Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Генерация 3D-опухолевых сфероидов для исследований по оценке лекарственных средств

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/65125
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,4, 2,4, 4, 2,4, 2,3, 1,2
1Department of Oncology, School of Medicine, Southeast University, 2State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, 3Institute of Medical Devices (Suzhou), Southeast University, 4Jiangsu Avatarget Biotechnology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

В данной статье демонстрируется стандартизированный метод построения трехмерных опухолевых сфероидов. Также описана стратегия наблюдения сфероидов и анализа глубокого обучения на основе изображений с использованием автоматизированной системы визуализации.

Abstract

В последние десятилетия, в дополнение к клеткам, культивируемым монослоями, были разработаны трехмерные опухолевые сфероиды в качестве потенциально мощного инструмента для оценки противоопухолевых препаратов. Тем не менее, традиционные методы культивирования не имеют возможности манипулировать опухолевыми сфероидами гомогенным образом на трехмерном уровне. Чтобы устранить это ограничение, в этой статье мы представляем удобный и эффективный метод построения опухолевых сфероидов среднего размера. Кроме того, мы описываем метод анализа на основе изображений с использованием программного обеспечения для анализа на основе искусственного интеллекта, которое может сканировать всю пластину и получать данные о трехмерных сфероидах. Было изучено несколько параметров. Используя стандартный метод построения опухолевого сфероида и высокопроизводительную систему визуализации и анализа, эффективность и точность тестов на лекарства, выполняемых на трехмерных сфероидах, могут быть значительно увеличены.

Introduction

Рак является одним из заболеваний, которых больше всего боятся люди, не в последнюю очередь из-за высокого уровня смертности1. В последние годы возможности лечения рака увеличились, поскольку были введены новые методы лечения 2,3,4,5. Двумерные (2D) и трехмерные (3D) модели in vitro используются для изучения рака в лабораторных условиях. Однако 2D-модели не могут сразу и точно оценить все важные параметры, указывающие на противоопухолевую чувствительность; следовательно, они не могут полностью представить взаимодействия in vivo при тестировании лекарственной терапии6.

С 2020 года мировой рынок трехмерной (3D) культуры значительно вырос. Согласно одному отчету NASDAQ OMX, к концу 2025 года мировая стоимость рынка 3D-клеточных культур превысит 2,7 миллиарда долларов США. По сравнению с методами 2D-культивирования, 3D-культивирование клеток обладает преимущественными свойствами, которые могут быть оптимизированы не только для пролиферации и дифференцировки, но и для долгосрочной выживаемости 7,8. Таким образом, клеточные микроокружения in vivo могут быть смоделированы для получения более точной характеристики опухоли, а также метаболического профилирования, чтобы можно было лучше понять геномные и белковые изменения. В связи с этим 3D-тест-системы теперь должны быть включены в основные операции по разработке лекарств, особенно те, которые сосредоточены на скрининге и оценке новых противоопухолевых препаратов. Трехмерные наросты иммортализированных установленных клеточных линий или первичных клеточных культур в сфероидных структурах обладают свойствами in vivo опухолей, такими как гипоксия и проникновение лекарств, а также клеточное взаимодействие, реакция и резистентность, и могут рассматриваться как строгая и репрезентативная модель для проведения скрининга лекарств in vitro 9,10,11.

Однако эти модели 3D-культуры также страдают от нескольких проблем, для решения которых может потребоваться некоторое время. Клеточные сфероиды могут быть сформированы с использованием этих протоколов, но они различаются в некоторых деталях, таких как время культивирования или встраивание гелей12, поэтому эти сконструированные клеточные сфероиды не могут хорошо контролироваться в ограниченном диапазоне размеров. Размер сфероидов может влиять на согласованность теста на жизнеспособность и анализа изображений. Микроокружение роста и факторы роста также варьируются, что может привести к различным морфологиям из-за различий в дифференцировке между клетками13. В настоящее время существует очевидная потребность в стандартном, простом и экономически эффективном методе построения всех типов опухолей с контролируемыми размерами.

С другой стороны, несмотря на то, что для оценки морфологии, жизнеспособности и скорости роста были разработаны однородные анализы и подходы к визуализации с высоким содержанием, высокопроизводительный скрининг 3D-моделей остается проблемой по различным причинам, о которых сообщается в литературе, таким как отсутствие единообразия в положении, размере и морфологии опухолевых сфероидов14,15,16.

В представленном здесь протоколе мы перечисляем каждый шаг в построении 3D-опухолевых сфероидов и описываем метод наблюдения и анализа сфероидов с использованием высокопроизводительной системы визуализации с высоким содержанием, которая включает автофокусировку, автовизуализацию и анализ, а также другие полезные характеристики. Мы показываем, как этот метод может производить 3D-опухолевые сфероиды одинакового размера, которые подходят для высокопроизводительной визуализации. Эти сфероиды также демонстрируют высокую чувствительность к медикаментозному лечению рака, и морфологические изменения в сфероидах можно контролировать с помощью визуализации с высоким содержанием. Таким образом, мы демонстрируем надежность этой методологии как средства создания 3D-опухолевых конструкций для целей оценки лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Конструкция сфероида

  1. Антиадгезионная обработка культуральной пластины
    1. Пипетку 100 мкл антиадгезионного реагента в каждую лунку 48-луночной пластины с U-образным дном колодца и держать в течение 10 мин. Через 10 минут аспирируйте реагент для покрытия и дважды промойте стерилизованным PBS.
    2. Поместите культуральную тарелку в инкубатор (37 ° C в увлажненном воздухе с 5% CO2) до использования.
  2. Подготовка, сбор и подсчет клеток
    1. Используйте питательную среду, специфичную для клеток, для культивирования клеток в колбах для клеточных культур (дополнительная таблица 2). Например, клетки NCI-H23, CT-26 культивируют в RPMI 1640, а клетки HT-29 культивируют в среде 5A Маккоя. Эти две среды дополнены 10% термоинактивированным FBS и 1% P/S соответственно.
    2. Поддерживайте все клетки в стандартных условиях культивирования (37 ° C в увлажненном воздухе с 5% CO2) во время пролиферации. Здесь клеточная линия NCI-H23 используется в качестве примера на следующих этапах.
    3. Промойте клетки, культивируемые в колбе Т25, дважды с 1x PBS, чтобы удалить питательную среду (лучше выбирать клетки в логарифмической фазе и проходить клетки при слиянии 80%-90%).
    4. Обработайте расширенные клетки 1 мл 0,25% трипсина/ЭДТА в течение 1-2 мин в инкубаторе при 37 °C, 5%CO2. Подтвердите форму клетки (в данном случае обычно круглую) под микроскопом, а затем прекратите лечение трипсином. Для этого аспирируют использованную суспензию трипсина/ЭДТА в колбу Т25 и промывают клетки 4 мл свежей среды.
    5. Перенесите всю суспензию (5 мл) в пробирку объемом 15 мл. Используйте 1 мл свежей среды, чтобы смыть остаточные клетки и добавить ее в пробирку. Центрифугируйте клетки при 186,48 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 10 мл свежей среды в клеточную гранулу, после чего аккуратно пипетируют до тех пор, пока клетки не окажутся в однородной суспензии.
    7. Аспирируйте 0,1 мл клеточной суспензии в новую центрифужную пробирку, добавьте 0,9 мл свежей среды, а затем хорошо пипетируйте суспензию.
    8. Извлеките 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток. Проведите этот процесс два-три раза и возьмите среднее значение.
    9. Разбавляют суспензию до достижения конечной плотности посева 50 000 клеток/мл в соответствии с концентрацией, полученной в процессе подсчета клеток на этапе 1.2.7.
  3. Культивирование клеток и формирование сфероидов
    1. Добавьте 200 мкл суспензии ячейки в каждую лунку 48-луночной U-образной нижней пластины.
    2. Оберните уплотнительную пленку вокруг пластины и центрифугируйте ее при 119,35 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
    3. Осторожно выньте пластину из центрифуги и снимите защитную пленку. Затем добавьте 5-8 мл стерилизованной воды в водный канал, окружающий лунки (для предотвращения испарения) и инкубируйте при 37 ° C в течение 5 дней. Не меняйте и не доливайте воду в водный канал в течение этого периода.
    4. Наблюдайте за агрегацией клеток в течение следующих 5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, клетки начинают собираться в колонии в течение 5 дней. Однако процесс построения сфероида может быть быстрее или медленнее с различными типами клеток и плотностью клеток. В связи с этим за клетками необходимо наблюдать каждый день, используя один из трех возможных методов. Во-первых, клетки можно наблюдать через дно лунки. Когда клетки еще не сформировали сфероид, на дне можно увидеть один слой клеток. Когда клетки образуют сфероид, на U-дне каждой лунки можно наблюдать плотную 3D-конструкцию. Другой метод предполагает проверку клеток под микроскопом. Когда клетки превращаются в опухолевый сфероид, в конструкцию входят три слоя (пролиферирующий слой, неактивный слой и некротическое ядро снаружи внутрь сфероида), которые имеют градиент прозрачности. Наконец, цвет питательной среды также может быть использован в наблюдательных целях. Это может быть полезно, когда трехслойная структура не может быть четко видна даже с помощью цифрового микроскопа. Когда среда превратится из пурпурно-красной в желтую, может начаться процесс встраивания сфероидов в гель. Среда не должна заменяться в период агрегации клеток.
  4. Заделка геля
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гели необходимо хранить при температуре ниже −20 °C. В частности, гели следует размещать подальше от дверцы холодильника, чтобы избежать колебаний температуры. Обратите внимание, что на этом этапе процесса гели находятся в замороженном состоянии.
    1. Возьмите замороженный гель из холодильника с температурой −20 °C и поместите его на ящик со льдом на все время эксперимента.
    2. Наблюдайте за клеточными сфероидами под микроскопом. Перед началом заделки геля состояние сфероидов следует еще раз проверить с помощью цифрового микроскопа.
    3. Осторожно удалите 150 мкл среды. Тарелку также следует поставить на ящик со льдом.
    4. Вставьте каждый сфероид в гель, медленно добавляя жидкий гель со стороны стенки лунки, перемещая предварительно охлажденный наконечник пипетки вокруг и внутри лунки. Подождите 5 минут, и если гель не распределяется равномерно, аккуратно нанесите гель наконечником пипетки объемом 10 мкл. Каждая лунка содержит опухолевый сфероид, 25 мкл геля 3,5 мг/мл и 50 мкл полной питательной среды. Также добавьте 75 мкл среды в контрольные приборы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лунка содержит один сфероид.
    5. Инкубируйте пластину при 37 °C в течение 30 минут до полного завершения гидрогелеобразования. Подтвердите статус гелеобразования под микроскопом.
    6. Наложите 125 мкл свежей среды на каждый образец.
    7. Культивируйте сфероиды еще 7-10 дней. Подготовьте группы сфероидов по четыре-шесть лунок в каждой и выберите для анализа не менее трех из них.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении теста на наркотики подготовьте две группы для одного образца. Одна группа используется для тестирования жизнеспособности, а другая — для захвата и анализа изображений.

2. Медикаментозное лечение

  1. Растворяют препарат согласно инструкции производителя. Приготовьте 100-кратные рабочие растворы с ДМСО. Готовят не менее пяти доз препарата в серийном разведении. Здесь в качестве примера используется препарат для лечения рака легких AMG 510. Состав приведен в дополнительной таблице 1.
  2. Используйте 0,1% ДМСО в качестве положительного контроля.
  3. Добавьте 125 мкл обработанной препаратом среды в каждую лунку и поместите пластину обратно в инкубатор (37 ° C в увлажненном воздухе с 5% CO2). На этом этапе каждая лунка содержит опухолевый сфероид, 25 мкл геля 3,5 мг/мл и 175 мкл среды. Контрольные элементы содержат 200 мкл среды.

3. Жизнеспособность сфероидов

  1. Измерьте жизнеспособность сфероида с помощью набора для анализа Alamar Blue в соответствии с рекомендациями производителя. Измерьте жизнеспособность с помощью микропланшетного фотометра (поглощение на длине волны 570 нм и 600 нм) после проведения обработки препаратом Аламар Блю.
  2. Измерьте жизнеспособность на 1-й, 4-й, 7-й и 10-й день после встраивания сфероидов в гель соответственно или как указано.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании анализа Alamar Blue требуется не менее 16 часов времени реакции. Поэтому добавляйте 20 мкл Alamar Blue во второй половине дня 0, 3-го, 6-го и 9-го дней.
  3. Аспирируйте 100 мкл надосадочной среды из каждой лунки в новую тестовую пластину и добавьте 80 мкл свежей среды в каждую лунку культуральной пластины. Затем замените еще 100 мкл обработанной препаратом среды. Убедитесь, что в колодце нет остатков Alamar Blue.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замена среды проводится в каждом случае, когда проверяется жизнеспособность, и обработанная препаратом среда групп анализа изображений должна быть заменена в тот же день.

4. Наблюдение за сфероидами и анализ глубокого обучения с помощью изображений в тесте на наркотики

  1. Отображение
    1. Аспирируйте 100 мкл среды перед визуализацией.
    2. Поставьте тарелку на сцену. Получение цифровых изображений сфероидов с помощью автоматизированного микроскопа с 10-кратным объективом (сначала 2-кратный объектив). Микроскоп может автоматически фокусировать и централизовать эти сфероиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: О функции автофокусировки и используемом алгоритме ранее сообщали Yazdanfar et al.17.
    3. Дождитесь автоматической визуализации. Для каждого сфероида приобретается четыре изображения. Интегрированное изображение формируется и обрабатывается с помощью программного обеспечения, подключенного к системе визуализации с высоким содержанием.
    4. Нажмите кнопку «Процесс исправления изображения» и выберите интегрированные образы в программном обеспечении.
    5. Выберите «Модель U-NET» и введите коэффициент конверсии (10-кратные объективные изображения имеют коэффициент конверсии 3,966). Нажмите в нижней части экрана ниже, чтобы начать обработку изображения. Затем сохраните данные о диаметре, периметре и шероховатости в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
    6. Вычислите индекс избыточного периметра (EPI). EPI — это отношение между периметром сфероида (P 0) и эквивалентным периметром (Pe), рассчитанное уравнением 1. Измерьте площадь сфероида в фокальной плоскости (S) по изображению J. Затем вычислите эквивалентный периметр сфероида, используя уравнение 2.
      EPI = (P o− P e)/Pe (уравнение 1)
      Equation 1(Уравнение 2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Периметр сфероида генерируется программным обеспечением с алгоритмами глубокого обучения на основе разработанной модели U-NET.
    7. Добавьте 100 мкл свежей среды с препаратом и поместите пластину обратно в инкубатор (37 °C на увлажненном воздухе с 5%CO2).
  2. Торможение сфероида
    1. Рассчитайте ингибирование роста опухоли (TGI) с помощью уравнения 3. Относительный объем сфероида (RTV) - это конечный объем по сравнению с исходным объемом (уравнение 4). Объем сфероида (V) автоматически рассчитывается программным обеспечением с использованием уравнения 5 в соответствии с выходным диаметром сфероида.
      TGI = (контроль RTV −обработка RTV)/контроль RTV × 100% (уравнение 3)
      RTV =V-клемма/V оригинал (уравнение 4)
      V = 4/3π(d/2)3 (уравнение 5)
      ПРИМЕЧАНИЕ: TGI получают со ссылкой на ингибирование роста in vivo , а опухолевый вес заменяется RTV. Контроль RTV - относительный объем сфероида контрольной группы,обработка RTV - относительный объем сфероида в группе, испытанной на лекарственном средстве,V-конец - объем сфероида в последний день,V исходный - объем сфероида в первый день культивирования, а d представляет собой диаметр сфероида.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1A, B показан процесс, используемый для построения опухолевых сфероидов в этом исследовании. Сначала мы засеяли клетки в 48-луночную U-образную нижнюю пластину. Этот шаг почти такой же, как и в 2D-культуре клеток. Мы держали пластину в общем инкубаторе с водой, окружающей лунки, чтобы отложенные клетки начали образовывать сфероиды в процессе самосборки. В нормальных условиях эксплуатации большинство типов опухолевых сфероидов полностью формировались через 5 дней при использовании целевой среды (дополнительная таблица 2). Мы проверили состояние построения сфероида в течение 5 дней с помощью цифрового микроскопа (рис. 1D). После того, как процесс роста был завершен, добавляли гель для обертывания отдельных сфероидов в каждой лунке, создавая in vivo подобный внеклеточный матрикс (ECM) для каждого сфероида. Затем было проведено тестирование на наркотики. Поскольку мы использовали систему визуализации с высоким содержанием с программным обеспечением для анализа глубокого обучения (рис. 1C), мы могли четко наблюдать рост отдельных сфероидов (рис. 1E) и получать значения подходящих параметров для определения характеристик во время лекарственной терапии, включая жизнеспособность, диаметр и шероховатость.

Figure 1
Рисунок 1: Формирование опухолевого сфероида и автоматизированная визуализация и анализ. (A) Схема, показывающая стандартную процедуру культивирования опухолевого сфероида с приведенной ниже временной шкалой. (B) Схема тестирования медикаментозного лечения с использованием опухолевых сфероидов, показывающих различные уровни инвазивности в 3D-матрицах. (C) Изображение основанной на алгоритмах системы автоматизированной визуализации и анализа, основанной на глубоком обучении, с указанием следующих деталей: платформа пластины; конденсатор с источником света; моторизованная ступень X, Y; моторизованный модуль оси Z; колесо объектива; колесо фильтра; ПЗС; и компьютер с разработанным системным программным обеспечением. (D) Образование опухолевых сфероидов NCI-H23 из монослойных клеток, наблюдаемых из окуляра микроскопа. Масштабная линейка представляет собой 500 мкм. (E) Изменение инвазивности и размера сфероидов NCI-H23 без медикаментозного лечения в течение 10 дней. Масштабные линейки представляют 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этом исследовании мы использовали противоопухолевый препарат AMG510, чтобы проверить его влияние на лечение немелкоклеточного рака легкого. Система анализа предоставляла данные изображения без сложной обработки изображений. Изображения светлого поля на рисунке 2 показывают, что рост сфероидов NCI-H23 может быть ингибирован AMG510. На это указывало уменьшение размера наряду с повышенной концентрацией. Напротив, размер увеличивался в контрольной группе в течение 10 дней. В этот период изменялась и шероховатость краевой стороны, свидетельствующая об инвазивности. Сфероиды показали плоские края на 1-й день, но шероховатые края на 10-й день. Однако следует отметить, что сравнение шероховатостей на изображениях светлого поля само по себе является сложной задачей. Следует также упомянуть, что стандартный метод включает сфероиды соответствующего среднего размера. Наконец, отметим, что с помощью этого метода был достигнут чистый фон, так как ко дну прилипло мало ячеек.

Figure 2
Рисунок 2: Изображения светлого поля клеточных сфероидов NCI-H23, обработанных различными концентрациями AMG510, автоматически захваченные микроскопом с высоким содержанием. Столбцы представляют разные дни, а строки представляют разные концентрации наркотиков. Результаты включают три сфероида для каждого состояния. Все изображения были автоматически сфокусированы с 2-кратным увеличением, а затем захвачены с 10-кратным увеличением системой визуализации с высоким содержанием с использованием программного обеспечения на основе искусственного интеллекта и контроллера микросреды, связанного с микроскопом. Масштабные линейки представляют 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты жизнеспособности клеток, показанные на рисунке 3А, продемонстрировали снижение жизнеспособности в 10-дневных культурах образцов, обработанных лекарственным средством, на всех уровнях дозировки по сравнению с контролем. Образцы с концентрацией более 0,01 мкМ показали быстрое снижение жизнеспособности опухолевых клеток, что указывает на чувствительность терапии AMG510 к немелкоклеточному раку легкого. На 10-й день эти образцы продемонстрировали аналогичные уровни конечной жизнеспособности со значениями ниже 70%, как показано на рисунке 3B.

Figure 3
Рисунок 3: Жизнеспособность опухолевых сфероидов групп образцов, обработанных AMG510. Препараты были добавлены на 1-й день. (A) Жизнеспособность сфероида опухоли измеряли на 1-й, 4-й, 7-й и 10-й день. (B) Жизнеспособность конечных клеток образцов с градиентами концентрации. Концентрации препарата, используемые для лечения каждого опухолевого сфероида, были установлены от 0,001 мкМ до 5 мкМ. Все данные представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 4А показана аналогичная тенденция в отношении анализа диаметра сфероида. Образцы с концентрацией выше 0,01 мкМ показали очевидное уменьшение среднего диаметра. Однородность размера сфероида также можно было увидеть в первый день лечения препаратом со значениями около 800 мкм. Соотношения диаметров этих сфероидов (рис. 4B) указывали на сокращение во время совместной культуры AMG510 заметно более очевидным образом, чем тест на жизнеспособность. Кроме того, мы рассчитали значения ингибирования роста сфероидных опухолей с точки зрения их диаметров, как показано на рисунке 4C. Значение TGI является относительным параметром оценки, и значения могут указывать на снижение роста в результате исходных различий в посеве между сфероидами; однако мы снова получили результат, что концентрации более 0,01 мкМ оказали очевидное влияние на успех лечения AMG510. В более раннем исследовании мы экспериментировали со значением IC50, которое является важным показателем для тестирования на наркотики; однако мы обнаружили, что сфероиды NCI-H23 при обработке AMG510 не проявляли изменений в этом параметре.

Figure 4
Рисунок 4: Размер опухоли, представленный диаметрами сфероидов в контрольной группе и группе образцов, обработанных AMG510. (A) Диаметры опухолевых сфероидов измеряли на 1-й, 4-й, 7-й и 10-й день. (B) Коэффициент роста сфероида был определен как конечный объем по отношению к исходному объему и рассчитан с использованием диаметров сфероидов. (C) Коэффициент ингибирования роста сфероида был определен относительно объема и рассчитан с использованием диаметров сфероидов. Концентрации AMG510, используемые для лечения каждого опухолевого сфероида, были установлены в диапазоне от 0,001 мкМ до 5 мкМ. Все данные представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Затем мы провели дальнейшую оценку инвазивности сфероидов с точки зрения значений шероховатости, полученных программным обеспечением (рис. 5A), а также индекса избыточного периметра на основе границ сфероидов, полученных теми же способами (рис. 5B). Более высокая шероховатость означает, что больше клеток мигрирует из сфероида в гель, что, таким образом, представляет собой более высокую инвазивность. Результаты контроля сравнивали с различными уровнями концентрации лекарственного средства. Для NCI-H23, инвазивной клеточной линии, шероховатость сфероида и значения EPI увеличивались со временем культивирования без какой-либо медикаментозной обработки18, и это может быть доказано изображениями светлого поля и увеличением диаметра в контрольных образцах. Тем не менее, рост был ослаблен обработкой AMG510, полностью пропорционально изменениям в размере.

Figure 5
Рисунок 5: Распознавание границ опухоли в контрольной группе без лечения и в группах образцов, обработанных AMG510. Препараты были добавлены на 1-й день. (A) Шероховатость опухоли измерялась программным обеспечением на 1-й, 4-й, 7-й и 10-й день, что указывает на инвазивность опухолевых сфероидов. (B) Периметр сфероида был обнаружен и нарисован программным обеспечением с использованием алгоритмов глубокого обучения. Затем области сфероидов в фокальной плоскости были измерены по изображению J, и на основе этих данных был рассчитан индекс избыточного периметра. Концентрации AMG510, используемые для лечения каждого опухолевого сфероида, были установлены в диапазоне от 0,001 мкМ до 5 мкМ. Все данные представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Состав пластины. В эксперименте использовался противоопухолевый препарат AMG510, а группы были установлены в соответствии с градиентами лекарств. Были использованы две пластины: одна для теста набора для анализа жизнеспособности и одна для анализа изображений.

Дополнительная таблица 2: Клеточные линии, которые использовались в 3D-конструировании опухолей и тестировании лекарств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти таблицы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Микроокружение играет важную роль в росте опухоли. Он может влиять на обеспечение внеклеточных матриц, градиенты кислорода, питание и механическое взаимодействие и, таким образом, влиять на экспрессию генов, сигнальные пути и многие функции опухолевых клеток 19,20,21. Во многих случаях 2D-клетки не производят таких эффектов или даже производят противоположные эффекты, тем самым влияя на оценку медикаментозного лечения. Однако появление 3D-моделей решило эту проблему. Например, наша оценка влияния AMG510 на систему лечения рака легких была завершена с использованием 3D-методов. Мы построили 3D-модель опухоли-сфероида-ECM (TSE), создав опухолевые сфероиды, встроенные в гель, для мониторинга лечения AMG510 на инвазивной клеточной линии, связанной с легкими. AMG510 является новым ингибитором, который нацелен на G12C-мутант KRAS22, и его эффективность была подтверждена нашими открытиями о том, что немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), с которым сталкиваются некоторые пациенты, реагируют на этот мутант. Из нашей серии экспериментальных данных и анализа можно выделить некоторые очень ценные данные. Чувствительность к AMG510 была значительно повышена в условиях 3D-сфероида по сравнению с 2D-состоянием и еще больше улучшилась в условиях гипоксии.

Модели, построенные с помощью настоящего метода, обладают рядом преимуществ. Во-первых, в качестве 3D-модели он может хорошо имитировать опухоль и внеклеточный матрикс. Простой, но эффективный метод построения 3D-опухолевых сфероидов позволяет клеткам выживать в течение 2 недель. После 5 дней строительства сфероида доступен период около 10 дней, что достаточно для проведения любого тестирования на наркотики. Кроме того, метод производства 3D-клеточных культур практически не отличается от 2D-метода, а его стоимость намного ниже, чем у 3D-биопечати. По сравнению с другими методами, такими как метод висячей капли, описанный здесь способ помогает получить более однородные сфероиды, а размер ячеек полностью контролируется типом и плотностью ячеек. Наконец, было показано, что эта модель применима к различным типам раковых клеток, и эта гибкость может оказаться особенно ценной. В будущем исследователи, занимающиеся образованием опухолевых сфероидов, могут добавлять не только фибробласты и эндотелиальные клетки к своим суспензиям опухолевых клеток, но и иммунные клетки, такие как Т-клетки и NK-клетки, чтобы стимулировать миграцию стромальных клеток и усиливать иммунотерапевтические эффекты новых лекарств23,24.

В последние десятилетия лишь немногие доклады были посвящены описанию методов и инструментов, доступных в настоящее время для извлечения важных биологических данных из 3D-моделей25. Эту информацию можно считать основополагающей для тестирования лекарств и терапевтических открытий с использованием 3D-моделей клеточных культур26. В исследовании Zanoni et al. описано новое программное обеспечение с открытым исходным кодом, которое выполняет автоматический анализ изображений 3D-колоний опухолей. Авторы показали, что морфологические параметры влияют на реакцию крупных сфероидов на медикаментозное лечение и что размер и форма сфероидов могут быть источниками изменчивости27. Однако с опухолевыми сфероидами, культивируемыми в 3D-геле, которые имитируют ECM in vivo, поведение клеток намного сложнее, и может проявляться инвазивность. Хотя данные касаются только размера и формы, такие ограничения останутся. Многие надежные и разнообразные параметры могут быть получены с помощью системы визуализации с высоким содержанием. Такие системы могут не только определять жизнеспособность клеток и форму сфероида, но также могут обнаруживать и проверять характеристики опухолей и ингибирующее действие лекарств на опухоли. Инвазивность также может быть определена такими средствами. Например, инвазивная опухоль может иметь относительно более высокое значение шероховатости, в то время как неинвазивная опухоль может иметь более высокое значение EPI. Изменения таких значений могут свидетельствовать о различных эффектах препарата. В будущем мы надеемся объединить эти методы с микрофлюидными чипами для получения более удобных и эффективных стратегий.

Стандартизированный метод, описанный здесь, может удовлетворить требования большинства скрининговых и оценочных тестов на лекарственные средства. Тем не менее, все еще есть некоторые проблемы, которые могут возникнуть в ходе будущих экспериментов. Например, клетки могут прилипать к внутренним стенкам лунок после центрифугирования, или питательная среда может быть неподходящей. Кроме того, гель, используемый в протоколе, а также широко используемый Матригель может легко гелифицироваться во время длительного процесса. Однако большинство из этих проблем могут быть решены с помощью стандартных методов эксплуатации и оптимизации. У этого метода есть и другие возможные ограничения. Из-за структуры сфероида питательные вещества, кислород и диффузия отходов через сфероид зависят от размера. Жизнеспособность клеток в ядре сфероида может быть поставлена под угрозу, когда диаметр сфероида превышает 1000 мкм. И наоборот, становится трудно наблюдать вторжение, когда диаметр ниже 400 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Мы благодарим всех сотрудников наших лабораторий за их критический вклад и предложения. Это исследование было поддержано ключевым проектом Комиссии по здравоохранению провинции Цзянсу (K2019030). Концептуализация была проведена C.W. и Z.C., методология была выполнена W.H. и M.L., исследование было выполнено W.H. и M.L., курирование данных было выполнено W.H., Z.Z., S.X. и M.L., первоначальная подготовка проекта была выполнена Z.Z., J.Z., S.X., W.H., и X.L., обзор и редактирование были выполнены З.К., управление проектом осуществлялось К.В. и З.К., а привлечение финансирования осуществлялось К.В. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-10 μL Pipette tips AXYGEN T-300
1.5 mL Boil proof microtubes Axygen MCT-150-C
100-1000μL Pipette tips KIRGEN KG1313
15 mL Centrifuge Tube Nest 601052
200 μL Pipette tips AXYGEN T-200-Y
3D gel Avatarget MA02
48-well U bottom Plate Avatarget P02-48UWP
50 mL Centrifuge Tube Nest 602052
Alamar Blue Thermo  DAL1100
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL #07010
Certified FBS BI 04-001-1ACS
Deionized water aladdin W433884-500ml
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Gibco 11965-092
DMSO sigma D2650-100ML
Excel sofware  Microsoft office
Graphpad prism sofware  GraphPad software 
High Content Imager and SMART system Avatarget 1-I01
Image J software National Institutes of Health
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) Gibco 51300-044
Parafilm Bemis PM-996
PBS Solarbio P1020
Penicillin/streptomycin Sol Gibco 15140-122
RPMI 1640 Gibco 11875-093
Scientific Fluoroskan Ascent Thermo Fluoroskan Ascent
T25 Flask JET Biofil TCF012050
Trypsin, 0.25% (1X) Hyclone SH30042.01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
  2. Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
  3. Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
  4. Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
  5. Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
  6. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
  9. Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
  10. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).
  11. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  12. Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
  13. Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
  14. Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  15. Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
  16. Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
  17. Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
  18. Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
  19. Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
  20. Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
  21. Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
  22. Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
  23. Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
  24. Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
  25. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  26. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
  27. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).

Tags

Исследование рака выпуск 192
Генерация 3D-опухолевых сфероидов для исследований по оценке лекарственных средств
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hou, W., Zhang, Z., Zhang, J., Xu,… More

Hou, W., Zhang, Z., Zhang, J., Xu, S., Li, M., Li, X., Chen, Z., Wang, C. Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies. J. Vis. Exp. (192), e65125, doi:10.3791/65125 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter