Summary
Este artículo demuestra un método estandarizado para construir esferoides tumorales tridimensionales. También se describe una estrategia para la observación de esferoides y el análisis de aprendizaje profundo basado en imágenes utilizando un sistema automatizado de imágenes.
Abstract
En las últimas décadas, además de las células cultivadas en monocapa, se han desarrollado esferoides tumorales tridimensionales como una herramienta potencialmente poderosa para la evaluación de medicamentos contra el cáncer. Sin embargo, los métodos de cultivo convencionales carecen de la capacidad de manipular los esferoides tumorales de manera homogénea a nivel tridimensional. Para abordar esta limitación, en este documento, presentamos un método conveniente y efectivo para construir esferoides tumorales de tamaño promedio. Además, describimos un método de análisis basado en imágenes utilizando un software de análisis basado en inteligencia artificial que puede escanear toda la placa y obtener datos sobre esferoides tridimensionales. Se estudiaron varios parámetros. Mediante el uso de un método estándar de construcción de esferoides tumorales y un sistema de imágenes y análisis de alto rendimiento, la eficacia y la precisión de las pruebas de drogas realizadas en esferoides tridimensionales se pueden aumentar drásticamente.
Introduction
El cáncer es una de las enfermedades más temidas por los seres humanos, sobre todo por su alta tasa de mortalidad1. En los últimos años, la posibilidad de tratar el cáncer ha aumentado a medida que se han introducido nuevas terapias 2,3,4,5. Los modelos in vitro bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) se utilizan para estudiar el cáncer en un entorno de laboratorio. Sin embargo, los modelos 2D no pueden evaluar de forma inmediata y precisa todos los parámetros importantes que indican sensibilidad antitumoral; por lo tanto, no logran representar completamente las interacciones in vivo en las pruebas de terapia farmacológica6.
Desde 2020, el mercado global de cultura tridimensional (3D) se ha impulsado enormemente. Según un informe de NASDAQ OMX, el valor global del mercado de cultivo celular 3D superará los USD 2.7 mil millones para fines de 2025. En comparación con los métodos de cultivo 2D, el cultivo celular 3D exhibe propiedades ventajosas, que pueden optimizarse no solo para la proliferación y diferenciación, sino también para la supervivencia a largo plazo 7,8. De esta manera, se pueden simular microambientes celulares in vivo para obtener una caracterización tumoral más precisa, así como perfiles metabólicos, de modo que se puedan comprender mejor las alteraciones genómicas y proteicas. Debido a esto, los sistemas de prueba 3D ahora deben incluirse en las operaciones convencionales de desarrollo de medicamentos, especialmente aquellos con un enfoque en la detección y evaluación de nuevos medicamentos antitumorales. Los crecimientos tridimensionales de líneas celulares establecidas inmortalizadas o cultivos celulares primarios en estructuras esferoides poseen características in vivo de tumores como hipoxia y penetración de fármacos, así como interacción celular, respuesta y resistencia, y pueden considerarse como un modelo estricto y representativo para realizar el cribado in vitro de drogas 9,10,11.
Sin embargo, estos modelos de cultura 3D también sufren de varios problemas que pueden tardar algún tiempo en resolverse. Los esferoides celulares se pueden formar utilizando estos protocolos, pero difieren en ciertos detalles, como el tiempo de cultivo o los geles de incrustación12, por lo que estos esferoides celulares construidos no pueden controlarse bien en un rango de tamaño restringido. El tamaño de los esferoides puede influir en la consistencia de la prueba de viabilidad y el análisis de imagen. Los microambientes de crecimiento y los factores de crecimiento también varían, lo que puede conducir a diferentes morfologías debido a las diferencias en la diferenciación entre las células13. Ahora existe una necesidad obvia de un método estándar, simple y rentable para construir todos los tipos de tumores con tamaños controlados.
Desde otra perspectiva, aunque se han desarrollado ensayos homogéneos y enfoques de imagen de alto contenido para evaluar la morfología, la viabilidad y la tasa de crecimiento, el cribado de alto rendimiento de los modelos 3D sigue siendo un desafío por varias razones reportadas en la literatura, como la falta de uniformidad en la posición, tamaño y morfología de los esferoides tumorales14,15,16.
En el protocolo presentado aquí, enumeramos cada paso en la construcción de esferoides tumorales 3D y describimos un método para la observación y el análisis de esferoides utilizando un sistema de imágenes de alto rendimiento y alto contenido que involucra enfoque automático, imágenes automáticas y análisis, entre otras características ventajosas. Mostramos cómo este método puede producir esferoides tumorales 3D de tamaño uniforme que son adecuados para imágenes de alto rendimiento. Estos esferoides también demuestran una alta sensibilidad al tratamiento farmacológico contra el cáncer, y los cambios morfológicos en los esferoides pueden ser monitoreados usando imágenes de alto contenido. En resumen, demostramos la robustez de esta metodología como un medio para generar construcciones tumorales 3D con fines de evaluación de fármacos.
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Protocol
1. Construcción esferoide
- Tratamiento antiadherencia de la placa de cultivo
- Pipetear 100 μL de reactivo antiadherencia en cada pocillo de una placa de 48 pocillos con un fondo de pozo en forma de U, y mantener durante 10 min. Después de 10 minutos, aspire el reactivo de recubrimiento y lávese dos veces con PBS esterilizado.
- Colocar la placa de cultivo en una incubadora (37 °C en aire humidificado con 5% deCO2) hasta su uso.
- Preparación, recolección y conteo de células
- Utilice el medio de cultivo específico de las células para cultivar las células en matraces de cultivo celular (Tabla complementaria 2). Por ejemplo, las células NCI-H23, CT-26 se cultivan en RPMI 1640, y las células HT-29 se cultivan en el medio 5A de McCoy. Estos dos medios se complementan con FBS inactivado por calor al 10% y P / S al 1%, respectivamente.
- Mantener todas las células en condiciones de cultivo estándar (37 °C en aire humidificado con 5% deCO2) durante la proliferación. Aquí, la línea celular NCI-H23 se utiliza como ejemplo en los siguientes pasos.
- Lavar dos veces las células cultivadas en un matraz T25 con 1x PBS para eliminar el medio de cultivo (es mejor elegir células en la fase logarítmica y pasar las células a una confluencia del 80%-90%).
- Tratar las células expandidas con 1 mL de tripsina/EDTA al 0,25% durante 1-2 min en una incubadora a 37 °C, 5% deCO2. Confirme la forma de la célula (normalmente circular en este caso) bajo el microscopio y luego detenga el tratamiento con tripsina. Para ello, aspirar la suspensión de tripsina/EDTA utilizada en el matraz T25 y lavar las células con 4 ml de medio fresco.
- Transfiera toda la suspensión (5 ml) a un tubo de 15 ml. Use 1 ml de medio fresco para lavar las células residuales y agregarlo al tubo. Centrifugar las células a 186,48 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante y agregue 10 ml de medio fresco al pellet celular, seguido de un pipeteo suave hasta que las células estén en una suspensión homogénea.
- Aspire 0.1 ml de suspensión celular en un nuevo tubo de centrífuga, agregue 0.9 ml de medio fresco y luego pipete bien la suspensión.
- Extraer 10 μL de la suspensión celular para el recuento celular. Realice este proceso dos o tres veces y tome un valor promedio.
- Diluir la suspensión para alcanzar una densidad de siembra final de 50.000 células/ml, de acuerdo con la concentración obtenida del proceso de recuento celular en el paso 1.2.7.
- Cultivo celular y formación de esferoides
- Agregue 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo en U de 48 pocillos.
- Envuelva la película de sellado alrededor de la placa y centrifugarla a 119,35 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Saque con cuidado la placa de la centrífuga y retire la película protectora. Luego, agregue 5-8 ml de agua esterilizada en el canal de agua que rodea los pozos (para evitar la evaporación) e incube a 37 ° C durante 5 días. No cambie / complemente el agua del canal de agua durante el período.
- Observe la agregación celular durante los siguientes 5 días.
NOTA: En general, las células comienzan a agruparse como colonias dentro de los 5 días. Sin embargo, el proceso de construcción de esferoides puede ser más rápido o más lento con diferentes tipos de células y densidades celulares. Debido a esto, las células deben observarse todos los días utilizando uno de los tres métodos posibles. Primero, las células se pueden observar a través del fondo de la placa del pozo. Cuando las células aún no han formado un esferoide, se puede ver una sola capa de células en la parte inferior. Cuando las células forman un esferoide, se puede observar una densa construcción 3D en el fondo en U de cada pozo. Otro método consiste en verificar las células bajo un microscopio. Cuando las células se convierten en un esferoide tumoral, la construcción involucra tres capas (una capa proliferante, una capa inactiva y un núcleo necrótico, desde el exterior hacia el interior del esferoide), que tienen un gradiente de transparencia. Finalmente, el color del medio de cultivo también se puede utilizar con fines de observación. Esto puede ser útil cuando la estructura de tres capas no se puede ver claramente, incluso con un microscopio digital. Cuando el medio cambia de rojo púrpura a amarillo, puede comenzar el proceso de incrustación de los esferoides en el gel. El medio no debe reemplazarse durante el período de agregación celular.
- Incrustación de gel
NOTA: Los geles deben almacenarse a una temperatura inferior a -20 °C. En particular, los geles deben colocarse lejos de la puerta del refrigerador para evitar fluctuaciones de temperatura. Tenga en cuenta que los geles están congelados en esta etapa del proceso.- Tome el gel congelado de la nevera a -20 °C y colóquelo en una nevera durante todo el tiempo durante el experimento.
- Observe los esferoides celulares bajo el microscopio. Antes de que comience la incrustación del gel, el estado de los esferoides debe verificarse nuevamente con un microscopio digital.
- Retire con cuidado 150 μL del medio. La placa también debe colocarse en la nevera.
- Incruste cada esferoide en el gel agregando el gel líquido lentamente desde el lado de la pared del pozo mientras mueve la punta de pipeta preenfriada alrededor y dentro del pozo. Espere 5 minutos y si el gel no se extiende uniformemente, pipetear suavemente el gel con una punta de pipeta de 10 μL. Cada pocillo contiene un esferoide tumoral, 25 μL de gel de 3,5 mg/ml y 50 μL de medio de cultivo completo. Agregue 75 μL de medio a los controles también.
NOTA: Cada pocillo contiene un esferoide. - Incubar la placa a 37 °C durante 30 minutos hasta que la hidrogelificación esté completamente completa. Confirme el estado de gelificación bajo el microscopio.
- Superponer 125 μL del medio fresco en cada muestra.
- Cultive los esferoides durante otros 7-10 días. Prepare grupos de esferoides con cuatro a seis pocillos cada uno y elija al menos tres de ellos para su análisis.
NOTA: Si realiza una prueba de drogas, prepare dos grupos para una muestra. Un grupo se utiliza para pruebas de viabilidad, mientras que el otro se utiliza para la captura y análisis de imágenes.
2. Tratamiento farmacológico
- Disuelva el medicamento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare soluciones de trabajo 100x con DMSO. Prepare al menos cinco dosis del medicamento en dilución en serie. Aquí, el medicamento terapéutico para el cáncer de pulmón, AMG 510, se usa como ejemplo. La composición se muestra en la Tabla Suplementaria 1.
- Use DMSO al 0.1% como control positivo.
- Añadir 125 μL de medio tratado con fármaco a cada pocillo y volver a colocar la placa en la incubadora (37 °C en aire humidificado con 5% deCO2). En esta etapa, cada pocillo contiene un esferoide tumoral, 25 μL de gel de 3,5 mg/ml y 175 μL del medio. Los controles contienen 200 μL del medio.
3. Viabilidad esferoide
- Mida la viabilidad del esferoide utilizando un kit de ensayo Alamar Blue de acuerdo con las directrices del fabricante. Medir la viabilidad utilizando un fotómetro de microplaca (absorbancia a 570 nm y 600 nm) después de realizar el tratamiento con Alamar Blue.
- Mida la viabilidad en el día 1, día 4, día 7 y día 10 después de incrustar los esferoides en el gel, respectivamente, o como se indique.
NOTA: Cuando se utiliza un ensayo Alamar Blue, se requieren al menos 16 h de tiempo de reacción. Por lo tanto, agregue 20 μL de Alamar Blue en las tardes del día 0, día 3, día 6 y día 9. - Aspirar 100 μL del medio sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de ensayo y añadir 80 μL de medio fresco a cada pocillo de la placa de cultivo. Luego, reemplace otros 100 μL del medio tratado con medicamentos. Asegúrese de que no haya restos de Alamar Blue en el pozo.
NOTA: El reemplazo del medio se lleva a cabo en cada ocasión en que se prueba la viabilidad, y el medio tratado con medicamentos de los grupos de análisis de imágenes debe reemplazarse el mismo día.
4. Observación esferoide y análisis de aprendizaje profundo a través de imágenes en la prueba de drogas
- Imagenológico
- Aspirar 100 μL del medio antes de la toma de imágenes.
- Coloca el plato en el escenario. Obtenga imágenes digitales de los esferoides utilizando un microscopio automatizado con un objetivo de 10x (objetivo 2x primero). El microscopio puede enfocar y centralizar estos esferoides automáticamente.
NOTA: La función de enfoque automático y el algoritmo utilizado han sido previamente reportados por Yazdanfar et al.17. - Espere la imagen automática. Se adquieren cuatro imágenes para cada esferoide. Se forma y procesa una imagen integrada con el software conectado al sistema de imágenes de alto contenido.
- Haga clic en el botón "Proceso de parche de imagen" y elija las imágenes integradas en el software.
- Elija "modelo U-NET" y escriba la tasa de conversión (las imágenes objetivas 10x tienen una tasa de conversión de 3.966). Haga clic en la parte inferior de la pantalla de abajo, para iniciar el procesamiento de la imagen. Luego, guarde los datos de diámetro, perímetro y rugosidad en el software de hoja de cálculo.
- Calcule el índice de exceso de perímetro (EPI). El EPI es la relación entre el perímetro del esferoide (P 0) y el perímetro equivalente (Pe), calculado por la Partida 1. Mida el área del esferoide en el plano focal (S) utilizando la Imagen J. Luego, calcule el perímetro equivalente del esferoide usando la Ec. 2.
EPI = (P o− P e)/Pe (Ec. 1)
(Ec. 2)
NOTA: El perímetro del esferoide es generado por el software con algoritmos de aprendizaje profundo basados en el modelo U-NET desarrollado. - Añadir 100 μL de medio fresco con el fármaco y volver a colocar la placa en la incubadora (37 °C en aire humidificado con 5% deCO2).
- Inhibición esferoide
- Calcule la inhibición del crecimiento tumoral (TGI) usando la Ec. 3. El volumen esferoide relativo (RTV) es el volumen terminal sobre el volumen original (Ec. 4). El volumen del esferoide (V) se calcula automáticamente mediante el software utilizando la Ec. 5 de acuerdo con la salida del diámetro del esferoide.
TGI = (control de RTV−tratamiento de RTV)/control de RTV × 100% (Ec. 3)
RTV = Vterminal/V original (Eq. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (Ec. 5)
NOTA: El TGI se obtiene con referencia a la inhibición del crecimiento in vivo , y los pesos tumorales se reemplazan con RTV. El control de RTV es el volumen esferoide relativo del grupo decontrol , eltratamiento con RTV es el volumen esferoide relativo del grupo probado con fármacos, Vterminal es el volumen del esferoide en el último día, Voriginal es el volumen del esferoide en el primer día de cultivo y d representa el diámetro del esferoide.
- Calcule la inhibición del crecimiento tumoral (TGI) usando la Ec. 3. El volumen esferoide relativo (RTV) es el volumen terminal sobre el volumen original (Ec. 4). El volumen del esferoide (V) se calcula automáticamente mediante el software utilizando la Ec. 5 de acuerdo con la salida del diámetro del esferoide.
(Ec. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1A,B muestra el proceso utilizado para la construcción de esferoides tumorales en este estudio. Primero sembramos las células en una placa de fondo en U de 48 pocillos. Este paso es casi el mismo que el utilizado en el cultivo celular 2D. Mantuvimos la placa en una incubadora común con agua que rodea los pozos para que las células depositadas comenzaran a formar esferoides en un proceso de autoensamblaje. En condiciones operativas normales, la mayoría de los tipos de esferoides tumorales se formaron completamente después de 5 días cuando se utilizó un medio dirigido (Tabla complementaria 2). Verificamos el estado de la construcción esferoide dentro de los 5 días con un microscopio digital (Figura 1D). Después de que se completó el proceso de crecimiento, se agregó gel para envolver los esferoides individuales en cada pozo, produciendo una matriz extracelular (ECM) similar a in vivo para cada esferoide. Luego se llevaron a cabo pruebas de drogas. Como utilizamos un sistema de imágenes de alto contenido con software de análisis de aprendizaje profundo (Figura 1C), pudimos observar claramente el crecimiento de esferoides individuales (Figura 1E) y obtener valores para parámetros adecuados para determinar las características durante la terapia farmacológica, incluida la viabilidad, el diámetro y la rugosidad.
Figura 1: Formación de esferoides tumorales e imágenes y análisis automatizados . (A) Esquema que muestra el procedimiento estándar de cultivo de esferoides tumorales con la línea de tiempo a continuación. (B) Esquema de las pruebas de tratamiento farmacológico utilizando esferoides tumorales que muestran diferentes niveles de invasividad en matrices 3D. (C) Imagen de un sistema relacionado con algoritmos basado en aprendizaje profundo para imágenes y análisis automatizados que muestre los siguientes detalles: plataforma de placas; condensador con fuente de luz; etapa X motorizada, Y; módulo motorizado del eje z; rueda de objetivos; rueda de filtro; CCD; y computadora con el software del sistema desarrollado. (D) La formación de esferoides tumorales NCI-H23 a partir de células monocapa observadas desde el ocular de un microscopio. La barra de escala representa 500 μm. (E) Variación en la invasividad y el tamaño de los esferoides NCI-H23 sin tratamiento farmacológico durante 10 días. Las barras de escala representan 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En este estudio, utilizamos el fármaco antitumoral AMG510 para probar su efecto en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas. El sistema de análisis proporcionó datos de imagen sin procesamiento de imágenes complejo. Las imágenes de campo claro de la Figura 2 muestran que el crecimiento de los esferoides NCI-H23 podría ser inhibido por AMG510. Esto fue indicado por la disminución del tamaño junto con el aumento de la concentración. En contraste, el tamaño aumentó en el grupo de control durante 10 días. Durante este período, la rugosidad del lado del borde, lo que indica invasividad, también cambió. Los esferoides exhibieron bordes planos el día 1 pero bordes ásperos el día 10. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que comparar la rugosidad a través de imágenes de campo claro solo es una tarea desafiante. También debe mencionarse que el método estándar involucra esferoides de tamaño promedio apropiado. Finalmente, observamos que se logró un fondo limpio utilizando este método, ya que pocas celdas se adhirieron a la parte inferior.
Figura 2: Imágenes de campo claro de esferoides celulares NCI-H23 tratados con diferentes concentraciones de AMG510 capturadas automáticamente por un microscopio de alto contenido. Las columnas representan diferentes días, y las filas representan diferentes concentraciones de fármaco. Los resultados incluyen tres esferoides para cada condición. Todas las imágenes se enfocaron automáticamente con un aumento de 2x y luego se capturaron con un aumento de 10x mediante el sistema de imágenes de alto contenido utilizando un software basado en inteligencia artificial y un controlador de microambiente asociado al microscopio. Las barras de escala representan 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los resultados de viabilidad celular, mostrados en la Figura 3A, demostraron una viabilidad reducida en los cultivos de 10 días de muestras tratadas con fármacos en todos los niveles de dosificación en comparación con el control. Las muestras con concentraciones superiores a 0,01 μM mostraron una rápida disminución de la viabilidad de las células tumorales, lo que indica la sensibilidad del tratamiento con AMG510 al cáncer de pulmón de células no pequeñas. El día 10, estas muestras mostraron niveles similares de viabilidad final, con valores inferiores al 70%, como se muestra en la Figura 3B.
Figura 3: Viabilidad del esferoide tumoral de los grupos de muestras tratados con AMG510. Los medicamentos se agregaron el día 1. (A) La viabilidad del esferoide tumoral se midió el día 1, el día 4, el día 7 y el día 10. (B) Viabilidad de la celda terminal de las muestras con gradientes de concentración. Las concentraciones del fármaco utilizado para tratar cada esferoide tumoral se establecieron de 0,001 μM a 5 μM. Todos los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 4A revela una tendencia similar con respecto al análisis del diámetro del esferoide. Las muestras con concentraciones superiores a 0,01 μM mostraron una reducción obvia en el diámetro promedio. La uniformidad en el tamaño del esferoide también se pudo ver en el primer día de tratamiento farmacológico, con valores de aproximadamente 800 μm. Las relaciones de diámetro de estos esferoides (Figura 4B) indicaron contracción durante el cocultivo AMG510 de una manera visiblemente más obvia que la prueba de viabilidad. Además, calculamos los valores de inhibición del crecimiento tumoral esferoide en términos de sus diámetros, como se muestra en la Figura 4C. El valor TGI es un parámetro de evaluación relativo, y los valores podrían indicar una disminución del crecimiento como resultado de las diferencias de siembra originales entre los esferoides; sin embargo, nuevamente obtuvimos el resultado de que las concentraciones superiores a 0,01 μM tuvieron un efecto obvio sobre el éxito del tratamiento con AMG510. En un estudio anterior, experimentamos con el valor IC50, que es un índice significativo para las pruebas de drogas; sin embargo, se encontró que los esferoides NCI-H23 bajo tratamiento con AMG510 no mostraron cambios en este parámetro.
Figura 4: Tamaño del tumor representado por diámetros esferoides en los grupos de muestra control y tratados con AMG510. (A) Los diámetros de los esferoides tumorales se midieron el día 1, el día 4, el día 7 y el día 10. (B) La relación de crecimiento del esferoide se definió como el volumen terminal en relación con el volumen original y se calculó utilizando los diámetros de los esferoides. (C) La relación de inhibición del crecimiento esferoide se definió en relación con el volumen y se calculó utilizando los diámetros de esferoides. Las concentraciones de AMG510 utilizadas para tratar cada esferoide tumoral se establecieron de 0,001 μM a 5 μM. Todos los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Luego llevamos a cabo una evaluación adicional de la invasividad de los esferoides en términos de los valores de rugosidad producidos como salida por el software (Figura 5A) y también el índice de exceso de perímetro basado en los límites del esferoides, producido por los mismos medios (Figura 5B). Una mayor rugosidad significa que más células están migrando del esferoide al gel, lo que, por lo tanto, representa una mayor invasividad. Los resultados de los controles se compararon con diferentes niveles de concentración del fármaco. Para NCI-H23, una línea celular invasiva, la rugosidad esferoide y los valores de EPI aumentaron con el tiempo de cultivo sin ningún tratamiento farmacológico18, y esto podría ser probado por las imágenes de campo claro y los aumentos de diámetro en las muestras de control. Sin embargo, el crecimiento fue atenuado por el tratamiento AMG510, totalmente en proporción con las variaciones de tamaño.
Figura 5: Reconocimiento del límite tumoral en los grupos de muestras de control no tratados y tratados con AMG510. Los medicamentos se agregaron el día 1. (A) La rugosidad tumoral fue medida por el software en el día 1, día 4, día 7 y día 10, lo que indica la invasividad de los esferoides tumorales. (B) El perímetro del esferoide fue localizado y dibujado por el software utilizando algoritmos de aprendizaje profundo. Las áreas esferoides en el plano focal se midieron mediante la Imagen J, y se calculó un índice de exceso de perímetro basado en estos datos. Las concentraciones de AMG510 utilizadas para tratar cada esferoide tumoral se establecieron de 0,001 μM a 5 μM. Todos los datos se presentan como media ± SEM (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla suplementaria 1: La composición de la placa. El fármaco antitumoral pulmonar AMG510 se utilizó en el experimento, y los grupos se establecieron de acuerdo con los gradientes de fármacos. Se utilizaron dos placas: una para la prueba del kit de ensayo de viabilidad y otra para el análisis de imágenes.
Tabla complementaria 2: Líneas celulares que se han utilizado en la construcción de tumores 3D y pruebas de drogas. Haga clic aquí para descargar estas tablas.
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Discussion
El microambiente juega un papel importante en el crecimiento del tumor. Puede afectar la provisión de matrices extracelulares, gradientes de oxígeno, nutrición e interacción mecánica y, por lo tanto, afectar la expresión génica, las vías de señalización y muchas funciones de las células tumorales 19,20,21. En muchos casos, las células 2D no producen tales efectos o incluso producen efectos opuestos, afectando así la evaluación de los tratamientos farmacológicos. Sin embargo, la aparición de modelos 3D ha abordado este problema. Por ejemplo, nuestra evaluación del efecto de AMG510 en un sistema de tratamiento del cáncer de pulmón se completó utilizando métodos 3D. Construimos un modelo 3D de tumor-esferoide-ECM (TSE) mediante la creación de esferoides tumorales incrustados dentro de un gel para monitorear el tratamiento con AMG510 en una línea celular invasiva relacionada con los pulmones. AMG510 es un nuevo inhibidor que se dirige al mutante G12C KRAS22, y su eficacia fue confirmada por nuestro hallazgo de que el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) experimentado por algunos pacientes que responden a este mutante. De nuestra serie de datos experimentales y análisis, se pueden discernir algunos datos muy valiosos. La sensibilidad a AMG510 mejoró significativamente en una condición esferoide 3D, en comparación con la condición 2D, y mejoró aún más dentro de una condición de hipoxia.
Los modelos construidos a través del método actual ofrecen varias ventajas. En primer lugar, como modelo 3D, puede simular bien el tumor y la matriz extracelular. El método simple pero efectivo de construir esferoides tumorales 3D permite que las células sobrevivan durante un período de 2 semanas. Después de los 5 días de construcción del esferoide, se dispone de un período de alrededor de 10 días, que es suficiente para llevar a cabo cualquier prueba de drogas. Además, el método de producción de cultivo celular 3D es casi el mismo que el método 2D, y su costo es mucho menor que el de la bioimpresión 3D. En comparación con otros métodos, como el método de caída colgante, el método descrito aquí ayuda a producir esferoides más uniformes, y el tamaño de la célula está totalmente controlado por el tipo y la densidad de las células. Finalmente, se ha demostrado que este modelo es aplicable a varios tipos de células cancerosas, y esta flexibilidad puede resultar especialmente valiosa. En el futuro, los investigadores involucrados en la formación de esferoides tumorales podrían agregar no solo fibroblastos y células endoteliales a sus suspensiones de células tumorales, sino también células inmunes como células T y células NK para promover la migración de células estromales y aumentar los efectos inmunoterapéuticos de nuevos medicamentos23,24.
En las últimas décadas, pocos informes se han centrado en describir las técnicas y herramientas actualmente disponibles para extraer datos biológicos significativos de modelos3D 25. Esta información puede considerarse fundamental para las pruebas de fármacos y el descubrimiento terapéutico utilizando modelos de cultivo celular3D 26. El estudio de Zanoni et al. describió un nuevo software de código abierto que lleva a cabo el análisis automático de imágenes de colonias tumorales en 3D. Los autores demostraron que los parámetros morfológicos influyeron en la respuesta de los grandes esferoides al tratamiento farmacológico y que el tamaño y la forma de los esferoides podrían ser fuentes de variabilidad27. Sin embargo, con los esferoides tumorales cultivados en gel 3D, que imitan las ECM in vivo, el comportamiento celular es mucho más complejo y se puede exhibir invasividad. Si bien los datos solo se refieren al tamaño y la forma, tales limitaciones permanecerán. Se pueden obtener muchos parámetros confiables y diversificados utilizando un sistema de imágenes de alto contenido. Tales sistemas no solo pueden determinar la viabilidad celular y la forma esferoide, sino que también pueden detectar y verificar las características de los tumores y el efecto inhibidor de los medicamentos sobre los tumores. La invasividad también se puede determinar por tales medios. Por ejemplo, un tumor invasivo puede tener un valor de rugosidad relativamente más alto, mientras que un tumor no invasivo puede tener un valor de EPI más alto. Los cambios en tales valores pueden indicar diferentes efectos del fármaco. En el futuro, esperamos combinar estas técnicas con chips microfluídicos para obtener estrategias más convenientes y efectivas.
El método estandarizado descrito aquí puede cumplir con los requisitos de la mayoría de las pruebas de detección y evaluación de drogas. Sin embargo, todavía hay algunos problemas que pueden ocurrir durante futuros experimentos. Por ejemplo, las células pueden adherirse a las paredes internas de los pocillos después de la centrifugación, o el medio de cultivo puede no ser adecuado. Además, el gel utilizado en el protocolo, así como el ampliamente utilizado Matrigel, pueden gelate fácilmente durante el largo proceso. Sin embargo, la mayoría de estos problemas se pueden resolver a través de técnicas estándar de operación y optimización. Existen otras limitaciones posibles en este método. Debido a la estructura del esferoide, los nutrientes, el oxígeno y la difusión de residuos a través del esferoide están influenciados por el tamaño. La viabilidad de las células en el núcleo esferoide puede verse comprometida cuando el diámetro del esferoide es superior a 1.000 μm. Por el contrario, se hace difícil observar la invasión cuando el diámetro es inferior a 400 μm.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los miembros de nuestros laboratorios por sus aportes y sugerencias críticas. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto Clave de la Comisión de Salud de Jiangsu (K2019030). La conceptualización fue realizada por C.W. y Z.C., la metodología fue realizada por W.H. y M.L., la investigación fue realizada por W.H. y M.L., la curación de datos fue realizada por W.H., Z.Z., S.X. y M.L., la preparación original del borrador fue realizada por Z.Z., J.Z., S.X., W.H., y X.L., la revisión y edición fue realizada por Z.C., la administración del proyecto fue realizada por C.W. y Z.C., y la adquisición de fondos fue realizada por C.W. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
