В данной статье демонстрируется стандартизированный метод построения трехмерных опухолевых сфероидов. Также описана стратегия наблюдения сфероидов и анализа глубокого обучения на основе изображений с использованием автоматизированной системы визуализации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация 3D-опухолевых сфероидов для исследований по оценке лекарственных средств
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В последние десятилетия, в дополнение к клеткам, культивируемым монослоями, были разработаны трехмерные опухолевые сфероиды в качестве потенциально мощного инструмента для оценки противоопухолевых препаратов. Тем не менее, традиционные методы культивирования не имеют возможности манипулировать опухолевыми сфероидами гомогенным образом на трехмерном уровне. Чтобы устранить это ограничение, в этой статье мы представляем удобный и эффективный метод построения опухолевых сфероидов среднего размера. Кроме того, мы описываем метод анализа на основе изображений с использованием программного обеспечения для анализа на основе искусственного интеллекта, которое может сканировать всю пластину и получать данные о трехмерных сфероидах. Было изучено несколько параметров. Используя стандартный метод построения опухолевого сфероида и высокопроизводительную систему визуализации и анализа, эффективность и точность тестов на лекарства, выполняемых на трехмерных сфероидах, могут быть значительно увеличены.
Введение
Рак является одним из заболеваний, которых больше всего боятся люди, не в последнюю очередь из-за высокого уровня смертности1. В последние годы возможности лечения рака увеличились, поскольку были введены новые методы лечения 2,3,4,5. Двумерные (2D) и трехмерные (3D) модели in vitro используются для изучения рака в лабораторных условиях. Однако 2D-модели не могут сразу и точно оценить все важные параметры, указывающие на противоопухолевую чувствительность; следовательно, они не могут полностью представить
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Конструкция сфероида
- Антиадгезионная обработка культуральной пластины
- Пипетку 100 мкл антиадгезионного реагента в каждую лунку 48-луночной пластины с U-образным дном колодца и держать в течение 10 мин. Через 10 минут аспирируйте реагент для покрытия и дважды промойте стерилизованным PBS.
- Поместите культуральную тарелку в инкубатор (37 ° C в увлажненном воздухе с 5% CO2) до использования.
- Подготовка, сбор и подсчет клеток
- Используйте питательную среду, специфичную для клеток, для культивирования клеток в колбах для клеточных культур (дополнительная таблица 2). Напри....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1A, B показан процесс, используемый для построения опухолевых сфероидов в этом исследовании. Сначала мы засеяли клетки в 48-луночную U-образную нижнюю пластину. Этот шаг почти такой же, как и в 2D-культуре клеток. Мы держали пластину в общем инкубаторе с водой, окружающей лунки, чтобы отложенные клетки начали образовывать сфероиды в процессе самосборки. В нормальных условиях эксплуатации большинство типов опухолевых сфероидов полностью формировались через 5 дней п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Микроокружение играет важную роль в росте опухоли. Он может влиять на обеспечение внеклеточных матриц, градиенты кислорода, питание и механическое взаимодействие и, таким образом, влиять на экспрессию генов, сигнальные пути и многие функции опухолевых клеток 19,20,21. Во многих случаях 2D-клетки не производят таких эффектов или даже производят противоположные эффекты, тем самым влияя на оценку медикаментозного лечения. Однако по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Мы благодарим всех сотрудников наших лабораторий за их критический вклад и предложения. Это исследование было поддержано ключевым проектом Комиссии по здравоохранению провинции Цзянсу (K2019030). Концептуализация была проведена C.W. и Z.C., методология была выполнена W.H. и M.L., исследование было выполнено W.H. и M.L., курирование данных было выполнено W.H., Z.Z., S.X. и M.L., первоначальная подготовка проекта была выполнена Z.Z., J.Z., S.X., W.H., и X.L., обзор и редактирование были выполнены З.К., управление проектом осуществлялось К.В. и З.К., а привлечение финансирования осуществлялось К.В. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5-10 мкм; L Наконечники для пипеток | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Устойчивые к кипячению микропробирки | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μ L Наконечники для пипеток | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 мл Гнездо для центрифужных пробирок | 601052 | ||
| 200 μ L Наконечники для пипеток | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D гель | Avatarget | MA02 | |
| 48-лунка U нижняя пластина | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 мл центрифужная трубка | гнездо 602052 | ||
| Alamar Blue | Thermo | ||
| Раствор для полоскания против прилипания | STEMCELL | #07010 | |
| Сертифицированный FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Деионизированная вода | Аладдин | W433884-500мл | |
| DMEM (модифицированная среда Dulbecco's Eagle) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad призма sofware | Программное обеспечение GraphPad | ||
| Имидж-сканер с высоким содержанием и SMART-система | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J программное обеспечение | Национальный институт здравоохранения | ||
| Добавка инсулин-трансферрин-селен-А (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Парапленка | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Пенициллин/ стрептомицин Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| трипсин, 0,25% (1X) | Гиклон | SH30042,01 |
Ссылки
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
