskrivna stegen innefattar utformningen av sgRNA, beredningen av AAV-sgRNA-partiklarna och mikroinjektionen av AAV i BAT-loberna.
Abstract
Brun fettvävnad (BAT) är en fettdepå specialiserad på energiavledning som också kan fungera som ett endokrint organ via utsöndring av bioaktiva molekyler. Skapandet av BAT-specifika knockoutmöss är en av de mest populära metoderna för att förstå bidraget från en gen av intresse för BAT-medierad energireglering. Den konventionella geninriktningsstrategin som använder Cre-LoxP-systemet har varit det huvudsakliga tillvägagångssättet för att generera vävnadsspecifika knockoutmöss. Detta tillvägagångssätt är dock tidskrävande och tråkigt. Här beskriver vi ett protokoll för snabb och effektiv knockout av en gen av intresse för BAT med hjälp av ett kombinerat Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 och adenoassocierat virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. Den interscapular BAT ligger i det djupa lagret mellan musklerna. BAT måste därför exponeras för att AAV ska kunna injiceras exakt och direkt i BAT inom synfältet. Lämplig kirurgisk hantering är avgörande för att förhindra skador på sympatiska nerver och kärl, såsom Sultzers ven som ansluter till BAT. För att minimera vävnadsskador finns det ett kritiskt behov av att förstå den tredimensionella anatomiska placeringen av BAT och de kirurgiska färdigheter som krävs i de tekniska stegen. Detta protokoll belyser de viktigaste tekniska procedurerna, inklusive utformningen av sgRNA som riktar sig mot genen av intresse, beredningen av AAV-sgRNA-partiklar och operationen för direkt mikroinjektion av AAV i båda BAT-loberna för att generera BAT-specifika knockoutmöss, som kan tillämpas brett för att studera de biologiska funktionerna hos gener i BAT.
Introduction
Fetma ökar i betydande takt över hela världen, vilket leder till ett brett spektrum av metaboliska sjukdomar 1,2,3. Fettvävnaden är nyckeln till dessa patologier. De två funktionellt distinkta typerna av fettvävnad som finns är vit fettvävnad (WAT), som lagrar överflödiga kalorier, och brun fettvävnad (BAT) och dess relaterade beige / britefett, som sprider energi för termogenes. BAT har erkänts för sin energiavledande funktion, men har också endokrina funktioner via produktion av bioaktiva molekyler som reglerar ämnesomsättningen i distala organ 4,5. Många studier på gnagare har visat att ökad mängd eller aktivitet av brunt eller beige fett leder till ökad energiförbrukning och förbättrad insulinkänslighet. Hos människor har personer med detekterbar BAT en signifikant lägre förekomst av kardiometaboliska sjukdomar6. BAT har således utmärkt terapeutisk potential för fetmarelaterade metabola följder 7,8,9.
För att undersöka fysiologin och patofysiologin för BAT-utveckling och funktion och för att belysa de molekylära mekanismer som är involverade i dessa processer är den BAT-specifika transgena musmodellen en metod som valts10. Cre-LoxP-rekombinationssystemet är det vanligaste sättet att producera villkorade knockoutmöss genom att redigera musgenomet. Detta system har möjliggjort modifiering (överuttryck eller knockout) av gener av intresse på ett vävnads-/cellspecifikt sätt11. Det kan också användas för att märka en specifik celltyp genom att uttrycka en selektiv fluorescerande reportergen.
Nyligen har Cre-LoxP-systemmetoden vidareutvecklats genom att kombinera CRISPR-Cas9-tekniken och adenoassocierat virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system12. CRISPR-Cas9-systemet är ett specifikt och effektivt genredigeringsverktyg för att modifiera, reglera eller rikta in sig på exakta regioner i genomet13. CRISPR-Cas9-baserad genomredigering möjliggör snabb genetisk manipulation av genomiska loci eftersom det inte kräver homolog rekombination med en genmålande vektor. Kombinerade Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och AAV-sgRNA-tekniker gör det möjligt för forskare att förstå genfunktioner mer exakt genom att möjliggöra undersökning av rollen för gener av intresse vid önskade tidpunkter i vävnader / celler. Dessutom minskar dessa kombinerade tekniker den tid och ansträngning som krävs för att generera transgena möss och möjliggör tidsmässig kontroll av CRISPR-Cas9-aktivitet för inducerbar genomredigering hos möss om en inducerbar Cre-linje används14.
AAV-vektorer är säkra och effektiva in vivo-genleveranssystem. AAV: er som riktar sig mot fettvävnad har dock släpat efter applikationer i andra vävnader, såsom hjärna, hjärta, lever och muskel15. På grund av den relativt låga transduktionseffektiviteten och tropismen med naturligt förekommande serotypvektorer är AAV-styrd genleverans till fettvävnad fortfarande utmanande15. Under de senaste 5 åren har vi och andra framgångsrikt etablerat effektiva och minimalt invasiva sätt att leverera AAV-styrda gener till fettvävnad och skapat musmodeller som gör det möjligt för oss att få en förståelse för de gener som är involverade i regleringen av BAT-funktion16,17,18,19. Genom att till exempel använda AAV8 för att leverera sgRNA riktat mot Alox12, som kodar för 12-lipoxygenas (12-LOX), i BAT hos Ucp1-Cre/Cas9-mössen, har vi upptäckt att aktiverad BAT producerar 12-LOX-metaboliter, nämligen 12-hydroxi-eikosapentaensyra (12-HEPE) och 13R, 14S-dihydroxidokosahexaensyra (maresin 2), för att reglera glukosmetabolismen och lösa fetma-associerad inflammation, respektive16, 17. Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll om de tekniska procedurerna, särskilt kirurgi för direkt mikroinjektion av AAV-sgRNA i BAT-loberna, för att generera BAT-specifika knockoutmöss med hjälp av det kombinerade Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och AAV-sgRNA-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök och vårdprocedurer godkändes av den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid Joslin Diabetes Center.
1. Screening av effektiva sgRNA i odlade celler
OBS: För att göra analysen kostnadseffektiv rekommenderar vi att du testar olika sgRNA i odlade celler via ett lentivirusbaserat system för Cas9 / sgRNA-uttryck (figur 1) innan du förpackar sgRNA i AAV-partiklar och väljer de sgRNA som ger den högsta knockdown-effektiviteten för in vivo-experiment .
- CRISPR-Cas9 sgRNA-design
- Designa sgRNA med hjälp av onlineverktyg, såsom Broad sgRNA design tool (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, CRISPOR online tool (http://crispor.tefor.net/)22 och andra tillgängliga verktyg.
- Ange gennamn eller DNA-målsekvenser i gennamnsrutan och välj NGG som protospacer intilliggande motiv (PAM) för SpCas9 för att generera potentiella sgRNA-sekvenser.
- Välj sgRNA med hög förväntad effektivitet på målet och låg off-target aktivitet. Till exempel rekommenderas sgRNA med en specificitetspoäng på minst 50 på CRISPOR-utgången för användning. Bland de specifika sgRNA som passerar filtret, välj de med höga effektivitetspoäng23.
OBS: I allmänhet väljs tre eller fyra sgRNA för att säkerställa identifiering av effektiva sgRNA.
- Konstruktion av CRISPR-Cas9 sgRNA-plasmiden
- Syntetisera sgRNA-oligopar som kodar för 20 nukleotid-sekvenser (nt) med överhäng (både 5 'och 3') från BsmBI-restriktionsstället (tabell 1) genom en DNA-syntesplattform.
- Ligateglödgade oligopar med BsmBI-linjäriserad lentiCRISPR v2-vektor.
- Omvandla ligeringsprodukten till Stbl3 E. coli-stammen och bekräfta sgRNA-insättningarna genom Sanger DNA-sekvensering med U6 framåtprimer.
OBS: Se den detaljerade kloningsproceduren i Addgenes protokoll med titeln LentiCRISPRv2 och lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 och enkelguide RNA24.
- Producerar lentivirala partiklar
- Cirka 24 timmar före transfektion, platta 7 x 105 HEK-293-celler i 4 ml komplett tillväxtmedium i en 6 cm vävnadsodlingsplatta.
- Tillsätt 15 μl LT1-transfektionsreagens till 250 μl serumfritt medium och inkubera i rumstemperatur i 5 minuter.
- Bered en transfektionscocktail för varje sgRNA enligt tabell 2 i 250 μL serumfritt medium. Blanda transfektionsreagenset som beretts i steg 1.3.2 med plasmidcocktailen och inkubera i 20-30 minuter vid rumstemperatur.
- Byt ut hela odlingsmediet med 3,5 ml färskt tillväxtmedium för HEK-293-celler och tillsätt sedan DNA-transfektionsreagensblandningen droppvis till HEK-293-cellerna odlade i 3,5 ml färskt tillväxtmedium.
- Efter 12-15 timmars transfektion, byt medium för att avlägsna transfektionsreagenset och ersätt det med 4 ml färskt tillväxtmedium.
- Efter 24 timmars inkubation, samla cellodlingsmediet som innehåller lentivirala partiklar och filtrera mediet genom ett 0,45 μm filter för att avlägsna eventuella HEK-293-celler. Virusen kan förvaras vid 4 °C i några dagar. För långvarig lagring bör virusen frysas vid -80 °C.
OBS: Följ riktlinjerna för biosäkerhet vid beredning av lentivirala partiklar och arbeta i en miljö (t.ex. BL2+) som är lämplig för hantering av lentivirus. Se den detaljerade proceduren för lentivirusberedning i Addgenes protokoll med titeln pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
- Infektion av bruna preadipocyter och bestämning av sgRNA-medierad knockdown
- Platta 1 x 106 mus förevigade bruna preadipocyter i 1 ml färskt medium innehållande 8 μg/ml polybrene per brunn i en 6-brunnsplatta.
OBS: I denna studie genererades de odödliga bruna preadipocyterna med användning av SV40 T-antigen25. Bruna preadipocyter odlas i DMEM med hög glukos med 10% FBS. - Tillsätt 1 ml lentiviral partikellösning från steg 1.3 för att infektera cellerna. Behåll en oinfekterad brunn av celler parallellt för att fungera som antibiotikavalskontroll.
- Byt till färskt medium 24 timmar efter infektion. Tillsätt motsvarande antibiotika (t.ex. puromycin med en slutlig koncentration på 1 μg / ml) till mediet för att döda de oinfekterade cellerna och välj de infekterade. Byt till färskt medium som innehåller det valda antibiotikumet varannan dag tills alla oinfekterade kontrollceller är döda.
- Samla protein från de virusinfekterade cellerna och bestäm knockdown-effektiviteten hos sgRNA genom western blot-analys. Följ den detaljerade västra blottningsproceduren i Eslami och Lujan26. På grund av den varierande omsättningshastigheten bland proteiner, testa flera tidpunkter (t.ex. från dag 6 till dag 12 efter virusinfektion) för att observera förlusten av proteinsignalen.
OBS: Om en antikropp som känner igen proteinet som kodas av genen av intresse inte är tillgänglig, kan Sanger-sekvensering alternativt användas för att bestämma genomredigeringseffektiviteten för varje sgRNA. Kortfattat, förstärka det genomiska DNA: t med hjälp av primers som flankerar den sgRNA-riktade regionen för att generera PCR-amplicons på ~ 700 bp i längd. Den projicerade brytplatsen bör helst vara ~ 200 bp nedströms från sekvenseringsstartplatsen. Utsätt sedan PCR-produkten för Sanger-sekvensering. Analysera sekvenseringsresultaten med hjälp av onlineverktygen, såsom spårning av indels av DEcomposition (TIDE), för att bestämma frekvensen av små indels genererade av varje sgRNA i en pool av celler27.
- Platta 1 x 106 mus förevigade bruna preadipocyter i 1 ml färskt medium innehållande 8 μg/ml polybrene per brunn i en 6-brunnsplatta.
2. Konstruktion av AAV-sgRNA-plasmiden
OBS: I detta steg klonas de effektiva sgRNA som identifierats från ovanstående skärm till pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP-vektorn28 (figur 2). Under tiden klonas också ett icke-målsökande sgRNA (t.ex. TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29) som inte känner igen någon sekvens i musgenomet till samma vektor för att fungera som en icke-redigerad kontroll.
- Linjärisera pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP-ryggraden med BbsI, som genererar identiska överhäng med syntetiserade sgRNA-oligos.
- Ligera glödgade oligopar med linjäriserad pAAV-vektor och bekräfta sgRNA-insättningarna enligt beskrivningen i steg 1.2.
OBS: Kloningsproceduren för lentiCRISPRv2-sgRNA tillämpas också för AAV-sgRNA-plasmidkonstruktionen.
3. AAV-förpackning
- Paketera AAV-vektorerna som genereras i avsnitt 2 i AAV-serotyp 8. Förbered AAV med hög titer enligt ett tidigare protokoll30, eller begär en AAV-förpackningstjänst från virala kärnor eller kommersiella tjänster. Späd virustitern till 1 x 1013 genomkopior/ml.
OBS: Det modifierade AAV2-genomet som uttrycker ett sgRNA är förpackat i AAV-serotyp 8. Denna serotyp valdes på grund av dess höga effektivitet för fettvävnad18,31. För att förhindra immunsvar inducerat av föroreningar, såsom cellskräp och små mängder medelkomponenter, krävs ultrarenad AAV för in vivo-injektion. Ultrarening kan uppnås genom jodixanolgradienter och ultracentrifugering30.
4. Beredning av Ucp1 Cre/Cas9-möss
- Köp Ucp1-Cre-musstammen (se Materialförteckning) som uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av Ucp1-promotorn. Köp homozygota Rosa26-floxed STOP-Cas9 knock-in möss32 (se materialtabell), där uttrycket av Cas9 regleras på ett Cre rekombinasberoende sätt.
- Korsa dessa stammar för att generera Ucp1-Cre/Cas9-möss, som tidigare beskrivits16,17. Förvara alla möss i ett temperatur- och luftfuktighetskontrollerat rum (23 °C, 30% luftfuktighet) på en 12 timmars ljus-mörk cykel (tänds klockan 6:30, tänds klockan 18:30) med fri tillgång till chow diet och vatten.
- Behandla de resulterande Ucp1-Cre/Cas9-mössen med AAV som bär antingen kontroll-sgRNA eller sgRNA som riktar sig mot genen av intresse genom metoden som beskrivs nedan. I denna studie användes 12-15 veckor gamla manliga Ucp1-Cre/Cas9-möss som vägde cirka 30 g.
5. Kirurgi för AAV-injektion i BAT hos möss
- Bedöva mössen med kontinuerlig inandning av 2,5% isofluran för induktion och underhåll.
- Smörj båda ögonen för att förhindra torkning. Ge sedan analgetika (banamin, 2,5 mg/kg kroppsvikt [BW], subkutan injektion, se Materialtabell) till mössen för att minimera och förebygga postoperativ smärta och nöd.
- Raka muspälsen på det interscapulära området med en rakapparat och sterilisera det kirurgiska området med minst tre alternerande omgångar av en jodbaserad eller klorhexidinbaserad skrubb följt av 70% etanol. Applicera sedan sterila kirurgiska draperier runt snittet.
- Skär huden mellan skulderbladen med en skalpell (figur 3A-B) och skala sedan bort den rakade huden för att exponera fettvävnaderna på halsen med kirurgisk sax (figur 3C-D). Snittets storlek är beroende av kroppsstorleken, men i allmänhet bör snittet vara cirka 2 cm för att exponera fettvävnaderna i det interscapulära området.
- Skär fettvävnaderna på gränsen mellan den distala regionen av fettvävnaderna och musklerna med ett enda snitt (figur 3E-F). Snittets storlek bör vara ca 1 cm för att bara öppna ingången för införandet av den kirurgiska saxen för trubbig skalning av fettvävnaderna.
- Dra av fettvävnaderna med den dominerande handen rakt och vertikalt med kirurgisk sax för att exponera BAT medan du klämmer ihop fettvävnaderna, inklusive BAT, med den icke-dominanta handen (figur 3G). Använd Sultzers ven som ett landmärke för att ange den exakta BAT-platsen.
Anmärkning: BAT i figur 3H exponerades fullständigt för en bilddemonstration. Överdriven dissektion kan orsaka skador på nerverna i den omgivande BAT. Felaktig riktning av saxen kan skada de omgivande musklerna och Sultzers ven dränerar BAT och kan leda till överflödig blödning. - För varje mus, injicera långsamt 40 μl AAV i båda BAT-loberna (20 μl per en lob av BAT) med en vass nål (32 G, se Materialtabell) ansluten till en Hamilton-spruta (100 μL, se Materialtabell; Figur 3I). Kontrollera om injektionen är framgångsrik eftersom det inte finns några läckage från injektionsstället under AAV-administrering.
Anmärkning: BAT i figur 3I exponerades helt i syfte att demonstrera en bild. Volymen AAV-lösning som ska administreras i en BAT-lob bestäms av storleken på mottagarmusens BAT. Vi har fastställt att 20 μL AAV-lösning är lämplig för en BAT-lob som väger cirka 0,05 g i en vanlig C57BL6/J-mus som väger 30 g. Vid behov kan viruslösningen behöva koncentreras för att uppnå önskad volym. - Bekräfta att ingen blödning uppstår från den injicerade BAT eller omgivande vävnad. Pressgasväv indränkt med väteperoxidlösning (se materialförteckning) på ett blödningsställe för hemostas.
- Placera de exponerade fettvävnaderna tillbaka till sitt normala läge. Sy upp kanten på fettvävnaderna och musklerna med en 5-0 absorberbar monofilamenttråd (figur 3J). Suturera det öppna skalet med 5-0 belagda vicryl ofärgade flätade trådar (figur 3K-L).
OBS: Figur 4 beskriver stegen för att sy de skalade fettvävnaderna och musklerna. - Håll djuren på en värmedyna efter operationen tills fullständig återhämtning. Ge djuren tillgång till mat, vatten och gott om sängkläder för häckning. Övervaka dem regelbundet för tecken på nöd eller sjukdom i 7 dagars återhämtning före experimentets början.
- Bekräfta effektiviteten av den riktade gendeletionen genom western blot-analys i BAT dissekerad från möss, som i Sugimoto et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under ovanstående procedurer är den exakta leveransen av AAV-sgRNA till BAT avgörande för protokollets framgång. För att maximera effekten av AAV-sgRNA och minimera vävnadsskadorna under operationen är det viktigt att förstå den tredimensionella (3D) anatomiska placeringen av BAT. Som visas i figur 3E är det svårt att identifiera den exakta placeringen av BAT utan att exponera vävnaden. Överdriven BAT-exponering kan dock skada vävnaden (figur 3H, I). därför bör proceduren utföras för att injicera AAV-lösningen inom ett begränsat anatomiskt utrymme (figur 3G). Figur 5A är avgörande för att säkerställa framgången med AAV-injektionen och den snabba återhämtningen av mössen efter operationen. Figur 5B-D visar potentiella brister som kan leda till misslyckade injektioner. Dessa inkluderar injektion av AAV-lösningen i fel område (figur 5B), nålpenetration genom vävnaden (figur 5C) och vävnadsballong på grund av en överdriven volym av AAV-lösningen (figur 5D). Slutligen måste knockdown-effektiviteten hos genen av intresse verifieras av proteinnivåerna i BAT som dissekeras från de injicerade mössen16. Till exempel visar proteinnivåerna av 12-LOX i BAT mätt med western blot effektiv knockdown på grund av att AAV8 levererar sgRNA riktat mot Alox12 (genen som kodar för 12-LOX) i BAT hos Ucp1-Cre/Cas9-möss (se figur 7b i den tidigare publicerade studien16).
Figur 1: Schematisk för lentiviral plasmid som uttrycker Cas9 och sgRNA. Lentiviral expressionsvektor för Cas9 och sgRNA (lentiCRISPRv2). Förkortningar: Puro = puromycin urvalsmarkör; psi + = psi förpackningssignal; RRE = varvresponselement ; cPPT = centrala polypurinkanalen; EFS = förlängningsfaktor-1α kort promotor; P2A = 2A självklyvande peptid; WPRE = posttranskriptionellt reglerande element; LTR = lång terminalupprepning. LentiCRIPSRv2 kan smältas med BsmBI, och ett par glödgade sgRNA-oligos kan klonas in i enledar-RNA-ställningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk för AAV-plasmiden som uttrycker sgRNA. AAV-vektorn för sgRNA. Förkortningar: ITR = I terminal repeat; CB = hybrid CMV-förstärkare/β-aktin promotor. pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP kan smältas med BbsI, och ett par glödgade sgRNA-oligos kan klonas in i enledar-RNA-ställningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Sekventiell kirurgi för AAV-injektion i de bilaterala BAT-loberna hos möss. En sövd mus har genomgått följande procedurer: (A-B) skärning av den rakade huden, (C-D) trubbigt avskalning av den rakade huden, (E-F) skärning av fettvävnaderna, (G) trubbigt skalning av fettvävnaderna, (H-I) injektion av AAV-lösningen i BAT-loberna med en Hamilton-spruta, (J) suturering mellan fettvävnaderna och musklerna och (K-L) mellan båda hudflikarna. Obs: I panelerna (H) och (I) är Sultzers ven ett landmärke för att bekräfta den exakta platsen för BAT. BAT i dessa två paneler exponerades helt för bilddemonstration. De gula streckade linjerna anger gränsen mellan fettvävnad och muskler i panel E och nålspetsen (dvs. injektionsstället) i panel I. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Steg för att sy de skalade fettvävnaderna och musklerna. (A) För in en nåltråd i de skalade fettvävnaderna för injektion, (B) penetrera fettvävnaderna, (C) haka en muskel, (D) dra upp en tråd för att sy de skalade fettvävnaderna och musklerna och ligera sedan trådarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Representativa bilder av lämpliga och olämpliga metoder för AAV-injektion i BAT-loberna hos möss. (A) Denna siffra representerar den föreslagna AAV-injektionen, där en ensidig BAT-lob får en injektion av 20 μL AAV-lösning. (B-D) Följande metoder för AAV-injektion kan leda till fel. b) Felaktigt injektionsställe (dvs. avsaknad av BAT-lober). c) nålen tränger in genom vävnaderna, och (D) vävnadsballong på grund av en stor mängd AAV-lösning, där en ensidig BAT-lob får en 80 μL injektion av AAV-lösning. De gula prickade cirklarna anger nålspetsen (dvs. injektionsstället). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Framåt oligo: 5' CACC-20bp gRNA-sekvens-3' |
| Omvänd oligo: 5' AAAC-20bp gRNA omvänd komplementsekvens-3' |
| Om målsekvensen till exempel är TCTGATAGCGTAGGAGTGAT skulle oligos vara: |
| Framåt oligo: 5' CACC TCTGATAGCGTAGGAGTGAT 3' |
| Omvänd oligo: 5' AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3' |
Tabell 1: Exempel på sgRNA-design. Exempel på en sgRNA-sekvens med överhäng som motsvarar BsmBI-restriktionsstället.
| Materialets namn | Företag | Katalognummer | Belopp |
| lentiCRISPER v2 plasmid | Addgene | #52961 | 5 μg |
| psPAX2 förpackning plasmid | Addgene | #12260 | 3,75 μg |
| pMD2.G hölje plasmid | Addgene | #12259 | 1,5 μg |
| OPTI-MEM serumfritt medium | Invitrogen | #31985 | 250 μl |
Tabell 2: LentiCRISPR. Plasmidcocktail för transfektion av sgRNA innehållande LentiCRISPRv2-plasmiden till HEK-293-celler för att producera CRISPR-sgRNA-lentivirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De befintliga publicerade metoderna för AAV-medierad genleverans till interscapular BAT innehåller inga detaljerade bilder och videor som beskriver de kirurgiska teknikerna och tillvägagångssättet för direkt AAV-injektion i BAT. I de flesta av de publicerade metoderna33,34 injiceras AAV i fettvävnaderna som omger interscapular BAT i stället för själva BAT. Därför finns det flera viktiga steg i detta protokoll som avgör studiens framgång. Dessa inkluderar utformningen av sgRNA, AAV-förpackningen och koncentrationen, genereringen av de BAT-specifika Cas9-mössen och de kirurgiska ingreppen. Noggranna och enastående kirurgiska färdigheter krävs för att slutföra in vivo-procedurerna. I synnerhet är det viktigt att minimera vävnadsskadorna när BAT exponeras och administreras AAV. På grund av flera genetiska och miljömässiga faktorer, såsom inhysningstemperatur, träning och dieter, kan volymen vitt fett som omger BAT och sammansättningen av BAT i sig variera mellan djur. Till exempel uppvisar överviktiga möss stora vita fettvävnader som omger BAT, och möss inrymda vid termoneutralitet (30 ° C) uppvisar vitnad BAT. Därför är det svårt att exakt bestämma 3D-platsen för BAT utan att öppna huden. Att minimalt avslöja BAT är ett utmanande men avgörande steg för AAV-injektion. Överdriven exponering av BAT under denna procedur kan orsaka allvarliga skador på sympatiska nerver och kärl, särskilt Sultzers ven som är ansluten till BAT.
Observera att volymen av AAV som injiceras i vävnaden också är en begränsande faktor för framgång. En överdriven volym av lösningen kan vara skadlig för cellerna och störa en effektiv virusinfektion för att leverera sgRNA in i adipocyterna. Eftersom BAT-storleken varierar med mottagarmössens ålder, kön och genetiska bakgrund kan optimeringsexperiment krävas16,17. Förutom att slå ner gener av intresse kan denna teknik dessutom tillämpas för att överuttrycka gener av intresse.
En potentiell fallgrop med denna teknik är den låga effektiviteten hos genknockout med ett sgRNA in vivo, även med sgRNA som ger effektiv knockout in vitro. Som en potentiell lösning kan kombination av två eller flera unika sgRNA i en enda injektion förbättra effektiviteten av genknockdown in vivo.
Sammanfattningsvis erbjuder de kombinerade Ucp1-Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och AAV-sgRNA-teknikerna ett robust och effektivt system för att generera möss med BAT-specifik genmanipulation. Denna metod kan anpassas för andra vävnader med hjälp av utvalda Cre-linjer och modifierad AAV-injektion i olika vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av U.S. National Institutes of Health (NIH) bidrag R01DK122808, R01DK102898 och R01DK132469 (till Y.-H.T.), samt P30DK036836 (till Joslin Diabetes Center's Diabetes Research Center). TT stöddes av SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan) och American Heart Association grant 903968. Y. Z. stöddes av Charles A. King Trust Fellowship. Vi tackar Sean D. Kodani för vänligheten att korrekturläsa manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
