Summary
この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。
Abstract
ここ数十年で、単層培養細胞に加えて、抗がん剤を評価するための潜在的に強力なツールとして、3次元腫瘍スフェロイドが開発されてきました。しかし、従来の培養方法では、腫瘍スフェロイドを三次元レベルで均質に操作する能力が欠けていました。この制限に対処するために、本論文では、平均的なサイズの腫瘍スフェロイドを構築するための便利で効果的な方法を提示します。さらに、プレート全体をスキャンして3次元回転楕円体のデータを取得できる人工知能ベースの解析ソフトウェアを使用した画像ベースの解析方法についても説明します。いくつかのパラメータが研究された。腫瘍スフェロイド構築の標準的な方法とハイスループットイメージングおよび解析システムを使用することにより、3次元スフェロイドで実行される薬物検査の有効性と精度を劇的に向上させることができます。
Introduction
癌は、特に死亡率が高いため、人間が最も恐れている病気の1つです1。近年、新しい治療法が導入されるにつれて、癌を治療する可能性が高まっています2,3,4,5。2次元(2D)および3次元(3D)in vitroモデルは、実験室環境で癌を研究するために使用されます。ただし、2Dモデルは、抗腫瘍感受性を示すすべての重要なパラメーターを即座に正確に評価することはできません。したがって、それらは薬物療法試験におけるin vivo相互作用を完全に表すことができない6。
2020年以降、世界の3次元(3D)培養市場は大幅に拡大しています。NASDAQ OMXのあるレポートによると、3D細胞培養市場の世界的な価値は2025年末までに27億米ドルを超えるでしょう。2D培養法と比較して、3D細胞培養は増殖と分化だけでなく、長期生存のためにも最適化できる有利な特性を示します7,8。このような手段により、in vivo細胞の微小環境をシミュレートして、より正確な腫瘍の特性評価と代謝プロファイリングを取得できるため、ゲノムおよびタンパク質の変化をよりよく理解できます。このため、3Dテストシステムは、特に新規抗腫瘍薬のスクリーニングと評価に焦点を当てた主流の医薬品開発業務に含める必要があります。スフェロイド構造における不死化樹立細胞株または初代細胞培養物の三次元増殖は、低酸素症や薬物浸透などの腫瘍のin vivoの特徴、ならびに細胞相互作用、応答、耐性を有しており、in vitro薬物スクリーニングを行うための厳格で代表的なモデルと見なすことができます9,10,11。
ただし、これらの3D培養モデルには、解決に時間がかかる可能性のあるいくつかの問題もあります。細胞スフェロイドはこれらのプロトコルを用いて形成することができるが、培養時間や包埋ゲル12などの特定の詳細が異なるため、これらの構築された細胞スフェロイドは、限られたサイズ範囲では十分に制御できない。スフェロイドのサイズは、生存率試験と画像解析の一貫性に影響を与える可能性があります。増殖微小環境および成長因子も様々であり、細胞13間の分化の違いにより異なる形態をもたらし得る。現在、制御されたサイズですべてのタイプの腫瘍を構築するための標準的で単純で費用効果の高い方法が明らかに必要とされています。
別の観点からは、形態、生存率、および増殖速度を評価するために均質アッセイおよびハイコンテントイメージングアプローチが開発されてきたが、3Dモデルのハイスループットスクリーニングは、腫瘍スフェロイドの位置、サイズ、および形態の均一性の欠如など、文献で報告されているさまざまな理由により依然として課題である14、15、16。
ここで紹介するプロトコルでは、3D腫瘍スフェロイドの構築における各ステップをリストし、オートフォーカス、オートイメージング、および分析などの有利な特性を含むハイスループット、ハイコンテントイメージングシステムを使用したスフェロイド観察および分析の方法について説明します。この方法では、ハイスループットイメージングに適した均一なサイズの3D腫瘍スフェロイドをどのように生成できるかを示します。これらのスフェロイドは、抗がん剤治療に対しても高い感受性を示し、スフェロイドの形態学的変化は、ハイコンテントイメージングを使用して監視できます。要約すると、薬物評価目的で3D腫瘍構築物を生成する手段として、この方法論の堅牢性を実証します。
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Protocol
1.回転楕円体構造
- 培養プレートの付着防止処理
- 癒着防止試薬100 μLをU字型ウェル底部を有する48ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れ、10分間保持する。10分後、コーティング試薬を吸引し、滅菌PBSで2回洗浄した。
- 培養プレートを使用時までインキュベーター(5%CO2で加湿空気中37°C)に入れる。
- 細胞の調製、収集、および計数
- 細胞に特異的な培養液を使用して、細胞培養フラスコ内で細胞を培養する(補足表2)。例えば、NCI-H23、CT-26細胞はRPMI 1640で培養され、HT-29細胞はマッコイの5A培地で培養されます。これら2つの培地には、それぞれ10%の熱不活化FBSと1%のP / Sが補充されています。
- 増殖中は、すべての細胞を標準培養条件(5%CO2を含む加湿空気中で37°C)に維持します。ここでは、NCI-H23細胞株を以下の工程で一例として用いる。
- T25フラスコで培養した細胞を1x PBSで2回洗浄して培養液を除去します(対数期の細胞を選択し、80%〜90%のコンフルエントで細胞を継代することをお勧めします)。
- 増殖した細胞を1 mLの0.25%トリプシン/EDTAで、37°C、5%CO2のインキュベーターで1〜2分間処理します。顕微鏡で細胞の形状(この場合は通常円形)を確認し、トリプシン処理を中止します。これを行うには、T25フラスコで使用済みのトリプシン/EDTA懸濁液を吸引し、4 mLの新しい培地で細胞を洗浄します。
- すべての懸濁液(5 mL)を15 mLチューブに移します。1 mLの新鮮な培地を使用して残留細胞を洗い流し、チューブに追加します。細胞を186.48 x g で室温で5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、10 mLの新鮮な培地を細胞ペレットに加え、細胞が均一な懸濁液になるまで穏やかにピペッティングします。
- 0.1 mLの細胞懸濁液を新しい遠沈管に吸引し、0.9 mLの新しい培地を加えてから、懸濁液をピペットでよくピペットで移します。
- 細胞計数のために10 μLの細胞懸濁液を抽出します。このプロセスを2〜3回実行し、平均値を取ります。
- ステップ1.2.7の細胞計数プロセスから得られた濃度に従って、懸濁液を希釈して最終播種密度50,000 cells/mLに到達させます。
- 細胞培養とスフェロイド形成
- 200 μLの細胞懸濁液を48ウェルU底プレートの各ウェルに加えます。
- シーリングフィルムをプレートに巻き付け、119.35 x g で室温で5分間遠心分離します。
- プレートを遠心分離機から慎重に取り出し、保護フィルムを引き剥がします。次に、5〜8 mLの滅菌水をウェルを囲む水路に追加し(蒸発を防ぐため)、37°Cで5日間インキュベートします。期間中は、水路に水を交換/補充しないでください。
- 次の5日間に細胞凝集を観察します。
注:一般に、細胞は5日以内にコロニーとして凝集し始めます。しかしながら、スフェロイド構築のプロセスは、異なる細胞タイプおよび細胞密度により、より速くまたは遅くなり得る。このため、細胞は3つの可能な方法のうちの1つを使用して毎日観察されなければなりません。まず、細胞をウェルプレートの底部を通して観察することができる。細胞がまだ回転楕円体を形成していない場合、細胞の単層が底に見える。細胞が回転楕円体を形成すると、各ウェルのU底に高密度の3D構築物が観察されます。別の方法は、顕微鏡下で細胞をチェックすることを含む。細胞が腫瘍スフェロイドになると、構造には3つの層(増殖層、不活性層、およびスフェロイドの外側から内側への壊死コア)が含まれ、透明度の勾配があります。最後に、培地の色は観察目的にも使用できます。これは、デジタルマイクロスコープを使用しても3層構造がはっきりと見えない場合に役立ちます。培地が紫赤色から黄色に変わると、スフェロイドをゲルに埋め込むプロセスが開始されます。細胞凝集期間中に培地を交換しないでください。
- ゲル包埋
注:ゲルは-20°C未満の温度で保存する必要があります。 特に、ゲルは温度変動を避けるために冷蔵庫のドアから遠く離れた場所に配置する必要があります。プロセスのこの段階では、ゲルは凍結状態にあることに注意してください。- -20°Cの冷蔵庫から冷凍ゲルを取り出し、実験中ずっとアイスボックスに置きます。
- 細胞スフェロイドを顕微鏡で観察します。ゲルの包埋を開始する前に、スフェロイドの状態をデジタル顕微鏡で再度確認する必要があります。
- 150 μLの培地を慎重に除去します。プレートもアイスボックスに置く必要があります。
- ウェルの壁側から液体ゲルをゆっくりと加え、予冷したピペットチップをウェルの周りと内側に動かして、各スフェロイドをゲルに埋め込みます。5分間待ってから、ゲルが均等に広がらない場合は、10 μLのピペットチップでゲルを静かにピペットでピペットします。各ウェルには、腫瘍スフェロイド、25 μLの3.5 mg/mLゲル、および50 μLの完全培地が含まれています。75 μLの培地もコントロールに追加します。
注:各ウェルには1つの回転楕円体が含まれています。 - ヒドロゲル化が完全に完了するまで、プレートを37°Cで30分間インキュベートします。ゲル化状態を顕微鏡で確認する。
- 各サンプルに125 μLの新鮮な培地を重ねます。
- スフェロイドをさらに7〜10日間培養します。それぞれ4〜6個のウェルを持つスフェロイドのグループを準備し、分析用に少なくとも3つを選択します。
注:薬物検査を行う場合は、1つのサンプルに対して2つのグループを準備してください。1つのグループは生存率テストに使用され、もう1つのグループは画像のキャプチャと分析に使用されます。
2.薬物治療
- 製造元の指示に従って薬を溶かしてください。DMSOで100倍の実用的な溶液を調製します。段階希釈で少なくとも5回分の薬物を調製する。ここでは、肺癌治療薬AMG 510を例に挙げて用いる。組成を 付表1に示す。
- ポジティブコントロールとして0.1%DMSOを使用します。
- 125 μLの薬物処理培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します(5%CO2を含む加湿空気中で37°C)。この段階では、各ウェルには腫瘍スフェロイド、25 μLの3.5 mg/mLゲル、および175 μLの培地が含まれています。コントロールには200μLの培地が含まれています。
3.スフェロイドの生存率
- メーカーのガイドラインに従って、Alamar Blueアッセイキットを使用してスフェロイドの生存率を測定します。アラマーブルー処理を行った後のマイクロプレート光度計(570nmおよび600nmにおける吸光度)を用いて生存率を測定する。
- スフェロイドをゲルに包埋した後の1日目、4日目、7日目、および10日目の生存率をそれぞれ、または示されているように測定します。
注:Alamar Blueアッセイを使用する場合、少なくとも16時間の反応時間が必要です。したがって、0日目、3日目、6日目、および9日目の午後に20μLのアラマーブルーを追加します。 - 各ウェルの上清培地100 μLを新しい試験プレートに吸引し、培養プレートの各ウェルに新鮮な培地80 μLを加えます。次に、さらに100μLの薬物処理培地を交換します。井戸にアラマーブルーの残骸がないことを確認してください。
注:培地交換は、生存率がテストされるたびに行われ、画像解析グループの薬物処理培地は同じ日に交換する必要があります。
4. 薬物検査における画像によるスフェロイド観察と深層学習解析
- イメージング
- イメージング前に培地100 μLを吸引します。
- プレートをステージに置きます。スフェロイドのデジタル画像は、10倍の対物レンズ(最初は2倍の対物レンズ)を備えた自動顕微鏡を使用して取得します。顕微鏡は、これらのスフェロイドを自動的に焦点を合わせ、集中させることができます。
注:オートフォーカス機能と使用されるアルゴリズムは、Yazdanfarらによって以前に報告されています17。 - 自動イメージングを待ちます。各回転楕円体について4つの画像が取得されます。統合された画像が形成され、ハイコンテントイメージングシステムに接続されたソフトウェアで処理されます。
- 「画像パッチプロセス」ボタンをクリックして、ソフトウェアに統合された画像を選択します。
- 「U-NETモデル」を選択し、コンバージョン率を入力します(10倍の対物レンズ画像のコンバージョン率は3.966です)。下の画面下部をクリックして、画像処理を開始します。次に、直径、周囲長、粗さのデータをスプレッドシートソフトウェアに保存します。
- 超過ペリメーター指数(EPI)を計算します。EPIは、式1で計算された回転楕円体の周囲長(P0)と等価の周囲長(P e)の比率です。画像Jを使用して、焦点面(S)での回転楕円体の面積を測定します。次に、式2を使用して回転楕円体の等価周囲長を計算します。
EPI = (P o− P e)/Pe (式 1)
(式 2)
注:回転楕円体の周囲長は、開発されたU-NETモデルに基づくディープラーニングアルゴリズムを使用してソフトウェアによって生成されます。 - 薬剤を含む100 μLの新鮮な培地を加え、プレートをインキュベーターに戻します(5%CO2を含む加湿空気中で37°C)。
- スフェロイド阻害
- 式3を使用して腫瘍増殖阻害(TGI)を計算します。相対回転楕円体体積(RTV)は、元の体積(式4)に対する終端体積です。回転楕円体の体積(V)は、回転楕円体の直径の出力に応じて、式5を使用してソフトウェアによって自動的に計算されます。
TGI = (RTV コントロール− RTV治療)/RTVコントロール × 100% (式 3)
RTV = V端子/Vオリジナル (式 4)
V = 4/3π(d/2)3 (式 5)
注:TGIは 、in vivo 増殖阻害を参照して得られ、腫瘍重量はRTVに置き換えられます。RTVコントロール は対照群の相対スフェロイド体積、RTV処理 は薬物試験群の相対スフェロイド体積、V末端 は最終日のスフェロイドの体積、Vオリジナル は培養初日のスフェロイドの体積、 d はスフェロイド直径を表す。
- 式3を使用して腫瘍増殖阻害(TGI)を計算します。相対回転楕円体体積(RTV)は、元の体積(式4)に対する終端体積です。回転楕円体の体積(V)は、回転楕円体の直径の出力に応じて、式5を使用してソフトウェアによって自動的に計算されます。
(式 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1A、B は、この研究で腫瘍スフェロイドを構築するために使用されたプロセスを示しています。まず、細胞を48ウェルU底プレートに播種しました。この工程は、2D細胞培養で使用される工程とほぼ同じです。プレートをウェルを囲む水を備えた共通のインキュベーターに保管し、沈着した細胞が自己組織化プロセスでスフェロイドを形成し始めるようにしました。通常の操作条件下では、ほとんどの種類の腫瘍スフェロイドは、標的培地を使用した5日後に完全に形成されました(補足表2)。5日以内の回転楕円体構造の状態をデジタルマイクロスコープで確認しました(図1D)。増殖プロセスが完了した後、ゲルを添加して各ウェル内の個々のスフェロイドを包み込み、各スフェロイドの in vivo様細胞外マトリックス(ECM)を作製しました。その後、薬物検査が実施されました。ディープラーニング解析ソフトウェア(図1C)を搭載したハイコンテントイメージングシステムを使用したため、個々のスフェロイドの成長を明確に観察し(図1E)、生存率、直径、粗さなどの薬物療法中の特性を決定するための適切なパラメーターの値を取得することができました。
図1:腫瘍スフェロイド形成と自動イメージングおよび分析 。 (A)標準的な腫瘍スフェロイド培養手順を以下のタイムラインで示す模式図。(B)3Dマトリックスでさまざまなレベルの侵襲性を示す腫瘍スフェロイドを使用した薬物治療検査の概略図。(C)自動イメージングと分析のためのディープラーニングベースのアルゴリズム関連システムの画像は、次のような詳細を示しています。光源付きコンデンサー;電動X、Yステージ;電動Z軸モジュール;対物レンズホイール;フィルターホイール;CCD;開発されたシステムソフトウェアを搭載したコンピュータ。(D)顕微鏡の接眼レンズから観察された単層細胞からのNCI-H23腫瘍スフェロイドの形成。スケールバーは500μmを表します。 (E)薬物処理なしのNCI-H23スフェロイドの10日間の侵襲性とサイズの変動。スケールバーは200μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
本研究では、抗腫瘍薬AMG510を用いて、非小細胞肺癌に対する効果を検証した。解析システムは、複雑な画像処理なしで画像データを提供しました。 図2 の明視野画像は、NCI-H23スフェロイドの成長がAMG510によって阻害される可能性があることを示しています。これは、濃度の増加とともにサイズの減少によって示されました。対照的に、サイズは対照群で10日間増加した。この間、侵襲性を示すエッジ側の粗さも変化した。回転楕円体は1日目に平坦なエッジを示しましたが、10日目には粗いエッジを示しました。ただし、明視野画像だけで粗さを比較することは困難な作業であることに注意してください。標準的な方法は、適切に平均サイズのスフェロイドを含むことにも言及すべきである。最後に、この方法を使用して、底に付着した細胞がほとんどないため、きれいな背景が達成されたことに注意してください。
図2:高濃度顕微鏡で自動的に撮影された異なる濃度のAMG510で処理されたNCI-H23細胞スフェロイドの明視野画像。 列は異なる日を表し、行は異なる薬物濃度を表します。結果には、各条件の3つのスフェロイドが含まれます。すべての画像は、2倍の倍率で自動的に焦点が合った後、人工知能ベースのソフトウェアと顕微鏡関連の微小環境コントローラーを使用して、ハイコンテントイメージングシステムによって10倍の倍率でキャプチャされました。スケールバーは200μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3Aに示す細胞生存率の結果は、対照と比較した場合、すべての用量レベルで薬物処理サンプルの10日間の培養において生存率の低下を示した。0.01 μMを超える濃度のサンプルは、腫瘍細胞の生存率の急速な低下を示し、非小細胞肺癌に対するAMG510療法の感受性を示しました。10日目に、これらのサンプルは、図3Bに示すように、70%未満の値で、同様のレベルの最終生存率を示しました。
図3:AMG510処理サンプル群の腫瘍スフェロイド生存率。 薬は1日目に追加されました。(A)腫瘍スフェロイド生存率は、1日目、4日目、7日目、および10日目に測定されました。(B)濃度勾配を有するサンプルの末端細胞生存率。各腫瘍スフェロイドの治療に用いた薬物濃度は、0.001 μMから5 μMに設定しました。すべてのデータは、SEM±平均値として表されます(n = 3)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4Aは、回転楕円体の直径解析に関して同様の傾向を示している。0.01 μMを超える濃度のサンプルは、平均直径の明らかな減少を示しました。スフェロイドサイズの均一性は、薬物治療の初日にも見られ、値は約800μmでした。これらのスフェロイドの直径比(図4B)は、AMG510共培養中の収縮を生存率試験よりも目に見えて明白な方法で示しました。さらに、図4Cに示すように、スフェロイド腫瘍増殖抑制値をそれらの直径の観点から計算した。TGI値は相対的な評価パラメータであり、値はスフェロイド間の元の播種の違いの結果として成長が低下したことを示している可能性があります。しかし、0.01 μMを超える濃度がAMG510治療の成功に明らかな影響を与えるという結果を再び得られました。以前の研究では、薬物検査の重要な指標であるIC50値を実験しました。しかし、AMG510処理下のNCI-H23スフェロイドは、このパラメータに変化を示さなかったことがわかりました。
図4:対照およびAMG510処理サンプル群におけるスフェロイド直径で表される腫瘍サイズ 。 (A)腫瘍スフェロイド径は、1日目、4日目、7日目、および10日目に測定されました。(B)スフェロイド成長率は、元の体積に対する末端体積として定義され、スフェロイド直径を使用して計算されました。(C)スフェロイド成長阻害率は体積に対して定義し、スフェロイド直径を使用して計算しました。各腫瘍スフェロイドの治療に用いたAMG510濃度は、0.001 μMから5 μMに設定しました。すべてのデータは、SEM±平均値として表されます(n = 3)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
次に、ソフトウェアによって出力された粗さの値(図5A)と、同じ方法で生成された回転楕円体の境界に基づく過剰周囲長指数(図5B)の観点から、スフェロイドの侵襲性をさらに評価しました。粗さが高いほど、より多くの細胞がスフェロイドからゲルに移動するため、侵襲性が高くなります。対照の結果を異なる薬物濃度レベルと比較した。侵襲性細胞株であるNCI-H23の場合、スフェロイド粗さとEPI値はどちらも薬物処理なしの培養時間とともに増加し18、これは対照サンプルの明視野画像と直径の増加によって証明できました。しかし、AMG510処理により、サイズのばらつきに完全に比例して成長が弱まりました。
図5:未処理対照およびAMG510処理サンプル群における腫瘍境界認識。 薬は1日目に追加されました。(A)腫瘍粗さは、1日目、4日目、7日目、および10日目にソフトウェアによって測定され、腫瘍スフェロイドの浸潤性を示します。(B)回転楕円体の周囲長は、深層学習アルゴリズムを使用してソフトウェアによって特定および描画されました。次に、焦点面の回転楕円体領域を画像Jで測定し、これらのデータに基づいて過剰周囲指数を計算しました。各腫瘍スフェロイドの治療に用いたAMG510濃度は、0.001 μMから5 μMに設定しました。すべてのデータは、SEM±平均値として表されます(n = 3)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:プレートの組成。 実験には抗肺腫瘍薬AMG510を使用し、薬物勾配に従ってグループを設定しました。2つのプレートを使用しました:1つは生存率アッセイキットテスト用、もう1つはイメージング分析用です。
補足表2:3D腫瘍構築および薬物検査に使用された細胞株。これらの表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
微小環境は腫瘍の成長に重要な役割を果たします。それは、細胞外マトリックス、酸素勾配、栄養、および機械的相互作用の提供に影響を与える可能性があり、したがって、遺伝子発現、シグナル経路、および腫瘍細胞の多くの機能に影響を与える可能性があります19、20、21。多くの場合、2D細胞はそのような効果を生み出さないか、反対の効果さえも生み出さないため、薬物治療の評価に影響を与えます。しかし、3Dモデルの出現はこの問題に対処しました。たとえば、肺がん治療システムに対するAMG510の効果の評価は、3D手法を使用して完了しました。肺関連浸潤細胞株のAMG510治療をモニタリングするために、ゲル内に埋め込まれた腫瘍スフェロイドを作成することにより、3D腫瘍スフェロイドECM(TSE)モデルを構築しました。AMG510は、G12C変異型KRAS22を標的とした新規阻害剤であり、非小細胞肺がん(NSCLC)に反応する一部の患者が経験したという知見により、その有効性が確認されました。一連の実験データと分析から、いくつかの非常に貴重なデータを識別することができます。AMG510に対する感度は、3Dスフェロイド条件下では2D条件と比較して有意に向上し、低酸素条件下ではさらに改善されました。
本手法で構築したモデルには、いくつかの利点があります。まず、3Dモデルとして、腫瘍と細胞外マトリックスをうまくシミュレートできます。3D腫瘍スフェロイドを構築するシンプルで効果的な方法により、細胞は2週間生存できます。5日間の回転楕円体構築の後、約10日間の期間が利用可能であり、これはあらゆる薬物検査を実施するのに十分である。さらに、3D細胞培養の生産方法は2D法とほぼ同じであり、そのコストは3Dバイオプリンティングよりもはるかに低いです。ハンギングドロップ法などの他の方法と比較して、ここで説明する方法は、より均一なスフェロイドを生成するのに役立ち、細胞サイズは細胞の種類と密度によって完全に制御されます。最後に、このモデルはさまざまな種類の癌細胞に適用できることが示されており、この柔軟性は特に高い価値があることが証明される可能性があります。将来的には、腫瘍スフェロイドの形成に携わる研究者は、線維芽細胞や内皮細胞を腫瘍細胞懸濁液に加えるだけでなく、T細胞やNK細胞などの免疫細胞も添加して間質細胞の移動を促進し、新薬の免疫療法効果を高める可能性があります23,24。
ここ数十年で、3Dモデルから重要な生物学的データを抽出するために現在利用可能な技術とツールの説明に焦点を当てたレポートはほとんどありません25。この情報は、3D細胞培養モデルを用いた薬物試験および治療的発見の基本と考えることができる26。Zanoniらの研究は、3D腫瘍コロニーの自動画像分析を実行する新しいオープンソースソフトウェアを説明した。著者らは、形態パラメータが薬物治療に対する大型スフェロイドの応答に影響を与え、スフェロイドのサイズと形状の両方が変動の原因である可能性があることを示しました27。しかし、 in vivoでECMを模倣する3Dゲルで培養した腫瘍スフェロイドでは、細胞の挙動がはるかに複雑になり、侵襲性を示す可能性があります。データはサイズと形状にのみ関係しますが、そのような制限は残ります。多くの信頼性の高い多様なパラメータは、ハイコンテントイメージングシステムを使用して取得できます。このようなシステムは、細胞の生存率とスフェロイドの形状を決定するだけでなく、腫瘍の特性と腫瘍に対する薬物の阻害効果を検出および検証することもできます。侵襲性もそのような手段によって決定することができる。例えば、浸潤性腫瘍は比較的高い粗さ値を有し得るが、非浸潤性腫瘍はより高いEPI値を有し得る。そのような値の変化は、異なる薬物効果を示すことができる。将来的には、これらの技術をマイクロ流体チップと組み合わせて、より便利で効果的な戦略を取得したいと考えています。
ここで説明する標準化された方法は、ほとんどの薬物スクリーニングおよび評価試験の要件を満たすことができます。ただし、将来の実験中に発生する可能性のあるいくつかの問題がまだあります。例えば、細胞は遠心分離後にウェルの内壁に接着する可能性があり、または培養培地が適さない可能性がある。さらに、プロトコルで使用されるゲル、および広く使用されているマトリゲルは、長いプロセス中に容易にゲル化することができます。ただし、これらの問題のほとんどは、標準的な操作と最適化の手法によって解決できます。この方法には、他にも考えられる制限があります。回転楕円体構造により、栄養分、酸素、および回転楕円体を通る廃棄物の拡散は、サイズの影響を受けます。スフェロイドコアの細胞の生存率は、スフェロイドの直径が1,000μmを超えると損なわれる可能性があります。逆に、直径が400μmを下回ると侵入を観察することが難しくなります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
研究室のすべてのメンバーの批判的な意見と提案に感謝します。この研究は、江蘇省衛生委員会(K2019030)の主要プロジェクトの支援を受けました。概念化はC.W.とZ.C.によって行われ、方法論はW.H.とM.L.によって実行され、調査はW.H.とM.L.によって実行され、データキュレーションはW.H.、Z.Z.、S.X.、およびM.L.によって実行され、元のドラフト準備はZ.Z.、J.Z.、S.X.、W.H.によって実行されました。 とX.L.、レビューと編集はZ.C.によって行われ、プロジェクト管理はC.W.とZ.C.によって行われ、資金獲得はC.W.によって行われました。すべての著者は、原稿の公開バージョンを読み、同意しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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