Summary
Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.
Abstract
In de afgelopen decennia zijn, naast monolaag-gekweekte cellen, driedimensionale tumorsferoïden ontwikkeld als een potentieel krachtig hulpmiddel voor de evaluatie van geneesmiddelen tegen kanker. De conventionele kweekmethoden missen echter het vermogen om de tumorsferoïden op een homogene manier op driedimensionaal niveau te manipuleren. Om deze beperking aan te pakken, presenteren we in dit artikel een handige en effectieve methode voor het construeren van tumorsferoïden van gemiddelde grootte. Daarnaast beschrijven we een methode van beeldgebaseerde analyse met behulp van op kunstmatige intelligentie gebaseerde analysesoftware die de hele plaat kan scannen en gegevens over driedimensionale sferoïden kan verkrijgen. Verschillende parameters werden bestudeerd. Door gebruik te maken van een standaardmethode van tumorsferoïde constructie en een high-throughput beeldvormings- en analysesysteem, kunnen de effectiviteit en nauwkeurigheid van medicijntests die worden uitgevoerd op driedimensionale sferoïden drastisch worden verhoogd.
Introduction
Kanker is een van de ziekten die het meest gevreesd wordt door de mens, niet in de laatste plaats vanwege het hoge sterftecijfer1. In de afgelopen jaren is de mogelijkheid om kanker te behandelen toegenomen omdat nieuwe therapieën zijn geïntroduceerd 2,3,4,5. Tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) in vitro modellen worden gebruikt om kanker in een laboratoriumomgeving te bestuderen. 2D-modellen kunnen echter niet onmiddellijk en nauwkeurig alle belangrijke parameters beoordelen die wijzen op antitumorgevoeligheid; daarom slagen ze er niet in om in vivo interacties volledig weer te geven bij het testen van medicamenteuze therapie6.
Sinds 2020 is de wereldwijde driedimensionale (3D) cultuurmarkt sterk gestimuleerd. Volgens een rapport van NASDAQ OMX zal de wereldwijde waarde van de 3D-celkweekmarkt tegen het einde van 2025 meer dan USD 2,7 miljard bedragen. In vergelijking met 2D-kweekmethoden vertoont 3D-celkweek voordelige eigenschappen, die niet alleen kunnen worden geoptimaliseerd voor proliferatie en differentiatie, maar ook voor overleving op lange termijn 7,8. Op dergelijke manieren kunnen in vivo cellulaire micro-omgevingen worden gesimuleerd om nauwkeurigere tumorkarakterisering te verkrijgen, evenals metabole profilering, zodat genomische en eiwitveranderingen beter kunnen worden begrepen. Daarom moeten 3D-testsystemen nu worden opgenomen in reguliere geneesmiddelenontwikkelingsoperaties, vooral die met een focus op het screenen en evalueren van nieuwe antitumorgeneesmiddelen. Driedimensionale gezwellen van vereeuwigde gevestigde cellijnen of primaire celculturen in sferoïde structuren bezitten in vivo kenmerken van tumoren zoals hypoxie en geneesmiddelpenetratie, evenals celinteractie, respons en resistentie, en kunnen worden beschouwd als een strikt en representatief model voor het uitvoeren van in vitro geneesmiddelenscreening 9,10,11.
Deze 3D-cultuurmodellen hebben echter ook last van verschillende problemen die enige tijd kunnen duren om op te lossen. Celsferoïden kunnen worden gevormd met behulp van deze protocollen, maar ze verschillen in bepaalde details, zoals kweektijd of inbeddingsgels12, dus deze geconstrueerde celsferoïden kunnen niet goed worden gecontroleerd onder een beperkt groottebereik. De grootte van de sferoïden kan de consistentie van de levensvatbaarheidstest en beeldvormingsanalyse beïnvloeden. De groeimicro-omgevingen en groeifactoren variëren ook, wat kan leiden tot verschillende morfologieën als gevolg van verschillen in de differentiatie tussen cellen13. Er is nu een duidelijke behoefte aan een standaard, eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het construeren van alle soorten tumoren met gecontroleerde groottes.
Vanuit een ander perspectief, hoewel homogene assays en high-content imaging benaderingen zijn ontwikkeld om morfologie, levensvatbaarheid en groeisnelheid te evalueren, blijft de high-throughput screening van 3D-modellen een uitdaging om verschillende redenen die in de literatuur worden gerapporteerd, zoals het gebrek aan uniformiteit in de positie, grootte en morfologie van tumorsferoïden14,15,16.
In het hier gepresenteerde protocol vermelden we elke stap in de constructie van 3D-tumorsferoïden en beschrijven we een methode voor sferoïde observatie en analyse met behulp van een high-throughput, high-content beeldvormingssysteem dat autofocus, auto-imaging en analyse omvat, naast andere voordelige kenmerken. We laten zien hoe deze methode 3D-tumorsferoïden van uniforme grootte kan produceren die geschikt zijn voor high-throughput beeldvorming. Deze sferoïden vertonen ook een hoge gevoeligheid voor de behandeling van kankergeneesmiddelen en morfologische veranderingen in de sferoïden kunnen worden gevolgd met behulp van beeldvorming met een hoog gehalte. Samenvattend tonen we de robuustheid van deze methodologie aan als een middel om 3D-tumorconstructies te genereren voor geneesmiddelenevaluatiedoeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sferoïde constructie
- Anti-hechtingsbehandeling van de kweekplaat
- Pipetteer 100 μL anti-adhesiereagens in elke put van een 48-putplaat met een U-vormige putbodem en bewaar gedurende 10 minuten. Zuig na 10 minuten het coatingreagens op en was tweemaal met gesteriliseerde PBS.
- Plaats de kweekplaat in een incubator (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2) tot gebruik.
- Celvoorbereiding, verzameling en tellen
- Gebruik het kweekmedium dat specifiek is voor de cellen om de cellen in celkweekkolven te kweken (aanvullende tabel 2). NCI-H23- en CT-26-cellen worden bijvoorbeeld gekweekt in RPMI 1640 en HT-29-cellen worden gekweekt in McCoy's 5A-medium. Deze twee media worden aangevuld met respectievelijk 10% warmte-geïnactiveerde FBS en 1% P/S.
- Houd alle cellen in standaard kweekomstandigheden (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2) tijdens proliferatie. Hier wordt de NCI-H23-cellijn als voorbeeld gebruikt in de volgende stappen.
- Was cellen gekweekt in een T25-kolf tweemaal met 1x PBS om het kweekmedium te verwijderen (het is beter om cellen in de logaritmische fase te kiezen en de cellen te passeren met een samenvloeiing van 80% -90%).
- Behandel de geëxpandeerde cellen met 1 ml 0,25% trypsine/EDTA gedurende 1- 2 minuten in een couveuse bij 37 °C, 5% CO2. Bevestig de celvorm (normaal gesproken cirkelvormig in dit geval) onder de microscoop en stop vervolgens de trypsinebehandeling. Zuig hiervoor de gebruikte trypsine/EDTA-suspensie op in de T25-kolf en was de cellen met 4 ml vers medium.
- Breng alle suspensie (5 ml) over in een buis van 15 ml. Gebruik 1 ml vers medium om de resterende cellen af te spoelen en voeg het toe aan de buis. Centrifugeer de cellen op 186,48 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en voeg 10 ml vers medium toe aan de celpellet, gevolgd door voorzichtig pipetteren totdat de cellen zich in een homogene suspensie bevinden.
- Zuig 0,1 ml celsuspensie op in een nieuwe centrifugebuis, voeg 0,9 ml vers medium toe en pipetteer de suspensie goed.
- Extract 10 μL van de celsuspensie voor celtelling. Voer dit proces twee of drie keer uit en neem een gemiddelde waarde.
- Verdun de suspensie tot een uiteindelijke zaaidichtheid van 50.000 cellen/ml, afhankelijk van de concentratie verkregen uit het celtellingsproces in stap 1.2.7.
- Celkweek en sferoïdevorming
- Voeg 200 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een U-bodemplaat met 48 putten.
- Wikkel de afdichtingsfolie om de plaat en centrifugeer deze op 119,35 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Haal de plaat voorzichtig uit de centrifuge en trek de beschermfolie eraf. Voeg vervolgens 5-8 ml gesteriliseerd water toe aan het waterkanaal rond de putten (om verdamping te voorkomen) en incubeer gedurende 5 dagen bij 37 °C. Ververs/vul gedurende de periode geen water aan het waterkanaal.
- Observeer de celaggregatie gedurende de volgende 5 dagen.
OPMERKING: Over het algemeen beginnen de cellen binnen 5 dagen als kolonies samen te klonteren. Het proces van sferoïde constructie kan echter sneller of langzamer zijn met verschillende celtypen en celdichtheden. Hierdoor moeten de cellen elke dag worden geobserveerd met behulp van een van de drie mogelijke methoden. Ten eerste kunnen de cellen worden waargenomen via de bodem van de putplaat. Wanneer de cellen nog geen sferoïde hebben gevormd, is onderaan een enkele laag cellen te zien. Wanneer de cellen een sferoïde vormen, kan een dicht 3D-construct worden waargenomen op de U-bodem van elke put. Een andere methode is het controleren van de cellen onder een microscoop. Wanneer de cellen een tumorsferoïde worden, omvat de constructie drie lagen (een prolifererende laag, een inactieve laag en een necrotische kern, van de buitenkant naar de binnenkant van de sferoïde), die een transparantiegradiënt hebben. Ten slotte kan de kleur van het kweekmedium ook worden gebruikt voor observatiedoeleinden. Dit kan handig zijn wanneer de drielaagse structuur niet duidelijk kan worden gezien, zelfs niet met behulp van een digitale microscoop. Wanneer het medium van paarsrood naar geel verandert, kan het proces van het inbedden van de sferoïden in de gel beginnen. Het medium mag niet worden vervangen tijdens de celaggregatieperiode.
- Gel inbedding
OPMERKING: De gels moeten worden bewaard bij een temperatuur onder −20 °C. In het bijzonder moeten gels ver weg van de koelkastdeur worden geplaatst om temperatuurschommelingen te voorkomen. Merk op dat de gels zich in dit stadium van het proces in een bevroren toestand bevinden.- Neem de bevroren gel uit de koelkast van −20 °C en leg deze tijdens het experiment de hele tijd op een ijskast.
- Observeer de celsferoïden onder de microscoop. Voordat de gelinbedding begint, moet de status van de sferoïden opnieuw worden gecontroleerd met een digitale microscoop.
- Verwijder voorzichtig 150 μL van het medium. De plaat moet ook op de ijskast worden geplaatst.
- Sluit elke sferoïde in de gel in door de vloeibare gel langzaam vanaf de wandzijde van de put toe te voegen terwijl de voorgekoelde pipetpunt rond en in de put wordt verplaatst. Wacht 5 minuten en als de gel zich niet gelijkmatig verspreidt, pipetteer de gel dan voorzichtig met een pipetpunt van 10 μL. Elk putje bevat een tumorsferoïde, 25 μL 3,5 mg/ml gel en 50 μL compleet kweekmedium. Voeg ook 75 μL medium toe aan de bedieningselementen.
OPMERKING: Elke put bevat één sferoïde. - Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30 minuten totdat de hydrogelatie volledig is voltooid. Bevestig de gelatatiestatus onder de microscoop.
- Bedek 125 μL van het verse medium op elk monster.
- Kweek de sferoïden nog eens 7-10 dagen. Bereid groepen sferoïden voor met elk vier tot zes putten en kies er ten minste drie voor analyse.
OPMERKING: Als u een drugstest uitvoert, bereid dan twee groepen voor op één monster. De ene groep wordt gebruikt voor het testen van de levensvatbaarheid, terwijl de andere wordt gebruikt voor het vastleggen en analyseren van afbeeldingen.
2. Medicamenteuze behandeling
- Los het medicijn op volgens de instructies van de fabrikant. Bereid 100x werkende oplossingen voor met DMSO. Bereid ten minste vijf doses van het geneesmiddel in seriële verdunning. Hier wordt het longkanker therapeutisch medicijn, AMG 510, als voorbeeld gebruikt. De samenstelling is weergegeven in aanvullende tabel 1.
- Gebruik 0,1% DMSO als positieve controle.
- Voeg 125 μL met geneesmiddelen behandeld medium toe aan elke put en plaats de plaat terug in de couveuse (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2). In dit stadium bevat elke put een tumorsferoïde, 25 μL van 3,5 mg / ml gel en 175 μL van het medium. De bedieningselementen bevatten 200 μL van het medium.
3. Levensvatbaarheid van sferoïde
- Meet de levensvatbaarheid van de sferoïde met behulp van een Alamar Blue-testkit volgens de richtlijnen van de fabrikant. Meet de levensvatbaarheid met behulp van een microplaatfotometer (absorptie bij 570 nm en 600 nm) nadat de behandeling met Alamar Blue is uitgevoerd.
- Meet de levensvatbaarheid op dag 1, dag 4, dag 7 en dag 10 na het insluiten van de sferoïden in de gel, respectievelijk, of zoals aangegeven.
OPMERKING: Bij gebruik van een Alamar Blue-test is ten minste 16 uur reactietijd vereist. Voeg daarom 20 μL Alamar Blue toe in de middagen van dag 0, dag 3, dag 6 en dag 9. - Zuig 100 μL van het bovennatuurlijke medium uit elke put naar een nieuwe testplaat en voeg 80 μL vers medium toe aan elke put van de kweekplaat. Vervang vervolgens nog eens 100 μL van het met geneesmiddelen behandelde medium. Zorg ervoor dat er geen overblijfselen van Alamar Blue in de put zitten.
OPMERKING: Mediumvervanging wordt uitgevoerd bij elke gelegenheid dat de levensvatbaarheid wordt getest en het met geneesmiddelen behandelde medium van de beeldvormingsanalysegroepen moet op dezelfde dag worden vervangen.
4. Sferoïde observatie en deep learning analyse door middel van beelden in de drugstest
- Beeldvorming
- Zuig 100 μL van het medium uit voor de beeldvorming.
- Plaats de plaat op het podium. Verkrijg digitale beelden van de sferoïden met behulp van een geautomatiseerde microscoop met een 10x objectief (2x objectief eerst). De microscoop kan deze sferoïden automatisch scherpstellen en centraliseren.
OPMERKING: De autofocusfunctie en het gebruikte algoritme zijn eerder gerapporteerd door Yazdanfar et al.17. - Wacht op de automatische beeldvorming. Voor elke sferoïde worden vier beelden verkregen. Een geïntegreerd beeld wordt gevormd en verwerkt met de software die is aangesloten op het high-content imaging systeem.
- Klik op de knop "Image patch process" en kies de geïntegreerde afbeeldingen in de software.
- Kies "U-NET model" en typ de conversieratio in (10x objectieve afbeeldingen hebben een conversieratio van 3.966). Klik onderaan het onderstaande scherm om de beeldverwerking te starten. Sla vervolgens de diameter-, omtrek- en ruwheidsgegevens op in spreadsheetsoftware.
- Bereken de excess perimeter index (EPI). De EPI is de verhouding tussen de sferoïde omtrek (P 0) en de equivalente omtrek (Pe), zoals berekend door Eq. 1. Meet het gebied van de sferoïde in het brandpuntsvlak (S) met behulp van afbeelding J. Bereken vervolgens de equivalente omtrek van de sferoïde met behulp van Eq. 2.
EPI = (P o− P e)/Pe (Eq. 1)
(Eq. 2)
OPMERKING: De sferoïde perimeter wordt gegenereerd door de software met deep-learning algoritmen op basis van het ontwikkelde U-NET model. - Voeg 100 μL vers medium toe aan het medicijn en plaats de plaat terug in de couveuse (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2).
- Sferoïde remming
- Bereken de tumorgroeiremming (TGI) met behulp van Eq. 3. Het relatieve sferoïde volume (RTV) is het eindvolume over het oorspronkelijke volume (Eq. 4). Het sferoïde volume (V) wordt automatisch berekend door de software met behulp van Eq. 5 volgens de sferoïde diameter output.
TGI = (RTV-controle− RTV-behandeling)/RTV-regeling × 100% (Eq. 3)
RTV =V-aansluiting/V-origineel (Eq. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (Eq. 5)
OPMERKING: De TGI wordt verkregen met betrekking tot in vivo groeiremming en de tumorgewichten worden vervangen door RTV. RTV-controle is het relatieve sferoïde volume van de controlegroep, RTV-behandeling is het relatieve sferoïde volume van de geteste groep met geneesmiddelen,V-terminal is het volume van de sferoïde op de laatste dag,V-origineel is het volume van de sferoïde op de eerste kweekdag en d vertegenwoordigt de sferoïde diameter.
- Bereken de tumorgroeiremming (TGI) met behulp van Eq. 3. Het relatieve sferoïde volume (RTV) is het eindvolume over het oorspronkelijke volume (Eq. 4). Het sferoïde volume (V) wordt automatisch berekend door de software met behulp van Eq. 5 volgens de sferoïde diameter output.
(Eq. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A,B toont het proces dat in deze studie wordt gebruikt voor het construeren van tumorsferoïden. We hebben de cellen eerst gezaaid in een 48-well U-bodemplaat. Deze stap is bijna hetzelfde als die wordt gebruikt in 2D-celcultuur. We bewaarden de plaat in een gemeenschappelijke incubator met water rond de putten, zodat de afgezette cellen sferoïden begonnen te vormen in een zelfassemblageproces. Onder normale operationele omstandigheden werden de meeste soorten tumorsferoïden volledig gevormd na 5 dagen wanneer een doelmedium werd gebruikt (aanvullende tabel 2). We controleerden de status van de sferoïdeconstructie binnen 5 dagen met een digitale microscoop (figuur 1D). Nadat het groeiproces was voltooid, werd gel toegevoegd om de individuele sferoïden in elke put te wikkelen, waardoor een in vivo-achtige extracellulaire matrix (ECM) voor elke sferoïde werd geproduceerd. Vervolgens werden drugstesten uitgevoerd. Omdat we een high-content beeldvormingssysteem met deep-learning analysesoftware (figuur 1C) gebruikten, konden we de individuele sferoïde groei duidelijk observeren (figuur 1E) en waarden verkrijgen voor geschikte parameters om kenmerken tijdens medicamenteuze therapie te bepalen, waaronder levensvatbaarheid, diameter en ruwheid.
Figuur 1: Tumorsferoïdevorming en geautomatiseerde beeldvorming en analyse . (A) Schema met de standaard tumorsferoïde kweekprocedure met de onderstaande tijdlijn. (B) Schema van het testen van medicamenteuze behandeling met behulp van tumorsferoïden die verschillende niveaus van invasiviteit in 3D-matrices laten zien. (C) Afbeelding van een op deep learning gebaseerd algoritme-gerelateerd systeem voor geautomatiseerde beeldvorming en analyse met details als volgt: plaatplatform; condensor met lichtbron; gemotoriseerde x, y-fase; gemotoriseerde z-as module; objectief wiel; filterwiel; CCD; en computer met de ontwikkelde systeemsoftware. (D) De vorming van NCI-H23 tumorsferoïden uit monolaagse cellen waargenomen vanaf het oculair van een microscoop. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. (E) Variatie in de invasiviteit en grootte van de NCI-H23-sferoïden zonder medicamenteuze behandeling gedurende 10 dagen. De schaalbalken vertegenwoordigen 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In deze studie gebruikten we het antitumorgeneesmiddel AMG510 om het effect ervan op de behandeling van niet-kleincellige longkanker te testen. Het analysesysteem leverde beeldgegevens zonder complexe beeldverwerking. De brightfieldbeelden in figuur 2 laten zien dat de groei van NCI-H23-sferoïden kan worden geremd door AMG510. Dit werd aangegeven door de verminderde grootte samen met de verhoogde concentratie. Daarentegen nam de grootte toe in de controlegroep gedurende 10 dagen. Tijdens deze periode veranderde ook de ruwheid van de randzijde, wat wijst op invasiviteit. De sferoïden vertoonden platte randen op dag 1, maar ruwe randen op dag 10. Er moet echter worden opgemerkt dat het vergelijken van ruwheid door middel van brightfield-afbeeldingen alleen al een uitdagende taak is. Er moet ook worden vermeld dat de standaardmethode sferoïden van een voldoende gemiddelde grootte omvat. Ten slotte merken we op dat met deze methode een schone achtergrond werd bereikt, omdat er maar weinig cellen aan de onderkant kleefden.
Figuur 2: Brightfield-beelden van NCI-H23-celsferoïden behandeld met verschillende concentraties AMG510 worden automatisch vastgelegd door een microscoop met een hoog gehalte. De kolommen vertegenwoordigen verschillende dagen en de rijen vertegenwoordigen verschillende medicijnconcentraties. De resultaten omvatten drie sferoïden voor elke aandoening. Alle beelden werden automatisch scherpgesteld met 2x vergroting en vervolgens vastgelegd met 10x vergroting door het high-content beeldvormingssysteem met behulp van op kunstmatige intelligentie gebaseerde software en een microscoop-bijbehorende micro-omgevingscontroller. De schaalbalken vertegenwoordigen 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De resultaten van de levensvatbaarheid van de cellen, weergegeven in figuur 3A, toonden een verminderde levensvatbaarheid in de 10-daagse culturen van met geneesmiddelen behandelde monsters bij alle doseringsniveaus in vergelijking met de controle. Monsters met concentraties van meer dan 0,01 μM vertoonden een snelle afname van de levensvatbaarheid van tumorcellen, wat wijst op de gevoeligheid van AMG510-therapie voor niet-kleincellige longkanker. Op dag 10 vertoonden deze monsters vergelijkbare niveaus van uiteindelijke levensvatbaarheid, met waarden onder 70%, zoals weergegeven in figuur 3B.
Figuur 3: Tumor sferoïde levensvatbaarheid van de met AMG510 behandelde monstergroepen. Op dag 1 werden drugs toegevoegd. (A) De levensvatbaarheid van tumorsferoïde werd gemeten op dag 1, dag 4, dag 7 en dag 10. B) Levensvatbaarheid van de eindcellen van de monsters met concentratiegradiënten. De geneesmiddelconcentraties die werden gebruikt om elke tumorsferoïde te behandelen, werden ingesteld van 0,001 μM tot 5 μM. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4A laat een vergelijkbare trend zien met betrekking tot de sferoïde diameteranalyse. Monsters met concentraties van meer dan 0,01 μM vertoonden een duidelijke vermindering van de gemiddelde diameter. Uniformiteit in de sferoïde grootte was ook te zien op de eerste dag van de medicamenteuze behandeling, met waarden van ongeveer 800 μm. De diameterverhoudingen van deze sferoïden (figuur 4B) duidden op krimp tijdens de AMG510-cocultuur op een zichtbaar meer voor de hand liggende manier dan de levensvatbaarheidstest. Daarnaast berekenden we de sferoïde tumorgroeiremmingswaarden in termen van hun diameters, zoals weergegeven in figuur 4C. De TGI-waarde is een relatieve evaluatieparameter en de waarden kunnen wijzen op verminderde groei als gevolg van oorspronkelijke zaaiverschillen tussen de sferoïden; we kregen echter opnieuw het resultaat dat concentraties boven 0,01 μM een duidelijk effect hadden op het succes van de AMG510-behandeling. In een eerdere studie experimenteerden we met de IC50-waarde, een belangrijke index voor het testen van geneesmiddelen; we vonden echter dat NCI-H23-sferoïden onder AMG510-behandeling geen veranderingen in deze parameter vertoonden.
Figuur 4: Tumorgrootte weergegeven door sferoïde diameters in de controle- en AMG510-behandelde monstergroepen. (A) Tumor sferoïde diameters werden gemeten op dag 1, dag 4, dag 7 en dag 10. (B) De sferoïde groeiverhouding werd gedefinieerd als het eindvolume ten opzichte van het oorspronkelijke volume en berekend met behulp van de sferoïde diameters. (C) De sferoïde groeiremmingsverhouding werd gedefinieerd ten opzichte van het volume en berekend met behulp van de sferoïde diameters. De AMG510-concentraties die werden gebruikt om elke tumorsferoïde te behandelen, werden ingesteld van 0,001 μM tot 5 μM. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vervolgens voerden we een verdere evaluatie uit van de invasiviteit van de sferoïden in termen van de ruwheidswaarden geproduceerd als output door de software (figuur 5A) en ook de overtollige perimeterindex op basis van de sferoïde grenzen, geproduceerd met dezelfde middelen (figuur 5B). Hogere ruwheid betekent dat meer cellen migreren van de sferoïde naar de gel, wat dus een hogere invasiviteit vertegenwoordigt. De resultaten van controles werden vergeleken met verschillende concentratieniveaus van geneesmiddelen. Voor NCI-H23, een invasieve cellijn, namen de sferoïde ruwheid en EPI-waarden beide toe met de kweektijd zonder enige medicamenteuze behandeling18, en dit kon worden bewezen door de brightfieldbeelden en diametertoenames in de controlemonsters. De groei werd echter afgezwakt door de behandeling met AMG510, geheel in verhouding tot de variaties in grootte.
Figuur 5: Tumorgrensherkenning in de onbehandelde controle- en AMG510-behandelde monstergroepen. Op dag 1 werden drugs toegevoegd. (A) Tumorruwheid werd gemeten door de software op dag 1, dag 4, dag 7 en dag 10, wat de invasiviteit van de tumorsferoïden aangeeft. (B) De sferoïde perimeter werd gelokaliseerd en getekend door de software met behulp van deep-learning algoritmen. De sferoïde gebieden in het brandpuntsvlak werden vervolgens gemeten met afbeelding J en op basis van deze gegevens werd een overtollige perimeterindex berekend. De AMG510-concentraties die werden gebruikt om elke tumorsferoïde te behandelen, werden ingesteld van 0,001 μM tot 5 μM. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: De samenstelling van de plaat. Het anti-longtumorgeneesmiddel AMG510 werd in het experiment gebruikt en groepen werden ingesteld op basis van medicijngradiënten. Er werden twee platen gebruikt: één voor de test van de levensvatbaarheidstestit en één voor de beeldvormingsanalyse.
Aanvullende tabel 2: Cellijnen die zijn gebruikt bij 3D-tumorconstructie en medicijntests. Klik hier om deze tabellen te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij tumorgroei. Het kan de levering van extracellulaire matrices, zuurstofgradiënten, voeding en mechanische interactie beïnvloeden en dus de genexpressie, signaalroutes en vele functies van tumorcellen beïnvloeden 19,20,21. In veel gevallen produceren 2D-cellen dergelijke effecten niet of zelfs tegengestelde effecten, waardoor de evaluatie van medicamenteuze behandelingen wordt beïnvloed. De opkomst van 3D-modellen heeft dit probleem echter aangepakt. Onze evaluatie van het effect van AMG510 op een longkankerbehandelingssysteem werd bijvoorbeeld voltooid met behulp van 3D-methoden. We construeerden een 3D-tumor-sferoïde-ECM (TSE) -model door tumorsferoïden te maken die zijn ingebed in een gel om AMG510-behandeling op een longgerelateerde invasieve cellijn te volgen. AMG510 is een nieuwe remmer die zich richt op G12C-mutant KRAS22, en de effectiviteit ervan werd bevestigd door onze bevinding dat de niet-kleincellige longkanker (NSCLC) ervaren door sommige patiënten die reageren op deze mutant. Uit onze reeks experimentele gegevens en analyses kunnen enkele zeer waardevolle gegevens worden onderscheiden. De gevoeligheid voor AMG510 was significant verbeterd onder een 3D-sferoïde conditie, vergeleken met de 2D-conditie, en verbeterde nog verder binnen een hypoxie-conditie.
De modellen die volgens de huidige methode zijn gebouwd, bieden verschillende voordelen. Ten eerste kan het als 3D-model de tumor en de extracellulaire matrix goed simuleren. De eenvoudige maar effectieve methode voor het construeren van 3D-tumorsferoïden stelt de cellen in staat om gedurende een periode van 2 weken te overleven. Na de 5 dagen van sferoïde constructie is een periode van ongeveer 10 dagen beschikbaar, wat voldoende is om eventuele drugstests uit te voeren. Bovendien is de methode van 3D-celcultuurproductie bijna hetzelfde als de 2D-methode en zijn de kosten veel lager dan die van 3D-bioprinting. In vergelijking met andere methoden zoals de hanging-drop-methode, helpt de hier beschreven methode om meer uniforme sferoïden te produceren en wordt de celgrootte volledig gecontroleerd door het type en de dichtheid van cellen. Ten slotte is aangetoond dat dit model toepasbaar is op verschillende soorten kankercellen, en deze flexibiliteit kan van bijzonder hoge waarde blijken te zijn. In de toekomst kunnen onderzoekers die zich bezighouden met de vorming van tumorsferoïden niet alleen fibroblasten en endotheelcellen toevoegen aan hun tumorcelsuspensies, maar ook immuuncellen zoals T-cellen en NK-cellen om stromale celmigratie te bevorderen en de immunotherapeutische effecten van nieuwe geneesmiddelen te stimuleren23,24.
In de afgelopen decennia hebben weinig rapporten zich gericht op het beschrijven van de technieken en hulpmiddelen die momenteel beschikbaar zijn om significante biologische gegevens uit 3D-modellen te extraheren25. Deze informatie kan worden beschouwd als fundamenteel voor het testen van geneesmiddelen en therapeutische ontdekking met behulp van 3D-celkweekmodellen26. De studie van Zanoni et al. beschreef nieuwe open-source software die automatische beeldanalyse van 3D-tumorkolonies uitvoert. De auteurs toonden aan dat morfologische parameters de reactie van grote sferoïden op medicamenteuze behandeling beïnvloedden en dat de grootte en vorm van sferoïden beide bronnen van variabiliteit konden zijn27. Met tumorsferoïden gekweekt in 3D-gel, die ECM's in vivo nabootsen, is het celgedrag echter veel complexer en kan invasiviteit worden vertoond. Hoewel de gegevens alleen betrekking hebben op grootte en vorm, blijven dergelijke beperkingen bestaan. Veel betrouwbare en gediversifieerde parameters kunnen worden verkregen met behulp van een beeldvormingssysteem met een hoog gehalte. Dergelijke systemen kunnen niet alleen de levensvatbaarheid van de cel en de sferoïde vorm bepalen, maar kunnen ook de kenmerken van tumoren en het remmingseffect van geneesmiddelen op tumoren detecteren en verifiëren. Invasiviteit kan ook op dergelijke manieren worden bepaald. Een invasieve tumor kan bijvoorbeeld een relatief hogere ruwheidswaarde hebben, terwijl een niet-invasieve tumor een hogere EPI-waarde kan hebben. Veranderingen in dergelijke waarden kunnen wijzen op verschillende effecten op het geneesmiddel. In de toekomst hopen we deze technieken te combineren met microfluïdische chips om meer handige en effectieve strategieën te verkrijgen.
De hier beschreven gestandaardiseerde methode kan voldoen aan de vereisten van de meeste screening- en evaluatietests voor geneesmiddelen. Er zijn echter nog steeds enkele problemen die zich tijdens toekomstige experimenten kunnen voordoen. Cellen kunnen zich bijvoorbeeld na het centrifugeren hechten aan de binnenwanden van de putten, of het kweekmedium is mogelijk niet geschikt. Bovendien kan de gel die in het protocol wordt gebruikt, evenals de veelgebruikte Matrigel, gemakkelijk gelate tijdens het lange proces. De meeste van deze problemen kunnen echter worden opgelost door middel van standaard bedienings- en optimalisatietechnieken. Er zijn andere mogelijke beperkingen in deze methode. Vanwege de sferoïde structuur worden voedingsstoffen, zuurstof en afvaldiffusie door de sferoïde beïnvloed door de grootte. De levensvatbaarheid van de cellen in de sferoïde kern kan worden aangetast wanneer de sferoïde diameter meer dan 1.000 μm is. Omgekeerd wordt het moeilijk om de invasie waar te nemen wanneer de diameter lager is dan 400 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken alle leden van onze laboratoria voor hun kritische inbreng en suggesties. Dit onderzoek werd ondersteund door het Key Project van Jiangsu Commission of Health (K2019030). Conceptualisatie werd uitgevoerd door C.W. en Z.C., de methodologie werd uitgevoerd door W.H. en M.L., het onderzoek werd uitgevoerd door W.H. en M.L., de datacuratie werd uitgevoerd door W.H., Z.Z., S.X., en M.L., de oorspronkelijke conceptvoorbereiding werd uitgevoerd door Z.Z., J.Z., S.X., W.H., en X.L., de beoordeling en bewerking werd uitgevoerd door Z.C., de projectadministratie werd uitgevoerd door C.W. en Z.C., en de financieringsacquisitie werd uitgevoerd door C.W. Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
