Summary
Questo articolo presenta un metodo riproducibile con nuove scoperte sulla presenza di cellule epiteliali nel sangue umano e nel midollo osseo umani e di topo normali utilizzando la citometria a flusso e la microscopia a immunofluorescenza. I topi transgenici Krt1-14;mTmG sono stati utilizzati come metodo in vivo per confermare questi risultati.
Abstract
Le cellule epiteliali sono state identificate nel sangue e nel midollo osseo di pazienti con cancro e altre malattie. Tuttavia, la presenza di cellule epiteliali normali nel sangue e nel midollo osseo di individui sani deve ancora essere identificata in modo coerente. Presentato qui è un metodo riproducibile per isolare le cellule epiteliali dal sangue umano e murino sano e dal midollo osseo (BM) utilizzando la citometria a flusso e la microscopia a immunofluorescenza (IF). Le cellule epiteliali in individui sani sono state identificate e isolate tramite citometria a flusso utilizzando la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM). È stato confermato che queste cellule EpCAM+ esprimono cheratina utilizzando la microscopia a immunofluorescenza in topi transgenici Krt1-14;mTmG. I campioni di sangue umano avevano 0,18% ± 0,0004 cellule EpCAM+ (SEM; n = 7 repliche biologiche, 4 repliche sperimentali). Nel BM umano, il 3,53% ± 0,006 (SEM; n=3 repliche biologiche, 4 repliche sperimentali) di cellule mononucleate erano EpCAM+. Nel sangue di topo, le cellule EpCAM+ costituivano 0,45% ± 0,0006 (SEM; n=2 repliche biologiche, 4 repliche sperimentali), e nel BM di topo, 5,17% ± 0,001 (SEM; n=3 repliche biologiche, 4 repliche sperimentali) erano EpCAM+. Nei topi, tutte le cellule EpCAM+ erano immunoreattive alla pan-citocheratina, come determinato dalla microscopia IF. I risultati sono stati confermati utilizzando topi transgenici Krt1-14;mTmG, con un numero basso (8,6 cellule native GFP+ per 106 cellule analizzate; 0,085% di cellule vitali), ma un numero significativo (p < 0,0005) di cellule GFP+ presenti nel BM murino normale, che non erano il risultato della casualità rispetto a più controlli negativi. Inoltre, le cellule EpCAM+ nel sangue di topo erano più eterogenee delle cellule CD45+ (0,58% nel BM; 0,13% nel sangue). Queste osservazioni concludono che le cellule che esprimono proteine della citocheratina sono rilevabili in modo riproducibile tra le cellule mononucleate di sangue umano e murino e BM. Dimostriamo un metodo di raccolta dei tessuti, citometria a flusso e immunocolorazione che può essere utilizzato per identificare e determinare la funzione di queste cellule epiteliali pan-citocheratiniche in individui sani.
Introduction
Le cellule epiteliali si trovano nelle barriere fisiche tra il nostro corpo e l'ambiente e sono in grado di riconoscere e rispondere ai cambiamenti nel loro microambiente1. Hanno una nicchia proliferante di cellule staminali che fornisce un modo per girare nuovo tessuto e riparare i danni2. Il nostro laboratorio studia le cellule staminali nei follicoli piliferi della pelle; La pelle è un buon modello per studiare il tessuto epiteliale e la proliferazione delle cellule staminali perché è facilmente visibile e c'è un costante ricambio di cellule. I tumori epiteliali sono la forma più comune di cancro, probabilmente a causa dei tessuti epiteliali, come la pelle, essendo la prima linea di difesa contro gli agenti cancerogeni ambientali, portando ad alti tassi di turnover e alla proliferazione delle cellule epiteliali3. La maggior parte dell'epidermide cutanea, lo strato protettivo superiore, è composta da cheratinociti, che esprimono diversi tipi di cheratine per fornire supporto e struttura4. I pazienti con tumori epiteliali hanno spesso cellule epiteliali presenti nel sangue e nel midollo osseo che esprimono anche cheratine. Le biopsie liquide sono un modo non invasivo per rilevare e monitorare queste cellule epiteliali in diversi fluidi corporei5. Le cellule epiteliali circolanti, chiamate anche cellule tumorali circolanti (CTC), si trovano nel sangue periferico e possono essere biomarcatori per la prognosi del cancro, oltre a guidare i trattamenti terapeutici individualizzati. Le CTC possono anche indicare la progressione della malattia, l'efficacia del trattamento e la sopravvivenza globale del paziente 5,6.
La molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) è un marcatore clinicamente utilizzato per le CTC e può identificare tumori di origine epiteliale nei pazienti oncologici. EpCAM svolge un ruolo nell'adesione, nella migrazione, nella segnalazione, nella proliferazione e nella differenziazione delle cellule6. Affinché una cellula epiteliale circolante possa essere classificata come CTC, deve essere positiva per le citocheratine 8, 18 e 19 e negativa per CD45, un marcatore leucocitario comune6. Le CTC sono solitamente identificate prima deplezione di CD45 con microsfere magnetiche, seguita da test per EpCAM e citocheratina 19 utilizzando la microscopia a immunofluorescenza7. La principale limitazione nel rilevamento dei CTC è la loro rarità; Costituiscono meno dello 0,01% di tutte le cellule del sangue e pochissime sopravvivono in circolazione per raggiungere organi distanti 8,9,10. È necessario prendere in considerazione la progettazione di esperimenti e tecniche per isolare e identificare queste cellule a causa della loro natura rara. Attualmente, esiste solo uno smistatore automatico a singola cellula approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) utilizzato per identificare i CTC e utilizza EpCAM come biomarcatore. Altri metodi includono la separazione delle sfere magnetiche e la citometria a flusso, o una combinazione di questi metodi. C'è bisogno di nuove tecniche che abbiano una maggiore sensibilità e specificità per il rilevamento di CTC rare11.
La citometria a flusso è un metodo preferito per la rilevazione di popolazioni cellulari rare nel sangue, nel midollo osseo e in altri campioni di tessuto. Queste cellule rare possono includere cellule staminali, cellule endoteliali circolanti, CTC e cellule residue della malattia. La citometria a flusso consente misurazioni quantitative di ciascun tipo di cellula e ordina queste cellule per ulteriori test 7,9. Sono stati eseguiti conteggi incrementali per garantire una valutazione accurata di queste cellule rare. La capacità di utilizzare il gating per escludere le cellule da ulteriori analisi è un modo per aumentare la specificità durante l'analisi delle cellule. I limiti della citometria a flusso sono il tempo necessario per l'analisi di campioni di grandi dimensioni e la mancanza di conferma visiva per l'identità cellulare. Per ovviare a questo, la microscopia a immunofluorescenza è stata eseguita sulle cellule selezionate per confermare le loro identità.
In precedenza il nostro laboratorio ha dimostrato che nei topi le cellule del midollo osseo vengono reclutate e contribuiscono ai tumori della pelle12. Queste cellule derivate dal midollo osseo sono positive per la pan-citocheratina e la citocheratina epidermica. Per chiarire ulteriormente il ruolo delle cellule staminali epiteliali, delle cellule derivate dal midollo osseo e delle cellule che esprimono citocheratina nella progressione tumorale, sono state ricercate cellule EpCAM+ citocheratine-positive in campioni normali di sangue murino e umano e midollo osseo. Come per la maggior parte degli esperimenti, questo metodo è stato sviluppato attraverso più iterazioni. In precedenza, i topi transgenici venivano utilizzati insieme a conteggi incrementali per cercare cellule che esprimono K14GFP nel midollo osseo12. Man mano che venivano contate più cellule, è stato possibile identificare una popolazione rappresentativa di cellule rare, come mostrato nella Figura 1 nella sezione dei risultati rappresentativi. Il razionale per lo studio delle cellule epiteliali nel sangue e nel midollo osseo normali era basato sulla letteratura iniziale sulle CTC, in cui i donatori sani normali avevano livelli di base di cellule EpCAM +13. Come accennato in precedenza, la caratterizzazione di EpCAM inizia spesso con l'esaurimento di CD45. Questo passaggio è stato omesso perché alcune cellule ematopoietiche hanno espressione di EpCAM e citocheratina per ragioni sconosciute che devono essere ulteriormente studiate. Pertanto, le cellule sono state selezionate in base alla presenza o all'assenza di EpCAM, indipendentemente dalla linea cellulare, e quindi immunocolorate per la citocheratina. Il protocollo riportato di seguito e il flusso di lavoro mostrato nella Figura 2 descrivono una tecnica che utilizza la citometria a flusso con compensazione e controlli, metodi statistici e imaging a immunofluorescenza per isolare e identificare queste rare popolazioni di cellule epiteliali.
Protocol
Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Minnesota in conformità con le linee guida NIH e federali. Sangue umano fresco e midollo osseo sono stati acquistati da fonti commerciali. I campioni sono stati raccolti dall'azienda nell'ambito di un protocollo IRB approvato da donatori negativi per HIV, epatite B, epatite C e sottoposti a screening per COVID-19. Tutti i campioni sono stati prima de-identificati e resi anonimi prima di essere spediti dalla società. Poiché questi sono stati ottenuti commercialmente, non è stata richiesta alcuna approvazione IRB.
1. Preparazione delle soluzioni
NOTA: Tutte le soluzioni devono essere preparate in una cappa biologica con un ambiente sterile. Ottenere la certificazione di biosicurezza livello 2 (BSL2) per il lavoro con sangue umano e midollo osseo.
- Preparare la soluzione per la raccolta del midollo osseo aggiungendo 1 mL di gentamicina e 5 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
- Preparare la soluzione tampone anticolorante aggiungendo 50 mL di FBS a 500 mL di HBSS.
- Preparare 1x tampone di lisi combinando 10 ml di tampone di lisi 10x con 90 ml di acqua sterile.
2. Preparazione del cappuccio
- Accendere il cofano e lasciarlo funzionare per alcuni minuti per ottenere un corretto flusso d'aria.
- Raccogliere tutti i materiali per eseguire la raccolta del midollo osseo. Spruzzarli all'interno del cappuccio con etanolo al 70% per mantenere un ambiente sterile. Spruzzare le mani ogni volta prima che vengano portate all'interno del cappuccio.
- Posizionare il vassoio autoclavato nel cappuccio insieme a forbici autoclavate, bisturi assemblato, pinzette e pinze curve in una piccola tazza riempita con etanolo al 70% per mantenerli sterili.
- Aggiungere 10 ml di soluzione per il prelievo del midollo osseo in una provetta da centrifuga da 50 ml ed etichettarla con "Arti". Etichettare un'altra provetta da centrifuga da 50 ml come "midollo osseo".
- Aspirare 10 ml di soluzione per la raccolta del midollo osseo in una siringa e quindi inserire un ago da 26 G.
3. Raccolta del midollo osseo dai topi
- Eutanasia del topo usando l'asfissia CO2 . La morte è confermata dall'assenza di un battito cardiaco e dal pizzicare i piedi per assicurarsi che non vi sia alcuna reazione. La dislocazione cervicale può essere eseguita come mezzo secondario di completa eutanasia.
- Mettere il mouse in un contenitore da 500 ml e aggiungere abbastanza iodio per coprire metà del mouse. Agitare delicatamente e ruotare il contenitore per garantire una copertura completa. Risciacquare con acqua deionizzata. Eseguire un altro lavaggio con iodio e poi due lavaggi con etanolo al 70% seguendo gli stessi passaggi.
- Posizionare il mouse nel cappuccio e appoggiarlo sul retro sul vassoio. Afferrare le zampe posteriori e separarle fino a quando non si avverte uno schiocco; Questo per separare le gambe dalla colonna vertebrale.
- Fai un'incisione di 1 cm sulla pelle del topo vicino alla zona inguinale. Inserire un paio di forbici chiuse nell'incisione e quindi aprire le forbici sotto la pelle per separarla dal peritoneo.
- Tagliare la pelle sulla gamba intorno alla coscia, e poi tagliare la pelle lungo la gamba per esporre i muscoli e le ossa.
- Rimuovere le zampe posteriori tagliando intorno all'articolazione dell'anca, assicurandosi di non tagliare il femore. Posizionare gli arti nel tubo etichettato come "Arti" Quando entrambe le gambe vengono rimosse, mettere il topo in un sacchetto di carcassa e metterlo nel congelatore.
NOTA: L'osso dell'anca deve essere sentito prima del taglio per guidare le forbici ed evitare di tagliare l'osso del femore, poiché la maggior parte del midollo osseo è ottenuto dal femore. - Inizia a tagliare via i muscoli, i tessuti e il grasso lungo uno degli arti usando le forbici. Tagliare parallelamente all'osso. Quindi, utilizzare il bisturi e rimuovere il grasso o il muscolo rimanente, utilizzando un movimento raschiante perpendicolare contro l'osso.
- Una volta che l'osso è pulito correttamente, separare il femore e la tibia al ginocchio. Usa il bisturi per fare tagli su entrambe le estremità del femore e della tibia dove non c'è midollo osseo visibile.
- Inserire la siringa e l'ago preparati nell'osso. Se c'è resistenza, tagliare un po 'di più dalla fine dell'osso fino a quando non c'è più resistenza.
- Mentre si tiene l'osso sopra il tubo etichettato come "midollo osseo", espellere la soluzione di raccolta del midollo osseo attraverso l'osso per lavare il midollo osseo nel tubo. Ripetere sull'altra estremità dell'osso per ottenere il resto del midollo osseo, fino a quando l'osso appare tutto bianco o vuoto.
- Ripetere i passaggi 7-9 per tutte le ossa e gli arti rimanenti; Tutto il midollo verrà lavato nello stesso tubo conico.
- Utilizzando una siringa vuota da 10 ml e un ago da 20 G, rompere i grumi di midollo osseo nel tubo aspirando il midollo osseo su e giù nella siringa 5-10 volte.
- Aggiungere un filtro sterile da 40 μm a una provetta da centrifuga pulita da 50 ml e sciacquarla con 1 mL di soluzione per la raccolta del midollo osseo. Quindi, filtrare il midollo osseo per rimuovere eventuali grumi rimanenti. Etichettare questo tubo "Midollo osseo filtrato".
- Conservare il midollo osseo filtrato in frigorifero o su ghiaccio fino all'uso. Dovrebbe essere usato lo stesso giorno della raccolta. Se non utilizzato lo stesso giorno, congelare le cellule utilizzando un crioconservante, come il dimetilsolfossido (DMSO).
ATTENZIONE: Tutti i rifiuti provenienti da questi esperimenti devono essere smaltiti correttamente in un contenitore per rifiuti a rischio biologico. Tutti gli oggetti taglienti dovrebbero andare in un contenitore di taglienti a rischio biologico correttamente etichettato.
4. Lisi dei globuli rossi del midollo osseo
- Centrifugare le cellule del midollo osseo a 170 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e smaltire il surnatante. Risospendere le cellule in 10 ml di 1x tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per 4 minuti.
- Aggiungere 30 ml di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) per interrompere la reazione del tampone di lisi. Centrifugare le celle per 8 minuti a 170 x g a temperatura ambiente. Aspirare e smaltire il surnatante. Risospendere in 10-20 ml di tampone colorante.
5. Conteggio delle cellule
- Combinare 500 μl di cellule con 9,5 ml di soluzione di raccolta del midollo osseo per ottenere una diluizione 1:20.
NOTA: Questo verrà utilizzato per la conta delle cellule e non ha bisogno di essere mantenuto sterile. - Estrarre 200 μL di cellule dalla diluizione 1:20, aggiungerle a 200 μL di tripano blu e mescolare bene.
- Aggiungere la miscela a un emocitometro e contare le cellule vive e morte su entrambi i lati. Calcolare la sospensione della cella originale utilizzando questa tabella (mostrata nel file supplementare 1) e le equazioni:
Celle per millilitro:
Totale celle:
- Ruotare le cellule a 170 x g per 10 minuti a 4 °C e risospendere a una concentrazione di 10 x 10 6 per 1 mL (1 x 106 cellule per 100 μL), in base ai suggerimenti del produttore per le diluizioni anticorpali.
- Procedere alla citometria a flusso (fase 8).
6. Raccolta di sangue dai topi
- Eutanasia del topo usando gas CO2 o lussazione cervicale.
- Eseguire un prelievo di sangue cardiaco con un angolo di 45° con un ago da 26 G collegato a una siringa da 1 mL rivestita con acido etilendiamminotetraacetico 0,5 M (EDTA).
- Ruotare il sangue e risospendere in supporti o tampone di colorazione.
NOTA: Le cellule saranno filate verso il basso e risospese alla concentrazione finale nel tampone colorante dopo la lisi dei globuli rossi e la conta cellulare. - Eseguire la lisi dei globuli rossi (fase 4).
- Eseguire il conteggio delle celle (passaggio 5).
- Procedere alla citometria a flusso (fase 8).
7. Elaborazione di campioni di sangue umano e midollo osseo
- Eseguire tutte le procedure con un cappuccio certificato BSL2 indossando dispositivi di protezione individuale.
- Raccogliere i campioni la notte precedente ed eseguire la lisi dei globuli rossi. Assicurarsi che i campioni siano resi anonimi e resi anonimi prima di spedire i campioni mononucleati durante la notte sul ghiaccio.
- All'arrivo, ruotare le cellule vive a 170 x g a 4 °C per 10 minuti.
NOTA: Questi sono campioni BSL2 che devono seguire le linee guida locali. - Risospendere le celle nel supporto o nel tampone di colorazione.
NOTA: Le cellule devono essere ruotate verso il basso e risospese alla concentrazione finale dopo il conteggio delle cellule con tampone colorante. - Eseguire il conteggio delle celle (passaggio 5).
- Procedere alla citometria a flusso (fase 8).
8. Citometria a flusso
- Macchiatura
- Dividere le celle in tubi etichettati individualmente in base al pannello di colorazione utilizzato, compresi i controlli di compensazione (non colorati, controlli isotipo, a singola colorazione e fluorescenza meno quelli [FMO]). Congelare le cellule rimanenti o utilizzarle per la selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza. Vedere la Tabella 1 per un esempio di pannello di colorazione con le diluizioni anticorpali utilizzate.
NOTA: Per ogni fluoroforo aggiuntivo aggiunto, devono essere aggiunti FMO in combinazione con i fluorofori rimanenti insieme a una singola macchia di quel fluoroforo. I controlli isotipo possono essere utilizzati per bloccare la colorazione non specifica. Ogni nuovo anticorpo utilizzato deve essere titolato con i campioni per una diluizione ottimale. - Aggiungere gli anticorpi secondo le diluizioni raccomandate dal produttore e mescolare bene facendo scorrere il fondo dei tubi. Le concentrazioni di anticorpi sono generalmente indicate come 1 x 106 cellule per 100 μL. Le diluizioni con anticorpi e controlli sono mostrate nella Tabella 1. Gli anticorpi sono coniugati con fluorofori e devono essere protetti dalla luce.
NOTA: È meglio usare EpCAM coniugato alla ficoeritrina (PE) per consentire la visualizzazione di basse popolazioni di cellule (titolare a 3-5 μL per 1 milione di cellule, come indicato nella Tabella 1). PE-CD49f è stato utilizzato come controllo PE a singola macchia (20 μL per 1 milione di cellule), poiché queste cellule sono più diffuse di PE-EpCAM e quindi più facili da usare per la compensazione. - Incubare per 30 minuti a 4 °C al buio.
- Dopo l'incubazione, riportare i tubi nella cappa BSL2 e aggiungere 1 mL di tampone colorante a ciascun tubo.
- Quindi, centrifugare i tubi a 170 x g a 4 °C per 5-10 minuti.
- Dopo la centrifugazione, riportare i tubi tappati con le celle alla cappa BSL2 e aspirare il surnatante. Assicurarsi di cambiare le punte della pipetta di aspirazione tra ogni tubo per evitare contaminazioni incrociate.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone colorante e scorrere il fondo dei tubi per mescolare.
- Lavare le celle altre due volte ripetendo i passaggi 8.1.4-8.1.7.
NOTA: non utilizzare pipette per risospendere, per evitare di perdere celle. - Risospendere in 500 μL di tampone colorante per la risospensione finale prima della citometria a flusso. Aggiungere 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) o discriminatore a cellule morte, secondo le raccomandazioni del produttore.
- Dividere le celle in tubi etichettati individualmente in base al pannello di colorazione utilizzato, compresi i controlli di compensazione (non colorati, controlli isotipo, a singola colorazione e fluorescenza meno quelli [FMO]). Congelare le cellule rimanenti o utilizzarle per la selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza. Vedere la Tabella 1 per un esempio di pannello di colorazione con le diluizioni anticorpali utilizzate.
- Citometro a flusso
- Dopo aver impostato la macchina, utilizzare i comandi e gli FMO per impostare la compensazione e i cancelli. Utilizzare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) come fluido guaina per aiutare a sostenere le cellule fragili. Utilizzare PBS se HBSS non è disponibile.
NOTA: Il citometro a flusso utilizzato e il software sono elencati nella tabella dei materiali. - Caricare i campioni uno alla volta e raccogliere punti dati per 50.000, 100.000, 500.000 e un milione di eventi. Conservare i tubi su ghiaccio o in frigorifero fino all'uso.
NOTA: è possibile impostare un limite di tempo al momento della raccolta per garantire la vitalità del campione. - Raccogliere le celle in 3 ml di RPMI con FBS al 10% in provette da centrifuga da 15 ml.
- Se si esegue l'immunofluorescenza sulle cellule EpCAM+, utilizzare il citometro a flusso per ordinare da 800 a 1.000 cellule in ciascun pozzetto di un vetrino a 8 pozzetti.
- Ordinare la popolazione di cellule EpCAM su vetrini separati come controllo negativo da utilizzare durante la colorazione per l'immunofluorescenza.
NOTA: Le cellule possono anche essere ordinate in tubi da 15 ml contenenti FBS e filati su un vetrino usando la citocentrifuga o una pipetta per evitare che le cellule scoppino. - Fissare i vetrini in una miscela al 50% di metanolo/50% di acetone a -20 °C per 10 minuti. Conservare i vetrini a -20 °C fino alla colorazione con immunofluorescenza.
- Dopo aver impostato la macchina, utilizzare i comandi e gli FMO per impostare la compensazione e i cancelli. Utilizzare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) come fluido guaina per aiutare a sostenere le cellule fragili. Utilizzare PBS se HBSS non è disponibile.
- Analisi citometrica a flusso
- Aprire il software di analisi della citometria a flusso con licenza.
- File standard di citometria a flusso di carico (FCS) acquisiti dal citometro a flusso con controlli e campioni.
- Fare clic su Crea gruppo e utilizzare parole chiave per inserire esempi e controlli in un gruppo .
NOTA: Utilizzare il controllo "nessuna macchia" per accedere al software di analisi della citometria a flusso, come illustrato nella Figura 3. - Fare doppio clic sull'esempio di controllo senza macchia per aprire un grafico non macchiato.
- Impostate l'asse y del grafico su SSC-A e l'asse x su FSC-A (area di dispersione laterale per area di dispersione diretta), che indica la dimensione della cella e la complessità interna.
- Fai clic sulla forma del poligono nel pannello in alto a sinistra e crea un cancello attorno alle celle. Assicurati di escludere le celle alla periferia, poiché molto probabilmente si tratta di detriti. Etichettare questo gate come "Celle", come mostrato nella Figura 3A.
- Una volta che le celle sono gated, fare doppio clic all'interno della forma poligonale per aprire un altro grafico in una nuova finestra.
- Impostate l'asse y del nuovo grafico su SSC-A e l'asse x su SSC-W per la discriminazione del doppietto. Fare clic sulla forma poligono e creare un rettangolo attorno alle singole celle. Etichettare questo "Single Cells", come mostrato nella Figura 3B.
- Una volta che le celle sono gated, fare doppio clic all'interno della forma poligonale per aprire un altro grafico in una nuova finestra.
- Impostare l'asse y su FSC-A e l'asse x su DAPI-A (o qualsiasi discriminatore a cellule morte utilizzato).
- Creare una porta poligonale attorno alle celle negative DAPI sul lato sinistro del grafico. Etichettare queste "cellule vive", come mostrato nella Figura 3C.
- Una volta che le celle sono gated, fare doppio clic all'interno della forma poligonale per aprire un altro grafico in una nuova finestra.
- Impostare l'asse y su SSC-A e l'asse x su EpCAM-PE (o qualsiasi fluoroforo utilizzato per identificare le cellule EpCAM). Le celle a sinistra sono EpCAM negative. Se alcune celle sono mostrate sulla destra, sono EpCAM positive.
- Utilizzare il grafico EpCAM-PE per creare un gate poligonale, che esclude le celle a sinistra e include solo lo spazio vuoto a destra. Etichettare l'area vuota a destra all'interno del poligono "EpCAM", come mostrato nella Figura 3D.
NOTA: questo è un controllo senza macchie, quindi non dovrebbe esserci espressione EpCAM. Utilizzare il controllo senza macchia per determinare quali celle sono EpCAM positive. Questo completa la strategia di gating per la compensazione, quindi tutti i grafici potrebbero essere chiusi in questo momento. - Nella pagina dell'area di lavoro, evidenzia la derivazione senza macchia con "Celle", "Celle singole", "Celle attive" ed "EpCAM". Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Copia analisi per raggruppare. In questo modo la strategia di gating viene copiata in tutti gli altri campioni caricati all'interno del gruppo creato in precedenza. Se un gruppo non è stato creato inizialmente, può essere creato ora selezionando Crea gruppo in alto a sinistra.
- Esaminare gli esempi all'interno del gruppo e controllare le porte poligonali disegnate in precedenza per assicurarsi che si adattino a tutti i campioni e controlli. Questo fornisce il numero percentuale e il numero di celle.
- Fai clic sul pulsante L dell'editor di layout nell'angolo in alto a sinistra sopra "Area di lavoro". Questi grafici possono quindi essere disposti ed esportati utilizzando l'editor di layout.
- Preparazione di reagenti di immunofluorescenza
- Preparare il diluente anticorpale combinando 1 g di albumina sierica bovina (BSA), 2 g di latte scremato, 10 ml di soluzione salina tamponata tris 10x (TBS), 100 μL di Tween e 90 ml di acqua distillata.
- Preparare TBST combinando 50 ml di 20x TBS, 950 mL di acqua distillata e 200 μL di Tween.
- Preparare il 10% di siero normale di cavallo (NHS) combinando 1 mL di NHS con 9 mL di diluente anticorpale (fase 8.4.1).
- Preparare l'1% di NHS combinando 1 mL di 10% NHS con 9 mL di TBST.
- Colorazione con immunofluorescenza
- Rimuovere i vetrini da -20 °C e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini tre volte in acqua distillata per 5 minuti ciascuno.
- Bloccare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente nel 10% NHS nel diluente anticorpale (punto 8.4.3).
- Diluire l'anticorpo primario (pan-citocheratina) a 1:750 nell'1% del NHS nel TBST (fase 8.4.4). Incubare i vetrini nell'anticorpo primario diluito per una notte a 4 °C.
- Il giorno successivo, lavare i vetrini tre volte con un tampone di lavaggio 1x (PBS o TBST) per 5 minuti ciascuno.
- Diluire l'anticorpo secondario a 1:1.000 nell'1% di NHS in TBST (fase 8.4.4). Incubare i vetrini nell'anticorpo secondario diluito per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini tre volte con 1x tampone di lavaggio per 5 minuti ciascuno. Montare e coprire le guide con supporti di montaggio rigidi con DAPI. Utilizzare un batuffolo di cotone per stendere delicatamente eventuali bolle sotto il coprifoglio.
Representative Results
Utilizzando questi metodi, sono state visualizzate rare popolazioni di cellule epiteliali nel sangue e nel midollo osseo di esseri umani e topi normali. Con le giuste compensazioni e controlli come descritto, i risultati hanno mostrato costantemente che il 4% -5% delle cellule nel midollo osseo murino erano EpCAM +, indipendentemente da quante cellule sono state contate, come mostrato in Figura 4 e Figura 5. Nei campioni di sangue murino, meno dello 0,5% delle cellule erano EpCAM+, come mostrato nella Figura 6. Nei campioni di midollo osseo umano, il 2% -5% delle cellule erano EpCAM +, come mostrato in Figura 7 e Figura 8. Mentre il 2% -5% è un grande intervallo, le percentuali all'interno di ogni singolo donatore erano coerenti man mano che venivano contate più cellule. Nei campioni di sangue umano, circa lo 0,3% delle cellule erano EpCAM+, come mostrato nella Figura 9. I nostri campioni di controllo (nessuna macchia, controllo isotipo e FMO) hanno prodotto pochissimi risultati EpCAM+ falsi positivi, come mostrato in Figura 4 e Figura 7. Le cellule dei gruppi EpCAM+ ed EpCAM- che sono state ordinate su vetrini hanno mostrato colorazione positiva per pan-citocheratina nei campioni EpCAM+ ed erano negative per pan-citocheratina nei campioni EpCAM-, come mostrato in Figura 10. Questi risultati indicano che gli esperimenti sono stati progettati in modo appropriato e riproducibili.
Figura 1: Topi transgenici Krt14Cre;mTmG con conta incrementale del midollo osseo. Il midollo osseo dei topi Krt1-14;mTmG è stato contato in modo incrementale. Le cellule GFP positive indicano l'espressione della cheratina 14 e sono state identificate utilizzando la citometria a flusso. Poiché sono state contate più cellule del midollo osseo, questa popolazione di cellule positive alla cheratina 14 era più facilmente identificabile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro per le cellule EpCAM+ e citocheratina+. Il midollo osseo e le cellule del sangue sono stati prima ordinati utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per separare le cellule EpCAM + ed EpCAM-. Queste cellule sono state ordinate in due diverse provette, nonché su due diversi vetrini. Le cellule smistate in provette sono state fatte girare su vetrini usando una citocentrifuga. I vetrini sono stati poi colorati utilizzando un anticorpo primario pan-citocheratina, quindi colorati con un anticorpo secondario. I vetrini sono stati analizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza per osservare l'espressione di pan-citocheratina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Software di analisi della citometria a flusso. Quando si analizzano i dati della citometria a flusso utilizzando il software di analisi, viene utilizzato il controllo senza macchia per selezionare le cellule di interesse. Le celle vengono prima selezionate con SSC-A e FSC-A, che mostrano la complessità interna e le dimensioni delle cellule. (A) Una porta poligonale è disegnata attorno alle celle. (B) Le singole celle vengono acquisite mediante il gating di SSC-A da parte di SSC-W. (C) Le cellule vive vengono acquisite mediante gating FSC-A rispetto a DAPI. (D) Le celle EpCAM negative sono escluse mediante gating a destra delle celle EpCAM negative. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi citometrica a flusso di cellule EpCAM+ nel midollo osseo di topo. I controlli di nessuna macchia, isotipo e FMO sono mostrati nel pannello superiore, con i conteggi incrementali di 50.000, 100.000 e 500.000 celle mostrati nel pannello inferiore. Questi grafici visualizzano la coerenza nelle percentuali tra i conteggi, nonostante l'aumento complessivo delle celle totali conteggiate. I pannelli a destra indicano la strategia di gating, come discusso in precedenza nella sezione di analisi della citometria a flusso e come mostrato nella Figura 3. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Le cellule EpCAM+ nel midollo osseo di topo comprendono il 5,17% ± lo 0,001% della popolazione. Sono state analizzate le cellule del midollo osseo di tre singoli topi. Sono stati inclusi i controlli appropriati per un adeguato rigore scientifico. La percentuale di cellule positive è rimasta costante tra i campioni, a causa del fatto che i topi sono geneticamente identici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Le cellule EpCAM+ nel sangue di topo comprendono lo 0,45% ± lo 0,0006% della popolazione. Sono state analizzate le cellule del sangue di due singoli topi. Sono stati inclusi controlli per dimostrare che è stata seguita la procedura corretta per produrre risultati conclusivi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Analisi citometrica a flusso su midollo osseo umano EpCAM+. I controlli di nessuna macchia, isotipo e FMO sono mostrati nel pannello superiore e i conteggi incrementali di 50.000, 100.000 e 500.000 celle sono mostrati nel pannello inferiore. Questi grafici visualizzano la coerenza nelle percentuali tra i conteggi, nonostante l'aumento complessivo delle celle totali conteggiate. I pannelli a destra indicano la strategia di gating, come discusso in precedenza nella sezione di analisi della citometria a flusso e come mostrato nella Figura 3. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Le cellule EpCAM+ nel midollo osseo umano comprendono il 3,53% ± lo 0,006% della popolazione. Sono stati analizzati tre diversi campioni di midollo osseo umano. Sono stati inclusi controlli appropriati per il rigore scientifico. La percentuale di cellule positive varia a causa dell'eterogeneità genetica tra gli esseri umani. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Le cellule EpCAM+ del sangue umano comprendono lo 0,18% ± lo 0,0004% della popolazione. Sono stati analizzati tre diversi campioni di sangue umano. Sono stati inclusi controlli appropriati per il rigore scientifico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Immunofluorescenza dei vetrini EpCAM+ ed EpCAM-. FACS è stato utilizzato per separare le celle EpCAM+ ed EpCAM-. La pan-citocheratina è stata colorata per l'utilizzo dell'anticorpo pan-citocheratina DAKO. Non è stato utilizzato alcun controllo anticorpale primario nel siero normale, poiché la pan-citocheratina è un anticorpo policlonale. Questi risultati confermano l'accuratezza di FACS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Midollo osseo umano o sangue | |||
| Anticorpo | Tubo # | # di celle | AB Conc |
| Innocente | 1 | 1x106 | X |
| Solo DAPI | 2 | 1x106 | 1uL/mL |
| Controllo isotipo PE | 3 | 1x106 | 1 uL |
| CD49f-PE Single Stain Control | 4 | 1x106 | 20 uL in 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE bassa titolazione | 5 | 1x106 | 3 uL in 100uL per 1x106 |
| Titolazione media EpCAM-PE | 6 | 1x106 | 4 uL in 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE ad alta titolazione | 7 | 1x106 | 5 uL in 100uL per 1x106 |
| EpCAM-PE High Sort su diapositive | 8 | 10x106 | 50 uL in 1 mL |
Tabella 1: Pannello di colorazione della citometria a flusso. Un esempio di un pannello di colorazione della citometria a flusso per cellule mononucleate del sangue o del midollo osseo. I controlli inclusi sono solo DAPI, controllo non colorato e controllo PE a singola macchia (PE-CD49f è stato utilizzato come controllo positivo migliore). La fluorescenza meno uno non è inclusa in questo pannello in quanto è solo un singolo colore (PE). Quando si aggiungono più coloranti fluorofori, come l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) o l'alloficocianina (APC), gli FMO dovrebbero essere inclusi escludendo un fluoroforo per ciascun controllo FMO.
File supplementare 1: Conteggio delle cellule vive mediante ematocitometro. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Ci sono alcune prove in letteratura della presenza di cellule epiteliali nel midollo osseo. In precedenza, gli articoli hanno tipicamente studiato il ruolo delle cellule epiteliali nel contesto di malattie e lesioni, come nel fegato, nei polmoni, nel tratto gastrointestinale (GI), nel timo e nella pelle14,15,16,17. Tuttavia, non si sa molto sulla presenza di queste cellule epiteliali nel midollo osseo di individui sani. Questo lavoro cerca di stabilire un metodo riproducibile, con l'obiettivo di identificare e isolare le cellule epiteliali dal sangue normale e dal midollo osseo. Questo metodo guiderà il campo in avanti per identificare perché le cellule epiteliali sono presenti e qual è il loro ruolo nel sangue e nel midollo osseo in assenza di malattia; Forse queste cellule fanno parte del normale mantenimento dei tessuti o si attivano nei momenti di lesione. Il midollo osseo è un deposito di cellule staminali; Tuttavia, non è chiaro quale possa essere il lignaggio di queste cellule epiteliali. Un recente articolo discute le cellule epiteliali derivate dal midollo osseo nel timo, che prima esprime EpCAM e il marcatore ematopoietico CD45, e poi perde la sua espressione CD45 nel tempo dopo la lesione15. La ricerca del nostro laboratorio ha anche confermato la presenza di cellule CD45 + EpCAM + all'interno di sangue sano e midollo osseo in assenza di lesione12. Tuttavia, il ruolo di queste cellule deve ancora essere determinato.
C'era bisogno di un metodo riproducibile per esaminare le cellule epiteliali all'interno del midollo osseo sano. Il metodo descritto aiuterà a caratterizzare ulteriormente queste cellule nel loro stato normale. Ci sono passaggi importanti in questo metodo per mantenere la riproducibilità. Uno dei passaggi più critici in questo protocollo è mantenere un ambiente sterile nel cappuccio durante la raccolta del midollo osseo dai topi. Se la raccolta viene effettuata da più topi, si evita la contaminazione incrociata tra i campioni utilizzando nuovi aghi e siringhe per ciascun topo. Ciò garantisce inoltre che il campione sia pulito e privo di contaminanti che potrebbero influire sui risultati. Inoltre, il numero di siringhe preparate e tubi conici etichettati per ogni mouse aggiuntivo deve essere aumentato. Un altro passo importante consiste nel lavare le ossa fino a quando un colore bianco pulito è evidente per garantire che la maggior parte delle cellule del midollo osseo siano state rimosse; Le possibilità di rilevare cellule rare aumentano in un campione più puro. È stata apportata una modifica per ottimizzare il protocollo di lisi dei globuli rossi; Sono stati testati diversi tamponi di lisi per trovare quello giusto che desse una vitalità costantemente elevata, poiché quasi la metà delle cellule veniva persa durante questa fase. Potrebbe essere necessario ottimizzare diversi reagenti e periodi di incubazione per ottenere risultati migliori in altre impostazioni.
La limitazione più significativa di questo protocollo è l'utilizzo della citometria a flusso per trovare popolazioni cellulari rare. Come discusso in precedenza, l'aggiunta di controlli e conteggi incrementali aiuta ad aumentare la specificità e l'accuratezza dell'analisi. Un'altra limitazione è che i marcatori appropriati per la popolazione di interesse devono essere identificati in anticipo. Pertanto, è necessario conoscere i marcatori chiave, gli anticorpi per la citometria a flusso e gli anticorpi compatibili con le specie bersaglio.
Questi metodi rappresentano un miglioramento rispetto ai metodi esistenti in quanto consentono l'analisi di singole cellule a una frazione del costo dell'isolatore CTC automatico esistente e del sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Inoltre, la citometria a flusso è più facilmente disponibile. FACS ha mantenuto una maggiore vitalità per le cellule rispetto ai risultati precedenti riportati utilizzando la separazione magnetica delle microsfere. Infine, queste tecniche consentono la separazione delle cellule per analisi a valle, come il sequenziamento dell'RNA di massa, il sequenziamento dello scRNA o la coltura cellulare.
Disclosures
Non sono noti conflitti di interesse.
Acknowledgments
Josh Monts, tecnico del citometro a flusso della struttura principale, The Hormel Institute
Todd Schuster, Core Facility Manager, The Hormel Institute
Derek Gordon, statistico, Rutgers University
Vorremmo ringraziare Karen Klein di Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM per la sua assistenza editoriale.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health con il numero di premio R21 AR075281 e da una sovvenzione in aiuto alla ricerca, all'arte e alla borsa di studio, Ufficio del vicepresidente per la ricerca, Università del Minnesota (proposta # 324240). Riconosciamo con gratitudine il sostegno dell'Hormel Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
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